專利名稱：十八烷基型整體式液相色譜微柱的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種液相色譜微柱，尤其是涉及一種十八烷基型整體式液相色譜微柱的制備方法。
背景技術(shù)：
微柱高效液相色譜(Micro-column HPLC)，簡稱為微柱液相色譜(μ-LC)，是近年來發(fā)展起來的一種色譜微分離技術(shù)，由于采用了新型的固定相和微型精密加工制造技術(shù)，使色譜柱的分離能力大為提高，加之其具有流動相、固定相、樣品消耗低和易于與質(zhì)譜(MS)、核磁共振波譜(NMR)聯(lián)用或與其它高效液相色譜柱(SEC、IC)組成二維HPLC等優(yōu)點，使其成為現(xiàn)代色譜界的一大研究熱點。它在醫(yī)藥、食品、環(huán)境、生物大分子(蛋白質(zhì)、多肽)分析、神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V泛的應(yīng)用前景(于世林，高效液相色譜方法及應(yīng)用，北京化學(xué)工業(yè)出版社，2005.226)。
傳統(tǒng)的液相色譜微柱多采用緊密填充法，固定相為微米級的球形填料，流速增大時柱壓急劇增大，這對色譜柱和儀器的使用壽命都大有影響。同時制備微尺寸的填充色譜柱，需要很高的裝柱技巧；而對于毛細(xì)管色譜柱，兩端過濾篩板的制備比較困難，成功率低，影響了微柱液相色譜的發(fā)展應(yīng)用。
近年來，高效液相色譜整體柱作為一種新型色譜柱迅速發(fā)展起來，整體柱(monolithiccolumn)又稱整體固定相(monolithic stationary phase)、連續(xù)床(continuous bed)、棒柱(rod)，是在柱管內(nèi)原位聚合或固定化了的具有連續(xù)整體多孔結(jié)構(gòu)材料，可以通過控制反應(yīng)物配比和聚合條件來得到具有理想孔徑分布的整體柱(鮑笑玲，許旭，分析化學(xué)，2005，33(11)1653～1658)。其具有制備簡單、通透性好、分析速度快、空間利用率高、毋需在柱兩端制備篩板等優(yōu)點。故整體式液相色譜微柱是解決μ-LC發(fā)展瓶頸的一個理想方法。
目前，整體式色譜柱主要應(yīng)用在常規(guī)高效液相色譜(采用2.0～4.6mm內(nèi)徑的不銹鋼管為柱材)和毛細(xì)管電色譜(采用25～250μm內(nèi)徑的熔融石英毛細(xì)管為柱材)(E.C.Peters，M.Petro，F(xiàn).Svec，J.M.J.Fréchet Anal.Chem.1997，693646～3649)以及毛細(xì)管液相色譜(采用200～320μm內(nèi)徑的熔融石英毛細(xì)管為柱材)(Grafnetter.J，Coufal.P， E，Suchánková J，BosákováZ， J J.of Chromatogr.A，2004，104943-49)，整體式液相色譜微柱報道還較少(Huang X.J.，Wang Q.Q.，Yan H.，Huang Y.，Huang B.L.，J.of Chromatogr.A，2005，1062183～188)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有的液相色譜微柱制備方法存在的影響色譜柱和相應(yīng)儀器的使用壽命，需要很高的裝柱技術(shù)，尤其是對于毛細(xì)管色譜柱兩端過濾篩板的制備比較困難，成功率低等問題，提供一種操作簡單、便捷，所得整體式液相色譜微柱通透性好、柱壓低、機械強度高、分析速度快，不需在整體柱表面鍵合其它功能基團即可直接進行μ-LC分離操作，同時可根據(jù)需要方便控制整體柱長度的十八烷基型整體式液相色譜微柱的制備方法。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是以甲基丙烯酸十八烷基酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物為連續(xù)整體式柱體骨架，正丙醇和1，4-丁二醇二元混合物為致孔劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，反應(yīng)后用乙腈將致孔劑和交聯(lián)度低的的聚合物沖洗出制備整體式液相色譜微柱的方法。所得整體柱不需鍵合其它功能基團即可直接在μ-LC下進行分離應(yīng)用。
