專利名稱：評(píng)價(jià)乙肝患者機(jī)體免疫力水平的方法、應(yīng)用于該方法的檢測(cè)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種評(píng)價(jià)乙肝病毒感染者機(jī)體免疫力水平的方法，還涉及應(yīng)用于該方法的兩種檢測(cè)試劑盒及其制備，該方法通過(guò)檢測(cè)乙肝核心抗原抗體亞類IgG3/IgG1比值評(píng)價(jià)乙肝病毒感染者的免疫力水平，其檢測(cè)結(jié)果同乙肝五項(xiàng)指標(biāo)、ALT的檢測(cè)結(jié)果對(duì)照，對(duì)判斷HBV病毒在體內(nèi)的發(fā)展和治療情況的預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的全球性傳染病，據(jù)估計(jì)，全世界目前大約有3億乙肝病毒攜帶者，且這一數(shù)字還在增加。其中，中國(guó)是乙型肝炎的高流行區(qū)，據(jù)我國(guó)70年代末和90年代初兩次全國(guó)肝炎的流行病學(xué)調(diào)查的數(shù)據(jù)顯示，我們國(guó)家感染過(guò)乙肝病毒的人有6.9億，感染率是57.6％，長(zhǎng)期攜帶乙肝病毒的人有1.2億，乙肝病毒表面抗原的攜帶率9.75％，歷年累積下來(lái)，現(xiàn)有慢性乙肝病人約兩千多萬(wàn)。HBV屬嗜肝病毒家族，可引起急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化，而且與肝癌的發(fā)生有密切的關(guān)系。
CD4+細(xì)胞是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的一類重要調(diào)節(jié)性細(xì)胞，具有輔助體液免疫和細(xì)胞免疫的功能。1986年Mosmann據(jù)其產(chǎn)生的細(xì)胞因子的不同，將小鼠CD4+細(xì)胞分為Th1和Th2兩個(gè)亞群，Th1主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α，主要參與誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)和產(chǎn)生IgG2a型抗體，Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-IO、IL-13等細(xì)胞因子，刺激B細(xì)胞增殖和分化，主要參與介導(dǎo)體液免疫和產(chǎn)生IgG1和IgE型抗體。Th1、Th2相互調(diào)節(jié)、相互制約，共同維持機(jī)體的免疫狀態(tài)。隨著對(duì)Th1和Th2的研究逐步深入，發(fā)現(xiàn)在人類也存在Th1和Th2細(xì)胞，現(xiàn)在已經(jīng)明確Th1/Th2型細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，影響免疫應(yīng)答的格局。人TH2通過(guò)分泌IL-4和IL-5輔助IgG1和IgA合成，分泌IL-10，抑制TH1細(xì)胞合成細(xì)胞因子，而TH1對(duì)IgG1合成則有抑制作用，但輔助其他幾種類型IG的合成，包括IgG3的合成。因此TH2功能與抗體亞類IgG1產(chǎn)量相關(guān)，TH1功能與抗體亞類IgG3產(chǎn)量相關(guān)。
免疫學(xué)研究表明TH1/TH2應(yīng)答能反映機(jī)體對(duì)病源體清除的能力。TH1和TH2型細(xì)胞因子的平衡是機(jī)體處于正常狀態(tài)的保證，二者失衡是感染、自身免疫病、變態(tài)反應(yīng)、器官移植排斥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生與惡化的重要促進(jìn)因素。在HBV感染中，機(jī)體能否建立有效清除HBV的保護(hù)性免疫有賴于免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞免疫和體液免疫，而免疫應(yīng)答過(guò)程需要多種免疫細(xì)胞的參與，其中Th細(xì)胞起重要作用。
研究已經(jīng)證實(shí)乙型肝炎的發(fā)生和發(fā)展與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)。許多臨床表明，慢乙肝的發(fā)展和后果主要取決于宿主的免疫應(yīng)答。
一般認(rèn)為Th1免疫應(yīng)答能增強(qiáng)宿主對(duì)感染(尤其是胞內(nèi)病原體)的免疫應(yīng)答和防御功能，而Th2應(yīng)答則與感染的進(jìn)展、持續(xù)性和慢化性有關(guān)，Th1和Th2所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)通常是通過(guò)自己分泌的細(xì)胞因子互相抑制的，既總是一個(gè)較另外一個(gè)具有優(yōu)勢(shì)。以往的研究已經(jīng)證實(shí)，在乙肝慢性者外周血中TH2占優(yōu)勢(shì)，TH1較弱。
在慢性肝炎TH1和TH2的對(duì)比中，TH1類細(xì)胞因子明顯降低(P＜0.001)，TH2類細(xì)胞則升高(P＜0.001)，即在慢性肝炎中，細(xì)胞免疫下降，而體液免疫加強(qiáng)，TH1/TH2類細(xì)胞免疫應(yīng)答出現(xiàn)了失衡，可見(jiàn)TH2類細(xì)胞因子水平上升與感染慢性化相關(guān)；目前的研究顯示，TH2型細(xì)胞應(yīng)答與病情慢性化有關(guān)，TH2型應(yīng)答愈占優(yōu)勢(shì)，炎癥反應(yīng)愈趨向于慢性化。各型慢性肝炎中，TH1類細(xì)胞因子均降低，TH2類細(xì)胞因子則升高。自限性HBV急性感染期間以Th1應(yīng)答為主，恢復(fù)期表現(xiàn)以Th0細(xì)胞應(yīng)答占優(yōu)(即同時(shí)分泌Th1類和Th2類細(xì)胞因子)，但分泌水平均下降。因此機(jī)體對(duì)HBV的免疫應(yīng)答失衡是慢性乙型肝炎的重要發(fā)生機(jī)制之一，表現(xiàn)為Th1型免疫低下而Th2型免疫亢進(jìn)。Th1型免疫低下致使免疫系統(tǒng)不能產(chǎn)生足量的Tc細(xì)胞及Th1型細(xì)胞因子以殺傷、破壞病毒感染的靶細(xì)胞和抑制病毒基因的復(fù)制及表達(dá)，機(jī)體不能及時(shí)清除病毒；Th2型細(xì)胞因子則進(jìn)一步抑制Th1型免疫應(yīng)答；病毒抗原的持續(xù)刺激又誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞凋亡或無(wú)能，因此形成宿主對(duì)病毒抗原的免疫耐受；最終導(dǎo)致了HBV的慢性持續(xù)感染。
