專利名稱：一種檢測超氧陰離子自由基的熒光探針及其合成方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)及臨床醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，涉及活性氧的熒光探針及其合成方法，尤其涉及超氧陰離子自由基的熒光探針及其合成方法，另外，本發(fā)明還涉及該熒光探針的用途。
背景技術(shù)：
自由基是生命活動(dòng)代謝過程中產(chǎn)生的具有高反應(yīng)活性的小分子物質(zhì)，一旦生物體自身不能有效、迅速清除過量存在的自由基，將會(huì)極大損傷具有重要生理功能的生物大分子，比如DNA，脂質(zhì)及蛋白質(zhì)。研究表明人類常見的幾種主要疾病，如癌癥、動(dòng)脈硬化癥、神經(jīng)退化疾病及糖尿病等(Witz G.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，1991，198675；Feig D.I.，Reid T.M.，Leob L.A.，Cancer Res.，1994，541890s)；及人類的衰老都與自由基的產(chǎn)生密切相關(guān)(Finkl T.，Holbrook N.J.，Nature，2000，408239)。但由于自由基壽命短、含量低、種類多，對其檢測仍是生命科學(xué)與化學(xué)分析領(lǐng)域最困難的問題之一。尤其是高選擇性、高靈敏度、實(shí)用性強(qiáng)的檢測方法尚未見有公布。作為產(chǎn)生其它活性自由基的前體，超氧陰離子自由基的識別和檢測尤其重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種效果較好的檢測超氧陰離子自由基的熒光探針，為探討人類疾病及老化的機(jī)制，為某些重大疾病的早期診斷與預(yù)防，提供良好的輔助手段；目的之二是提供工藝簡單、成本低廉的該熒光探針的合成方法；目的之三是提供該熒光探針的用途。
本發(fā)明的目的之一可通過如下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的熒光探針結(jié)構(gòu)式為
X＝O，NH，SY1，Y2＝F，Cl，CH3，OCH3R＝苯基，取代苯基，烷基。
本發(fā)明的目的之二可通過如下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)該合成方法按如下步驟進(jìn)行a.將原料按照熒光染料∶膦?；噭酶剿釀?∶2～3.5∶1～3的質(zhì)量比，先將熒光染料和膦?；噭┓謩e溶解于四氫呋喃中，然后混勻，加熱回流0.5～1.5小時(shí)；b.再將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，過濾，濾液濃縮至浸膏；c.然后再加苯溶解浸膏，水洗至中性，濃縮得粗品；d.最后硅膠柱層析分離得純品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
本發(fā)明的目的之二還可通過如下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)所述的熒光染料選自熒光素及其取代衍生物、萘熒光素及其取代衍生物或羅丹明；所述的熒光素取代衍生物選自2’，4’，5’，7’-四氟熒光素或4’，5’-二甲基熒光素；所述的萘熒光素取代衍生物選自2’，5’，8’，11’-四氟萘熒光素或2’，11’-二甲基萘熒光素；所述的膦?；噭┻x自二苯基膦酰氯或取代二苯基膦酰氯；所述的取代二苯基膦酰氯選自二-2’，4’-二硝基苯基)膦酰氯或二-2’，4’-二甲基苯基膦酰氯；所述的附酸劑選自三乙胺、吡啶或甲基吡啶。
本發(fā)明的目的之三可通過如下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)將本發(fā)明的測定超氧陰離子自由基的熒光探針用于化學(xué)體系、化學(xué)模擬生物體系中羥基自由基的檢測，生物活細(xì)胞和活組織內(nèi)的羥基自由基的分析檢測和熒光成像檢測，以及臨床醫(yī)學(xué)上病變組織中羥基自由基的檢測。
本發(fā)明以熒光素、二苯基次膦酰氯和吡啶為原料，制成的熒光探針M.p118-122℃.1H NMR(300MHz，DMSO-d6，TMS)δ＝8.01(d，3JH，H＝7.86Hz，1H)，7.96～7.90(m，8H)，7.72(m，2H)，7.67～7.56(m，12H)，7.36(s，2H)，7.28(d，3JH，H＝7.80Hz，1H)，7.08(d，3JH，H＝8.76Hz，2H)，6.78(d，3JH，H＝8.76Hz，2H).IR(KBr，cm-1)1768，1606，1486，1392.MS(APCI)calcd 732.2，found 732.2.31P NMR(400MHz，DMSO，85％ H3P04)31.384ppm。
