專利名稱：孕中期唐氏綜合征產前篩查試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于孕中期唐氏綜合征產前篩查的試劑盒，屬于醫(yī)學和生物學檢測領域。
背景技術：
唐氏綜合征又稱21-三體綜合征或先天愚型(Down’s Syndrome，DS)，是造成智力發(fā)展障礙的最常見的先天缺陷，它的發(fā)生率大約為1/750，其特征主要表現為嚴重的智力低下，智商多為20～60，只有同齡正常人的1/4～1/2，有小頭、枕部扁平、項厚、眼裂小、外側上斜、內眥深、眼距寬、馬鞍鼻、口常半開、舌?？谕狻⑹种付檀?、掌紋有通貫、小指內彎等癥狀，其發(fā)生具有偶然性、隨機性，發(fā)生率會隨孕婦年齡的增大而升高，該病目前沒有有效的治療方法，防止此類疾病發(fā)生所采取的辦法，就是在懷孕期間進行產前篩查和必要的產前診斷，盡早發(fā)現并采取相應措施，目前，臨床上產前診斷的方法主要采用絨毛膜取樣或者羊水穿刺來進行產前診斷，這些方法對于產前檢出唐氏綜合征胎兒，防止這類胎兒的出生起到了一定作用，但由于羊膜腔穿刺有一定的創(chuàng)傷性，可引起流產，且不可能直接的大范圍的對所有孕婦用確診的方法進行檢測，另外還需要一定的技術設備條件、花費時間較長、費用較大，不可能在所有的孕婦中廣泛開展，其次，即使一些具有羊膜腔穿刺適應癥的高危孕婦，由于對羊膜腔穿刺可能會造成流產的恐懼心理，拒絕接受羊水染色體檢查，因此，唐氏綜合征的出生數仍然比較高。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種結果準確可靠、無創(chuàng)傷性、安全、靈敏度高的孕中期唐氏綜合征產前篩查試劑盒。
為實現上述目的，本發(fā)明的技術方案為孕中期唐氏綜合征產前篩查試劑盒，其特征在于所述試劑盒由AFP標準品、AFP單克隆抗體包被板條、AFP質控品、AFP酶結合物、β-HCG標準品、β-HCG單克隆抗體包被板條、β-HCG質控品、β-HCG酶結合物、標本稀釋液、濃縮洗滌液、發(fā)光底物液、封板膜，板架組成。
所述AFP、β-HCG標準品的制備方法為先分別將AFP、β-HC6凍干標準品溶解并稀釋至所需的最高濃度，再采用倍比稀釋法稀釋至所需濃度，獲得AFP、β-HCG標準品。
所述AFP、β-HCG單克隆抗體包被板條的制備包括以下步驟(1)、采用單克隆抗體技術，先使用AFP或β-HCG純品按常規(guī)對小鼠進行免疫，取脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，加以篩選配對，建立AFP和β-HCG單克隆抗體細胞庫，然后再經接種小鼠腹腔制備腹水，再將腹水純化后獲得特異性為100％、純度大于96％的AFP或β-HCG配對單克隆抗體；(2)、將純化的AFP或β-HCG單克隆抗體用碳酸鹽緩沖液稀釋，然后加入包被板條各孔內，經吸附、洗滌、封閉、干燥后獲得AFP或β-HCG單克隆抗體包被板條；(3)、將AFP或β-HCG單克隆抗體包被板條裝入專用鋁箔包裝袋，封口并冷藏備用。
