專利名稱：一種驗(yàn)證性篩選目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種驗(yàn)證性篩選目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體的方法。
背景技術(shù)：
目前，研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合特性的方法有以下幾種1)定向肽庫(kù)(oriented peptide library)，最早的研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合模體的方法，即將目的結(jié)構(gòu)域與定向多肽庫(kù)共同孵育，結(jié)合多肽以混合狀態(tài)測(cè)序并用統(tǒng)計(jì)的方式確定共有結(jié)合序列。這種方法可以有效地揭示目的結(jié)構(gòu)域?qū)ε潴w特定位點(diǎn)上的氨基酸的偏好性；缺點(diǎn)是不能確定配體特定位點(diǎn)上不能出現(xiàn)的氨基酸，也不能分離出獨(dú)立的真實(shí)結(jié)合序列。
2)定向肽庫(kù)芯片(oriented peptide array library)，此技術(shù)是定向肽庫(kù)和芯片兩種技術(shù)的結(jié)合，即先將數(shù)百個(gè)不同的、分別由多種定向多肽組成的定向肽庫(kù)逐一合成在固相支持物上，然后用目的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行篩選。這種方法能夠從芯片上直接讀出共有結(jié)合序列，無需測(cè)序；但也不能得到獨(dú)立的真實(shí)結(jié)合序列，而且不能定量比較各種結(jié)合多肽與目的結(jié)構(gòu)域的親和力。
3)SPOT合成(synthesis of peptides on cellulose membranes)，即先用化學(xué)方法在纖維素膜上合成多種多肽，然后檢測(cè)這些多肽與目的結(jié)構(gòu)域的結(jié)合情況。此方法可以得到獨(dú)立的真實(shí)結(jié)合序列。但是合成多肽的序列依賴于已知信息，因此無法發(fā)現(xiàn)新的、意想不到的結(jié)合序列；并且通量受限于膜上可合成多肽的數(shù)量。
4)噬菌體展示(phage display)，即多肽被展示在噬菌體表面，然后用目的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行篩選。這種方法的篩選通量可以達(dá)到很高；但低親和力配體往往被高親和力配體掩蓋，而無法有效地篩選獲得。
上述方法都是體外實(shí)驗(yàn)方法，不僅需要純化蛋白質(zhì)，而且人為實(shí)驗(yàn)條件(如孵育溫度、洗脫緩沖液pH值等)對(duì)結(jié)果影響很大。
酵母雙雜交(yeast two-hybrid)是一種體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法，已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用的的研究。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可以避免配體間親和力的競(jìng)爭(zhēng)，能夠捕獲弱的、瞬時(shí)的相互作用，而且可以得到獨(dú)立的真實(shí)結(jié)合序列。但是傳統(tǒng)的酵母雙雜交方法通常用于篩選cDNA文庫(kù)，文庫(kù)中低豐度配體往往被高豐度配體所掩蓋，因此想要全面地研究目的結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性則需要反復(fù)篩選多種cDNA文庫(kù)，同時(shí)需要進(jìn)行大量測(cè)序工作。
上述方法都是針對(duì)某個(gè)特定的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行的大規(guī)模篩選，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。面對(duì)每種結(jié)構(gòu)域家族中的數(shù)百個(gè)成員，如果逐一進(jìn)行大規(guī)模篩選，工作量之巨大幾乎不可能完成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效的驗(yàn)證性篩選目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體的方法。
本發(fā)明所提供的驗(yàn)證性篩選目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體的方法，包括以下步驟1)用酵母雙雜交系統(tǒng)，以目的結(jié)構(gòu)域家族中結(jié)合特性有代表性的成員為誘餌蛋白篩選酵母雙雜交文庫(kù)，所述酵母雙雜交文庫(kù)包括隨機(jī)多肽文庫(kù)、或任一物種的細(xì)胞或組織的基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)；2)建立目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體文庫(kù)收集步驟1)篩選獲得的結(jié)合配體克隆以及其它已知或可能的目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體克隆，得到目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體文庫(kù)；3)以該目的結(jié)構(gòu)域家族中的其它成員或所述步驟1)中的結(jié)構(gòu)域成員為誘餌蛋白，用酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證性篩選步驟2)構(gòu)建的結(jié)合配體文庫(kù)，得到目的結(jié)構(gòu)域的陽(yáng)性和陰性結(jié)合配體；4)對(duì)步驟1)和/或步驟3)中篩選得到的每個(gè)目的結(jié)構(gòu)域的陽(yáng)性結(jié)合配體序列和陰性結(jié)合配體序列進(jìn)行序列分析，總結(jié)每個(gè)目的結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性，推測(cè)其共有結(jié)合序列；5)用步驟4)中推測(cè)的共有結(jié)合序列檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中所有可能與目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合的配體蛋白；再根據(jù)蛋白質(zhì)的生物學(xué)信息，進(jìn)一步預(yù)測(cè)最有可能的目的結(jié)構(gòu)域的配體蛋白；6)用常規(guī)的鑒定蛋白質(zhì)相互作用的方法驗(yàn)證步驟5)預(yù)測(cè)的目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體蛋白，得到與目的結(jié)構(gòu)域相互作用的配體蛋白。
所述步驟1)中的目的結(jié)構(gòu)域的選擇是多種多樣的，該方法尤其適用于結(jié)合非修飾線形短肽的結(jié)構(gòu)域，例如PDZ結(jié)構(gòu)域(識(shí)別S/T/Φ-x-Φ-COOH motif)、WW結(jié)構(gòu)域(識(shí)別PPxY motif)、GYF結(jié)構(gòu)域(識(shí)別PPG-F/I/L/M/V motif)、EVH1結(jié)構(gòu)域(識(shí)別FPPPPxD/E motif)、SH3結(jié)構(gòu)域(識(shí)別PxxP/RxxK motif)和VHS結(jié)構(gòu)域(識(shí)別D/E-xxLL motif)等；選擇目的結(jié)構(gòu)域家族中結(jié)合特性有代表性的成員作為誘餌蛋白進(jìn)行篩選，以使篩選獲得的目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體能夠涵蓋所有的類型，如目的結(jié)構(gòu)域?yàn)镻DZ結(jié)構(gòu)域時(shí)，可選擇該結(jié)構(gòu)域家族中的ZO-1 PDZ1，ZO-1 PDZ3，Erbin PDZ和GIPC PDZ結(jié)構(gòu)域成員。
步驟2)中已知或可能的目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體克隆包括已知的目的結(jié)構(gòu)域配體蛋白的cDNA克隆，預(yù)測(cè)的目的結(jié)構(gòu)域配體蛋白的cDNA克隆，目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合多肽克隆以及目的結(jié)構(gòu)域的潛在結(jié)合多肽克隆等。
若步驟3)沒有篩選到足夠數(shù)量的結(jié)合配體，則進(jìn)行補(bǔ)充篩選，即以所述目的結(jié)構(gòu)域?yàn)檎T餌蛋白進(jìn)行步驟1)的篩選，再將獲得的結(jié)合配體克隆添加到步驟2)構(gòu)建的結(jié)合配體文庫(kù)中，擴(kuò)充配體庫(kù)，接著進(jìn)行步驟3)-6)。