本發(fā)明以萘熒光素、二苯基次膦酰氯和吡啶為原料，制成的熒光探針M.p110-112℃.1H NMR(300MHz，DMSO-d6，TMS)δ＝8.68(d，3JH，H＝9.1Hz，2H)，8.08(m，1H)，7.95(m，1H)，7.72(d，3JH，H＝8.0Hz，8H)，7.69(m，2H)，7.50(m，4H)，7.45～7.36(m，12H)，7.20(s，2H)，6.70(d，3JH，H＝9.1Hz，2H).IR(KBr，cm-1)1758，1645，1608，1574，1392，1251，1205，1156.MS(APCI)calcd 832.7697，found 832.7.31PNMR(400MHz，DMSO，85％H3PO4)30.9597ppm。
本發(fā)明根據(jù)超氧陰離子自由基獨(dú)特的親核性發(fā)明了基于亞膦酸酯的熒光探針，用于檢測超氧陰離子自由基的識別和檢測，具有高選擇性、高靈敏度和實(shí)用性強(qiáng)的積極效果，解決了目前生命科學(xué)與化學(xué)分析領(lǐng)域中的一大難題；通過超氧與探針的特異性反應(yīng)，利用共聚焦掃描顯微鏡實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)原位超氧陰離子自由基的直接有效檢測。本發(fā)明的熒光探針為研究超氧介導(dǎo)的生化反應(yīng)、自由基損傷生物大分子的作用機(jī)理、損傷與疾病的關(guān)系及臨床治療提供了較好的理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)方法。本發(fā)明的方法工藝簡單，操作方便，設(shè)備投入少，生產(chǎn)和運(yùn)行成本低。
本發(fā)明的重要貢獻(xiàn)還在于成功的合成了萘系列遠(yuǎn)可見-近紅外熒光探針(600-900nm)，避開了生物體自身熒光的干擾，為生物樣品中低含量的自由基檢測提供了可能。而熒光素系列則為食品，環(huán)境方面的檢測提供了更好的靈敏度?？傊?，本發(fā)明的熒光探針及其合成必將極大促進(jìn)自由基生物化學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。


圖1是本發(fā)明合成的二苯基亞膦酸熒光素酯用于氧化脅迫下小鼠腹膜巨噬細(xì)胞(Balb/c)內(nèi)超氧陰離子檢測的熒光成像。
圖2是本發(fā)明合成的二苯基亞膦酸萘熒光素酯用于氧化脅迫下巨噬細(xì)胞(RAW264.7)內(nèi)超氧陰離子檢測的熒光成像。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1先分別向置有1.0克熒光素、2.3克二苯基膦酰氯的燒瓶中加入可使熒光素、二苯基膦酰氯完全溶解的四氫呋喃溶劑，然后向溶有二苯基膦酰氯的四氫呋喃溶液中于磁攪拌下先加入3毫升吡啶，再于室溫下緩慢加入溶有熒光素的四氫呋喃溶液，加熱回流0.5小時(shí)；再將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，過濾除去反應(yīng)液中的固體殘?jiān)?，濾液減壓濃縮至浸膏，然后再加苯溶解浸膏，用15％稀氨水、30℃的水依次洗滌至中性，分出有機(jī)層，硫酸鈉干燥，減壓濃縮得熒光探針粗品；最后，用硅膠柱分離組分，洗脫劑為甲醇-三氯甲烷(3∶7v/v)，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，真空干燥得熒光探針純品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
實(shí)施例2先分別向置有1.0克熒光素、3.5克二苯基膦酰氯的燒瓶中加入可使熒光素、二苯基膦酰氯完全溶解的四氫呋喃溶劑，然后向溶有二苯基膦酰氯的四氫呋喃溶液中于磁攪拌下先加入1毫升吡啶，再于室溫下緩慢加入溶有熒光素的四氫呋喃溶液，加熱回流1.5小時(shí)；再將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，過濾除去反應(yīng)液中的固體殘?jiān)?，濾液減壓濃縮至浸膏，然后再加苯溶解浸膏，用5％稀氨水、40℃的水依次洗滌至中性，分出有機(jī)層，硫酸鈉干燥，減壓濃縮得熒光探針粗品；最后，用硅膠柱分離組分，洗脫劑為甲醇-三氯甲烷(5∶5v/v)，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，真空干燥得熒光探針純品，淋洗液乙酸乙酯/正己烷。