所述AFP、β-HCG酶結合物的制備包括以下步驟(1)、稱取辣根過氧化物酶倒入一棕色小玻璃瓶內，取1ml雙蒸水溶解，用加樣器取200ul高碘酸鈉溶液，滴入盛辣根過氧化物酶的小瓶內，室溫振蕩20min；(2)、振蕩好的辣根過氧化物酶溶液取入透析袋，放入配制好的醋酸緩沖液中，4℃冰箱透析過夜；(3)、取待標記抗體加入另一透析袋中，放入配制好的碳酸鹽緩沖液中，置于4℃冰箱內透析過夜；(4)、次日，取出辣根過氧化物酶溶液，和抗體混勻，放入碳酸鹽緩沖液中攪拌透析3小時；(5)、將透析好的辣根過氧化物酶和抗體溶液，置于棕色小瓶內，加入硼氫化鈉溶液充分混勻，用振蕩器振蕩2小時；(6)、將葡聚糖凝膠G-200裝柱，將上述標記物加于柱頂部，用洗脫液洗脫；
(7)、用小試管依次分段接收流出物，用事先包被好的羊抗鼠板條進行檢測，取顯蘭色板孔對應試管內的酶結合物；(8)、將收集的酶結合物加入等量甘油混勻，放置于-20℃冰箱保存；(9)、將酶結合物稀釋到工作濃度，配制酶結合物工作液，裝入試劑瓶冷藏備用。
所述發(fā)光底物液包括底物液A和底物液B，其配制包括以下步驟(1)、底物液A的配制用電子天平準確稱取BSA、Tris所需量，加入容量瓶，加適量雙蒸水，輕搖使之溶解完全，以雙蒸水定容，再用HCl調PH至9.0，用加樣器取H2O2加入上述液體中，混勻，將配制好的底物液A溶液按照規(guī)定量分裝到試劑瓶內，擰緊瓶蓋放在2～8℃保存?zhèn)溆茫?2)、底物液B的配制用電子天平準確稱取BSA、Tris所需量，加入容量瓶，加適量雙蒸水，輕搖使之溶解完全，以雙蒸水定容，再用HCl調PH至9.0，再用電子天平準確稱取魯米諾、對位碘酚倒入容量瓶，充分溶解、混勻，將配制好的底物液B溶液按照規(guī)定量分裝到試劑瓶內，擰緊瓶蓋，放在2～8℃保存?zhèn)溆谩?br> 所述使用方法包括以下步驟(1)AFP測定a、取出在冷藏環(huán)境中貯存的試劑，達到與室溫平衡的溫度；b、將濃縮洗滌液按1∶40的比例稀釋，搖勻備用，作為應用洗滌液；c、根據AFP標準品、質控品及待測標本確定所需孔數；d、AFP標準品、質控品直接取50ul加入相應孔內，用前搖勻；e、在待測標本孔中先分別加45ul標本稀釋液；f、取5ul血清加入已加標本稀釋液的孔內，用移液器吹打，孔內液體由綠色變?yōu)樗{色；g、每孔加入50ul AFP酶結合物，用振蕩器振蕩30秒鐘，蓋上封板膜，置37℃水浴1小時；h、洗板甩盡板中液體，用洗滌液注滿各孔，停留10秒后用力甩去，重復5次后拍干；i、加底物根據使用量，將底物液A和底物液B按1∶1充分混勻，每孔加入新配制的發(fā)光底物50ul，用振蕩器振蕩20秒，放入發(fā)光儀內，于5～20分鐘測量結果；(2)β-HCG測定a、取出在冷藏環(huán)境中貯存的試劑，達到與室溫平衡的溫度；b、將濃縮洗滌液按1∶40的比例稀釋，搖勻備用，作為應用洗滌液；c、根據β-HCG標準品、質控品及待測標本確定所需孔數；d、β-HCG標準品、質控品混勻后直接取50ul加入相應孔內；e、在待測標本孔中先分別加25ul標本稀釋液；f、取25ul血清加入已加標本稀釋液的孔內，用移液器吹打幾次，孔內液體由綠色變?yōu)樗{色；g、用振蕩器振蕩30秒鐘，蓋上封板膜，置37℃水浴1小時；h、洗板甩盡板中液體，用洗滌液注滿各孔，停留10秒后用力甩去，重復5次后拍干；i、孔加入50ulβ-HCG酶結合物，37℃水浴15分鐘，甩盡板中液體，用洗滌液注滿各孔，停留10秒后用力甩去，重復5次后拍干；j、加底物根據使用量，將底物液A和底物液B按1∶1充分混勻，每孔加入新配制的發(fā)光底物50ul，用振蕩器振蕩20秒鐘，放入發(fā)光儀內，于5～20分鐘測量結果。
