專利名稱：多簇抗原及制備方法、寬譜特異性多克隆抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于小分子化合物(分子量小于1000道爾頓)免疫化學(xué)和殘留分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多簇抗原及制備方法、以及一種多克隆抗體及其用途。
背景技術(shù)：
目前用于免疫化學(xué)分析的抗體主要是單克隆抗體和多克隆抗體兩類，大多是針對單一目標(biāo)化合物的檢測，有很高的專一性和特異性。但對于農(nóng)藥、獸藥等小分子化合物多殘留分析，免疫學(xué)方法通常有兩種途徑，一種是先針對不同的農(nóng)藥等小分子化合物，分別制備相應(yīng)的特異性抗體，然后將這些抗體一起使用，可同時檢測多種農(nóng)藥等小分子化合物。另一種方法是針對一類農(nóng)藥等小分子化合物同系物的共性結(jié)構(gòu)來設(shè)計和合成半抗原，從而得到對于特定的一類(或其中幾種)化合物都具有識別和檢測能力的抗體，即具有寬譜特異性(broad specificity)。
目前用于農(nóng)藥、毒品等小分子化合物多殘留分析的免疫技術(shù)多為針對同系物的母核結(jié)構(gòu)而設(shè)計的半抗原來制備針對同類化合物的寬譜特異性抗體。該方法在增加識別范圍的同時，檢測靈敏度卻有所下降，而且該類抗體的識別范圍預(yù)先不能確定。另外，該方法在對不同結(jié)構(gòu)類型的化合物多殘留檢測上的應(yīng)用受到了限制，至今還未見相關(guān)文獻(xiàn)報道一種抗體可同時識別多種不同結(jié)構(gòu)類別的小分子化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種寬譜特異性多克隆抗體，該多克隆抗體能用于快速、簡便地同時檢測出樣品中的多種相同或不同結(jié)構(gòu)類別的殘留小分子化合物，本發(fā)明還提供了用于制備該多克隆抗體的多簇抗原以及該多簇抗原的制備方法。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的全新思路為在合成小分子化合物半抗原的基礎(chǔ)上，設(shè)計并將不同種類的小分子化合物半抗原分子偶聯(lián)到同一載體蛋白分子上，制備得到含多個抗原決定簇的人工抗原(簡稱多簇抗原)，再將該多簇抗原免疫動物制備出同時抗對應(yīng)多種化合物的寬譜特異性多克隆抗體，從而建立適用于小分子化合物多殘留快速檢測的酶聯(lián)免疫吸附測定方法。具體如下本發(fā)明提供一種多簇抗原的制備方法，選用2～15種不同的小分子化合物半抗原，以蛋白質(zhì)分子為載體，依次進(jìn)行以下步驟1)、在蛋白質(zhì)分子上通過偶聯(lián)方法偶聯(lián)上一種小分子化合物半抗原分子，進(jìn)行透析純化；2)、以上述步驟所得的產(chǎn)物為載體，繼續(xù)偶聯(lián)另一種小分子化合物半抗原分子，再進(jìn)行透析純化；3)、重復(fù)步驟2)直至偶聯(lián)完所有的小分子化合物半抗原。
作為本發(fā)明的多簇抗原的制備方法的改進(jìn)蛋白質(zhì)分子為牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清蛋白(HSA)或鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)的分子。
作為本發(fā)明的多簇抗原的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)偶聯(lián)方法為碳二亞胺法、混合酸酐法、重氮化法或戊二醛法。
作為本發(fā)明的多簇抗原的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)小分子化合物半抗原為農(nóng)藥小分子化合物半抗原、獸藥小分子化合物半抗原、環(huán)境小分子有機(jī)污染物半抗原或毒品/興奮劑小分子化合物半抗原。農(nóng)藥可選用有機(jī)磷類農(nóng)藥、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥、有機(jī)雜環(huán)類農(nóng)藥、除草劑類農(nóng)藥或殺菌劑類農(nóng)藥等，獸藥可選用氯霉素、克侖特羅、非諾特羅、特布他林、沙丁醇胺、四環(huán)素、土霉素、金霉素、二甲胺四環(huán)素、氨苯磺胺、磺胺二甲基嘧啶、磺胺嘧啶、睪酮、雌二醇或雌酮等等，毒品/興奮劑可選用嗎啡、可卡因、大麻、海洛因、甲基苯丙胺等等。進(jìn)一步說有機(jī)磷類農(nóng)藥選用甲基對硫磷、乙基對硫磷、甲胺磷、三唑磷、甲基毒死蜱、毒死蜱、二嗪磷、倍硫磷等等；擬除蟲菊酯類農(nóng)藥選用苯醚菊酯、氯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氰戊菊酯、S-氰戊菊酯等等；氨基甲酸酯類農(nóng)藥選用克百威、丁硫克百威、丙硫百克威等等；苯甲酰脲類農(nóng)藥選用氟啶脲、氟苯脲、氟鈴脲、除蟲脲等等；有機(jī)雜環(huán)類農(nóng)藥選用吡蟲啉、氟蟲腈、噻嗪酮、噻蟲醛、蟲螨腈等等；除草劑類農(nóng)藥選用2甲4氯、二氯喹啉酸、乙草胺、綠磺隆、甲磺隆、丙苯磺隆、醚唑磺隆等等；殺菌劑類農(nóng)藥選用百菌清、福美雙、腈菌唑、三唑酮、三唑醇等等。
本發(fā)明還提供了依照上述制備方法所制得的多簇抗原。
本發(fā)明還提供了利用上述多簇抗原所制得的寬譜特異性多克隆抗體。
本發(fā)明還提供了上述寬譜特異性多克隆抗體的用途用于對含有所述小分子化合物的樣品進(jìn)行檢測。
本發(fā)明所獲得的多簇抗原(即多抗原決定簇人工抗原)是用作動物免疫的抗原體系的原料。
本發(fā)明所獲得的多克隆抗體為寬譜特異性多克隆抗體，能利用該抗體可用于小分子化合物(如農(nóng)藥、獸藥、環(huán)境有機(jī)污染物和毒品/興奮劑等)多殘留快速檢測的免疫吸附分析方法及試劑盒的研究。