步驟5)中的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)可根據(jù)實(shí)際需要選擇一個(gè)或/和多個(gè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，所述蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)包括Swiss-Prot，Nr和IPI等；所述蛋白質(zhì)的生物學(xué)信息，包括蛋白的亞細(xì)胞定位和已知功能等。
步驟6)中的驗(yàn)證方法可為酵母雙雜交、蛋白質(zhì)Pull-Down方法或免疫共沉淀方法等。
上述驗(yàn)證性篩選目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體的方法還包括將在步驟6)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的天然蛋白克隆添加到步驟2)構(gòu)建的結(jié)合配體文庫(kù)的步驟，以擴(kuò)充配體庫(kù)。
本發(fā)明提供了一種驗(yàn)證性篩選目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體的方法。用該方法篩選目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體具有以下優(yōu)點(diǎn)一、高效性由于一個(gè)結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合多個(gè)配體，一個(gè)配體可以被多個(gè)結(jié)構(gòu)域識(shí)別；因此與某個(gè)結(jié)構(gòu)域家族中的有代表性的成員結(jié)合的多肽，較完全隨機(jī)的多肽，更有可能與該家族中的其它成員結(jié)合。所以，直接驗(yàn)證性篩選一個(gè)有針對(duì)性的、較小的配體庫(kù)與傳統(tǒng)篩選方法相比，可極大地提高篩選效率。本發(fā)明的配體庫(kù)可由步驟1)的篩選、補(bǔ)充篩選獲得的陽(yáng)性結(jié)合配體克隆以及步驟6)中驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的配體克隆組成，隨著整個(gè)體系的循環(huán)，配體庫(kù)將逐漸擴(kuò)大，驗(yàn)證篩選的效率還會(huì)不斷提高。配體庫(kù)中的配體序列都是已知的，因此步驟3)中驗(yàn)證篩選的結(jié)果—陽(yáng)性序列和陰性序列，可直接讀出，無需測(cè)序。二、實(shí)用性目的結(jié)構(gòu)域的陽(yáng)性結(jié)合序列和陰性序列可通過本發(fā)明的驗(yàn)證性篩選方法快速獲得。這些序列信息對(duì)準(zhǔn)確分析結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性是同等重要的，但是現(xiàn)有其它方法往往無法獲得或忽略陰性結(jié)果。此外，精準(zhǔn)結(jié)構(gòu)域結(jié)合特性的獲得有助于尋找和設(shè)計(jì)特定多肽，以用于科學(xué)研究和制備多肽類藥物。鑒定出的特異性配體，即只被一個(gè)結(jié)構(gòu)域家族成員識(shí)別而不與其它成員結(jié)合的配體，極有可能可作為阻斷性多肽，用于蛋白相互作用的研究和相關(guān)疾病的治療中。三、廣泛適用性本發(fā)明提供的驗(yàn)證性篩選目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體的方法適用于多種結(jié)合非修飾線形短肽的結(jié)構(gòu)域，如PDZ結(jié)構(gòu)域、WW結(jié)構(gòu)域、GYF結(jié)構(gòu)域、EVH1結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域和VHS結(jié)構(gòu)域等?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，本發(fā)明將在目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體的篩選及研制相關(guān)疾病的治療性藥物中發(fā)揮巨大作用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為驗(yàn)證性篩選人類PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體的流程2為PDZ結(jié)構(gòu)域配體庫(kù)配體類型分布3為PDZ結(jié)構(gòu)域配體庫(kù)配體長(zhǎng)度分布4為驗(yàn)證性篩選實(shí)驗(yàn)(yeast mating assay)篩選效率圖5為驗(yàn)證性篩選實(shí)驗(yàn)(yeast mating assay)His+陽(yáng)性克隆篩選結(jié)果圖6為驗(yàn)證性篩選實(shí)驗(yàn)(yeast mating assay)LacZ+陽(yáng)性克隆篩選結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所有DNA合成和測(cè)序工作均由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。
實(shí)驗(yàn)材料1、菌株E.Coli DH5α基因型F-，Φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，end A1，recA1，hsdR17(rk-，mk+)，supE44，thi-1，gyrA96，relA1，phoA，λ-。
酵母菌株(購(gòu)自Clontech公司)

2、質(zhì)粒載體(均購(gòu)自Clontech公司)pBridge酵母雙雜交GAL4 BD載體，含GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)編碼序列；pAS2-1酵母雙雜交GAL4 BD載體，含GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)編碼序列；pGADT7酵母雙雜交GAL4 AD載體，含GAL4激活結(jié)構(gòu)域(AD)編碼序列。
3、主要試劑和材料限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I，T4DNA連接酶，T4多核苷酸激酶，pfu DNA聚合酶均購(gòu)自大連寶生物公司。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。
各種培養(yǎng)基成分分別購(gòu)自Clontech公司、Sigma公司及欣經(jīng)科公司(日本進(jìn)口分裝)。
PEG4000，β-巰基乙醇，3-AT，LiAc，酸洗玻璃珠(Glass beads)購(gòu)自Sigma公司。鮭精DNA購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司。
4、試劑盒質(zhì)粒小量制備試劑盒和DNA產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，小分子量DNA片段高效快速純化回收試劑盒購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司。
5、主要溶液配制1)50％PEG4000(100mL)將50g PEG4000溶解于ddH2O中至總體積100mL，高壓滅菌，室溫保存。
2)1M LiAc(100mL)將10.2g LiAc溶解于ddH2O中至總體積100mL，調(diào)節(jié)pH值至7.5，高壓滅菌，室溫保存。
3)1M 3-AT(100mL)將8.4g 3-AT溶解于ddH2O中至總體積100mL，過濾除菌，-20℃保存。
4)細(xì)菌培養(yǎng)基(1000mL)

配制方法按上表分別稱取各種試劑，加入800mL ddH2O，用10M NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，定容至1000mL，高壓滅菌，4℃保存。
5)酵母選擇性培養(yǎng)基(1000mL)

配制方法按上表分別稱取各種試劑，加入ddH2O定容至950mL，高壓滅菌15min，冷卻到約55℃，加入50mL 40％的消毒葡萄糖溶液(Dextrose)使之濃度為2％，4℃保存。
6)YPD的配制(1000mL)細(xì)菌蛋白胨20g酵母提取物10g瓊脂粉(僅固體培養(yǎng)基) 20g
配制方法加ddH2O至總體積為950mL，高壓滅菌15min，冷卻到約55℃，加入50mL 40％的消毒葡萄糖溶液(Dextrose)使之濃度為2％，4℃保存。
7)X-gal儲(chǔ)液(20mg/mL)取X-gal 200mg，用二甲基甲酰胺(DMF)定容于10mL，避光保存于-20℃。
8)PCI溶液49％苯酚，49％CHCl3，2％異戊醇。
9)Z溶液Na2HPO4·7H2O 16.1g/L，NaH2PO4·H2O 5.5g/L，KCl 0.75g/L，MgSO4·7H2O 0.246g/L，調(diào)節(jié)pH值至7.0，高壓滅菌，室溫保存。
10)Z buffer/X-gal溶液(用于ONPG實(shí)驗(yàn))100mL Z buffer，0.27mL β-巰基乙醇，1.67mL X-gal儲(chǔ)液。