有益效果本發(fā)明采用以上方法，應用單克隆抗體技術、酶標記技術和酶催化化學發(fā)光定量檢測技術，結合化學發(fā)光定量檢測儀，定量檢測孕婦血清中的AFP或β-HCG，然后采用專用數據分析處理軟件對數據進行處理，實現孕中期唐氏綜合征產前篩查的目的，由于應用了化學發(fā)光定量檢測技術，結果準確可靠，實現了無創(chuàng)傷性、安全、靈敏度高的產前篩查，本發(fā)明具有較高的市場推廣價值。
注意事項1、不同批號的試劑不能混用；
2、拆封未使用完的AFP或β-HCG單克隆抗體包被酶標板條，須密封保存，勿受潮；3、試劑盒于2～8℃、避光、干燥貯存，不得凍存。
具體實施例方式
實施例，孕中期唐氏綜合征產前篩查試劑盒，所述試劑盒由AFP標準品、AFP單克隆抗體包被板條、AFP質控品、AFP酶結合物、β-HCG標準品、β-HCG單克隆抗體包被板條、β-HCG質控品、β-HCG酶結合物、標本稀釋液、濃縮洗滌液、發(fā)光底物液、封板膜，板架組成。
所述AFP、β-HCG標準品，其制備方法為先分別將AFP、β-HCG凍干標準品溶解并稀釋至所需的最高濃度，再采用倍比稀釋法稀釋至所需濃度，獲得AFP、β-HCG標準品。
所述AFP、β-HCG單克隆抗體包被板條的制備包括以下步驟(1)、采用單克隆抗體技術，先使用AFP或β-HCG純品按常規(guī)對小鼠進行免疫，取脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，加以篩選配對，建立AFP和β-HCG單克隆抗體細胞庫，然后再經接種小鼠腹腔制備腹水，再將腹水純化后獲得特異性為100％、純度大于96％的AFP或β-HCG配對單克隆抗體；(2)、將純化的AFP或β-HCG單克隆抗體用碳酸鹽緩沖液稀釋，然后加入包被板條各孔內，經吸附、洗滌、封閉、干燥后獲得AFP或β-HCG單克隆抗體包被板條；(3)、將AFP或β-HCG單克隆抗體包被板條裝入專用鋁箔包裝袋，封口并冷藏備用。
所述AFP、β-HCG酶結合物的制備包括以下步驟(1)、稱取辣根過氧化物酶倒入一棕色小玻璃瓶內，取1ml雙蒸水溶解，用加樣器取200ul高碘酸鈉溶液，滴入盛辣根過氧化物酶的小瓶內，室溫振蕩20min；(2)、振蕩好的辣根過氧化物酶溶液取入透析袋，放入配制好的醋酸緩沖液中，4℃冰箱透析過夜；(3)、取待標記抗體加入另一透析袋中，放入配制好的碳酸鹽緩沖液中，置于4℃冰箱內透析過夜；(4)、次日，取出辣根過氧化物酶溶液，和抗體混勻，放入碳酸鹽緩沖液中攪拌透析3小時；(5)、將透析好的辣根過氧化物酶和抗體溶液，置于棕色小瓶內，加入硼氫化鈉溶液充分混勻，用振蕩器振蕩2小時；(6)、將葡聚糖凝膠G-200裝柱，將上述標記物加于柱頂部，用洗脫液洗脫；(7)、用小試管依次分段接收流出物，用事先包被好的羊抗鼠板條進行檢測，取顯蘭色板孔對應試管內的酶結合物；(8)、將收集的酶結合物加入等量甘油混勻，放置于-20℃冰箱保存；(9)、將酶結合物稀釋到工作濃度，配制酶結合物工作液，裝入試劑瓶冷藏備用。
