專(zhuān)利名稱(chēng)：一種快速微量檢測(cè)組織乙酰膽堿酯酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速微量檢測(cè)組織乙酰膽堿酯酶的方法。
背景技術(shù)：
乙酰膽堿酯酶水解碘化硫代乙酰膽堿(ATCh·I)生成硫代膽堿和乙酸，硫代膽堿與DTNB反應(yīng)生成5-巰基-2-硝基苯甲酸(TNB)黃色化合物，根據(jù)顏色深淺進(jìn)行比色定量(414nm)，水解產(chǎn)物硫代膽堿的數(shù)量可反應(yīng)膽堿酯酶活性的水平。在使用該方法中通常用組織勻漿液與乙酰膽堿碘化物水浴孵育一段時(shí)間后使用三氯乙酸(TCA)等終止劑終止反應(yīng)。局限性是一次可檢測(cè)樣品數(shù)量少、所需樣品體積大、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)且需要水浴鍋等實(shí)驗(yàn)設(shè)備，另外終止劑TCA極易潮解，配置時(shí)濃度不易準(zhǔn)確掌握，且TCA的使用影響最終顯色。本發(fā)明采用微量加樣及動(dòng)態(tài)讀數(shù)檢測(cè)法，不需要使用顯色終止劑，用酶反應(yīng)速率反應(yīng)組織中乙酰膽堿酯酶的活性。在96孔板中完成反應(yīng)及檢測(cè)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了對(duì)動(dòng)物組織乙酰膽堿酯酶的高通量、快速、微量的檢測(cè)。
技術(shù)方案下面以大鼠腦組織乙酰膽堿酯酶測(cè)定為例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行說(shuō)明1)稱(chēng)取約0.05克組織，按1∶10(質(zhì)量/體積)比例加入冰冷的勻漿緩沖液(20毫摩爾/升Tris·Cl，0.15毫摩爾/升NaCl，pH 7.4)，用玻璃勻漿器冰浴勻漿。
2)10000rpm，4℃離心30分鐘，取上清。
3)在96孔板中加入140微升磷酸鈉緩沖液(100毫摩爾/升，pH7.4)，30微升勻漿上清液，10微升7.6毫摩爾/升的DTNB溶液(用磷酸鈉緩沖液配制)，此為樣品組。相應(yīng)對(duì)照組中每孔加入160微升磷酸鈉緩沖液，30微升勻漿上清液，10微升7.6毫摩爾/升的DTNB溶液。各孔均用移液器吹打，使之充分混勻，室溫放置10分鐘。
4)設(shè)置于酶標(biāo)儀參數(shù)，動(dòng)態(tài)法測(cè)量414nm吸光度值，總讀數(shù)時(shí)間為3分鐘，每隔20秒讀數(shù)一次，每次讀數(shù)之前震動(dòng)5秒。
5)步驟3)到時(shí)間后，用排槍向樣品組每孔同時(shí)加入20微升30毫摩爾/升碘化硫代乙酰膽堿(用磷酸鈉緩沖液配制)，馬上進(jìn)行讀數(shù)。
6)另取20微升上清勻漿液，稀釋25倍，取100微升進(jìn)行蛋白定量。
7)結(jié)果以(樣品組每分鐘吸光度變化值-相應(yīng)對(duì)照組每分鐘吸光度變化值)/毫克蛋白表示。
特征1、采用動(dòng)態(tài)法檢測(cè)，顯色不受終止劑的干擾，且孵育時(shí)間大大縮短；2、反應(yīng)直接在96孔板中進(jìn)行，縮短了檢測(cè)周期；3、采用微量加樣法，所需樣品及試劑消耗減少。
權(quán)利要求
1.一種快速微量檢測(cè)組織乙酰膽堿酯酶的方法。其特征在于，該方法按下列步驟順序進(jìn)行(以小鼠肝臟乙酰膽堿酯酶測(cè)定為例)1)稱(chēng)取約0.05克組織，按1∶10(質(zhì)量/體積)比例加入冰冷的勻漿緩沖液(20毫摩爾/升Tris·Cl，0.15毫摩爾/升NaCl，pH7.4)，用玻璃勻漿器冰浴勻漿。2)10000rpm，4℃離心30分鐘，取上清。3)在96孔板中加入140微升磷酸鈉緩沖液(100毫摩爾/升，pH 7.4)，30微升勻漿上清液，10微升7.6毫摩爾/升的DTNB溶液(用磷酸鈉緩沖液配制)，此為樣品組。相應(yīng)對(duì)照組中每孔加入160微升磷酸鈉緩沖液，30微升勻漿上清液，10微升7.6毫摩爾/升的DTNB溶液。各孔均用移液器吹打，使之充分混勻，室溫放置10分鐘。4)設(shè)置于酶標(biāo)儀參數(shù)，動(dòng)態(tài)法測(cè)量414nm吸光度值，總讀數(shù)時(shí)間為3分鐘，每隔20秒讀數(shù)一次，每次讀數(shù)之前震動(dòng)5秒。5)步驟3)到時(shí)間后，用排槍向樣品組每孔同時(shí)加入20微升30毫摩爾/升碘化硫代乙酰膽堿(用磷酸鈉緩沖液配制)，馬上進(jìn)行讀數(shù)。6)另取20微升上清勻漿液，稀釋25倍，取100微升進(jìn)行蛋白定量。7)結(jié)果以(樣品組每分鐘吸光度變化值—相應(yīng)對(duì)照組每分鐘吸光度變化值)/毫克蛋白表示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織乙酰膽堿酯酶的檢測(cè)方法，其特征在于采用動(dòng)態(tài)法檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)組織乙酰膽堿酯酶的方法，其特征在于采用微量加樣法，所需樣品及試劑消耗減少。
全文摘要
一種快速微量檢測(cè)組織乙酰膽堿酯酶的方法。在96孔板中加入140微升磷酸鈉緩沖液，30微升勻漿上清液，10微升7.6毫摩爾/升的DTNB溶液。動(dòng)態(tài)法測(cè)量414nm吸光度值，總讀數(shù)時(shí)間為3分鐘，每隔20秒讀數(shù)一次，每次讀數(shù)之前震動(dòng)5秒，再加入20微升30毫摩爾/升碘化硫代乙酰膽堿(用磷酸鈉緩沖液配制)，馬上進(jìn)行讀數(shù)。本發(fā)明采用動(dòng)態(tài)法檢測(cè)，顯色不受終止劑的干擾，且反應(yīng)直接在96孔板中進(jìn)行，縮短了檢測(cè)周期；采用微量加樣法，所需樣品及試劑消耗減少。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1818654SQ200610049808
公開(kāi)日2006年8月16日 申請(qǐng)日期2006年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月14日
發(fā)明者朱欣, 劉慧剛, 徐立紅 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)