11)10×TE(100mL)1M Tris-HCl，10mM EDTA，溶于ddH2O中至總體積100mL，調(diào)節(jié)pH至7.5，高壓滅菌。
12)酵母裂解溶液(用于酵母DNA的提取)300mM NaCl，10mM Tris，1mM EDTA，0.1％SDS，調(diào)節(jié)pH至8.0，高壓滅菌。
實(shí)施例1、驗(yàn)證性篩選人類PDZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)合配體現(xiàn)以人類PDZ結(jié)構(gòu)域?yàn)槔?，用本發(fā)明的方法篩選該結(jié)構(gòu)域的結(jié)合配體，流程圖如圖1所示，具體過程包括以下步驟一、以人類PDZ結(jié)構(gòu)域家族中結(jié)合特性有代表性的成員為誘餌蛋白，用酵母雙雜交技術(shù)篩選隨機(jī)多肽文庫(kù)1、挑選人類PDZ結(jié)構(gòu)域家族中結(jié)合特性有代表性的成員PDZ結(jié)構(gòu)域特異性地識(shí)別和結(jié)合配體蛋白C-末端的4個(gè)氨基酸殘基。根據(jù)所識(shí)別氨基酸殘基的不同，PDZ結(jié)構(gòu)域被傳統(tǒng)地分為四類I類，-[S/T]-x-Φ-COOH；II類，-Φ-x-Φ-COOH；III類，-[D/E/K/R]-x-Φ-COOH；IV類，-x-ψ-[D/E]-COOH(x代表任意氨基酸，Φ代表疏水性氨基酸，ψ代表芳香族氨基酸)。
為使篩選獲得的PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體能夠涵蓋所有的類型，首先選擇四個(gè)人類PDZ結(jié)構(gòu)域ZO-1 PDZ1、ZO-1 PDZ3、Erbin PDZ和GIPC PDZ，將其作為誘餌蛋白分別篩選隨機(jī)多肽文庫(kù)。根據(jù)已知的結(jié)合序列推知ZO-1 PDZ1可結(jié)合I、II、III類配體，ZO-1 PDZ3結(jié)合II類配體，Erbin PDZ主要結(jié)合I類配體，GIPC PDZ主要結(jié)合I類配體，因此，以這四個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域篩選隨機(jī)多肽文庫(kù)所獲得的陽(yáng)性配體，理論上可以涵蓋PDZ結(jié)合配體的主要類型。
2、構(gòu)建酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒A、ZO-1 PDZ1結(jié)構(gòu)域誘餌質(zhì)粒ZO-1 PDZ1-pBridge的構(gòu)建a)PCR擴(kuò)增ZO-1 PDZ1(Swiss-ProtQ07157，氨基酸1-105)的cDNA編碼序列以人類肝臟cDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，在引物P1(上游引物)5’-CCGGAATTCATGGAGGAAACAGCTATATGGGAACAACAT-3’和P2(下游引物)5’-CGCGGATCCCTAAGGACGACTTACTGGTATTTGAACTTTCTT-3’的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增ZO-1PDZ1結(jié)構(gòu)域的編碼序列，20μl PCR反應(yīng)體系為人類肝臟cDNA文庫(kù)1μl，引物P1和P2各1μl，dNTP(各2.5mM)1μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液2μl，Pfu DNA聚合酶1μl，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl。PCR反應(yīng)條件為先94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳(電壓100V，1h)檢測(cè)，用小分子量DNA片段高效快速純化回收試劑盒回收、純化300bp的目的片段。
b)EcoR I和BamH I雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pBridge用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I對(duì)步驟a)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pBridge進(jìn)行雙酶切，酶切體系及條件為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物/質(zhì)粒載體10-12μl，10×反應(yīng)緩沖液2μl，BamH I 1μl，EcoR I 1μl，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl，37℃水浴反應(yīng)2h，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒分別回收兩種酶切產(chǎn)物。
c)連接將步驟b)的兩種酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接體系及條件為載體DNA 4μl(200ng)，目的DNA片段2μl(10ng)，10×反應(yīng)緩沖液1μl，T4DNA連接酶1μl(2U)，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至10μl，16℃水浴反應(yīng)16h。
d)轉(zhuǎn)化及鑒定將步驟c)的連接產(chǎn)物用化學(xué)法轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪于LB/氨芐青霉素固體培養(yǎng)基，挑取單克隆菌落，提質(zhì)粒，用酶切、PCR和測(cè)序的方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果獲得了正確插入目的DNA片段的ZO-1 PDZ1結(jié)構(gòu)域的誘餌質(zhì)粒，命名為ZO-1 PDZ1-pBridge。
B、ZO-1 PDZ3結(jié)構(gòu)域誘餌質(zhì)粒ZO-1 PDZ3-pBridge的構(gòu)建a)PCR擴(kuò)增ZO-1 PDZ3(Swiss-ProtQ07157，氨基酸401-500)的cDNA編碼序列以人類肝臟cDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，在引物P3(上游引物)5’-CCGGAATTCATGAAGATGGGATTTCTTCGGCCCAGCATG-3’和P4(下游引物)5’-CGCGGATCCCTATGATTCTACAATGCGACGATAAACATCCTT-3’的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增ZO-1PDZ3結(jié)構(gòu)域的編碼序列，20μl PCR反應(yīng)體系為人類肝臟cDNA文庫(kù)1μl，引物P3和P4各1μl，dNTP(各2.5mM)1μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液2μl，Pfu DNA聚合酶1μl，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl。PCR反應(yīng)條件為先94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳(電壓100V，1h)檢測(cè)，用小分子量DNA片段高效快速純化回收試劑盒回收、純化300bp的目的片段。
b)EcoR I和BamH I雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pBridge用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I對(duì)步驟a)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pBridge進(jìn)行雙酶切，酶切體系及條件為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物/質(zhì)粒載體10-12μl，10×反應(yīng)緩沖液2μl，BamH I 1μl，EcoR I 1μl，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl，37℃水浴反應(yīng)2h，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒分別回收兩種酶切產(chǎn)物。
c)連接將步驟b)的兩種酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接體系及條件為載體DNA 4μl(200ng)，目的DNA片段2μl(10ng)，10×反應(yīng)緩沖液1μl，T4DNA連接酶1μl(2U)，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至10μl，16℃水浴反應(yīng)16h。