因此如何檢測(cè)宿主(即患者)的免疫應(yīng)答對(duì)于有效治療和預(yù)后預(yù)示都是具有重大意義。
當(dāng)前判斷疾病免疫發(fā)病機(jī)制中Th1或Th2細(xì)胞效應(yīng)為主導(dǎo)的方法，主要是依據(jù)炎癥組織局部細(xì)胞因子的表達(dá)，也可根據(jù)外周血清中抗體反應(yīng)，如IgG亞類的變化進(jìn)行判斷。細(xì)胞因子檢測(cè)方法既檢測(cè)TH1相關(guān)的IL-2、IFNγ和TH2相關(guān)的IL-4、IL-10。本方法檢測(cè)指標(biāo)較多，聯(lián)合評(píng)價(jià)方法復(fù)雜。由于已經(jīng)知道TH2與抗體亞類IgG1相關(guān)，TH1與抗體亞類IgG3相關(guān)，因此檢測(cè)抗體的亞類是個(gè)可以選擇的方向。
乙型肝炎病毒核心抗原(hepatitis B virus core antigen，HBcAg)蛋白由183～185個(gè)氨基酸殘基(各亞型之間稍有不同)組成，相對(duì)分子質(zhì)量為21000，其C端富含精氨酸，有結(jié)合核酸RNA的能力，并與其組裝成乙肝核心顆粒有關(guān)，同時(shí)也含有多種蛋白酶作用位點(diǎn)，N端的1～144位氨基酸殘基是真正的顆粒裝配區(qū)。HBcAg能夠直接激活B細(xì)胞，是典型的T細(xì)胞非依賴性抗原。同時(shí)HBcAg也是強(qiáng)有效的T細(xì)胞免疫原，即也是T細(xì)胞依賴性抗原。
HBcAg為強(qiáng)免疫原，幾乎在所有HBV感染中均可出現(xiàn)抗-HBc和T細(xì)胞應(yīng)答。乙肝感染后，HBcAb在絕大部分患者體液內(nèi)都可以獲得，目前所檢測(cè)方法均為測(cè)總抗體方法，沒(méi)有對(duì)其抗體亞類進(jìn)行檢測(cè)。在多種病毒和寄生蟲的免疫機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，患者感染后血液中總的IgG也許是正常，但是IgG某些亞類是缺陷的，而不同亞類IgG與肌體免疫保護(hù)力相關(guān)，因此此時(shí)正常水平總的IgG可能是誤導(dǎo)，不能起到診斷的作用。
目前臨床上缺乏簡(jiǎn)便的手段來(lái)衡量乙肝患者自身對(duì)病源體清除的能力。申請(qǐng)人研究發(fā)現(xiàn)了檢測(cè)乙肝核心抗體中的IgG3和IgG1亞類的比值可以反映乙肝患者體內(nèi)TH1/TH2的平衡，并發(fā)現(xiàn)這對(duì)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)可以預(yù)示疾病恢復(fù)，肌體免疫力。對(duì)不同人群乙肝抗體亞類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)乙肝核心抗體IgG3亞類與IgG1亞類的比率是預(yù)示肝炎疾病轉(zhuǎn)歸的指示性指標(biāo)。由于IgG3/IgG1被認(rèn)為可以反映TH1/TH2的相關(guān)情況，因此檢測(cè)IgG3/IgG1可以用于評(píng)價(jià)乙肝病毒感染者免疫力水平。本方法較采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血清TH1型細(xì)胞因子(IL-2、IFNγ)和TH2型細(xì)胞因子(IL4、IL-I0)水平判斷TH1/TH2更為簡(jiǎn)便。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便有效的評(píng)價(jià)乙肝患者機(jī)體免疫力水平的方法，還提供了應(yīng)用于該方法的兩種檢測(cè)試劑盒及其制備方法。采用本發(fā)明的方法和產(chǎn)品，可以更好地評(píng)估乙型肝炎感染后機(jī)體的免疫情況，更好地評(píng)價(jià)治療效果和預(yù)后情況，并配合現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)，為乙肝患者的治療提供幫助。
本發(fā)明提供的評(píng)價(jià)乙肝患者機(jī)體免疫力水平的方法，包括下列步驟(1)檢測(cè)核心抗體亞類IgG3和IgG1；(2)計(jì)算IgG3和IgG1的比值；(3)根據(jù)IgG3和IgG1的比值評(píng)估乙肝患者機(jī)體清除病原體的能力，預(yù)測(cè)乙肝治療效果和預(yù)后。
其中所述核心抗體亞類IgG3和IgG1的檢測(cè)方法可以采用下列方法中的一種或幾種酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法、時(shí)間分辨方法、流式細(xì)胞儀。
如IgG3/IgG1的比值小于1，說(shuō)明機(jī)體免疫能力不完善，比值越小說(shuō)明免疫能力越不完善；隨著比值升高，顯示機(jī)體免疫能力趨向完善，如果IgG3/IgG1的比值大于1，說(shuō)明機(jī)體免疫能力較好，治療有效。
本發(fā)明提供一種試劑盒為檢測(cè)核心抗體亞類IgG3和IgG1的酶聯(lián)免疫試劑盒，其包括包被了乙肝核心抗原的酶標(biāo)板、酶工作液、酶聯(lián)反應(yīng)底物溶液、顯色液、反應(yīng)終止液和清洗緩沖液。
這種試劑盒的制作方法如下(1)獲得乙肝核心抗原，包被到酶標(biāo)板吸附過(guò)夜；(2)用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磷酸鹽緩沖液封閉過(guò)夜，甩干后晾干；(3)獲得酶標(biāo)記物鼠抗人IgG3單克隆抗體和鼠抗人IgG1單克隆抗體；(4)將酶標(biāo)記物分別溶解于含有小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工作液1、酶工作液2；(5)將酶標(biāo)板、各酶工作液、酶聯(lián)反應(yīng)底物溶液、顯色液、反應(yīng)終止液和清洗緩沖液共同包裝，得到試劑盒。
