專利名稱：微流控芯片及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于毛細(xì)管電泳芯片和快速化學(xué)發(fā)光聯(lián)用的分析技術(shù)，特別涉及微流控芯片及在線化學(xué)發(fā)光體系，并將其集成為一體用于臨床多種腫瘤標(biāo)志物同步分析和腫瘤的早期診斷。
背景技術(shù)：
免疫分析是利用抗原/抗體反應(yīng)來測定痕量物質(zhì)的一種高靈敏度、高選擇性的方法，它為血清腫瘤標(biāo)志物的臨床免疫測定提供了有力手段。通常血清腫瘤標(biāo)志物的免疫測定方法大多采用“雙抗體夾心法”，如放射免疫分析、酶聯(lián)免疫、時間分辨熒光法、化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光法。放射免疫分析法由于其標(biāo)記簡單，靈敏度高，干擾少，應(yīng)用范圍寬等特點，一度成為臨床免疫學(xué)檢驗中最常用的方法。但它需要進行放射性操作，對人體構(gòu)成危害，試劑壽命也有限等局限性，促使人們不斷探索非放射性標(biāo)記的免疫分析方法，因此酶免疫分析、熒光時間分辨免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析和電化學(xué)免疫分析等一系列非放射性標(biāo)記的新方法相繼得到發(fā)展。這些方法極大地促進了臨床免疫檢測項目的推陳出新和檢測手段的自動化、智能化和網(wǎng)絡(luò)化。然而這些方法需采用專用包被板(管)，檢測過程需要較長時間的溫育、多次洗板和專用儀器檢測，檢測周期長，操作步驟繁瑣，成本高。盡管已出現(xiàn)全自動免疫分析儀，但可檢測項目有限，儀器體積較大，儀器和試劑的價格昂貴，難以廣泛使用，因而在惡性腫瘤的早期診斷、預(yù)后監(jiān)測和大規(guī)模篩查方面受到限制。如何簡化操作步驟，縮短分析時間，降低檢測成本，儀器的小型化和便攜化，提高檢測的準(zhǔn)確度和靈敏度，研制新型的檢測儀器將是十分必要的和具有重要意義的。瑞士的A.Manz在1990年提出了微全分析系統(tǒng)(Micro TotalAnalysis Systems，μ-TAS)的概念，為上述問題的解決提供了一種全新思路。
微全分析系統(tǒng)是一個跨學(xué)科的新領(lǐng)域，它利用微機電加工(MEMS)技術(shù)與生物技術(shù)的結(jié)合，把分析實驗室的功能集成到一個芯片上。因此，微全分析系統(tǒng)也稱為“芯片實驗室”。根據(jù)芯片結(jié)構(gòu)及工作原理，可將微全分析系統(tǒng)分為兩大類微陣列芯片(Microarray chip)和微流控芯片(Microfluidicchip)。微陣列芯片技術(shù)，是一種被動式芯片技術(shù)，它是將待測樣品的探針固定芯片的表面，形成陣列結(jié)構(gòu)，但其檢測成本一般較高和同時檢測時間上也相對較長，存在非特異性的干擾，檢測結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性和假陰性。微流控芯片作為第二代芯片技術(shù)，是一種主動式芯片技術(shù)，解決了陣列芯片的以上缺憾，同時也繼承了其高通量的特點(微流控芯片也可以做成陣列形式，形成陣列電泳)。陣列毛細(xì)管電泳已在人類基因組的測序發(fā)揮了巨大的作用。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)時代的到來，微流控芯片技術(shù)將發(fā)揮更大的作用。相對于傳統(tǒng)的免疫分析，基于微流控芯片的免疫分析系統(tǒng)具有如下優(yōu)勢(1)耗樣量少；(2)操作簡單，步驟大大簡化；(3)可以同時分析多個樣品；(4)靈敏度較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的一在于提供一種微流控芯片。
本發(fā)明的再一目的是提供目的一的微流控芯片用于臨床多種腫瘤標(biāo)志物同步分析和腫瘤的早期診斷，使用該微流控芯片可進行多種腫瘤標(biāo)志物的快速同步分離和檢測，操作簡單，整個檢測成本低廉。