d)轉(zhuǎn)化及鑒定將步驟c)的連接產(chǎn)物用化學(xué)法轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪于LB/氨芐青霉素固體培養(yǎng)基，挑取單克隆菌落，提質(zhì)粒，用酶切、PCR和測(cè)序的方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果獲得了正確插入目的DNA片段的ZO-1 PDZ3結(jié)構(gòu)域的誘餌質(zhì)粒，命名為ZO-1 PDZ3-pBridge。
C、GIPC PDZ結(jié)構(gòu)域誘餌質(zhì)粒GIPC PDZ-pBridge的構(gòu)建a)PCR擴(kuò)增GIPC PDZ(Swiss-ProtO14908，氨基酸123-223)的cDNA編碼序列以人類肝臟cDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，在引物P5(上游引物)5’-CCGGAATTCGACTTCATCTTCGCCCACGTGAAGGGGCAGCGCAAG-3’和P6(下游引物)5’-CGCGGATCCCTACTGGCTGATCATGTCGAAGGCCTTGCGAGG-3’的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增GIPCPDZ結(jié)構(gòu)域的編碼序列，20μl PCR反應(yīng)體系為人類肝臟cDNA文庫(kù)1μl，引物P5和P6各1μl，dNTP(各2.5mM)1μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液2μl，Pfu DNA聚合酶1μl，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl。PCR反應(yīng)條件為先94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳(電壓100V，1h)檢測(cè)，用小分子量DNA片段高效快速純化回收試劑盒回收、純化300bp的目的片段。
b)EcoR I和BamH I雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pBridge用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I對(duì)步驟a)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pBridge進(jìn)行雙酶切，酶切體系及條件為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物/質(zhì)粒載體10-12μl，10×反應(yīng)緩沖液2μl，BamH I 1μl，EcoR I 1μl，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl，37℃水浴反應(yīng)2h，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒分別回收兩種酶切產(chǎn)物。
c)連接將步驟b)的兩種酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接體系及條件為載體DNA 4μl(200ng)，目的DNA片段2μl(10ng)，10×反應(yīng)緩沖液1μl，T4DNA連接酶1μl(2U)，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至10μl，16℃水浴反應(yīng)16h。
d)轉(zhuǎn)化及鑒定將步驟c)的連接產(chǎn)物用化學(xué)法轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪于LB/氨芐青霉素固體培養(yǎng)基，挑取單克隆菌落，提質(zhì)粒，用酶切、PCR和測(cè)序的方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果獲得了正確插入目的DNA片段的GIPC PDZ結(jié)構(gòu)域的誘餌質(zhì)粒，命名為GIPC PDZ-pBridge。
D、Erbin PDZ結(jié)構(gòu)域誘餌質(zhì)粒Erbin PDZ-pBridge的構(gòu)建a)PCR擴(kuò)增Erbin PDZ結(jié)構(gòu)域(Swiss-ProtQ96RT1，氨基酸1273-1371)的cDNA編碼序列以人類T細(xì)胞cDNA文庫(kù)(購(gòu)自Stratagene公司)為模板，在引物P7(上游引物)5’-GAATTCGGCCATGAACTGGCAAAACAAG-3’和P8(下游引物)5’-GAATTCTTATGAGGAAACTTCTCGTAC-3’的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增Erbin PDZ結(jié)構(gòu)域的編碼序列，20μl PCR反應(yīng)體系為人類T細(xì)胞cDNA文庫(kù)1μl，引物P7和P8各1μl，dNTP(各2.5mM)1μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液2μl，Pfu DNA聚合酶1μl，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl。PCR反應(yīng)條件為先94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳(電壓100V，1h)檢測(cè)，用小分子量DNA片段高效快速純化回收試劑盒回收、純化300bp的目的片段。
b)EcoR I單酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pBridge用限制性內(nèi)切酶EcoR I對(duì)步驟a)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pBridge進(jìn)行單酶切，酶切體系及條件為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物/質(zhì)粒載體10-12μl，10×反應(yīng)緩沖液2μl，EcoRI 1μl，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl，37℃水浴反應(yīng)2h，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒分別回收兩種酶切產(chǎn)物。
c)連接將步驟b)的兩種酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接體系及條件為載體DNA 4μl(200ng)，目的DNA片段2μl(10ng)，10×反應(yīng)緩沖液1μl，T4DNA連接酶1μl(2U)，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至10μl，16℃水浴反應(yīng)16h。
d)轉(zhuǎn)化及鑒定將步驟c)的連接產(chǎn)物用化學(xué)法轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪于LB/氨芐青霉素固體培養(yǎng)基，挑取單克隆菌落，提質(zhì)粒，用酶切、PCR和測(cè)序的方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果獲得了正確插入目的DNA片段的Erbin PDZ結(jié)構(gòu)域誘餌質(zhì)粒，命名為Erbin PDZ-pBridge。
E、HtrA2 PDZ結(jié)構(gòu)域誘餌質(zhì)粒HtrA2 PDZ-pBridge的構(gòu)建a)PCR擴(kuò)增HtrA2 PDZ結(jié)構(gòu)域(Swiss-ProtO43464，氨基酸343-454)的cDNA編碼序列以人類骨髓cDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，在引物P9(上游引物)5’-CGCGGATCCATCGTGGGGAAAAGAAGAATT-3’和P10(下游引物)5’-GGCGGATCCAGGGGTCACATATAAGGTCAG-3’的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增HtrA2 PDZ結(jié)構(gòu)域的編碼序列，20μl PCR反應(yīng)體系為人類骨髓cDNA文庫(kù)1μl，引物P9和P10各1μl，dNTP(各2.5mM)1μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液2μl，Pfu DNA聚合酶1μl，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl。PCR反應(yīng)條件為先94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳(電壓100V，1h)檢測(cè)，用小分子量DNA片段高效快速純化回收試劑盒回收、純化300bp的目的片段。
b)BamH I單酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pBridge用限制性內(nèi)切酶BamH I對(duì)步驟a)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pBridge進(jìn)行單酶切，酶切體系及條件為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物/質(zhì)粒載體10-12μl，10×反應(yīng)緩沖液2μl，BamHI 1μl，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl，37℃水浴反應(yīng)2h，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒分別回收兩種酶切產(chǎn)物。