其中所述包被板制作的過(guò)程為包被乙肝核心抗原，該核心抗原可以是病毒中提取也可以是基因工程重組蛋白，具有生物高活性，經(jīng)過(guò)電泳鑒定，蛋白純度超過(guò)90％。將此抗原用碳酸緩沖液體(CB Buffer)稀釋成低濃度進(jìn)行包被，包被載體為聚苯乙烯塑料板。包被時(shí)每孔100μl，吸附過(guò)夜，用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磷酸鹽緩沖液封閉過(guò)夜，甩干后晾干，即獲得核心抗原包被酶標(biāo)板，酶標(biāo)板可選用國(guó)產(chǎn)板或進(jìn)口板，規(guī)格可以是96孔平板或12×8、12×4可拆條板；所述酶工作液的制備過(guò)程為將酶標(biāo)記物HRP(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記的鼠抗人IgG3單克隆抗體和HRP標(biāo)記鼠抗人IgG1單克隆抗體，分別溶解于含有小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工作液1、酶工作液2；所述酶標(biāo)單克隆抗體的制備可以采用下列步驟(a)NaIO4-乙二醇法進(jìn)行HRP的氧化，達(dá)到終濃度10mg/ml；(b)單克隆抗體和HRP在堿性碳酸鹽緩沖液中透析6小時(shí)，實(shí)現(xiàn)HRP對(duì)單克隆抗體的標(biāo)記，反應(yīng)結(jié)束后用NaBH4溶液終止反應(yīng)，再對(duì)PBS透析過(guò)夜；(c)用飽和硫酸銨沉淀，獲得純化的HRP酶標(biāo)鼠抗人IgG1或IgG3單克隆抗體。
所述輔助試劑的配制過(guò)程為(a)底物溶液磷酸-檸檬酸緩沖液(pH5.0)配制的3％過(guò)氧化氫溶液；(b)顯色液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)甲醇溶液，濃度為0.1mg/ml；(c)反應(yīng)終止液2mol/L硫酸；(d)清洗緩沖液(20倍濃縮液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐溫20溶液。
檢測(cè)方法包括下述步驟(1)抗原-抗體反應(yīng)在包被板的2個(gè)微孔中分別加入50μl待測(cè)血清樣品，進(jìn)行溫育37℃水浴保溫30分鐘；(2)加酶2個(gè)微孔中分別加入酶工作液1和酶工作液2，進(jìn)行溫育37℃水浴保溫30分鐘；(3)顯色反應(yīng)每孔依次加入底物溶液，顯色液各50μl，37℃水浴保溫10分鐘，每孔再加入50μl反應(yīng)終止液結(jié)束反應(yīng)；(4)測(cè)量以空白對(duì)照孔的吸光值調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定OD值并記錄；(5)結(jié)果判斷對(duì)比IgG3和IgG1的顯色OD值，IgG3/IgG1比值越小，說(shuō)明機(jī)體清除病原體能力越差，IgG3/IgG1比值越大，說(shuō)明機(jī)體清除病原體能力越好，比值升高或者大于1說(shuō)明即將恢復(fù)或已經(jīng)恢復(fù)。
本發(fā)明提供的另一種試劑盒為檢測(cè)核心抗體亞類IgG3和IgG1的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其包括包被了乙肝核心抗原的酶標(biāo)板；酶工作液；酶聯(lián)反應(yīng)底物溶液、顯色液、清洗緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品。
這種試劑盒的制作方法包括以下步驟
(1)獲得乙肝核心抗原，包被到化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板吸附過(guò)夜；(2)用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磷酸鹽緩沖液封閉過(guò)夜，甩干后晾干；(3)獲得酶標(biāo)記物鼠抗人IgG3單克隆抗體和鼠抗人IgG1單克隆抗體；(4)將酶標(biāo)記物分別溶解于含有小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工作液1、酶工作液2；(5)將酶標(biāo)板、各酶工作液、酶聯(lián)反應(yīng)底物溶液、顯色液、清洗緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品共同包裝，得到試劑盒。其中，所述包被板的制作過(guò)程為包被乙肝核心抗原，該核心抗原可以是病毒中提取也可以是基因工程重組蛋白，具有生物高活性，經(jīng)過(guò)電泳鑒定，蛋白純度超過(guò)90％。將此抗原用檸檬酸緩沖液體稀釋成低濃度進(jìn)行包被，包被載體為化學(xué)發(fā)光塑料板，包被時(shí)每孔100μl，吸附過(guò)夜，用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磷酸鹽緩沖液封閉過(guò)夜，甩干后晾干，即獲得核心抗原包被酶標(biāo)板，酶標(biāo)板可選用國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，規(guī)格可以是96孔平板或12×8、12×4可拆條板；所述酶工作液的制備過(guò)程為將酶標(biāo)記物HRP(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記的鼠抗人IgG3單克隆抗體和HRP標(biāo)記鼠抗人IgG1單克隆抗體，分別溶解于含有小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工作液1、酶工作液2；所述酶標(biāo)單克隆抗體的制備可以采用下列步驟(a)NaIO4-乙二醇法進(jìn)行HRP的氧化，達(dá)到終濃度10mg/ml；(b)單克隆抗體和HRP在堿性碳酸鹽緩沖液中透析6小時(shí)，實(shí)現(xiàn)HRP對(duì)多克隆抗體的標(biāo)記，反應(yīng)結(jié)束后用NaBH4溶液終止反應(yīng)，再對(duì)PBS透析過(guò)夜；(c)用飽和硫酸銨沉淀，獲得純化后的HRP酶標(biāo)鼠抗人IgG1或IgG3單克隆抗體。