本發(fā)明的微流控芯片是集成分離和在線化學(xué)發(fā)光檢測為一體，由基片和蓋片組成(如圖1所示)，在基片上設(shè)有分離緩沖液池1、樣品廢液池2、待測樣品池3、分離廢液池4、發(fā)光底物進樣池5、檢測窗口6；所述的各池之間由微管道相連通；其中微管道分為待測樣品進樣通道7、分離通道8、發(fā)光底物進樣通道9；所述的分離通道8為簡單的直通道，由待測樣品池3至分離廢液池4；所述的待測樣品的進樣通道7的兩端分別為分離通道8和待測樣品池3，待測樣品進樣通道7與分離通道8的交匯點為微流控芯片的十字交叉口10；檢測窗口6位于微流控芯片的十字交叉口10與分離廢液池4之間的分離通道8上；所述的發(fā)光底物進樣通道9的兩端分別連接檢測窗口6處的分離通道8和發(fā)光底物進樣池5。所述的分離緩沖液池1、樣品廢液池2、待測樣品池3、分離廢液池4、發(fā)光底物進樣池5的里面分別安裝有電極，且這些電極分別通過各自對應(yīng)的電極與高壓電源相連。
所述的發(fā)光底物的進樣通道9與分離通道垂直相連通，易于形成樣品和底物有效的混合和反應(yīng)。
所述的微流控芯片的制作材料選自(基片和蓋片)玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷等透明性高聚物、聚苯乙烯、聚氯乙烯、酚醛樹脂、環(huán)氧樹脂、聚氨酯中的一種或一種以上的任意共聚物。
本發(fā)明的微流控芯片上的所有通道的驅(qū)動方式都為電滲進樣方式，形式簡單、統(tǒng)一，易于高密度集成。
基于以上的單通道電泳分離和在線化學(xué)發(fā)光檢測而形成的陣列毛細(xì)管電泳分離和化學(xué)發(fā)光冷CCD掃描成像的芯片體系可以進行高通量的檢測。
本發(fā)明的微流控芯片用于臨床多種腫瘤標(biāo)志物同步分析和腫瘤的早期診斷，使用該微流控芯片可進行多種腫瘤標(biāo)志物的快速同步分離和檢測。
本發(fā)明采用高效快速的發(fā)光底物是通用試劑魯米諾或APS-5(美國Lumigen公司)，其中APS-5的結(jié)構(gòu)如下 它們分別對應(yīng)常用的酶標(biāo)記物辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)，用于臨床腫瘤的早期診斷；其中魯米諾對應(yīng)辣根過氧化物酶，APS-5對應(yīng)堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)。
用于本發(fā)明免疫分析用微流控芯片的特異性抗體可以為抗蛋白抗體、抗核酸抗體或抗激素小分子抗體。
本發(fā)明具有簡單的芯片構(gòu)造，制作簡單，分離效率高，檢測靈敏度高，將該微流控芯片用于臨床腫瘤的早期診斷分析系統(tǒng)成本低易于推廣。


圖1.本發(fā)明實施例1的微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2.本發(fā)明實施例1的AFP和AFP-mAb-ALP芯片電泳分離圖譜。
圖3.本發(fā)明實施例1的甲胎蛋白芯片電泳分離圖譜。
圖4.本發(fā)明實施例1的根據(jù)AFP-mAb-ALP分離檢測峰的峰高得到的工作曲線。
圖5.本發(fā)明實施例2的癌胚抗原芯片電泳分離圖譜。
圖6.本發(fā)明實施例2的根據(jù)CEA-mAb-ALP分離檢測峰的峰高得到的工作曲線。
圖7.本發(fā)明實施例3的含有甲胎蛋白和癌胚抗原的血清芯片電泳分離圖譜。
附圖標(biāo)記1.分離緩沖液池 2.樣品廢液池 3.待測樣品池4.分離廢液池5.發(fā)光底物進樣池 6.檢測窗口7.待測樣品進樣通道 8.分離通道9.發(fā)光底物進樣通道10.微流控芯片的十字交叉口具體實施方式
實施例1芯片設(shè)計和制作(1)按圖1所示的結(jié)構(gòu)設(shè)計制作微流控芯片。
在玻璃基片上使用金剛石鉆頭分別打出1～3mm的分離緩沖液池1、樣品廢液池2、待測樣品池3、分離廢液池4、發(fā)光底物進樣池5；各池之間由寬100μm，深30μm(弱酸性玻璃腐刻液BOE溶液，濕法刻蝕1小時得到)的微管道相連通；其中待測樣品池3至分離廢液池4的直通分離通道8長為4cm；待測樣品池3和分離通道8之間由待測樣品的進樣通道7相連通，待測樣品進樣通道7與分離通道8相通的交匯點為微流控芯片的十字交叉口10；一檢測窗口6位于微流控芯片的十字交叉口10與分離廢液池4之間的分離通道8上；在檢測窗口6處的分離通道8和發(fā)光底物進樣池5之間由發(fā)光底物進樣通道9相連通。