本發(fā)明涉及的寬譜特異性多克隆抗體，是通過如下方法實現(xiàn)的選用8-10周大，體重為2-3公斤左右，健康的雄性家兔。實驗免疫劑量基礎(chǔ)免疫為0.25～2.0mg/kg，加強(qiáng)免疫劑量為0.5～4.0mg/kg。用生理鹽水分別稀釋適量人工抗原復(fù)合物，加入等體積弗氏完全佐劑，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多點注射與大腿肌肉注射相結(jié)合的方法?；A(chǔ)免疫后3～4周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，以后每隔2周再次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫時采用弗氏不完全佐劑。從第三次免疫開始，每次免疫后第8～10天，從兔子心臟或耳緣靜脈采血，測定效價和特異性。待免疫血清效價合格后，就進(jìn)行采血。
本實驗采用心臟取血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后，放置于37℃溫箱中半小時，待收集在血清瓶中的血液凝固后，用接種針沿血清瓶邊緣將血塊與玻璃瓶壁脫離，再放到4℃下過夜，待血塊收縮后，用吸管將血清吸入試管中，離心(4000rpm，15分鐘，4℃下)分離出血清?？寡寮兓话悴捎眯了?硫酸銨鹽析法，也可采用蛋白A柱層析法。辛酸-硫酸銨鹽析法是一個經(jīng)典的方法。辛酸在偏酸性的條件下能將血清中除IgG以外的蛋白質(zhì)都沉淀下來中，上清中只有IgG。純化后的抗體溶液經(jīng)低溫冷凍干燥制的凍干粉，-20℃下保存。該抗體能與對應(yīng)結(jié)合到免疫原上2～15種的小分子化合物或其半抗原分子全部或其中部分形成特異性結(jié)合。該抗體用途，是用作小分子化合物的多殘留免疫化學(xué)分析方法及其試劑盒的研究與開發(fā)。
本發(fā)明依靠免疫學(xué)、免疫化學(xué)基本原理和生物技術(shù)手段，將含有胺基、羥基、羧基、巰基等活性基團(tuán)的小分子目標(biāo)分析物半抗原與載體蛋白質(zhì)逐一偶聯(lián)，制備有效多簇人工抗原，免疫動物制備對相應(yīng)小分子分析物特異性抗體，利用抗原抗體的特異性免疫學(xué)反應(yīng)和易被檢測識別的標(biāo)記物的放大作用，定量地檢測樣本中多種超微量小分子目標(biāo)分析物，具有特異、靈敏、準(zhǔn)確、快速、方便、廉價等特點。
利用本發(fā)明可以對不同類別的小分子化合物采用同一種簡便的方法進(jìn)行快速多殘留檢測，而無須像目前通行的殘留檢測方法一樣要進(jìn)行分類處理后才可檢測；還可以根據(jù)檢驗任務(wù)的需要，通過抗原的預(yù)先設(shè)計，有目的的制備出能夠識別需要檢測的對象的寬譜特異性抗體來構(gòu)建ELISA分析方法，從而滿足不同作物、特殊產(chǎn)品(如進(jìn)出口產(chǎn)品)檢驗任務(wù)的需要，節(jié)約財力、物力，大幅度提高工作效率。這對農(nóng)藥、獸藥、興奮劑、毒品和小分子環(huán)境有機(jī)污染物(POPs、環(huán)境內(nèi)激素等)多殘留免疫檢測技術(shù)研究與應(yīng)用具有重要的價值。
具體實施例方式
實施例1、所用的半抗原為乙基對硫磷半抗原(PA)、氰戊菊酯半抗原(JU)，結(jié)構(gòu)式如下 免疫原JU-BSA-PA的制備(1)、免疫原的合成利用碳二亞胺法將80微摩爾有機(jī)磷農(nóng)藥乙基對硫磷的半抗原化合物PA溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)，離心，取上清液100～800μL緩慢加入到4～8mL10～20mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)1～6小時，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然后用生理鹽水透析，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?br> (2)、以上述步驟所得的產(chǎn)物為載體，采用同樣的方法繼續(xù)偶聯(lián)另一種小分子化合物半抗原分子JU，再進(jìn)行透析純化；分裝，于-20℃下保存。
具體為將80微摩爾擬除蟲菊酯類農(nóng)藥氰戊菊酯的半抗原化合物JU溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)，離心，取上清液100～800μL緩慢加入到4～8ml含10～20mg/mLPA-BSA的碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)1～6小時，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然后用生理鹽水透析，分裝，于-20℃下保存。
包被抗原的合成與純化包被抗原的合成利用混合酸酐法。將80微摩爾有機(jī)磷農(nóng)藥乙基對硫磷的半抗原化合物PA與80微摩爾擬除蟲菊酯類農(nóng)藥氰戊菊酯的半抗原化合物JU分別溶解在2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，分別加入等當(dāng)量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室溫下反應(yīng)1～2小時，反應(yīng)液100～800μL分別加入到5～10mL10～20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)1～4小時，然后分別裝入透析袋，先分別用蒸餾水透析1～4次，然后用分別用生理鹽水透析，分裝，于-20℃下保存。
人工抗原的鑒定按照合成免疫原和包被抗原時反應(yīng)物和產(chǎn)物的比例，分別取反應(yīng)物和產(chǎn)物進(jìn)行紫外(200nm～400nm)掃描。
經(jīng)計算半抗原與蛋白質(zhì)的結(jié)合比如下PA∶JU∶BSA＝6.4∶8.7∶1；JU∶OVA＝5.3∶1；PA∶OVA＝7.2∶1。