所述發(fā)光底物液包括底物液A和底物液B，其配制包括以下步驟(1)、底物液A的配制用電子天平準確稱取BSA、Tris所需量，加入容量瓶，加適量雙蒸水，輕搖使之溶解完全，以雙蒸水定容，再用HCl調PH至9.0，用加樣器取H2O2加入上述液體中，混勻，將配制好的底物液A溶液按照規(guī)定量分裝到試劑瓶內，擰緊瓶蓋放在2～8℃保存?zhèn)溆茫?2)、底物液B的配制用電子天平準確稱取BSA、Tris所需量，加入容量瓶，加適量雙蒸水，輕搖使之溶解完全，以雙蒸水定容，再用HCl調PH至9.0，再用電子天平準確稱取魯米諾、對位碘酚倒入容量瓶，充分溶解、混勻，將配制好的底物液B溶液按照規(guī)定量分裝到試劑瓶內，擰緊瓶蓋，放在2～8℃保存?zhèn)溆谩?br> 所述試劑盒的使用方法包括以下步驟(1)AFP測定a、取出在冷藏環(huán)境中貯存的試劑，達到與室溫平衡的溫度；b、將濃縮洗滌液按1∶40的比例稀釋，搖勻備用，作為應用洗滌液；c、根據AFP標準品、質控品及待測標本確定所需孔數；d、AFP標準品、質控品直接取50ul加入相應孔內，用前搖勻；
e、在待測標本孔中先分別加45ul標本稀釋液；f、取5ul血清加入已加標本稀釋液的孔內，用移液器吹打，孔內液體由綠色變?yōu)樗{色；g、每孔加入50ul AFP酶結合物，用振蕩器振蕩30秒鐘，蓋上封板膜，置37℃水浴1小時；h、洗板甩盡板中液體，用洗滌液注滿各孔，停留10秒后用力甩去，重復5次后拍干；i、加底物根據使用量，將底物液A和底物液B按1∶1充分混勻，每孔加入新配制的發(fā)光底物50ul，用振蕩器振蕩20秒，放入發(fā)光儀內，于5～20分鐘測量結果；(2)β-HCG測定a、取出在冷藏環(huán)境中貯存的試劑，達到與室溫平衡的溫度；b、將濃縮洗滌液按1∶40的比例稀釋，搖勻備用，作為應用洗滌液；c、根據β-HCG標準品、質控品及待測標本確定所需孔數；d、β-HCG標準品、質控品混勻后直接取50ul加入相應孔內；e、在待測標本孔中先分別加25ul標本稀釋液；f、取25ul血清加入已加標本稀釋液的孔內，用移液器吹打幾次，孔內液體由綠色變?yōu)樗{色；g、用振蕩器振蕩30秒鐘，蓋上封板膜，置37℃水浴1小時；h、洗板甩盡板中液體，用洗滌液注滿各孔，停留10秒后用力甩去，重復5次后拍干；i、孔加入50ulβ-HCG酶結合物，37℃水浴15分鐘，甩盡板中液體，用洗滌液注滿各孔，停留10秒后用力甩去，重復5次后拍干；j、加底物根據使用量，將底物液A和底物液B按1∶1充分混勻，每孔加入新配制的發(fā)光底物50ul，用振蕩器振蕩20秒鐘，放入發(fā)光儀內，于5～20分鐘測量結果。
權利要求
1.孕中期唐氏綜合征產前篩查試劑盒，其特征在于所述試劑盒由AFP標準品、AFP單克隆抗體包被板條、AFP質控品、AFP酶結合物、β-HCG標準品、β-HCG單克隆抗體包被板條、β-HCG質控品、β-HCG酶結合物、標本稀釋液、濃縮洗滌液、發(fā)光底物液、封板膜，板架組成。