所述的分離緩沖液池1、樣品廢液池2、待測樣品池3、分離廢液池4、發(fā)光底物進樣池5的里面分別安裝有電極，且這些電極分別通過各自對應(yīng)的電極與高壓電源相連。然后將一微流控芯片的蓋片覆蓋在基片上。
(2)以肝癌的腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)為例，該蛋白為單鏈糖蛋白，分子量約65～70KD。首先將含AFP的血清與mAb-ALP反應(yīng)(37℃溫育30min)之后，取其反應(yīng)后的溶液進行分離。選用3.75mM的硼砂溶液，20mMNaCl，0.01％Tween 20(pH＝9.68)作為分離的緩沖液體系。進樣電場為300V/cm，分離電場為400V/cm，化學(xué)發(fā)光底物的進樣電場為400V/cm。采用基于“時間”的進樣方式首先將待測樣品放入待測樣品池3內(nèi)，然后按順序?qū)⒎蛛x緩沖液放入分離緩沖液池1、樣品廢液池2、分離廢液池4內(nèi)；由于微通道尺寸都在微米級范圍內(nèi)，各個試樣池內(nèi)的溶液可自動在毛細(xì)驅(qū)動力的作用下進入各自相連的微通道內(nèi)(如果加快溶液進入微通道內(nèi)，先將除分離廢液池之外的各個溶液池充滿所對應(yīng)的溶液，在分離廢液池上加上負(fù)壓，使得各個溶液池內(nèi)的溶液進入所連通道，當(dāng)微通道溶液在負(fù)壓的作用下到達分離廢液池內(nèi)后，最后將分離廢液池充滿分離緩沖液)。打開待測樣品池電極和分離廢液池電極，同時使樣品廢液池電極和分離緩沖液池電極懸浮起來，進樣5秒，待測樣品從待測樣品池3經(jīng)進樣通道7進入芯片的十字交叉口10；然后打開分離緩沖液池電極、發(fā)光底物進樣池電極和分離廢液池電極，使待測樣品池電極和樣品廢液池電極懸浮，待測樣品經(jīng)分離通道8電泳分離，進入檢測窗口6進行檢測；經(jīng)檢測后的樣品區(qū)帶在電驅(qū)動下最終進入分離廢液池。得到芯片電泳圖譜如圖2所示。A為mAb-ALP分離檢測峰，B為AFP-mAb-ALP免疫復(fù)合物的分離檢測峰。AFP腫瘤標(biāo)志物的分離與檢測在3分鐘內(nèi)完成。在保持其它條件不變的情況下，改變AFP的濃度(2.09mIU/L；6.14mIU/L；19.72mIU/L；60.21mIU/L；200.81mIU/L)，進行分離檢測可以得到如圖3所示的分離圖譜，根據(jù)AFP-mAb-ALP分離檢測峰的峰高得到如圖4的工作曲線(相關(guān)系數(shù)R＝0.993)。檢測靈敏度為0.6ng/nL。
實施例2芯片設(shè)計和制作同實施例1。
以直結(jié)腸癌的標(biāo)志物癌胚抗原(CEA)為例，該腫瘤標(biāo)志物分子量約為180KD。首先將含CEA的血清與mAb-ALP反應(yīng)(37℃溫育30min)之后，取其反應(yīng)后的溶液進行分離。選用3.75mM的硼砂溶液，20mM NaCl，0.01％Tween 20(pH＝9.68)作為分離的緩沖液體系。進樣電場為300V/cm，分離電場為400V/cm，化學(xué)發(fā)光底物的進樣電場為400V/cm。采用基于“時間”的進樣方式打開待測樣品池電極和分離廢液池電極，同時使樣品廢液池電極和分離緩沖液池電極懸浮起來，進樣5秒，待測樣品從待測樣品池3經(jīng)進樣通道7進入芯片的十字交叉口10；然后打開分離緩沖液池電極、發(fā)光底物進樣池電極和分離廢液池電極，使待測樣品池電極和樣品廢液池電極懸浮，待測樣品經(jīng)分離通道8電泳分離，進入檢測窗口6進行檢測。得到芯片電泳圖譜如圖5所示。在150s分離檢測到的是mAb-ALP，在250s得到的是CEA-mAb-ALP免疫復(fù)合物的分離檢測峰。對應(yīng)CEA的濃度(80mIU/L；200mIU/L；1000mIU/L；2000mIU/L)根據(jù)CEA-mAb-ALP分離檢測峰的峰高得到如圖6的工作曲線(相關(guān)系數(shù)R＝0.999)。檢測靈敏度為0.3ng/nL。
實施例3芯片設(shè)計和制作同實施例1。