本發(fā)明的反應(yīng)過程如下1)毛細(xì)管內(nèi)壁活化 2)毛細(xì)管內(nèi)壁預(yù)聚合 3)交聯(lián)聚合 其交聯(lián)體系結(jié)構(gòu)示意如下
本發(fā)明的步驟如下1)毛細(xì)管內(nèi)壁活化依次用丙酮、鹽酸、二次水、NaOH溶液、二次水清洗活化毛細(xì)管內(nèi)壁，氮吹干燥，使毛細(xì)管內(nèi)壁獲得豐富的游離型硅羥基；2)毛細(xì)管內(nèi)壁的預(yù)聚合在毛細(xì)管內(nèi)壁鍵合一層帶烯基的硅烷化試劑γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)；3)制備甲基丙烯酸十八烷基酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯整體柱反應(yīng)混合物包括反應(yīng)單體混合物、引發(fā)劑和致孔劑，按質(zhì)量百分比(下同)反應(yīng)單體混合物占整個反應(yīng)混合物的40％～70％，反應(yīng)單體混合物中的甲基丙烯酸十八烷基酯(OMA)與乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)的含量比例為OMA為69.5％～39.5％，EDMA為29.5％～59.5％，引發(fā)劑偶氮二異丁腈為反應(yīng)單體混合物的0.5％～3％；其余為致孔劑，致孔劑為由正丙醇和1，4-丁二醇構(gòu)成的二元混合物，按比例稱取OMA、EDMA、致孔劑和引發(fā)劑，混合氮吹超聲震蕩脫氣后注入已預(yù)鍵合的毛細(xì)管中，一端封口，超聲震蕩后封住另一端，水浴中反應(yīng)，用高壓泵驅(qū)動乙腈沖洗后即得到多孔結(jié)構(gòu)的連續(xù)整體式液相色譜微柱，可在μ-LC模式下對其進行色譜評價。
在步驟1)中，所述的毛細(xì)管內(nèi)壁依次用丙酮清洗15～30min，1mol L-1NaOH沖洗0.5～3h，二次水沖洗0.5h，0.1mol L-1HCl在50～70℃下沖洗2h，二次水沖洗0.5h，然后置于氣相色譜柱溫箱中，120～300℃，最好160℃緩慢氮吹過夜，爾后兩端封口并置于干燥器中保存，使毛細(xì)管內(nèi)壁獲得豐富的游離型硅羥基。
在步驟2)中，所述的毛細(xì)管內(nèi)壁的預(yù)聚合是按體積百分比(V/V)用加入0.25％～0.5％的有機酸的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)注入經(jīng)過活化干燥的毛細(xì)管內(nèi)，兩端封口，室溫過夜，然后用氮氣吹掃30min，重復(fù)一次，最后用氮氣吹掃0.5～3h。有機酸為乙酸或甲酸。
在加入0.25％～0.5％有機酸的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)注入毛細(xì)管前，通氮同時超聲震蕩脫氣除氧。
在步驟3)中，致孔劑中的正丙醇和1，4-丁二醇的含量按百分比為正丙醇∶1，4-丁二醇＝70％∶30％；混合液注入已預(yù)鍵合的毛細(xì)管中，一端封口后超聲震蕩脫氣的時間為15～30min，然后封住另一端，水浴中反應(yīng)，水浴溫度為50～70℃，水浴中反應(yīng)時間為15～24h，然后截成適當(dāng)長度，用高壓泵驅(qū)動乙腈沖洗5～10h后即可得到多孔結(jié)構(gòu)的連續(xù)整體式液相色譜微柱。
本發(fā)明以甲基丙烯酸十八烷基酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯為柱體骨架，以正丙醇和1，4-丁二醇的二元混合物為致孔劑，在熔融硅毛細(xì)管中原位合成了整體式液相色譜微柱。當(dāng)清洗活化毛細(xì)管內(nèi)壁后，在一定溫度下緩慢氮吹干燥過夜，使毛細(xì)管內(nèi)壁獲得豐富的游離型硅羥基。然后注入帶烯基的硅烷化試劑γ-MAPS，并加入干燥的有機酸(甲酸或乙酸)為催化劑，使得γ-MAPS與內(nèi)壁的硅羥基有較大的鍵合度，因此可有更多的雙鍵作為錨位和隨后加入的單體混合物共聚，使得柱體和毛細(xì)管緊密相連，兩端無需使用過濾篩板。所得柱材料具有提供流動相快速傳遞的通孔和提供分離場所的微孔的雙孔結(jié)構(gòu)，可通過控制反應(yīng)物配比和聚合條件來獲得理想的孔徑分布。本發(fā)明操作簡單便捷，所得整體式液相色譜微柱通透性好、柱壓低、機械強度高、分析速度快，不需在整體柱表面鍵合其它功能基團即可直接進行μ-LC分離操作，同時可根據(jù)需要方便控制整體柱的長度。