免疫動物制備抗血清實驗選用8-10周大，體重為2-3公斤，健康的雄性家兔。免疫三只兔子。實驗免疫劑量基礎(chǔ)免疫為0.25～2.0mg/kg，加強(qiáng)免疫劑量為0.5～4.0mg/kg，用生理鹽水分別稀釋適量人工抗原復(fù)合物，加入等體積弗氏完全佐劑，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多點注射與大腿肌肉注射相結(jié)合的方法。3～4周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，以后每隔2周再次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫時采用弗氏不完全佐劑。從第三次免疫開始，每次免疫后第8～10天，從兔子心臟或耳緣靜脈采血，測定效價和特異性。待免疫血清效價合格后，就進(jìn)行采血。
本實驗采用心臟取血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后，放置于37℃溫箱中半小時，待收集在血清瓶中的血液凝固后，用接種針沿血清瓶邊緣將血塊與玻璃瓶壁脫離，再放到4℃下過夜，待血塊收縮后，用吸管將血清吸入試管中，離心(4000rpm，15分鐘，4℃)分離出血清。
抗血清效價測定按常規(guī)方法免疫兔子。從加強(qiáng)免疫第二次開始，在每次免疫后第8天于兔子耳緣靜脈采血，血清經(jīng)適當(dāng)稀釋后用間接ELISA測定效價，半抗原-OVA結(jié)合物包被濃度均為10ug/ml。末免后采全血，抗血清的對PA和JU的效價分別為1∶89600、1∶12800。
抗體的純化與鑒定一般采用辛酸-硫酸銨鹽析法，也可采用蛋白A柱層析法。辛酸-硫酸銨鹽析法是一個經(jīng)典的方法。辛酸在偏酸性的條件下能將血清中除IgG以外的蛋白質(zhì)都沉淀下來中，上清中只有IgG。辛酸加入因抗體的來源不同而不同，人血清為70ul/ml，兔血清為75ul/ml，小鼠血清為40ul/ml，小鼠腹水為33ul/ml。這種方法IgG的回收率達(dá)90％以上。
最佳抗體工作濃度和包被抗原復(fù)合物濃度的確定用方陣滴定法確定最佳抗體工作濃度和包被抗原復(fù)合物濃度(間接ELISA法)，同時稀釋抗體和固相抗原包被液。在同一包被濃度下，隨著抗體的稀釋，所得的OD值呈下降趨勢，同樣在同一抗體稀釋濃度下，隨著包被濃度的下降，所得OD值也呈下降趨勢。通常選擇OD值1.0左右時的抗體和包被抗原濃度作為工作濃度。從實驗可知，當(dāng)抗體0.4μg·mL-1，包被抗原PA-OVA濃度為0.6μg·mL-1時OD值約等于1.0；當(dāng)抗體為1.5μg·mL-1，包被抗原JU-OVA濃度為4.0μg·mL-1時，OD值約等于1.0。
標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測靈敏度將PA-OVA或JU-OVA偶聯(lián)復(fù)合物，用包被液稀釋至各自的工作濃度包被96孔微量反應(yīng)板。每孔加入上述包被液100μL，于37℃溫箱中孵育2h。甩掉包被液，用PBST緩沖液洗滌，每孔加入封閉液300μL，于37℃溫箱中孵育0.5h。甩掉封閉液，用PBST緩沖液洗滌，加入預(yù)先配制的氰戊菊酯(或乙基對硫磷)各濃度標(biāo)準(zhǔn)液50μL/孔，每濃度3孔重復(fù)，再加入預(yù)先配制的抗體稀釋液(PA-OVA包被孔加抗體0.8μg·mL-1，JU-OVA包被孔加抗體3.0μg·mL-1)50μL/孔，設(shè)不加藥對照和無抗體空白對照。加入預(yù)先以PBS稀釋1000倍的酶標(biāo)二抗(goat anti-rabbit IgG-HRP)100μL/孔，放入37℃溫箱中孵育1h，甩去孔內(nèi)液體，用PBST溶液洗滌。加入OPD-過氧化氫底物溶液100μL/孔，37℃溫箱中孵育15min后加入2mol/L H2SO450μL/孔終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測定490nm波長下的吸光值。根據(jù)抑制與農(nóng)藥濃度之間的半對數(shù)關(guān)系作圖即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。
ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線以抑制率與農(nóng)藥濃度的半對數(shù)曲線表示，抑制率以下式計算 式中ODmax為不加藥時的吸光值，ODx為農(nóng)藥x時的吸光值，ODmin為無抗體空白對照孔的吸光值。
由上述公式計算得農(nóng)藥各濃度的抑制率，作圖。氰戊菊酯在10-2000μg·L-1范圍內(nèi)，抑制率與氰戊菊酯濃度的對數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r＝0.9781，抑制率為50％時氰戊菊酯的濃度(I50)為417.4μg·L-1，最低檢測限[抑制率為10％時氰戊菊酯的濃度(I10)]為23.3μg·L-1；乙基對硫磷在16-2000μg·L-1范圍內(nèi)，抑制率與乙基對硫磷濃度的對數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r＝0.9673，抑制率為50％時乙基對硫磷的濃度(I50)為893.6μg·L-1，最低檢測限[抑制率為10％時乙基對硫磷的濃度(I10)]為41.3μg·L-1。
實施例2、所用的半抗原為乙基對硫磷半抗原(PA)、克百威半抗原(BFNB)，結(jié)構(gòu)式如下 免疫原PA-BSA-BFNB的制備(1)、免疫原的合成利用碳二亞胺法將80微摩爾氨基甲酸酯類農(nóng)藥克百威的半抗原化合物BFNB溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)，離心，取上清液100～800μL緩慢加入到4～8ml含10～20mg/mL BFNB-BSA的碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)1～6小時，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然后用生理鹽水透析，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?br> (2)、以上述步驟所得的產(chǎn)物為載體，采用同樣的方法繼續(xù)偶聯(lián)另一種小分子化合物半抗原分子BFNB，再進(jìn)行透析純化；分裝，于-20℃下保存。