實(shí)施例3將三乙胺替換吡啶，其他分別同實(shí)施例1、2。
實(shí)施例4將甲基吡啶替換吡啶，其他分別同實(shí)施例1、2。
實(shí)施例5將二(2，4-二硝基苯基)膦酰氯替換二苯基次膦酰氯，其他分別同實(shí)施例1～4。
實(shí)施例6將二(2，4-二甲基苯基)膦酰氯替換二苯基次膦酰氯，其他分別同實(shí)施例1～4。
實(shí)施例7將2’，4’，5’，7’-四氟熒光素替換熒光素，其他分別同實(shí)施例1～6。
實(shí)施例8將4’，5’-二甲基熒光素替換熒光素，其他分別同實(shí)施例1～6。
實(shí)施例9將萘熒光素替換熒光素，其他分別同實(shí)施例1～6。
實(shí)施例10將2’，5’，8’，11’-四氟萘熒光素替換熒光素，其他分別同實(shí)施例1～6。
實(shí)施例11將或2’，11’-二甲基萘熒光素替換熒光素，其他分別同實(shí)施例1～6。
實(shí)施例12將羅丹明替換熒光素，其他分別同實(shí)施例1～6。
權(quán)利要求
1.一種測定超氧陰離子自由基的熒光探針，其特征在于該熒光探針的結(jié)構(gòu)式為 X＝O，NH，SY1，Y2＝F，Cl，CH3，OCH3R＝苯基，取代苯基，烷基。
2.一種測定超氧陰離子自由基的熒光探針的合成方法，其特征在于該方法按如下步驟進(jìn)行a.將原料按照熒光染料膦酰化試劑∶附酸劑＝1∶2～3.5∶1～3的質(zhì)量比，先將熒光染料和膦酰化試劑分別溶解于四氫呋喃中，然后混勻，加熱回流0.5～1.5小時(shí)；b.再將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，過濾，濾液濃縮至浸膏；c.然后再加苯溶解浸膏，水洗至中性，濃縮得粗品；d.最后硅膠柱層析分離得純品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于所述的熒光染料選自熒光素及其取代衍生物、萘熒光素及其取代衍生物或羅丹明。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的合成方法，其特征在于所述的熒光素取代衍生物選自2’，4’，5’，7’-四氟熒光素或4’，5’-二甲基熒光素。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的合成方法，其特征在于所述的萘熒光素取代衍生物選自2’，5’，8’，11’-四氟萘熒光素或2’，11’-二甲基萘熒光素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于所述的膦?；噭┻x自二苯基膦酰氯或取代二苯基膦酰氯。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的合成方法，其特征在于所述的取代二苯基膦酰氯選自二-2’，4’-二硝基苯基膦酰氯或二-2’，4’-二甲基苯基膦酰氯。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于所述的附酸劑選自三乙胺、吡啶或甲基吡啶。
9.權(quán)利要求1所述的測定超氧陰離子自由基的熒光探針用于化學(xué)體系、化學(xué)模擬生物體系中羥基自由基的檢測，生物活細(xì)胞和活組織內(nèi)的羥基自由基的分析檢測和熒光成像檢測，以及臨床醫(yī)學(xué)上病變組織中羥基自由基的檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測超氧陰離子自由基的熒光探針及其合成方法，該方法按如下步驟進(jìn)行a.將原料按照熒光染料∶膦酰化試劑∶附酸劑＝1∶2～3.5∶1～3的質(zhì)量比，先將熒光染料和膦?；噭┓謩e溶解于四氫呋喃中，然后混勻，加熱回流0.5～1.5小時(shí)；b.再將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，過濾，濾液濃縮至浸膏；c.然后再加苯溶解浸膏，水洗至中性，濃縮得粗品；d.最后硅膠柱層析分離得純品。
文檔編號G01N21/00GK1837211SQ20061004356
公開日2006年9月27日 申請日期2006年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月11日
發(fā)明者唐波, 徐克花, 劉霞 申請人:山東師范大學(xué)