圖1為實施例1整體柱的掃描電鏡圖。
圖2為柱體和管壁連接處的掃描電鏡圖。
圖3為實施例2反應(yīng)單體混合物/致孔劑不同比例所得整體柱的掃描電鏡圖。
圖4為實施例3反應(yīng)單體/交聯(lián)劑不同比例所得整體柱的掃描電鏡圖。
圖5為實施例4對苯的同系物的分離液相色譜圖。在圖5中，橫坐標(biāo)為時間Time(min)，縱坐標(biāo)為Absorbance(mAU)。
圖6為實施例5對六種物質(zhì)的混標(biāo)的快速分離液相色譜圖。在圖6中，橫坐標(biāo)為時間Time(min)，縱坐標(biāo)為Absorbance(mAU)。
圖7為實施例4和實施例5的流速與柱壓關(guān)系圖。在圖7中，橫坐標(biāo)為流速Flowrate(μLmin-1)，縱坐標(biāo)為柱壓Back pressure(MPa)。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例11)毛細(xì)管內(nèi)壁的清潔活化處理取內(nèi)徑530μm，長3m的熔融硅毛細(xì)管，先用丙酮清洗30min，用1mol L-1NaOH沖洗30min后二次水沖洗至中性，然后用0.1mol L-1HCl在溫度70℃下沖洗2h，二次水沖洗至中性后置于氣相色譜柱溫箱中，160℃緩慢氮吹過夜，爾后兩端封口置于干燥器中保存。
2)毛細(xì)管內(nèi)壁的預(yù)聚合取2.0mLγ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)加入10μL的干燥乙酸，通氮并超聲震蕩10min，然后將其注入到預(yù)處理過的毛細(xì)管內(nèi)，兩端封口，置于烘箱中60℃反應(yīng)20h后，用丙酮將剩余反應(yīng)液沖出，然后緩慢氮吹2h。該步驟在操作最好無水無氧，重復(fù)該步驟可獲得更大的鍵合度。使用時可根據(jù)需要切成不同長度。
3)整體柱的制備按甲基丙烯酸十八烷基酯(OMA)∶乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)∶偶氮二異丁腈(AIBN)＝40∶60∶(0.5、1、1.5、3)配置反應(yīng)單體混合物；致孔劑由70％的正丙醇和30％的1，4-丁二醇組成，反應(yīng)單體混合物與致孔劑按40∶60混合；氮吹超聲震蕩脫氣15min后注入已預(yù)鍵合的毛細(xì)管中，一端封口超聲震蕩后封住另一端。70℃水浴中反應(yīng)24h后，接到液相色譜泵上，用乙腈沖洗5h即可。圖1中的1a、1b、1c、1d分別為AIBN的比分別為0.5、1、1.5、3的掃描電鏡圖。圖2為柱體和管壁連接處的掃描電鏡圖。
實施例2毛細(xì)管內(nèi)壁的清潔活化處理同實施例1，在毛細(xì)管內(nèi)壁預(yù)鍵合中，取2.0mLγ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)加入2μL的干燥甲酸，其它同實施例1，OMA∶EDMA∶AIBN＝49.5∶49.5∶1配置反應(yīng)單體混合物；致孔劑由70％的正丙醇和30％的1，4丁二醇組成，反應(yīng)單體混合物與致孔劑按比例分別為45∶55；50∶50；55∶45；70∶30混合后氮吹超聲震蕩脫氣15min注入已預(yù)鍵合的毛細(xì)管中，一端封口超聲震蕩后封住另一端。50℃水浴中反應(yīng)20h后，接到液相色譜泵上，用乙腈沖洗8h即可。圖3中的3a、3b、3c、3d分別為反應(yīng)單體混合物與致孔劑的比例為45∶55；50∶50；55∶45；70∶30的掃描電鏡圖。