c)連接將步驟b)的兩種酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接體系及條件為載體DNA 4μl(200ng)，目的DNA片段2μl(10ng)，10×反應(yīng)緩沖液1μl，T4DNA連接酶1μl(2U)，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至10μl，16℃水浴反應(yīng)16h。
d)轉(zhuǎn)化及鑒定將步驟c)的連接產(chǎn)物用化學(xué)法轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪于LB/氨芐青霉素固體培養(yǎng)基，挑取單克隆菌落，提質(zhì)粒，用酶切、PCR和測(cè)序的方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果獲得了正確插入目的DNA片段的HtrA2 PDZ結(jié)構(gòu)域的誘餌質(zhì)粒，命名為HtrA2 PDZ-pBridge。
F、LNX1 PDZ2結(jié)構(gòu)域誘餌質(zhì)粒LNX1 PDZ2-pACT2-1的構(gòu)建a)PCR擴(kuò)增LNX1 PDZ2結(jié)構(gòu)域(Swiss-ProtQ8TBB1，氨基酸371-473)的cDNA編碼序列以IMAGE5164034克隆(購(gòu)自Invitrogen公司)為模板，在引物P11(上游引物)5’-CCGGAATTCGATGCCTACAGACCCCGAGAT-3’和P12(下游引物)5’-CGCGGATCCCTACTGAAAGATGTCAGGGCTCCG-3’的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增LNX1 PDZ2結(jié)構(gòu)域的編碼序列，20μl PCR反應(yīng)體系為IMAGE5164034克隆1μl，引物P11和P12各1μl，dNTP(各2.5mM)1μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液2μl，Pfu DNA聚合酶1μl，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl。PCR反應(yīng)條件為先94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳(電壓100V，1h)檢測(cè)，用小分子量DNA片段高效快速純化回收試劑盒回收、純化300bp的目的片段。
b)EcoR I和BamH I雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pACT2-1用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I對(duì)步驟a)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pAS2-1進(jìn)行雙酶切，酶切體系及條件為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物/質(zhì)粒載體10-12μl，10×反應(yīng)緩沖液2μl，BamH I 1μl，EcoR I 1μl，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl，37℃水浴反應(yīng)2h，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒分別回收兩種酶切產(chǎn)物。
c)連接將步驟b)的兩種酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接體系及條件為載體DNA 4μl(200ng)，目的DNA片段2μl(10ng)，10×反應(yīng)緩沖液1μl，T4DNA連接酶1μl(2U)，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至10μl，16℃水浴反應(yīng)16h。
d)轉(zhuǎn)化及鑒定將步驟c)的連接產(chǎn)物用化學(xué)法轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪于LB/氨芐青霉素固體培養(yǎng)基，挑取單克隆菌落，提質(zhì)粒，用酶切、PCR和測(cè)序的方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果獲得了正確插入目的DNA片段的LNX1 PDZ2結(jié)構(gòu)域的誘餌質(zhì)粒，命名為L(zhǎng)NX1 PDZ2-pACT2-1。
經(jīng)DNA測(cè)序鑒定，上述酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒的核苷酸序列和讀碼框架均正確無誤，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
3、構(gòu)建新型酵母雙雜交隨機(jī)多肽文庫(kù)現(xiàn)利用人類基因組DNA和煙草基因組DNA分別構(gòu)建了10個(gè)新型隨機(jī)多肽文庫(kù)，具體構(gòu)建方法參見申請(qǐng)?zhí)枮?2120209.5的專利“隨機(jī)多肽文庫(kù)構(gòu)建方法”。將此10個(gè)隨機(jī)多肽文庫(kù)混合成一個(gè)更大的隨機(jī)多肽文庫(kù)，命名為“總隨機(jī)多肽文庫(kù)”。所有構(gòu)建的新型隨機(jī)多肽文庫(kù)結(jié)果如表1所示表1新型隨機(jī)多肽文庫(kù)列表

4、酵母雙雜交篩選新型隨機(jī)多肽文庫(kù)1)酵母菌株的保存與表型驗(yàn)證用挑菌環(huán)蘸取少量保存于-80℃的酵母CG1945菌液，劃線培養(yǎng)于YPD固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3-5天，直至菌落直徑達(dá)2mm，4℃保存。
正常的酵母CG1945菌落由于ade2-101突變而呈粉色或紅色，且直徑大于2mm?，F(xiàn)挑3-4個(gè)單克隆菌落接種于不同的選擇性固體培養(yǎng)基(SD/-Trp，SD/-Leu，SD/-His，SD/-Ura，YPD)，30℃培養(yǎng)4-5天，核對(duì)生長(zhǎng)情況。
表型驗(yàn)證結(jié)果表明酵母CG1945菌株的所有表型完全正常。
2)酵母的小量快速轉(zhuǎn)化(PEG/LiAc法)a、挑取酵母CG1945單克隆菌落接種于3mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、250rpm搖培14-16小時(shí)；b、取1mL經(jīng)培養(yǎng)的酵母菌置于1.5mL微量離心管中，12,000rpm離心20s；c、將細(xì)胞重懸于1mL無菌ddH2O中，12,000rpm離心20s；d、將酵母沉淀重懸于1mL 100mM LiAc溶液中，30℃溫浴5min；e、12,000rpm，離心20s，吸棄上清，依次加入下述溶液
240μl 50％PEG400036μl 1.0M LiAc5μl鮭精DNA(10.0mg/mL)10μl 質(zhì)粒DNA(100-5000μg)45μl ddH2Of、劇烈振蕩混合溶液1min，充分懸浮細(xì)胞，42℃水浴20min；g、12,000rpm離心20s，吸棄上清；h、加入200-400μl ddH2O，用加樣器輕柔吹打，重懸細(xì)胞；i、將轉(zhuǎn)化細(xì)胞均勻涂布在SD/-Trp固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2-4天。
3)隨機(jī)多肽文庫(kù)轉(zhuǎn)化含誘餌質(zhì)粒的酵母CG1945(PEG/LiAc法)a、挑幾個(gè)直徑為2-3mm含誘餌質(zhì)粒的酵母CG1945克隆于0.5mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，劇烈振蕩打散菌落，使細(xì)胞均勻懸?。蝗缓筠D(zhuǎn)移菌液至50mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30℃、250rpm搖培18h，使之生長(zhǎng)至平臺(tái)期(OD600＞1.5)；b、轉(zhuǎn)移培養(yǎng)后的菌液于300mL YPD液體培養(yǎng)基中，使菌液的OD600＝0.2-0.3，30℃、250rpm，搖培3h；c、將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到6個(gè)50mL離心管中，1000g室溫離心5min；d、棄去上清，共加入25-50mL ddH2O，懸浮細(xì)胞；e、將細(xì)胞集中在一個(gè)離心管中，1000g室溫離心5min；f、棄去上清，將細(xì)胞重懸于1.5mL新鮮制備的無菌1×TE/LiAc溶液(10mL1×TE/LiA溶液含ddH2O 8mL，10×TE 1mL，10×LiAc(1.0M)1mL)中；g、在50mL離心管中依次加入隨機(jī)多肽文庫(kù)質(zhì)粒10-50μg和鮭精DNA(10.0mg/mL)2mg并混合均勻；h、加入1mL新鮮制備的酵母感受態(tài)細(xì)胞，混合均勻；i、加入6mL PEG/LiAc溶液(10mL PEG/LiAc溶液含50％PEG40008mL，10×TE1mL 10×LiAc(1.0M)1mL)并劇烈振蕩2min使之混勻；j、30℃、200rpm搖培30min；k、加入0.7mL DMSO顛倒混勻；l、42℃水浴15min，間或搖晃使之混勻；m、冰浴1-2min；n、1000g室溫離心5min；o、棄去上清，加入1×TE溶液4mL，懸浮細(xì)胞；p、將細(xì)胞均勻涂抹于20個(gè)SD/-Trp-Leu-His固體培養(yǎng)基上(150mm)，30℃培養(yǎng)4-7天。