具體為將80微摩爾有機(jī)磷類農(nóng)藥乙基對硫磷的半抗原化合物PA溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)，離心，取上清液100～800μL緩慢加入到4～8ml含10～20mg/mL的BFNB-BSA結(jié)合物的碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)1～6小時，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然后用生理鹽水透析，分裝，于-20℃下保存。
包被抗原的合成與純化包被抗原的合成利用混合酸酐法。將80微摩爾氨基甲酸酯類農(nóng)藥克百威的半抗原化合物BFNB溶解在2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室溫下反應(yīng)1～2小時，反應(yīng)液100～800μL加入到5～10mL10～20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)1～4小時，然后分別裝入透析袋，先分別用蒸餾水透析1～4次，然后用生理鹽水透析，分裝，于-20℃下保存。
人工抗原的鑒定按照合成免疫原和包被抗原時反應(yīng)物和產(chǎn)物的比例，分別取反應(yīng)物和產(chǎn)物進(jìn)行紫外(200nm～400nm)掃描。
經(jīng)計算半抗原與蛋白質(zhì)的結(jié)合比如下PA∶BFNB∶BSA＝6.1∶7.9∶1；BFNB∶OVA＝8.3∶1。
免疫動物制備抗血清實驗選用8-10周大，體重為2-3公斤，健康的雄性家兔。免疫三只兔子。實驗免疫劑量基礎(chǔ)免疫為0.25～2.0mg/kg，加強(qiáng)免疫劑量為0.5～4.0mg/kg，用生理鹽水分別稀釋適量人工抗原復(fù)合物，加入等體積弗氏完全佐劑，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多點注射與大腿肌肉注射相結(jié)合的方法。3～4周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，以后每隔2周再次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫時采用弗氏不完全佐劑。從第三次免疫開始，每次免疫后第8～10天，從兔子心臟或耳緣靜脈采血，測定效價和特異性。待免疫血清效價合格后，就進(jìn)行采血。
本實驗采用心臟取血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后，放置于37℃溫箱中半小時，待收集在血清瓶中的血液凝固后，用接種針沿血清瓶邊緣將血塊與玻璃瓶壁脫離，再放到4℃下過夜，待血塊收縮后，用吸管將血清吸入試管中，離心(4000rpm，15分鐘，4℃下)分離出血清。
抗血清效價測定按常規(guī)方法免疫兔子。從加強(qiáng)免疫第二次開始，在每次免疫后第8天于兔子耳緣靜脈采血，血清經(jīng)適當(dāng)稀釋后用間接ELISA測定效價，半抗原-OVA結(jié)合物包被濃度均為10ug/ml。末免后采全血，抗血清的對PA和BFNB的效價分別為1∶51200、1∶47400。
抗體的純化與鑒定一般采用辛酸-硫酸銨鹽析法，也可采用蛋白A柱層析法。辛酸-硫酸銨鹽析法是一個經(jīng)典的方法。辛酸在偏酸性的條件下能將血清中除IgG以外的蛋白質(zhì)都沉淀下來中，上清中只有IgG。辛酸加入因抗體的來源不同而不同，人血清為70ul/ml，兔血清為75ul/ml，小鼠血清為40ul/ml，小鼠腹水為33ul/ml。這種方法IgG的回收率達(dá)90％以上。
最佳抗體工作濃度和包被抗原復(fù)合物濃度的確定用方陣滴定法確定最佳抗體工作濃度和包被抗原復(fù)合物濃度(間接ELISA法)，同時稀釋抗體和固相抗原包被液。在同一包被濃度下，隨著酶標(biāo)抗體的稀釋，所得的OD值呈下降趨勢，同樣在同一抗體稀釋濃度下，隨著包被濃度的下降，所得OD值也呈下降趨勢。通常選擇OD值1.0左右時的抗體和包被抗原濃度作為工作濃度。從實驗可知，當(dāng)抗體0.5μg·mL-1，包被抗原PA-OVA濃度為1.0μg·mL-1時OD值約等于1.0；當(dāng)抗體為0.8μg·mL-1，包被抗原BFNB-OVA濃度為0.8μg·mL-1時，OD值約等于1.0。
標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測靈敏度將PA-OVA或BFNB-OVA偶聯(lián)復(fù)合物，用包被液稀釋至各自的工作濃度包被96孔微量反應(yīng)板。每孔加入上述包被液100μL，于37℃溫箱中孵育2h。甩掉包被液，用PBST緩沖液洗滌，每孔加入封閉液300μL，于37℃溫箱中孵育0.5h。甩掉封閉液，用PBST緩沖液洗滌，加入預(yù)先配制的克百威(或乙基對硫磷)各濃度標(biāo)準(zhǔn)液50μL/孔，每濃度3孔重復(fù)，再加入預(yù)先配制的抗體稀釋液(PA-OVA包被孔加抗體1.0μg·mL-1，BFNB-OVA包被孔加抗體1.6μg·mL-1)50μL/孔，設(shè)不加藥對照和無抗體空白對照。加入預(yù)先以PBS稀釋1000倍的酶標(biāo)二抗(goat anti-rabbitIgG-HRP)100μL/孔，放入37℃溫箱中孵育1h，甩去孔內(nèi)液體，用PBST溶液洗滌。加入OPD-過氧化氫底物溶液100μL/孔，37℃溫箱中孵育15min后加入2mol/LH2SO450μL/孔終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測定490nm波長下的吸光值。根據(jù)抑制與農(nóng)藥濃度之間的半對數(shù)關(guān)系作圖即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。
ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線以抑制率與農(nóng)藥濃度的半對數(shù)曲線表示，抑制率以下式計算 式中ODmax為不加藥時的吸光值，ODx為農(nóng)藥x時的吸光值，ODmin為無抗體空白對照孔的吸光值。