實施例3毛細(xì)管內(nèi)壁的清潔活化處理同實施例1，在毛細(xì)管內(nèi)壁預(yù)鍵合中，取2.0mLγ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)加入5μL的干燥乙酸其它同實施例1，配制OMA∶EDMA分別為69.5∶29.5，64.5∶34.5，59.5∶39.5，54.5∶44.5，AIBN為1的反應(yīng)單體混合物；致孔劑由70％的正丙醇和30％的1，4-丁二醇組成，反應(yīng)單體混合物與致孔劑按比例40∶60混合后氮吹超聲震蕩脫氣15min注入已預(yù)鍵合的毛細(xì)管中，一端封口超聲震蕩后封住另一端。60℃水浴中反應(yīng)20h后，接到液相色譜泵上，用乙腈沖洗5h即可。圖4中的4a、4b、4c、4d分別為OMA∶EDMA＝69.5∶29.5；64.5∶34.5；59.5∶39.5；54.5∶44.5的掃描電鏡圖。
實施例4毛細(xì)管內(nèi)壁的清潔活化處理及內(nèi)壁預(yù)鍵合同實施例1，配制OMA∶EDMA∶AIBN＝39.5∶59.5∶1的反應(yīng)單體混合物；致孔劑由70％的正丙醇和30％的1，4-丁二醇組成，反應(yīng)單體混合物與致孔劑的比例為62∶38，60℃水浴中反應(yīng)18h后接到液相色譜泵上，用乙腈沖洗10h即可。截取制備好的整體柱16.5cm，在μ-LC模式下，以乙腈∶水＝60∶40(V/V)為流動相，流速為20μL min-1，檢測波長為254nm，對苯的同系物進行分離，對應(yīng)峰分別為1.苯，2.甲苯，3.乙苯，4.異丙苯。其譜圖如圖5所示。
實施例5毛細(xì)管內(nèi)壁的清潔活化處理及內(nèi)壁預(yù)鍵合同實施例1，配制OMA∶EDMA∶AIBN＝57.5∶27.5∶1的反應(yīng)單體混合物；致孔劑由70％的正丙醇和30％的1，4-丁二醇組成，反應(yīng)單體混合物與致孔劑的比例為40∶60，60℃水浴中反應(yīng)15h后接到液相色譜泵上，用乙腈沖洗10h即可。截取制備好的整體柱19.7cm，在μ-LC模式下，以乙腈∶水＝60∶40(V/V)為流動相，流速為60μL min-1，檢測波長為254nm，對六種物質(zhì)的混標(biāo)進行快速分離，對應(yīng)峰分別為1.硫脲2.苯酚3.苯4.甲苯5.乙苯6.異丙苯。其譜圖如圖6所示。
實施例6用實施例4和實施例5制備的整體柱，其柱長分別為16.5cm、19.7cm，以乙腈∶水＝60∶40(V/V)為流動相，發(fā)現(xiàn)柱壓與流速有很好的線性關(guān)系，說明所得整體柱材料機械強度好，內(nèi)部均勻。其流速—柱壓關(guān)系如圖7中的曲線a、b所示，曲線a、b相應(yīng)R＝0.9999和R＝0.9985。
權(quán)利要求
1.十八烷基型整體式液相色譜微柱的制備方法，其特征在于其反應(yīng)過程如下1)毛細(xì)管內(nèi)壁活化 2)毛細(xì)管內(nèi)壁的預(yù)聚合 3)交聯(lián)聚合 其交聯(lián)體系結(jié)構(gòu)示意如下
2.如權(quán)利要求1所述的十八烷基型整體式液相色譜微柱的制備方法，其特征在于其步驟如下1)毛細(xì)管內(nèi)壁活化依次用丙酮、鹽酸、二次水、NaOH溶液、二次水清洗活化毛細(xì)管內(nèi)壁，氮吹干燥，使毛細(xì)管內(nèi)壁獲得豐富的游離型硅羥基；2)毛細(xì)管內(nèi)壁的預(yù)聚合在毛細(xì)管內(nèi)壁鍵合一層帶烯基的硅烷化試劑γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷；3)制備甲基丙烯酸十八烷基酯—乙二醇二甲基丙烯酸酯整體柱反應(yīng)混合物包括反應(yīng)單體混合物、引發(fā)劑和致孔劑，按質(zhì)量百分比反應(yīng)單體混合物占整個反應(yīng)混合物的40％～70％，反應(yīng)單體混合物中的甲基丙烯酸十八烷基酯與乙二醇二甲基丙烯酸酯的含量比例為甲基丙烯酸十八烷基酯為69.5％～39.5％，乙二醇二甲基丙烯酸酯為29.5％～59.5％，引發(fā)劑偶氮二異丁腈占反應(yīng)單體混合物的0.5％～3％；其余為致孔劑，致孔劑為由正丙醇和1，4-丁二醇構(gòu)成的二元混合物，按比例稱取甲基丙烯酸十八烷基酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯和致孔劑和引發(fā)劑，混合氮吹超聲震蕩脫氣后注入已預(yù)鍵合的毛細(xì)管中，一端封口，超聲震蕩后封住另一端，水浴中反應(yīng)，用高壓泵驅(qū)動乙腈沖洗后即得到多孔結(jié)構(gòu)的連續(xù)整體式液相色譜微柱。