4)轉(zhuǎn)化效率及篩選克隆數(shù)量分析取少量轉(zhuǎn)化細(xì)胞，分別按1∶10、1∶100、1∶1000的比例用ddH2O稀釋，各取100μl鋪于SD/-Trp-Leu固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3-4天至菌落出現(xiàn)，選擇菌落數(shù)介于30-300之間者計(jì)數(shù)，并按下述公式計(jì)算轉(zhuǎn)化效率和篩選克隆數(shù)。
篩選克隆數(shù)(cfu)＝cfu/μg×轉(zhuǎn)化DNA質(zhì)量(μg)5)β-半乳糖苷酶活性的檢測(cè)a、制備新鮮的Z buffer/X-gal溶液10mL，將一張干凈濾紙置于其中，使其完全潤(rùn)濕；b、挑取直徑大于2mm的His+酵母菌落劃在另一個(gè)新鮮的SD/-Trp-Leu-His固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2-4天；c、用一張無菌、干燥的濾紙鋪于平皿表面，在濾紙上扎3個(gè)不對(duì)稱的小孔以確定方向；d、待濾紙潤(rùn)濕后，立即用鑷子揭下，將其置于液氮中，并使沾有酵母細(xì)胞的一面朝上，用鑷子使濾紙完全浸沒于液氮中1-2min；e、取出濾紙，室溫解凍；f、將沾有酵母的濾紙小心置于步驟1)中潤(rùn)濕的濾紙上，并使有酵母細(xì)胞的一面朝上；g、置于30℃溫箱內(nèi)，定期觀察酵母顏色變化情況，8小時(shí)以內(nèi)顏色變藍(lán)的菌落為陽(yáng)性克隆。
6)陽(yáng)性結(jié)合配體質(zhì)粒(陽(yáng)性AD克隆質(zhì)粒)的提取a、挑取陽(yáng)性酵母克隆于3mL SD/-Leu液體培養(yǎng)基中，30℃、250rpm搖培12-24小時(shí)；b、12,000rpm離心20s，收集酵母細(xì)胞；c、將沉淀重懸于200μl酵母裂解液中，振蕩使其充分重懸；d、加入酸洗玻璃珠，使總體積至400μl，劇烈振蕩1min；e、加入200μl PCI溶液，劇烈振蕩1min；f、12,000rpm離心5min；g、小心吸取上清至另一個(gè)離心管中，加入200μl PCI溶液并劇烈振蕩，12,000rpm離心5min；
h、小心吸取上清至另一個(gè)離心管中，加入200μl CHCl3抽提；i、小心吸取上清至另一個(gè)離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，室溫放置15min，j、12000rpm離心10min沉淀DNA；k、用1mL 70％的乙醇洗滌2遍，離心回收沉淀；l、干燥沉淀，溶解于10-20μl ddH2O中；m、電轉(zhuǎn)化1μl DNA溶液于E.Coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，鋪于LB/氨芐青霉素固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)14-16h，挑取單克隆菌落，提取質(zhì)粒。
7)酵母雙雜交二次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)現(xiàn)用酵母雙雜交的方法進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，以再次驗(yàn)證篩選獲得的陽(yáng)性相互作用，即將篩選出來的陽(yáng)性AD質(zhì)粒分別一一轉(zhuǎn)化到含誘餌質(zhì)粒的CG1945酵母細(xì)胞中，檢測(cè)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的β-半乳糖苷酶活性，確定兩個(gè)蛋白之間的相互作用，具體方法包括以下步驟a、挑選含誘餌質(zhì)粒的CG1945酵母單克隆菌落接種于3mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30℃、250rpm搖培14-16小時(shí)；b、12,000rpm離心20s，收集所有酵母細(xì)胞；c、將酵母細(xì)胞重懸于1mL ddH2O中，12,000rpm離心20s，收集酵母細(xì)胞；d、將酵母細(xì)胞重懸于1mL 100mM的LiAc溶液中，30℃溫浴5min；e、12,000rpm離心20s，收集酵母細(xì)胞，吸棄上清，依次加入下列溶液240μl 50％PEG400036μl1.0M LiAc5μl 鮭精DNA(10.0mg/mL)10μlAD質(zhì)粒(100-5000μg)45μlddH2Of、劇烈振蕩溶液至少1min，使細(xì)胞充分懸浮，42℃水浴20min；g、12,000rpm離心20s，棄上清；h、加入200-400μl ddH2O重懸細(xì)胞；i、將細(xì)胞均勻涂布在SD/-Trp-Leu-His的固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3-7天。
8)β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)檢測(cè)步驟7)酵母雙雜交二次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中獲得的酵母克隆的β-半乳糖苷酶活性，方法同步驟5)，此步驟中獲得的LacZ+克隆確定為陽(yáng)性結(jié)合配體。
9)陽(yáng)性質(zhì)粒的測(cè)序?qū)⒉襟E8)鑒定出的陽(yáng)性結(jié)合配體克隆送北京奧科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。
結(jié)果用誘餌蛋白PDZ結(jié)構(gòu)域ZO-1 PDZ1、ZO-1 PDZ3、Erbin PDZ和GIPC PDZ篩選新型隨機(jī)多肽文庫(kù)分別得到了42、37、34和15個(gè)非冗余陽(yáng)性結(jié)合配體，其C-末端序列見表2表2 PDZ結(jié)構(gòu)域篩選隨機(jī)多肽文庫(kù)結(jié)果——結(jié)合配體C-末端


二、PDZ結(jié)合配體文庫(kù)的構(gòu)建及分析1、PDZ結(jié)合配體文庫(kù)的構(gòu)建1)收集所有步驟一中篩選獲得的非冗余陽(yáng)性PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體克隆，提取質(zhì)粒；2)將陽(yáng)性克隆分別轉(zhuǎn)化到Y(jié)187(MATα)酵母細(xì)胞中，方法同步驟一；3)挑取轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞于SD/-Leu液體培養(yǎng)基中，30℃、250rpm搖培14-16小時(shí)；4)將培養(yǎng)的酵母菌液加入20％甘油溶液，-80℃保存。
結(jié)果得到由128個(gè)非冗余PDZ結(jié)合配體組成的PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體文庫(kù)。
2、PDZ結(jié)合配體文庫(kù)的分析為檢測(cè)步驟1構(gòu)建的配體庫(kù)是否能夠用于驗(yàn)證性篩選研究新的PDZ結(jié)構(gòu)域，現(xiàn)對(duì)其配體的類型和長(zhǎng)度進(jìn)行了分析，其配體類型的分布如圖2所示，該配體庫(kù)中每類配體分別是I類72個(gè)(56.25％)，II類35個(gè)(27.34％)，III類6個(gè)(4.70％)，IV類1個(gè)(0.80％)，非常規(guī)配體14個(gè)(10.90％)。除了四類傳統(tǒng)的PDZ結(jié)合配體外，此配體庫(kù)還包括非常規(guī)的結(jié)合配體(0位是C或親水性氨基酸的配體)，篩選這些非常規(guī)配體極有可能發(fā)現(xiàn)新的PDZ結(jié)合保守序列，由于I類和II類配體是PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合的主要的、最多的配體，所以此配體庫(kù)中配體類型的分布與PDZ結(jié)構(gòu)域配體結(jié)合類型的偏好性一致。配體長(zhǎng)度分布的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3所示，配體庫(kù)中配體的長(zhǎng)度最短的是6個(gè)氨基酸殘基、最長(zhǎng)的是91個(gè)氨基酸殘基，絕大多數(shù)配體的長(zhǎng)度是6-20個(gè)氨基酸殘基。由于PDZ結(jié)構(gòu)域是特異性地識(shí)別和結(jié)合配體C-末端的4個(gè)氨基酸殘基，所以配體庫(kù)中配體的長(zhǎng)度完全滿足PDZ結(jié)構(gòu)域的識(shí)別要求。上述配體類型分布和長(zhǎng)度分布分析結(jié)果均表明此配體庫(kù)適用于驗(yàn)證性篩選PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體。