由上述公式計算得農(nóng)藥各濃度的抑制率，作圖?？税偻?6-1000μg·L-1范圍內(nèi)，抑制率與克百威濃度的對數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r＝0.9733，抑制率為50％時克百威的濃度(I50)為349.8μg·L-1，最低檢測限[抑制率為10％時克百威的濃度(I10)]為19.8μg·L-1；乙基對硫磷在16-2000μg·L-1范圍內(nèi)，抑制率與乙基對硫磷濃度的對數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r＝0.9814，抑制率為50％時乙基對硫磷的濃度(I50)為763.7μg·L-1，最低檢測限[抑制率為10％時乙基對硫磷的濃度(I10)]為62.9μg·L-1。
實施例3、所用的半抗原為三唑磷半抗原(THBu)、毒死蜱半抗原(DSP)和克百威半抗原(BFNB)，結(jié)構(gòu)式如下 免疫原 的制備(1)、BSA-DSP結(jié)合物的制備將80微摩爾有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱的半抗原化合物DSP溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)，離心，取上清液100～800μL緩慢加入到4～8mL10～20mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)1～6小時，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然后用生理鹽水透析，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?br> (2)、以上述步驟所得的產(chǎn)物為載體，采用同樣的方法繼續(xù)偶聯(lián)另一種小分子化合物半抗原分子BFNB，再進(jìn)行透析純化；于-20℃下保存?zhèn)溆谩?br> DSP-BSA-BFNB結(jié)合物的制備具體為將80微摩爾氨基甲酸酯類農(nóng)藥克白威的半抗原化合物BFNB溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)，離心，取上清液100～800μL緩慢加入到4～8mL含10～20mg/mL的DSP-BSA結(jié)合物的碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)1～6小時，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然后用生理鹽水透析，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?br> (3)、重復(fù)步驟(2)，偶聯(lián)上第三種小分子化合物半抗原分子THBu，再進(jìn)行透析純化，分裝，于-20℃下保存。
結(jié)合物的制備具體為將80微摩爾有機(jī)磷農(nóng)藥三唑磷的半抗原化合物THBu溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)，離心，取上清液100～800μL緩慢加入到4～8mL含10～20mg/mL的DSP-BSA-BFNB結(jié)合物的碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)1～6小時，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然后用生理鹽水透析，分裝，于-20℃下保存。
包被抗原的合成與純化包被抗原的合成利用混合酸酐法。將80微摩爾有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱的半抗原化合物DSP與80微摩爾三唑磷的半抗原化合物THBu分別溶解在2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，分別加入等當(dāng)量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室溫下反應(yīng)1～2小時，取反應(yīng)液100～800μL分別加入到5～10mL10～20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)1～4小時，分別然后裝入透析袋，先用蒸餾水透析1～4次，然后用生理鹽水透析，分別分裝，于-20℃下保存。
人工抗原的鑒定按照合成免疫原和包被抗原時反應(yīng)物和產(chǎn)物的比例，分別取反應(yīng)物和產(chǎn)物進(jìn)行紫外(200nm～400nm)掃描。
經(jīng)計算半抗原與蛋白質(zhì)的結(jié)合比如下DSP∶BFNB∶THBu∶BSA＝7.4∶5.8∶6.3∶1；DSP∶OVA＝9.8∶1；THBu∶OVA＝11.7∶1免疫動物制備抗血清實驗選用8-10周左右，體重為2-3公斤，健康的雄性家兔。實驗免疫劑量基礎(chǔ)免疫為0.25～2.0mg/kg，加強(qiáng)免疫劑量為0.5～4.0mg/kg，用生理鹽水分別稀釋適量人工抗原復(fù)合物，加入等體積弗氏完全佐劑，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多點注射與大腿肌肉注射相結(jié)合的方法。3～4周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，以后每隔2周再次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫時采用弗氏不完全佐劑。從第三次免疫開始，每次免疫后第8～10天，從兔子心臟或耳緣靜脈采血，測定效價和特異性。待免疫血清效價合格后，就進(jìn)行采血。
本實驗采用心臟取血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后，放置于37℃溫箱中半小時，待收集在血清瓶中的血液凝固后，用接種針沿血清瓶邊緣將血塊與玻璃瓶壁脫離，再放到4℃下過夜，待血塊收縮后，用吸管將血清吸入試管中，離心(4000rpm，15分鐘，4℃下)分離出血清。