所述輔助試劑的配制，方法如下
(a)底物溶液1.0ml EDTA(1.0×10-2M)1.0ml H2O2(7.5×10-3M)、0.4ml HCl(1.0×10-2M)、0.2ml Tween20(1％)；(b)顯色液luminol 5.0×10-4Mol/L；(c)清洗緩沖液(20倍濃縮液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐溫20溶液；(d)標(biāo)準(zhǔn)品包括人核心抗體IgG3和人核心抗體IgG1標(biāo)準(zhǔn)品。
檢測(cè)方法包括下述步驟(1)抗原-抗體反應(yīng)在化學(xué)發(fā)光包被板的微孔中分別加入50μl已稀釋好的不同濃度的2個(gè)系列標(biāo)準(zhǔn)品，或2孔待測(cè)血清樣品，進(jìn)行溫育37℃水浴保溫30分鐘，重復(fù)洗板操作4次(2)加酶將配成酶工作液1、酶工作液2分別加入相應(yīng)孔內(nèi)；進(jìn)行溫育37℃水浴保溫30分鐘，重復(fù)洗板操作4次(3)顯色反應(yīng)每孔依次加入底物溶液，顯色液各25μl，37℃水浴保溫10分鐘；(4)測(cè)量在化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x上依序測(cè)量各孔的發(fā)光強(qiáng)度(RLU)，測(cè)量時(shí)間1秒/孔；(5)結(jié)果計(jì)算(a)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線以IgG3標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定的RLU值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線；以IgG1標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定的RLU值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線；(b)計(jì)算待測(cè)血清樣品濃度根據(jù)待測(cè)樣品的RLU值從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)血清樣品的核心抗體IgG3和IgG1濃度(c)結(jié)果判斷對(duì)比IgG3和IgG1的含量，IgG3/IgG3比值越小，說(shuō)明機(jī)體清除病原體能力越差，IgG3/IgG3比值越大，說(shuō)明機(jī)體清除病原體能力越好，比值升高或大于1說(shuō)明即將恢復(fù)或已經(jīng)恢復(fù)。
由于本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)乙肝核心抗體中的IgG3和IgG1亞類的比值，反映出乙肝患者體內(nèi)TH1/TH2的平衡，從而對(duì)乙肝患者機(jī)體免疫力水平進(jìn)行評(píng)價(jià)和判斷，為評(píng)價(jià)治療效果、預(yù)測(cè)預(yù)后情況提供了一個(gè)重要的依據(jù)，這些指標(biāo)或判斷同現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)相配合，有助于做出更為準(zhǔn)確的診斷，為乙肝患者的治療提供幫助。本發(fā)明的兩種試劑盒采用了本發(fā)明提出的方法，使用和操作方便，成本低，使本發(fā)明的方法得以實(shí)現(xiàn)。


圖1為大三陽(yáng)標(biāo)本的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的數(shù)據(jù)分布圖；圖2為小三陽(yáng)標(biāo)本的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的數(shù)據(jù)分布圖；圖3為感染后自動(dòng)恢復(fù)的標(biāo)本245或25的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的數(shù)據(jù)分布圖。
具體實(shí)施例方式
下面用實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1一種乙型肝炎病毒核心抗原抗體亞類IgG3/IgG1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(96人份)其組成包括核心抗原包被板(96孔)1塊；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗人IgG3酶標(biāo)工作液體1瓶，6ml/瓶；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗人IgG1酶標(biāo)工作液體1瓶，6ml/瓶；底物溶液、顯色液各1瓶，各5ml/瓶；反應(yīng)終止液1瓶，5ml/瓶；清洗緩沖液(20X濃縮)1瓶，30ml/瓶。
具體制作如下
1.制作核心抗原包被板包被酶標(biāo)板采用Costar公司生產(chǎn)的12×8可拆條板，核心抗原為市購(gòu)。所獲核心抗原用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋為20μg/ml后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100μl，吸附過(guò)夜，用清洗緩沖液洗板，再用該封閉液緩沖液封閉過(guò)夜，甩干后晾干，即獲得核心抗原包被酶標(biāo)板。按96孔/塊用鋁箔袋包裝、真空封閉；2.制備辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗人抗IgG3或IgG1抗體1)酶的氧化(全過(guò)程避光)a)稱取HRP 5mg，加ddH2O 250μl溶解；b)稱取NaIO45mg，加ddH2O 250μl溶解，配制成20mg/mL的濃度；c)往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，邊加邊攪拌；d)將混合好的溶液置于4℃，靜置30分鐘；e)取5ml乙二醇溶于25μl ddH2O中，逐滴加入上述混合溶液中，邊加邊攪拌；f)室溫靜置30分鐘；g)酶氧化過(guò)程完成，HRP終濃度為10mg/ml；2)單克隆抗體的準(zhǔn)備及標(biāo)記(避光)a)調(diào)整抗體濃度到5mg/ml左右(蛋白濃度過(guò)低則用PEG20000濃縮)，用pH9.5左右的50mmol/L CB(1mol/L NaHCO3與1mol/L Na2CO3按10∶1的比例混合，使用前以蒸餾水稀釋20倍)透析去甘油或雜質(zhì)(如Tris)，4℃下透析過(guò)夜，其中換液3次；b)將單克隆抗體與HRP按1∶4混合，于50mmol/L pH9.5 CB中透析6小時(shí)以上，頭兩個(gè)小時(shí)換液一次；c)用新鮮配置的1mg NaBH4溶液終止反應(yīng)。搖勻，4℃靜置2小時(shí)，每半小時(shí)搖一次，NaBH4溶液加入的量要合適；