三、酵母雙雜交(酵母接合實(shí)驗(yàn)，yeast mating array)驗(yàn)證性篩選PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體文庫(kù)1)將步驟一構(gòu)建的含有目的PDZ結(jié)構(gòu)域的酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CG1945(MATa)酵母細(xì)胞；2)分別取步驟二構(gòu)建的PDZ配體庫(kù)中每種配體的酵母菌液(MATα)10μl點(diǎn)在96孔培養(yǎng)板上，并分別與60μl含誘餌質(zhì)粒的酵母菌液(MATa)混勻，將混合物分別點(diǎn)在96孔YPD固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)30h；3)將生長(zhǎng)出的酵母菌落轉(zhuǎn)移至96孔SD/-His/-Leu/-Trp固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2-4天，篩選His+陽(yáng)性克隆，篩選結(jié)果如圖5所示；同時(shí)，將生長(zhǎng)出的酵母菌落轉(zhuǎn)移至96孔SD/-Leu/-Trp固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2-4天，檢測(cè)篩選效率，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，酵母接合效率為100％；4)檢測(cè)96孔SD/-His/-Leu/-Trp固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的酵母克隆的β-半乳糖苷酶活性，篩選LacZ+陽(yáng)性克隆，篩選結(jié)果如圖6所示；由于配體序列是已知的，所以，可直接從顏色變化讀出陽(yáng)性和陰性結(jié)合配體的序列。
結(jié)果以HtrA2 PDZ結(jié)構(gòu)域和LNX1 PDZ2結(jié)構(gòu)域?yàn)檎T餌蛋白，用高通量的酵母雙雜交接合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證性篩選PDZ配體庫(kù)，分別得到38和83個(gè)陽(yáng)性結(jié)合配體，其C-末端序列見表3；以ZO-1 PDZ1、ZO-1 PDZ3和Erbin PDZ結(jié)構(gòu)域?yàn)檎T餌蛋白，驗(yàn)證性篩選PDZ配體庫(kù)，分別得到16、0和3個(gè)新的陽(yáng)性結(jié)合配體，并且每個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域都鑒定出了陰性結(jié)合序列。
表3 PDZ結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證篩選陽(yáng)性結(jié)果—結(jié)合配體C-末端


四、PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合特性的分析和配體蛋白的預(yù)測(cè)1、首先將每個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域篩選獲得的所有陽(yáng)性配體序列作序列比對(duì)，并對(duì)比分析陰性序列，總結(jié)每個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性，推測(cè)共有結(jié)合序列，結(jié)果如表4所示。
2、根據(jù)共有結(jié)合序列用Tailfit軟件檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中所有C-末端序列符合共有結(jié)合序列的天然蛋白。
3、根據(jù)蛋白質(zhì)的生物學(xué)信息，如亞細(xì)胞定位、已知功能，進(jìn)一步篩選出高可信度的配體蛋白，結(jié)果如表4所示表4 用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的配體蛋白



五、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的預(yù)測(cè)的相互作用(酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證)1)合成表達(dá)上述預(yù)測(cè)配體蛋白的C-末端10個(gè)氨基酸殘基的寡聚核苷酸，以Claudin-17為例，合成表達(dá)蛋白Claudin-17(預(yù)測(cè)的ZO-1 PDZ1配體蛋白)C-末端10個(gè)氨基酸殘基的寡聚核苷酸正義鏈5’-AATTCATGCTTAGTAAGACCTCCACCAGTTATGTCTAAG-3’和反義鏈5’-GATCCTTAGACATAACTGGTGGAGGTCTTACTAAGCATG-3’；2)插入片段的制備將上述合成的編碼Claudin-17C-末端10個(gè)氨基酸殘基的正義鏈和反義鏈進(jìn)行磷酸化和退火，方法為a)在0.5mL離心管中配制反應(yīng)液10×ATP(1mM)5μl，10×T4多核苷酸激酶緩沖液5μl，T4多核苷酸激酶5μl，ddH2O 30μl；b)將此反應(yīng)液平均分成A、B兩管(22.5μl/管)，在A管中加入正義鏈2.5μl，在B管中加入反義鏈2.5μl(正、反義鏈的原始濃度均為11.5μM)；c)A、B管均于37℃溫育1h，合并A、B管的反應(yīng)產(chǎn)物，共獲得反應(yīng)液50μl；d)將此反應(yīng)液于80℃反應(yīng)30min；置于室溫20min，使正、反義鏈之間退火；e)在退火后反應(yīng)液中加入450μl ddH2O稀釋，得到反應(yīng)液C。
3)連接將步驟2)獲得的Claudin-17 C-末端10個(gè)氨基酸殘基的編碼序列連接入載體pGADT7中，連接體系為經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切的載體pGADT7 1μl，反應(yīng)液C7μl，10×連接緩沖液1μl，T4DNA連接酶1μl(2U)，16℃反應(yīng)16個(gè)小時(shí)；4)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，鋪于LB/氨芐青霉素固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)14-16小時(shí)；5)挑取單克隆菌落，提質(zhì)粒，用PCR和酶切反應(yīng)鑒定是否正確插入目的DNA片段，將陽(yáng)性克隆送北京奧科生物技術(shù)有限公司測(cè)序；6)將構(gòu)建的表達(dá)預(yù)測(cè)配體蛋白C-末端的AD質(zhì)粒與表達(dá)相應(yīng)PDZ結(jié)構(gòu)域的BD質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)化酵母CG1945；7)檢測(cè)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的β-半乳糖苷酶活性；8)將構(gòu)建的天然蛋白C-末端克隆加入到所構(gòu)建的PDZ配體庫(kù)中，擴(kuò)充配體庫(kù)。
經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，四種PDZ結(jié)構(gòu)域(ZO-1 PDZ1，PDZ3，Erbin PDZ和GIPC PDZ)都發(fā)現(xiàn)了新的配體蛋白，見表4中*標(biāo)示的蛋白。
以上實(shí)施例是以人類PDZ結(jié)構(gòu)域?yàn)槔?，說明了本發(fā)明驗(yàn)證性篩選該結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體的方法，與此類似，本發(fā)明的方法完全適用于篩選WW結(jié)構(gòu)域，GYF結(jié)構(gòu)域，EVH1結(jié)構(gòu)域，SH3結(jié)構(gòu)域和VHS結(jié)構(gòu)域等其它結(jié)合非修飾線形短肽結(jié)構(gòu)域的結(jié)合配體，理由如下絕大多數(shù)蛋白質(zhì)相互作用是通過相互作用結(jié)構(gòu)域與其識(shí)別模體的結(jié)合完成的。很大一部分相互作用結(jié)構(gòu)域識(shí)別和結(jié)合的是非修飾線形短肽，包括PDZ結(jié)構(gòu)域(識(shí)別S/T/Φ-x-Φ-COOH motif)，WW結(jié)構(gòu)域(識(shí)別PPxY motif)，GYF結(jié)構(gòu)域(識(shí)別PPG-F/I/L/M/V motif)，EVH1結(jié)構(gòu)域(識(shí)別FPPPPxD/E motif)，SH3結(jié)構(gòu)域(識(shí)別PxxP/RxxK motif)和VHS結(jié)構(gòu)域(識(shí)別D/E-xxLL motif)等多種結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性有著共同的特點(diǎn)1)其識(shí)別模體都是配體蛋白上的一段保守的線形短肽；2)這些結(jié)構(gòu)域家族的不同成員之間有著相同或相似的結(jié)合特性，因此彼此之間所識(shí)別的配體有差異，也有重疊；3)在某個(gè)結(jié)構(gòu)域家族中，一個(gè)成員可以結(jié)合多個(gè)配體，一個(gè)結(jié)合配體能夠被多個(gè)成員識(shí)別。上述這些共同的特點(diǎn)正是本發(fā)明方法建立的理論基礎(chǔ)，凡滿足這些特點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域均適用于本發(fā)明的方法。上述實(shí)施例只是以PDZ結(jié)構(gòu)域?yàn)槔?，詳?xì)闡述和證明了本發(fā)明方法的原理和可行性，其它結(jié)構(gòu)域在此不再一一贅述。