2.如權利要求1所述的孕中期唐氏綜合征產前篩查試劑盒的制備方法，其特征在于所述AFP、β-HCG標準品的制備方法為先分別將AFP、β-HCG凍干標準品溶解并稀釋至所需的最高濃度，再采用倍比稀釋法稀釋至所需濃度，獲得AFP或β-HCG標準品。
3.如權利要求1或2所述的孕中期唐氏綜合征產前篩查試劑盒的制備方法，其特征在于所述AFP、β-HCG單克隆抗體包被板條的制備包括以下步驟(1)、采用單克隆抗體技術，先使用AFP或β-HCG純品按常規(guī)對小鼠進行免疫，取脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，加以篩選配對，建立AFP和β-HCG單克隆抗體細胞庫，然后再經接種小鼠腹腔制備腹水，再將腹水純化后獲得特異性為100％、純度大于96％的AFP或β-HCG配對單克隆抗體；(2)、將純化的AFP或β-HCG單克隆抗體用碳酸鹽緩沖液稀釋，然后加入包被板條各孔內，經吸附、洗滌、封閉、干燥后獲得AFP或β-HCG單克隆抗體包被板條；(3)、將AFP或β-HCG單克隆抗體包被板條裝入專用鋁箔包裝袋，封口并冷藏備用。
4.如權利要求3所述的孕中期唐氏綜合征產前篩查試劑盒的制備方法，其特征在于所述AFP、β-HCG質控品的制備方法為先分別將AFP、β-HCG凍干標準品溶解并稀釋至所需的濃度，獲得AFP或β-HCG質控品。
5.如權利要求4所述的孕中期唐氏綜合征產前篩查試劑盒的制備方法，其特征在于所述AFP、β-HCG酶結合物的制備包括以下步驟(1)、稱取辣根過氧化物酶倒入一棕色小玻璃瓶內，取1ml雙蒸水溶解，用加樣器取200ul高碘酸鈉溶液，滴入盛辣根過氧化物酶的小瓶內，室溫振蕩20min；(2)、振蕩好的辣根過氧化物酶溶液取入透析袋，放入配制好的醋酸緩沖液中，4℃冰箱透析過夜；(3)、取待標記抗體加入另一透析袋中，放入配制好的碳酸鹽緩沖液中，置于4℃冰箱內透析過夜；(4)、次日，取出辣根過氧化物酶溶液，和抗體混勻，放入碳酸鹽緩沖液中攪拌透析3小時；(5)、將透析好的辣根過氧化物酶和抗體溶液，置于棕色小瓶內，加入硼氫化鈉溶液充分混勻，用振蕩器振蕩2小時；(6)、將葡聚糖凝膠G-200裝柱，將上述標記物加于柱頂部，用洗脫液洗脫；(7)、用小試管依次分段接收流出物，用事先包被好的羊抗鼠板條進行檢測，取顯蘭色板孔對應試管內的酶結合物；(8)、將收集的酶結合物加入等量甘油混勻，放置于-20℃冰箱保存；(9)、將酶結合物稀釋到工作濃度，配制酶結合物工作液，裝入試劑瓶冷藏備用。
6.如權利要求5所述的孕中期唐氏綜合征產前篩查試劑盒的制各方法，其特征在于所述發(fā)光底物液包括底物液A和底物液B，其配制包括以下步驟(1)、底物液A的配制用電子天平準確稱取BSA、Tris所需量，加入容量瓶，加適量雙蒸水，輕搖使之溶解完全，以雙蒸水定容，再用HCl調PH至9.0，用加樣器取H2O2加入上述液體中，混勻，將配制好的溶液按照規(guī)定量分裝到試劑瓶內，擰緊瓶蓋放在2～8℃保存?zhèn)溆茫?2)、底物液B的配制用電子天平準確稱取BSA、Tris所需量，加入容量瓶，加適量雙蒸水，輕搖使之溶解完全，以雙蒸水定容，再用HCl調PH至9.0，再用電子天平準確稱取魯米諾、對位碘酚倒入容量瓶，充分溶解、混勻，將配制好的溶液按照規(guī)定量分裝到試劑瓶內，擰緊瓶蓋，放在2～8℃保存?zhèn)溆谩?br> 7.