抗血清效價測定按常規(guī)方法免疫兔子。從加強(qiáng)免疫第二次開始，在每次免疫后第8天于兔子耳緣靜脈采血，血清經(jīng)適當(dāng)稀釋后用間接ELISA測定效價，半抗原-OVA結(jié)合物包被濃度均為10ug/ml。末免后采全血，抗血清的對DSP、THBu和BFNB的效價分別為1∶18600、1∶24600、1∶89800。
抗體的純化與鑒定一般采用辛酸-硫酸銨鹽析法，也可采用蛋白A柱層析法。辛酸-硫酸銨鹽析法是一個經(jīng)典的方法。辛酸在偏酸性的條件下能將血清中除IgG以外的蛋白質(zhì)都沉淀下來中，上清中只有IgG。辛酸加入因抗體的來源不同而不同，人血清為70ul/ml，兔血清為75ul/ml，小鼠血清為40ul/ml，小鼠腹水為33ul/ml。這種方法IgG的回收率達(dá)90％以上。
最佳抗體工作濃度和包被抗原復(fù)合物濃度的確定用方陣滴定法確定最佳抗體工作濃度和包被抗原復(fù)合物濃度(間接ELISA法)，同時稀釋抗體和固相抗原包被液。在同一包被濃度下，隨著酶標(biāo)抗體的稀釋，所得的OD值呈下降趨勢，同樣在同一抗體稀釋濃度下，隨著包被濃度的下降，所得OD值也呈下降趨勢。通常選擇OD值1.0左右時的抗體和包被抗原濃度作為工作濃度。從實驗可知，當(dāng)抗體1.0μg·mL-1，包被抗原THBu-OVA濃度為5.0μg·mL-1時OD值約等于1.0；當(dāng)抗體為0.6μg·mL-1，包被抗原BFNB-OVA濃度為0.6μg·mL-1時，OD值約等于1.0；當(dāng)抗體為0.1μg·mL-1，包被抗原DSP-OVA濃度為3.0μg·mL-1時，OD值約等于1.0。
標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測靈敏度將THBu-OVA或BFNB-OVA或DSP-OVA偶聯(lián)復(fù)合物，用包被液稀釋至各自的工作濃度包被96孔微量反應(yīng)板。每孔加入上述包被液100μL，于37℃溫箱中孵育2h。甩掉包被液，用PBST緩沖液洗滌，每孔加入封閉液300μL，于37℃溫箱中孵育0.5h。甩掉封閉液，用PBST緩沖液洗滌，加入預(yù)先配制的克百威(或三唑磷、毒死蜱)各濃度標(biāo)準(zhǔn)液50μL/孔，每濃度3孔重復(fù)，再加入預(yù)先配制的抗體稀釋液(THBu-OVA包被孔加抗體2.0μg·mL-1，BFNB-OVA包被孔加抗體1.2μg·mL-1；DSP-OVA包被孔加抗體0.2μg·mL-1)50μL/孔，設(shè)不加藥對照和無抗體空白對照。加入預(yù)先以PBS稀釋1000倍的酶標(biāo)二抗(goat anti-rabbit IgG-HRP)100μL/孔，放入37℃溫箱中孵育1h，甩去孔內(nèi)液體，用PBST溶液洗滌。加入OPD-過氧化氫底物溶液100μL/孔，37℃溫箱中孵育15min后加入2mol/L H2SO450μL/孔終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測定490nm波長下的吸光值。根據(jù)抑制與農(nóng)藥濃度之間的半對數(shù)關(guān)系作圖即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。
ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線以抑制率與農(nóng)藥濃度的半對數(shù)曲線表示，抑制率以下式計算 式中ODmax為不加藥時的吸光值，ODx為農(nóng)藥x時的吸光值，ODmin為無抗體空白對照孔的吸光值。
由上述公式計算得農(nóng)藥各濃度的抑制率，作圖。在毒死蜱1-500μg·L-1范圍內(nèi)，抑制率與毒死蜱濃度的對數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r＝0.9813，抑制率為50％時毒死蜱的濃度(I50)為62.9μg·L-1，最低檢測限[抑制率為10％時毒死蜱的濃度(I10)]為1.5μg·L-1；三唑磷在1-500μg·L-1范圍內(nèi)，抑制率與三唑磷濃度的對數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r＝0.9814，抑制率為50％時三唑磷的濃度(I50)為69.0μg·L-1，最低檢測限[抑制率為10％時三唑磷的濃度(I10)]為5.1μg·L-1；克百威在10-1000μg·L-1范圍內(nèi)，抑制率與克百威濃度的對數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r＝0.9793，抑制率為50％時克百威的濃度(I50)為395.8μg·L-1，最低檢測限[抑制率為10％時克百威的濃度(I10)]為18.9g·L-1。
實施例4、所用的半抗原為乙基對硫磷半抗原(PA)、氰戊菊酯半抗原(JU)、克百威半抗原(BFNB)和毒死蜱半抗原(DSP)，結(jié)構(gòu)式如下 免疫原 的制備(1)、將80微摩爾有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱的半抗原化合物DSP溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)，離心，取上清液100～800μL緩慢加入到4～8mL10～20mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)1～6小時，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然后用生理鹽水透析，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?br> (2)、以上述步驟所得的產(chǎn)物為載體，采用同樣的方法繼續(xù)偶聯(lián)另一種小分子化合物半抗原分子BFNB，再進(jìn)行透析純化；分裝，于-20℃下保存。