用本發(fā)明的方法獲得的結(jié)合配體和構(gòu)建的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體文庫(kù)可用于蛋白質(zhì)和多肽功能的研究以及相關(guān)藥物的研發(fā)。
權(quán)利要求
1.一種驗(yàn)證性篩選目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體的方法，包括以下步驟1)用酵母雙雜交系統(tǒng)，以目的結(jié)構(gòu)域家族中結(jié)合特性有代表性的成員為誘餌蛋白篩選酵母雙雜交文庫(kù)，所述酵母雙雜交文庫(kù)包括隨機(jī)多肽文庫(kù)、或任一物種的細(xì)胞或組織的基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)；2)建立目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體文庫(kù)收集步驟1)篩選獲得的結(jié)合配體克隆以及其它已知或可能的目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體克隆，得到目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體文庫(kù)；3)以該目的結(jié)構(gòu)域家族中的其它成員或所述步驟1)中的結(jié)構(gòu)域成員為誘餌蛋白，用酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證性篩選步驟2)構(gòu)建的結(jié)合配體文庫(kù)，得到目的結(jié)構(gòu)域的陽(yáng)性和陰性結(jié)合配體；4)對(duì)步驟1)和/或步驟3)中篩選得到的每個(gè)目的結(jié)構(gòu)域的陽(yáng)性結(jié)合配體序列和陰性結(jié)合配體序列進(jìn)行序列分析，總結(jié)每個(gè)目的結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性，推測(cè)其共有結(jié)合序列；5)用步驟4)中推測(cè)的共有結(jié)合序列檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中所有可能與目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合的配體蛋白；再根據(jù)蛋白質(zhì)的生物學(xué)信息，進(jìn)一步預(yù)測(cè)最有可能的目的結(jié)構(gòu)域的配體蛋白；6)用常規(guī)的鑒定蛋白質(zhì)相互作用的方法驗(yàn)證步驟5)預(yù)測(cè)的目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體蛋白，得到與目的結(jié)構(gòu)域相互作用的配體蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中的目的結(jié)構(gòu)域?yàn)榻Y(jié)合非修飾線形短肽的結(jié)構(gòu)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述目的結(jié)構(gòu)域?yàn)镻DZ結(jié)構(gòu)域、WW結(jié)構(gòu)域、GYF結(jié)構(gòu)域、EVH1結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域或VHS結(jié)構(gòu)域。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述PDZ結(jié)構(gòu)域中結(jié)合特性有代表性的成員為ZO-1 PDZ1，PDZ3，Erbin PDZ和GIPC PDZ。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)中已知或可能的目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體克隆包括已知的目的結(jié)構(gòu)域配體蛋白的cDNA克隆，預(yù)測(cè)的目的結(jié)構(gòu)域配體蛋白的cDNA克隆，目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合多肽克隆和目的結(jié)構(gòu)域的潛在結(jié)合多肽克隆。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于若步驟3)沒有篩選到足夠數(shù)量的結(jié)合配體，則進(jìn)行補(bǔ)充篩選，方法為以該結(jié)構(gòu)域?yàn)檎T餌蛋白進(jìn)行步驟1)的篩選，然后將篩選到的結(jié)合配體克隆添加到步驟2)構(gòu)建的結(jié)合配體文庫(kù)中，擴(kuò)充配體庫(kù)，接著進(jìn)行步驟3)-6)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述步驟5)中的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)包括Swiss-Prot，Nr和IPI；所述蛋白質(zhì)的生物學(xué)信息包括蛋白的亞細(xì)胞定位和已知功能。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述步驟6)中的驗(yàn)證方法為酵母雙雜交系統(tǒng)、蛋白質(zhì)Pull-Down方法或免疫共沉淀方法。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于將在所述步驟6)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的天然蛋白克隆添加到步驟3)構(gòu)建的結(jié)合配體文庫(kù)中，擴(kuò)充配體庫(kù)。
10.用權(quán)利要求1-4任一所述方法構(gòu)建的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體文庫(kù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種驗(yàn)證性篩選目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體的方法。該方法包括以下步驟1)以目的結(jié)構(gòu)域家族中結(jié)合特性有代表性的成員為誘餌蛋白篩選酵母雙雜交文庫(kù)；2)收集步驟1)篩選獲得的結(jié)合配體克隆以及其它已知或可能的目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體克隆，得到目的結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體文庫(kù)；3)以該結(jié)構(gòu)域家族中的其它成員或步驟1)中的成員為誘餌蛋白，用酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證性篩選步驟2)構(gòu)建的結(jié)合配體文庫(kù)，得到目的結(jié)構(gòu)域的陽(yáng)性和陰性結(jié)合配體；4)分析步驟1)和/或步驟3)篩選得到的目的結(jié)構(gòu)域的陽(yáng)性和陰性結(jié)合序列，總結(jié)結(jié)合特性和共有結(jié)合序列；5)預(yù)測(cè)目的結(jié)構(gòu)域的配體蛋白；6)驗(yàn)證預(yù)測(cè)的相互作用，得到與目的結(jié)構(gòu)域相互作用的配體蛋白。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101037707SQ20061005718
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2006年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月13日
發(fā)明者高友鶴, 宋婀莉, 高詩(shī)娟, 田瑞, 馬素參, 黃海明 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所