首先將含CEA的血清和AFP血清分別與其對應(yīng)的mAb-ALP反應(yīng)(37℃溫育30min)之后，然后將兩種溶液混合，取其混合溶液進行分離。選用3.75mM的硼砂溶液，20mM NaCl，0.01％Tween 20(pH＝9.68)作為分離的緩沖液體系。進樣電場為300V/cm，分離電場為400V/cm，化學(xué)發(fā)光底物的進樣電場為400V/cm。采用基于“時間”的進樣方式打開待測樣品池電極和分離廢液池電極，同時使樣品廢液池電極和分離緩沖液池電極懸浮起來，進樣5秒，待測樣品從待測樣品池3經(jīng)進樣通道7進入芯片的十字交叉口10；然后打開分離緩沖液池電極、發(fā)光底物進樣池電極和分離廢液池電極，使待測樣品池電極和樣品廢液池電極懸浮，待測樣品經(jīng)分離通道8電泳分離，進入檢測窗口6進行檢測。得到芯片電泳圖譜如圖7所示。從圖中可以看出35s的分離檢測峰對應(yīng)的為AFP標(biāo)記抗體，110s的分離檢測峰對應(yīng)的為AFP的免疫復(fù)合物，150s的分離檢測峰對應(yīng)的為CEA的標(biāo)記抗體，250s對應(yīng)的為CEA免疫復(fù)合物。峰高表征對應(yīng)的含量，并可由AFP和CEA的工作曲線(圖4和圖5)查出。
權(quán)利要求
1.一種微流控芯片，是集成分離和在線化學(xué)發(fā)光檢測為一體，微流控芯片上的所有通道的驅(qū)動方式都為電滲進樣方式，其特征是所述的微流控芯片由基片和蓋片組成，在基片上設(shè)有分離緩沖液池(1)、樣品廢液池(2)、待測樣品池(3)、分離廢液池(4)、發(fā)光底物進樣池(5)、檢測窗口(6)；所述的各池之間由微管道相連通；其中微管道分為待測樣品進樣通道(7)、分離通道(8)、發(fā)光底物進樣通道(9)；所述的分離通道(8)由待測樣品池(3)至分離廢液池(4)；所述的待測樣品的進樣通道(7)的兩端分別為樣品廢液池(2)和分離緩沖液池(1)，待測樣品進樣通道(7)與分離通道(8)的交匯點為微流控芯片的十字交叉口(10)；檢測窗口(6)位于微流控芯片的十字交叉口(10)與分離廢液池(4)之間的分離通道(8)上；所述的發(fā)光底物進樣通道(9)的兩端分別連接檢測窗口(6)處的分離通道(8)和發(fā)光底物進樣池(5)；所述的分離緩沖液池(1)、樣品廢液池(2)、待測樣品池(3)、分離廢液池(4)、發(fā)光底物進樣池(5)的里面分別安裝有電極，且這些電極分別通過各自對應(yīng)的電極與高壓電源相連。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征是所述的發(fā)光底物的進樣通道(9)與分離通道垂直相連通。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征是所述的微流控芯片的材料選自玻璃，聚甲基丙烯酸甲酯，聚二甲基硅氧烷中的一種，或聚苯乙烯、聚氯乙烯、酚醛樹脂、環(huán)氧樹脂、聚氨酯中的一種或一種以上的任意共聚物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項所述的微流控芯片的用途，其特征是所述的微流控芯片用于臨床多種腫瘤標(biāo)志物同步分析和腫瘤的早期診斷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項所述的微流控芯片的用途，其特征是所述的微流控芯片能夠進行多種腫瘤標(biāo)志物的快速同步分離和檢測。
全文摘要
本發(fā)明屬于毛細(xì)管電泳芯片和快速化學(xué)發(fā)光聯(lián)用的分析技術(shù)，涉及微流控芯片及在線化學(xué)發(fā)光體系，并將其集成為一體用于臨床多種腫瘤標(biāo)志物同步分析和腫瘤的早期診斷。在由基片和蓋片組成的芯片的基片上設(shè)有由微管道相連通的分離緩沖液池(1)、樣品廢液池(2)、待測樣品池(3)、分離廢液池(4)、發(fā)光底物進樣池(5)、檢測窗口(6)；分離通道(8)由待測樣品池至樣品廢液池；待測樣品進樣通道與分離通道的交匯點為微流控芯片的十字交叉口(10)；檢測窗口位于十字交叉口與分離廢液池之間的分離通道上；發(fā)光底物進樣通道的兩端分別連接檢測窗口和發(fā)光底物進樣池；各池里面安裝有電極，且這些電極分別通過各自對應(yīng)的電極與高壓電源相連。
文檔編號G01N33/543GK101034064SQ200610058759
公開日2007年9月12日 申請日期2006年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月6日
發(fā)明者高云華, 李成武 申請人:中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所