DSP-BSA-BFNB結(jié)合物的制備具體為將80微摩爾氨基甲酸酯類農(nóng)藥克白威的半抗原化合物BFNB溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)，離心，取上清液100～800μL緩慢加入到4～8mL含10～20mg/mL的DSP-BSA結(jié)合物的碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)1～6小時，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然后用生理鹽水透析，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?br> (3)、重復(fù)步驟(2)，依次再偶聯(lián)上小分子化合物半抗原分子THBu和PA，再進(jìn)行透析純化，分裝，于-20℃下保存。
DSP-BSA-BFNB-JU結(jié)合物的制備具體為將80微摩爾有機(jī)磷農(nóng)藥三唑磷的半抗原化合物THBu溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)，離心，取上清液100～800μL緩慢加入到4～8mL含10～20mg/mL的DSP-BSA-BFNB結(jié)合物的碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)1～6小時，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然后用生理鹽水透析，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?br> PA-DSP-BSA-BFNB-JU結(jié)合物的制備具體為將80微摩爾有機(jī)磷農(nóng)藥乙基對硫磷的半抗原化合物PA溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入等當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應(yīng)，離心，取上清液100～800μL緩慢加入到4～8mL含10～20mg/mL DSP-BSA-BFNB-JU結(jié)合物的碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)1～6小時，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然后用生理鹽水透析，分裝，于-20℃下保存。
人工抗原的鑒定按照合成免疫原和包被抗原時反應(yīng)物和產(chǎn)物的比例，分別取反應(yīng)物和產(chǎn)物進(jìn)行紫外(200nm～400nm)掃描。
經(jīng)計算半抗原與蛋白質(zhì)的結(jié)合比如下DSP∶PA∶BFNB∶JU∶BSA＝8.1∶11.3∶5.7∶4.5∶1免疫動物制備抗血清實驗選用8-10周大，體重為2-3公斤，健康的雄性家兔。免疫三只兔子。實驗免疫劑量基礎(chǔ)免疫為0.25～2.0mg/kg，加強(qiáng)免疫劑量為0.5～4.0mg/kg，用生理鹽水分別稀釋適量人工抗原復(fù)合物，加入等體積弗氏完全佐劑，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多點注射與大腿肌肉注射相結(jié)合的方法。3～4周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，以后每隔2周再次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫時采用弗氏不完全佐劑。從第三次免疫開始，每次免疫后第8～10天，從兔子心臟或耳緣靜脈采血，測定效價和特異性。待免疫血清效價合格后，就進(jìn)行采血。
本實驗采用心臟取血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后，放置于37℃溫箱中半小時，待收集在血清瓶中的血液凝固后，用接種針沿血清瓶邊緣將血塊與玻璃瓶壁脫離，再放到4℃下過夜，待血塊收縮后，用吸管將血清吸入試管中，離心(4000rpm，15分鐘，4℃下)分離出血清。
抗血清效價測定按常規(guī)方法免疫兔子。從加強(qiáng)免疫第二次開始，在每次免疫后第8天于兔子耳緣靜脈采血，血清經(jīng)適當(dāng)稀釋后用間接ELISA測定效價，半抗原-OVA結(jié)合物包被濃度均為10ug/ml。末免后采全血，抗血清的對PA、JU、DSP和BFNB的效價分別為1∶71860、1∶8000、1∶44900、1∶98300。
抗體的純化與鑒定一般采用辛酸-硫酸銨鹽析法，也可采用蛋白A柱層析法。辛酸-硫酸銨鹽析法是一個經(jīng)典的方法。辛酸在偏酸性的條件下能將血清中除IgG以外的蛋白質(zhì)都沉淀下來中，上清中只有IgG。辛酸加入因抗體的來源不同而不同，人血清為70ul/ml，兔血清為75ul/ml，小鼠血清為40ul/ml，小鼠腹水為33ul/ml。這種方法IgG的回收率達(dá)90％以上。
最佳抗體工作濃度和包被抗原復(fù)合物濃度的確定用方陣滴定法確定最佳抗體工作濃度和包被抗原復(fù)合物濃度(間接ELISA法)，同時稀釋抗體和固相抗原包被液。在同一包被濃度下，隨著酶標(biāo)抗體的稀釋，所得的OD值呈下降趨勢，同樣在同一抗體稀釋濃度下，隨著包被濃度的下降，所得OD值也呈下降趨勢。通常選擇OD值1.0左右時的抗體和包被抗原濃度作為工作濃度。從實驗可知，當(dāng)抗體1.0μg·mL-1，包被抗原PA-OVA濃度為1.5μg·mL-1時OD值約等于1.0；當(dāng)抗體為0.9μg·mL-1，包被抗原BFNB-OVA濃度為0.6μg·mL-1時，OD值約等于1.0；當(dāng)抗體為0.5μg·mL-1，包被抗原DSP-OVA濃度為2.0μg·mL-1時，OD值約等于1.0；當(dāng)抗體為2.0μg·mL-1，包被抗原JU-OVA濃度為3.0μg·mL-1時，OD值約等于1.0。