3.如權(quán)利要求2所述的十八烷基型整體式液相色譜微柱的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述的毛細(xì)管內(nèi)壁依次用丙酮清洗15～30min，1mol L-1NaOH沖洗0.5～3h，二次水沖洗0.5h，0.1mol L-1HCl在50～70℃下沖洗2h，二次水沖洗0.5h，然后置于氣相色譜柱溫箱中，120～300℃氮吹，爾后兩端封口并置于干燥器中保存，使毛細(xì)管內(nèi)壁獲得豐富的游離型硅羥基。
4.如權(quán)利要求3所述的十八烷基型整體式液相色譜微柱的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述的氮吹其溫度為160℃。
5.如權(quán)利要求2所述的十八烷基型整體式液相色譜微柱的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述的毛細(xì)管內(nèi)壁的預(yù)聚合是按體積百分比用加入0.25％～0.5％的有機酸的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷注入經(jīng)過活化干燥的毛細(xì)管內(nèi)，兩端封口，室溫過夜，然后用氮氣吹掃30min，重復(fù)一次，最后用氮氣吹掃0.5～3h。
6.如權(quán)利要求2或5所述的十八烷基型整體式液相色譜微柱的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述的有機酸為乙酸或甲酸。
7.如權(quán)利要求2所述的十八烷基型整體式液相色譜微柱的制備方法，其特征在于在步驟2)中，在加入0.25％～0.5％有機酸的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷注入毛細(xì)管前，通氮同時超聲震蕩脫氣除氧。
8.如權(quán)利要求2所述的十八烷基型整體式液相色譜微柱的制備方法，其特征在于在步驟3)中，致孔劑中的正丙醇和1，4-丁二醇的含量按百分比為正丙醇∶1，4-丁二醇＝70％∶30％。
9.如權(quán)利要求2所述的十八烷基型整體式液相色譜微柱的制備方法，其特征在于在步驟3)中，混合液注入已預(yù)鍵合的毛細(xì)管中，一端封口超聲震蕩脫氣的時間為15～30min，水浴中反應(yīng)，水浴溫度為50～70℃，水浴中反應(yīng)時間為15～24h，用高壓泵驅(qū)動乙腈沖洗5～10h后即可得到多孔結(jié)構(gòu)的連續(xù)整體式液相色譜微柱。
全文摘要
十八烷基型整體式液相色譜微柱的制備方法，涉及一種液相色譜微柱，提供一種操作簡單、便捷，所得整體式液相色譜微柱通透性好、柱壓低、機械強度高、分析速度快，不需在整體柱表面鍵合其它功能基團即可直接進行μ－LC分離操作，同時可根據(jù)需要方便控制整體柱長度的十八烷基型整體式液相色譜微柱的制備方法。步驟為毛細(xì)管內(nèi)壁活化后進行毛細(xì)管內(nèi)壁的預(yù)聚合，再制備甲基丙烯酸十八烷基酯－乙二醇二甲基丙烯酸酯整體柱。以甲基丙烯酸十八烷基酯－乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物為連續(xù)整體式柱體骨架，正丙醇和1，4－丁二醇二元混合物為致孔劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，反應(yīng)后用乙腈將致孔劑和交聯(lián)度低的聚合物沖洗出。
文檔編號G01N30/60GK1833772SQ200610054640
公開日2006年9月20日 申請日期2006年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月14日
發(fā)明者徐振東, 王秋泉, 付強 申請人:廈門大學(xué)