d)用pH7.2的10mM PBS(預(yù)配置0.01mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4儲(chǔ)備液，根據(jù)需要的pH值混勻二者成PBS緩沖液)透析過(guò)夜。換液一次即可；3)純化HRP酶標(biāo)鼠抗人IgG3或IgG3單克隆抗體a)完成標(biāo)記的單克隆抗體溶液中逐滴加入飽和硫酸銨溶液，邊加入邊攪拌，直至飽和硫酸銨濃度降低至1/3；b)4℃靜置1小時(shí)；c)8000rpm離心10分鐘，將上清移至新管中，沉淀用等體積PBS重新懸浮；d)重復(fù)以上操作，將飽和硫酸銨濃度提高到40％，分別收集上清和沉淀；e)重復(fù)以上操作，將飽和硫酸銨濃度提高到50％，分別收集上清和沉淀；f)重復(fù)以上操作，將飽和硫酸銨濃度提高到60％，分別收集上清和沉淀；g)收集分離的各個(gè)組分，SDS-PAGE鑒定純度；h)提純的HRP-單克隆抗體對(duì)PBS透析過(guò)夜；i)超濾管離心濃縮純化的HRP-單克隆抗體，獲得克分子比接近1∶8的酶標(biāo)鼠抗人IgG3或IgG1單克隆抗體；4)組裝用含10％胎牛血清的緩沖液稀釋由步驟3)獲得的酶標(biāo)鼠抗人IgG3或IgG1單克隆抗體至合適的工作濃度，按6ml/瓶分裝，貯存于4℃。
4.配制底物溶液磷酸-檸檬酸緩沖液(PH5.0)配制的3％過(guò)氧化氫溶液，按5ml/瓶分裝；5.配制顯色液TMB(0.1mg/ml)甲醇溶液，按5ml/瓶分裝；6.配制反應(yīng)終止液2mol/L H2SO4，按3ml/瓶分裝；7.配制清洗緩沖液(20倍濃縮液)PBS(pH7.4)配制的1％吐溫20溶液，按15ml/瓶分裝。
這種試劑盒的質(zhì)量檢測(cè)方式為1)準(zhǔn)確性15份大三陽(yáng)慢性肝炎質(zhì)控血清(包括特異性對(duì)照血清)參考品的檢測(cè)結(jié)果，IgG1/IgG3大于1。15份小三陽(yáng)慢性肝炎質(zhì)量控制血清中，3份標(biāo)本的IgG3/IgG1大于1，15份感染后恢復(fù)的標(biāo)本(245陽(yáng)性)，12份IgG3/IgG1大于1；2)精密度隨機(jī)抽取20盒不同批次試劑盒，用同一份質(zhì)控血清按說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行重復(fù)測(cè)定。分別計(jì)算核心抗體亞類IgG1/IgG3測(cè)定結(jié)果，分別求出均值、SD和變異系數(shù)CV。精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示批間CV＜＜15％。
這種試劑盒的具體使用方式為1.清洗緩沖液配制將試劑盒提供的濃縮清洗緩沖液加蒸餾水20倍稀釋；2.抗原-抗體反應(yīng)在試劑盒提供的核心抗原包被板的2個(gè)微孔中分別加入同一個(gè)待測(cè)血清樣品；3.溫育37℃水浴保溫30分鐘，重復(fù)洗板操作5次，每次3分鐘；4.加酶分別加入鼠抗人IgG3酶工作液和鼠抗人IgG1酶工作液；5.溫育37℃水浴保溫30分鐘。重復(fù)洗板操作5次，每次3分鐘；6.顯色反應(yīng)每孔依次加入底物溶液、TMB顯色液各50μl，37℃水浴保溫10分鐘，每孔再加入50ul反應(yīng)終止液結(jié)束反應(yīng)；7.比色以空白對(duì)照孔的吸光值調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定OD平均值；記錄各孔吸光值；6.結(jié)果判斷對(duì)比IgG3和IgG1的OD值，IgG3/IgG1比值越小，說(shuō)明機(jī)體清除病原體能力越差，IgG3/IgG1比值越大，說(shuō)明機(jī)體清除病原體能力越好，比值升高或大于1說(shuō)明即將恢復(fù)或已經(jīng)恢復(fù)。
實(shí)施例2一種乙肝核心抗體亞類IgG3/IgG1化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑(96人份)其組成包括核心抗原IgG3標(biāo)準(zhǔn)品1瓶；
核心抗原IgG1標(biāo)準(zhǔn)品1瓶；核心抗原包被板(96孔)1塊；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗人IgG3單克隆抗體1瓶，6ml/瓶；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗人IgG3單克隆抗體1瓶，6ml/瓶；底物溶液、顯色液各1瓶，各5ml/瓶；清洗緩沖液(20X濃縮)1瓶，30ml/瓶。
具體制作方法如下1.制作核心抗原包被板1)酶標(biāo)板采用Costar公司生產(chǎn)的12×8可拆條板，核心抗原為基因工程重組或病毒提取，市購(gòu)；2)所獲核心抗原用0.05mol/L檸檬酸緩沖液稀釋為20μg/ml后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100μl，吸附過(guò)夜，用清洗緩沖液洗板，再用該封閉液緩沖液封閉過(guò)夜，甩干后晾干，即獲得核心抗原包被酶標(biāo)板，按96孔/塊用鋁箔袋包裝、真空封閉；2.制備辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗人抗IgG3或IgG1抗體1)酶的氧化(全過(guò)程避光)a)稱取HRP 5mg，加ddH2O 250μl溶解；b)稱取NaIO45mg，加ddH2O 250μl溶解，配制成20mg/mL的濃度；c)往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，邊加邊攪拌；d)將混合好的溶液置于4℃，靜置30分鐘；e)取5ml乙二醇溶于25μl ddH2O中，逐滴加入上述混合溶液中，邊加邊攪拌；f)室溫靜置30分鐘；g)酶氧化過(guò)程完成，HRP終濃度為10mg/ml；2)組裝