如權利要求1所述的孕中期唐氏綜合征產前篩查試劑盒的使用方法，其特征在于所述使用方法包括以下步驟(1)AFP測定a、取出在冷藏環(huán)境中貯存的試劑，達到與室溫平衡的溫度；b、將濃縮洗滌液按1∶40的比例稀釋，搖勻備用，作為應用洗滌液；c、根據AFP標準品、質控品及待測標本確定所需孔數；d、AFP標準品、質控品直接取50ul加入相應孔內，用前搖勻；e、在待測標本孔中先分別加45ul標本稀釋液；f、取5ul血清加入已加標本稀釋液的孔內，用移液器吹打，孔內液體由綠色變?yōu)樗{色；g、每孔加入50ul AFP酶結合物，用振蕩器振蕩30秒鐘，蓋上封板膜，置37℃水浴1小時；h、洗板甩盡板中液體，用洗滌液注滿各孔，停留10秒后用力甩去，重復5次后拍干；i、加底物根據使用量，將底物液A和底物液B按1∶1充分混勻，每孔加入新配制的發(fā)光底物50ul，用振蕩器振蕩20秒，放入發(fā)光儀內，于5～20分鐘測量結果；(2)β-HCG測定a、取出在冷藏環(huán)境中貯存的試劑，達到與室溫平衡的溫度；b、將濃縮洗滌液按1∶40的比例稀釋，搖勻備用，作為應用洗滌液；c、根據β-HCG標準品、質控品及待測標本確定所需孔數；d、β-HCG標準品、質控品混勻后直接取50ul加入相應孔內；e、在待測標本孔中先分別加25ul標本稀釋液；f、取25ul血清加入已加標本稀釋液的孔內，用移液器吹打幾次，孔內液體由綠色變?yōu)樗{色；g、用振蕩器振蕩30秒鐘，蓋上封板膜，置37℃水浴1小時；h、洗板甩盡板中液體，用洗滌液注滿各孔，停留10秒后用力甩去，重復5次后拍干；i、孔加入50ulβ-HCG酶結合物，37℃水浴15分鐘，甩盡板中液體，用洗滌液注滿各孔，停留10秒后用力甩去，重復5次后拍干；j、加底物根據使用量，將底物液A和底物液B按1∶1充分混勻，每孔加入新配制的發(fā)光底物50ul，用振蕩器振蕩20秒鐘，放入發(fā)光儀內，于5～20分鐘測量結果。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種孕中期唐氏綜合征產前篩查試劑盒，試劑盒由AFP標準品、AFP單克隆抗體包被板條、AFP質控品、AFP酶結合物、β－HCG標準品、β－HCG單克隆抗體包被板條、β－HCG質控品、β－HCG酶結合物、標本稀釋液、濃縮洗滌液、發(fā)光底物液、封板膜，板架組成，應用單克隆抗體技術、酶標記技術和酶催化化學發(fā)光定量檢測技術，結合化學發(fā)光定量檢測儀，定量檢測孕婦血清中的AFP或β－HCG，然后采用專用數據分析處理軟件對數據進行處理，實現孕中期唐氏綜合征產前篩查的目的，由于應用了化學發(fā)光定量檢測技術，結果準確可靠，實現了無創(chuàng)傷性、安全、靈敏度高的產前篩查，本發(fā)明具有較高的市場推廣價值。
文檔編號G01N33/531GK101086500SQ200610044608
公開日2007年12月12日 申請日期2006年6月9日 優(yōu)先權日2006年6月9日
發(fā)明者楊致亭, 王愛香, 夏祥階, 孫明強, 王曉波 申請人:楊致亭