標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測靈敏度將PA-OVA(或BFNB-OVA、DSP-OVA、JU-OVA等)偶聯(lián)復(fù)合物，用包被液稀釋至各自的工作濃度包被96孔微量反應(yīng)板。每孔加入上述包被液100μL，于37℃溫箱中孵育2h。甩掉包被液，用PBST緩沖液洗滌，每孔加入封閉液300μL，于37℃溫箱中孵育0.5h。甩掉封閉液，用PBST緩沖液洗滌，加入預(yù)先配制的對硫磷(或三唑磷、毒死蜱、克百威)各濃度標(biāo)準(zhǔn)液50μL/孔，每濃度3孔重復(fù)，再加入預(yù)先配制的抗體稀釋液(PA-OVA包被孔加抗體2.0μg·mL-1，BFNB-OVA包被孔加抗體1.8μg·mL-1；DSP-OVA包被孔加抗體1.0μg·mL-1；JU-OVA包被孔加抗體4.0μg·mL-1；)50μL/孔，設(shè)不加藥對照和無抗體空白對照。加入預(yù)先以PBS稀釋1000倍的酶標(biāo)二抗(goat anti-rabbit IgG-HRP)100μL/孔，放入37℃溫箱中孵育1h，甩去孔內(nèi)液體，用PBST溶液洗滌。加入OPD-過氧化氫底物溶液100μL/孔，37℃溫箱中孵育15min后加入2mol/L H2SO450μL/孔終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測定490nm波長下的吸光值。根據(jù)抑制與農(nóng)藥濃度之間的半對數(shù)關(guān)系作圖即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。
ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線以抑制率與農(nóng)藥濃度的半對數(shù)曲線表示，抑制率以下式計算 式中ODmax為不加藥時的吸光值，ODx為農(nóng)藥x時的吸光值，ODmin為無抗體空白對照孔的吸光值。
由上述公式計算得農(nóng)藥各濃度的抑制率，作圖?？税偻?-500μg·L-1范圍內(nèi)，抑制率與克百威濃度的對數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r＝0.9780，抑制率為50％時克百威的濃度(I50)為273.0μg·L-1，最低檢測限[抑制率為10％時克百威的濃度(I10)]為24.9μg·L-1對硫磷在1-1000μg·L-1范圍內(nèi)，抑制率與對硫磷濃度的對數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r＝0.9688，抑制率為50％時對硫磷的濃度(I50)為796.3μg·L-1，最低檢測限[抑制率為10％時對硫磷的濃度(I10)]為71.6μg·L-1；毒死蜱在1-500μg·L-1范圍內(nèi)，抑制率與毒死蜱濃度的對數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r＝0.9890，抑制率為50％時毒死蜱的濃度(I50)為46.3μg·L-1，最低檢測限[抑制率為10％時毒死蜱的濃度(I10)]為3.7μg·L-1。氰戊菊酯在10-2000μg·L-1范圍內(nèi)，抑制率與氰戊菊酯濃度的對數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r＝0.9677，抑制率為50％時氰戊菊酯的濃度(I50)為450.8μg·L-1，最低檢測限[抑制率為10％時氰戊菊酯的濃度(I10)]為32.7μg·L-1。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種多簇抗原的制備方法，其特征在于，選用2～15種不同的小分子化合物半抗原，以蛋白質(zhì)分子為載體，依次進(jìn)行以下步驟1)、在蛋白質(zhì)分子上通過偶聯(lián)方法偶聯(lián)上一種小分子化合物半抗原分子，進(jìn)行透析純化；2)、以上述步驟所得的產(chǎn)物為載體，繼續(xù)偶聯(lián)另一種小分子化合物半抗原分子，再進(jìn)行透析純化；3)、重復(fù)步驟2)直至偶聯(lián)完所有的小分子化合物半抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多簇抗原的制備方法，其特征是所述蛋白質(zhì)分子為牛血清蛋白、卵清蛋白、人血清蛋白或鑰孔血藍(lán)蛋白的分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多簇抗原的制備方法，其特征是所述偶聯(lián)方法為碳二亞胺法、混合酸酐法、重氮化法或戊二醛法。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多簇抗原的制備方法，其特征是所述小分子化合物半抗原為農(nóng)藥小分子化合物半抗原、獸藥小分子化合物半抗原、環(huán)境小分子有機(jī)污染物半抗原或毒品/興奮劑小分子化合物半抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4所述的制備方法制得的多簇抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求所述5的多簇抗原制得的寬譜特異性多克隆抗體。
7.如權(quán)利要求6所述的寬譜特異性多克隆抗體的用途，其特征是用于對含有所述小分子化合物的樣品進(jìn)行檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多簇抗原的制備方法，選用2～15種不同的小分子化合物半抗原，以蛋白質(zhì)分子為載體，依次進(jìn)行以下步驟1)、在蛋白質(zhì)分子上通過偶聯(lián)方法偶聯(lián)上一種小分子化合物半抗原分子，進(jìn)行透析純化；2)、以上述步驟所得的產(chǎn)物為載體，繼續(xù)偶聯(lián)另一種小分子化合物半抗原分子，再進(jìn)行透析純化；3)、重復(fù)步驟2)直至偶聯(lián)完所有的小分子化合物半抗原。本發(fā)明還公開了上述制備方法制得的多簇抗原，以及根據(jù)上述多簇抗原制得的寬譜特異性多克隆抗體。本發(fā)明的寬譜特異性多克隆抗體的用途是用于對含有上述小分子化合物的樣品進(jìn)行檢測。
文檔編號G01N33/53GK1908664SQ200610053008
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月18日
發(fā)明者桂文君, 朱國念, 王姝婷, 郭逸蓉, 金仁耀 申請人:浙江大學(xué)