用含10％胎牛血清的緩沖液稀釋由步驟3)獲得的鼠抗人抗IgG3或IgG1抗體至合適的工作濃度，按6ml/瓶分裝，貯存于4℃；3)底物溶液1.0ml EDTA(1.0×10-2M)1.0ml H2O2(7.5×10-3M)、0.4mlHCl(1.0×10-2M)、0.2ml Tween20(1％)，按5ml/瓶分裝；4)配制顯色液顯色液1uminol 5.0×10-4Mol/L，按5ml/瓶分裝；5)配制清洗緩沖液(20倍濃縮液)PBS(pH7.4)配制的1％吐溫20溶液，按15ml/瓶分裝。
這種試劑盒的質(zhì)量檢測(cè)方式為1)準(zhǔn)確性15份大三陽(yáng)慢性肝炎質(zhì)控血清(包括特異性對(duì)照血清)參考品的檢測(cè)結(jié)果，IgG1含量/IgG3含量大于1。15份小三陽(yáng)慢性肝炎質(zhì)量控制血清中，3份標(biāo)本的IgG3含量/IgG1含量大于1，15份感染后恢復(fù)的標(biāo)本(245陽(yáng)性)，12份IgG3/IgG1大于1；2)精密度隨機(jī)抽取20盒不同批次試劑盒，用同一份質(zhì)控血清按說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行重復(fù)測(cè)定。分別計(jì)算核心抗體亞類IgG1/IgG3測(cè)定結(jié)果，分別求出均值、SD和變異系數(shù)CV。精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示批間CV＜＜15％；3)線性范圍用核心抗體亞類IgG1或IgG3純品稀釋成一系列不同濃度的純品溶液300ng、100ng、25ng、10ng、5ng、1ng。按照說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制曲線。線性范圍內(nèi)最高檢測(cè)上限值為300ng/ml，最低檢測(cè)下限值為1ng/ml。試劑盒的線性范圍為1-300ng/ml；4)檢測(cè)靈敏度根據(jù)上述線性范圍測(cè)定結(jié)果，本試劑盒的檢測(cè)靈敏度為1ng/ml。
這種試劑盒的具體使用方式為1.清洗緩沖液配制將試劑盒提供的濃縮清洗緩沖液加蒸餾水20倍稀釋；
2.將試劑盒提供的IgG3和IgG1標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)本平行檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)品各點(diǎn)濃度分別為300ng、100ng、25ng、10ng、5ng、1ng；3.抗原-抗體反應(yīng)在試劑盒提供的核心包被板的微孔中分別加入50μl已稀釋好的2個(gè)系列的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，或在平行的2孔中加入同一個(gè)待測(cè)血清樣品，37℃水浴保溫30分鐘。然后用清洗緩沖液重復(fù)洗板4次，每次3分鐘；4.酶聯(lián)反應(yīng)分別加入相應(yīng)的鼠抗人IgG3或IgG1單克隆抗體酶工作液，溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保溫30分鐘。重復(fù)洗板操作4次，每次3分鐘；5.顯色反應(yīng)每孔依次加入底物溶液、顯色液各25μl；6.讀值在化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x上依序測(cè)量各孔的發(fā)光強(qiáng)度(RLU)，測(cè)量時(shí)間1秒/孔；7.結(jié)果計(jì)算a)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線以IgG3標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定的RLU值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線；以IgG1標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定的RLU值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線；b)計(jì)算待測(cè)血清樣品濃度根據(jù)待測(cè)樣品的RLU值從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)血清樣品的核心抗體IgG3和IgG1濃度；c)結(jié)果判定對(duì)比IgG3和IgG1的含量，IgG3/IgG3比值越小，說(shuō)明機(jī)體清除病原體能力越差，IgG3/IgG3比值越大，說(shuō)明機(jī)體清除病原體能力越好，比值大于1說(shuō)明即將恢復(fù)或已經(jīng)恢復(fù)。
為對(duì)本發(fā)明進(jìn)行檢驗(yàn)，申請(qǐng)人采用本發(fā)明的兩種試劑盒，對(duì)不同狀況下的乙肝患者、過(guò)往感染者以及健康人群進(jìn)行了IgG3/IgG1指標(biāo)和其他現(xiàn)有檢驗(yàn)指標(biāo)的對(duì)比檢驗(yàn)和分析，證明本發(fā)明的方法以及本發(fā)明的兩種試劑盒的可靠性和有效性。采用本發(fā)明的方法和本發(fā)明的試劑盒，可以有效地檢測(cè)出乙肝核心抗原抗體亞類IgG3/IgG1比值，用于評(píng)價(jià)乙肝病毒感染者的免疫力水平，其檢測(cè)結(jié)果同乙肝五項(xiàng)指標(biāo)、ALT的檢測(cè)結(jié)果對(duì)照，對(duì)判斷HBV病毒在體內(nèi)的發(fā)展和治療情況的預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義。
實(shí)驗(yàn)1采用實(shí)施例1的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒對(duì)不同乙型肝炎患者和過(guò)往感染恢復(fù)樣品的檢測(cè)為判斷本發(fā)明乙肝核心抗體亞類IgG3/IgG1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)情況，本發(fā)明取地壇醫(yī)院病毒研究室血清總共280份研究數(shù)據(jù)100份已知HBV-大三陽(yáng)慢性肝炎標(biāo)本，100份經(jīng)過(guò)抗病毒治療后轉(zhuǎn)陰性既小三陽(yáng)標(biāo)本，80份過(guò)往感染乙肝病毒已經(jīng)恢復(fù)的血清標(biāo)本(245陽(yáng)性)。分別檢測(cè)每個(gè)標(biāo)本的IgG3/IgG1的OD值，結(jié)果見(jiàn)表1。
表1.不同肝炎人群的IgG3/IgG1比較

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明對(duì)于與病程轉(zhuǎn)歸正性相關(guān)，小三陽(yáng)中有22％免疫能力接近于達(dá)到清除病原體的能力。在恢復(fù)期標(biāo)本中，體現(xiàn)了抗體亞類較為均衡，也體現(xiàn)了TH1/TH2的轉(zhuǎn)化情況。
實(shí)驗(yàn)2采用實(shí)施例2的化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒對(duì)不同乙型肝炎患者和過(guò)往感染恢復(fù)樣品的檢測(cè)檢測(cè)來(lái)源于浙江湖州醫(yī)院的拉米夫定治療系列血清5例，觀察這些標(biāo)本在經(jīng)過(guò)治療的過(guò)程中既從大三陽(yáng)性到小三陽(yáng)的轉(zhuǎn)化過(guò)程中，核心抗體亞類IgG3/IgG1的情況。檢測(cè)結(jié)果與乙肝五項(xiàng)指標(biāo)、ALT的檢測(cè)結(jié)果對(duì)照，對(duì)判斷HBV病毒在體內(nèi)的發(fā)展和治療情況的預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義。結(jié)果分別見(jiàn)表2(基于保護(hù)患者個(gè)人隱私的考慮，刪除了表中的患者姓名)。
表2.乙肝患者IgG3/IgG1以及其他檢測(cè)指標(biāo)對(duì)照表


結(jié)果顯示，本發(fā)明乙肝核心抗體亞類IgG3/IgG1試劑在對(duì)治療有效預(yù)后的檢測(cè)與病情預(yù)后相同，對(duì)治療無(wú)效預(yù)后的檢測(cè)也與病情預(yù)后相同。
實(shí)驗(yàn)3本發(fā)明乙肝核心抗體亞類IgG3/IgG1酶免試劑在檢測(cè)肝炎、正常人TH1和TH2相關(guān)指標(biāo)關(guān)聯(lián)分析實(shí)驗(yàn)背景對(duì)照組為中心血站獻(xiàn)血人員20例，未攜帶病毒，并且單獨(dú)表面抗體陽(yáng)性。慢性肝炎65例，來(lái)源于地壇醫(yī)院住院病人，ALT均高于正常值。乙肝感染后恢復(fù)血清，其標(biāo)志是乙肝二對(duì)半中245陽(yáng)性。TH1和TH2細(xì)胞因子檢測(cè)采用商品化試劑盒。結(jié)果見(jiàn)表3。
表3.對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分析以上結(jié)果非常明顯的看出，慢性肝炎患者體內(nèi)TH1和TH2失衡，TH2占優(yōu)勢(shì)，這個(gè)時(shí)候IgG3/IgG1的比率遠(yuǎn)小于1，而在乙肝感染恢復(fù)后患者血清內(nèi)的TH1增長(zhǎng)，與TH2相比較，處于平衡或占有優(yōu)勢(shì)，體現(xiàn)在血清中IgG3/IgG1的比率大于1。
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，得出本發(fā)明乙肝核心抗體亞類IgG1、IgG3、IgG2、IgG4、酶免試劑在檢測(cè)乙型肝炎大三陽(yáng)、小三陽(yáng)、感染恢復(fù)后血清的對(duì)比圖，即附圖1-3。從這些圖中，也可以得出這樣的結(jié)論HBcAb的IgG3與IgG1的比例均衡是對(duì)病毒治療有效所具有的免疫力的一個(gè)重要特征。
可以理解的是，對(duì)于相同患者，采用不同的檢測(cè)手段，得到的HBcAb的IgG3與IgG1數(shù)值可能是不同的，兩者的比值也可能是不同。因此在不同的檢測(cè)手段下，相同的IgG3/IgG1數(shù)值可以代表乙肝患者不同的機(jī)體免疫力水平狀況，因此需要對(duì)不同檢測(cè)手段下IgG3、IgG1和IgG3/IgG1數(shù)據(jù)同患者狀況之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義下的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行分析，或者對(duì)各種檢測(cè)手段下這些數(shù)據(jù)的變化進(jìn)行對(duì)比，以揭示不同檢測(cè)手段下具體的IgG3/IgG1數(shù)據(jù)同患者免疫水平和預(yù)后狀況的關(guān)系，確定在不同檢測(cè)手段下判斷預(yù)后良好和預(yù)后不良的IgG3/IgG1數(shù)據(jù)范圍。同時(shí)，也應(yīng)該理解到，任何一種檢測(cè)指標(biāo)都具有其局限性，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行多指標(biāo)的綜合判斷。
權(quán)利要求
1.一種評(píng)價(jià)乙肝患者機(jī)體免疫力水平的方法，包括下列步驟(1)檢測(cè)乙肝病毒核心抗體亞類IgG3和IgG1；(2)計(jì)算IgG3和IgG1的比值；(3)根據(jù)IgG3和IgG1的比值評(píng)估乙肝患者機(jī)體清除病原體的能力，預(yù)測(cè)乙肝治療效果和預(yù)后。
2.如權(quán)利要求1所述的評(píng)價(jià)乙肝患者機(jī)體免疫力水平的方法，其特征在于核心抗體亞類IgG3和IgG1的檢測(cè)方法為下列方法中的一種或幾種酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法、時(shí)間分辨方法、流式細(xì)胞儀。
3.一種檢測(cè)核心抗體亞類IgG3和IgG1的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括下列組件(1)包被了乙肝核心抗原的酶標(biāo)板；(2)酶工作液；(3)酶聯(lián)反應(yīng)底物溶液、顯色液、反應(yīng)終止液和清洗緩沖液
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述的底物溶液為磷酸-檸檬酸緩沖液(pH5.0)配制的3％過(guò)氧化氫溶液；顯色液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)甲醇溶液，濃度為0.1mg/ml；反應(yīng)終止液為2mol/L硫酸；清洗緩沖液(20倍濃縮液，20×)為PBS(pH7.4)配制的0.05％吐溫20溶液。
5.如權(quán)利要求3所述的試劑盒的制作方法，包括以下步驟(1)獲得乙肝核心抗原，包被到酶標(biāo)板吸附過(guò)夜；(2)用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磷酸鹽緩沖液封閉過(guò)夜，甩干后晾干；(3)獲得酶標(biāo)記物鼠抗人IgG3單克隆抗體和鼠抗人IgG1單克隆抗體；(4)將酶標(biāo)記物分別溶解于含有小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工作液1、酶工作液2；(5)將酶標(biāo)板、各酶工作液、酶聯(lián)反應(yīng)底物溶液、顯色液、反應(yīng)終止液和清洗緩沖液共同包裝，得到試劑盒。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒的制作方法，其特征在于所述酶標(biāo)單克隆抗體的制備采用下列步驟(a)NaIO4-乙二醇法進(jìn)行HRP的氧化，達(dá)到終濃度10mg/ml；(b)單克隆抗體和HRP在堿性碳酸鹽緩沖液中透析6小時(shí)，實(shí)現(xiàn)HRP對(duì)單克隆抗體的標(biāo)記，反應(yīng)結(jié)束后用NaBH4溶液終止反應(yīng)，再對(duì)PBS透析過(guò)夜；(c)用飽和硫酸銨沉淀，獲得純化的HRP酶標(biāo)鼠抗人IgG1或IgG3單克隆抗體。
7.一種檢測(cè)核心抗體亞類IgG3和IgG1的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，包括下列組件(1)包被了乙肝核心抗原的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板；(2)酶工作液；(3)酶聯(lián)反應(yīng)底物溶液、顯色液、清洗緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述的底物溶液為1.0mlEDTA(1.0×10-2M)、1.0ml H2O2(7.5×10-3M)、0.4ml HCl(1.0×10-2M)、0.2ml吐溫20(1％)；顯色液為1uminol(5.0×10-4Mol/L)；清洗緩沖液(20倍濃縮液，20×)為PBS(pH7.4)配制的0.05％吐溫20溶液；標(biāo)準(zhǔn)品包括人核心抗體IgG3和人核心抗體IgG1標(biāo)準(zhǔn)品。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒的制作方法，包括以下步驟(1)獲得乙肝核心抗原，包被到化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板吸附過(guò)夜；(2)用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磷酸鹽緩沖液封閉過(guò)夜，甩干后晾干；(3)獲得酶標(biāo)記物鼠抗人IgG3單克隆抗體和鼠抗人IgG1單克隆抗體；(4)將酶標(biāo)記物分別溶解于含有小牛血清白蛋白的溶解液中，配成酶工作液1、酶工作液2；(5)將酶標(biāo)板、各酶工作液、酶聯(lián)反應(yīng)底物溶液、顯色液、清洗緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品共同包裝，得到試劑盒。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒的制作方法，其特征在于所述酶標(biāo)單克隆抗體的制備采用下列步驟(a)NaIO4-乙二醇法進(jìn)行HRP的氧化，達(dá)到終濃度10mg/ml；(b)單克隆抗體和HRP在堿性碳酸鹽緩沖液中透析6小時(shí)，實(shí)現(xiàn)HRP對(duì)多克隆抗體的標(biāo)記，反應(yīng)結(jié)束后用NaBH4溶液終止反應(yīng)，再對(duì)PBS透析過(guò)夜；(c)用飽和硫酸銨沉淀，獲得純化的HRP酶標(biāo)鼠抗人IgG1或IgG3單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種評(píng)價(jià)乙肝患者機(jī)體免疫力水平的方法、應(yīng)用于該方法的一種檢測(cè)核心抗體亞類IgG3和IgG1的酶聯(lián)免疫試劑盒和一種檢測(cè)核心抗體亞類IgG3和IgG1的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)試劑盒及其制備方法。所述方法包括下列步驟(1)檢測(cè)核心抗體亞類IgG3和IgG1；(2)計(jì)算IgG3和IgG1的比值；(3)根據(jù)IgG3和IgG1的比值評(píng)估乙肝患者機(jī)體清除病原體的能力，預(yù)測(cè)乙肝治療效果和預(yù)后。所述各試劑盒采用所述方法，對(duì)人血清中的乙肝核心抗原抗體中的亞類IgG3和IgG1進(jìn)行檢驗(yàn)。本發(fā)明可用于乙型肝炎病毒的發(fā)展水平、預(yù)后診斷，治療效果評(píng)價(jià)等。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1869697SQ20061008749
公開(kāi)日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2006年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月12日
發(fā)明者林長(zhǎng)青 申請(qǐng)人:北京熱景生物技術(shù)有限公司