專利名稱：瓜類細菌性果實腐斑病免疫磁珠及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種用于檢測由燕麥嗜酸菌西瓜亞種病菌引起的瓜類細菌性果實腐斑病，即BFB的特異試劑及其制備方法，尤其是一種瓜類細菌性果實腐斑病免疫磁珠及制備方法。
背景技術(shù)：
燕麥嗜酸菌西瓜亞種(Acidovorax avenae subsp.citrulli)，簡稱Aac，可以引起瓜類細菌性果實腐斑病(Bacterial fruit blotch of cucurbits)，簡稱BFB，這種細菌屬于世界性檢疫有害生物，而尤其引起的上述病害是我國公布的《中華人民共和國進境植物檢疫危險性病、蟲、雜草名錄》中規(guī)定的三類危險性病害。
瓜類細菌性果實腐斑病目前發(fā)病地區(qū)有日益擴大的趨勢。該病苗期癥狀常表現(xiàn)為大的黑色病斑而無任何水浸狀，這使田間診斷變的很困難，病原細菌的分離培養(yǎng)診斷需要10～14d，程序繁瑣。瓜類種子細菌性果實腐斑病帶菌率大于0.1％時，就可能給生產(chǎn)帶來較大損失。但如此低的帶菌率，給檢測增加了很大的難度，如用99％的準確度確保種子批號的帶菌率在0.1％以下，每個批號需抽取50000粒種子檢測，這就是檢測費用高的原因之一。研制出適合我國實際的種子帶菌檢測技術(shù)，是防止該病在我國蔓延的有效措施之一。
目前檢測瓜類種子細菌性果實腐斑病的方法有
(1)幼苗檢測。即在溫室條件下，創(chuàng)造適合瓜類細菌性果實腐斑病的發(fā)病條件，即溫度在27～30℃之間，濕度在85％以上，一般需要4～5周后才可檢測出種子細菌性果實腐斑病的帶菌率。這種方法是傳統(tǒng)的病菌檢測方法，是國際種子協(xié)會認可的檢測方法，能反映在實際情況下可能的發(fā)病情況，但條件較難控制，費時，占地大，費用高。根據(jù)我國制種批次小，分散的具體實情，這種檢測方法很難推廣應用。
(2)保濕生長盒檢測法。即在透光的塑料盒中裝入蛭石和珍珠巖，然后將種子散播其上，密封后放入25℃，日光燈人工生長室中，大約兩周后即可檢測出病苗。這種方法的優(yōu)點是條件控制準確，占地小，易于規(guī)范化操作，準確性較高；缺點是有時會受苗期其它病害如瘁倒病的干擾。
(3)利用半選擇性培養(yǎng)基。將種子發(fā)芽后保濕保溫，然后將幼苗勻漿液在半選擇培養(yǎng)基上進行選擇培養(yǎng)，找出細菌性果實腐斑病菌菌落，將其純化后再根據(jù)病菌的生理生化和病理特征確認。也可從種子中分離獲得，可先將種皮和種胚分離后分別置于pH7.1的磷酸緩沖液中培養(yǎng)過夜，然后劃線分離，以確定種子是內(nèi)部帶菌還是外部帶菌。對病葉、病果，取新鮮病健交界處病斑，用KB培養(yǎng)基就能夠分離得到。瓜類細菌性果實腐斑病菌在該培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)2d可見菌落，3d后，菌落圓形，直徑1～2mm，3～4d后，菌落繼續(xù)擴大，形成一個橄欖綠中心的環(huán)形，而多數(shù)其它種傳細菌菌落藍色菌落更小。
(4)血清學檢測方法。近年趨向于利用熒光抗體法和酶聯(lián)吸附法。熒光抗體法(fluorescent antibody technique)是將熒光染料與抗體以化學方法結(jié)合起來形成標記抗體。抗體與熒光染料結(jié)合不影響抗體的特性，標記的熒光抗體與相應的抗原結(jié)合后，受熒光顯微鏡高壓汞燈光源的紫外光照射，便激發(fā)出熒光，熒光的存在就表示抗原的存在。酶聯(lián)免疫吸附法，enzyme linked immunosorbent assay簡稱ELISA，是繼免疫熒光技術(shù)和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫標記技術(shù)。有直接法、間接法、雙抗夾心法及競爭法。ELISA具有選擇性好、靈敏度高、結(jié)果判斷客觀準確、實用性強的優(yōu)點而廣泛應用于生物和醫(yī)學領(lǐng)域。ELISA技術(shù)對大量樣品的檢測尤其適合。血清學技術(shù)最主要的缺點是受抗血清質(zhì)量和?；缘南拗?。多克隆抗體制備簡單，但通常和近緣細菌有交叉反應，飽和吸附雖然可以消除部分交叉反應，但常以降低效價為代價；單克隆抗體雖然?；院茫话阒荒軝z測一個或幾個血清型的細菌，制備過程復雜，技術(shù)和設備要求較高。
(5)分子檢測。近些年來，以聚合酶鏈式反應PCR為代表的分子生物學技術(shù)被越來越多的應用于植物病原細菌的檢測。由于這一技術(shù)具有快速簡便、靈敏度高、特異性強的優(yōu)點，故而在各個領(lǐng)域包括植物病源菌方面得到廣泛應用和迅速發(fā)展。如中國專利CN02125686.1，公開一種改進了PCR反應參數(shù)和目標產(chǎn)物電泳條帶檢測程序的定量聚合酶鏈反應方法。其特點是聚合酶鏈反應的正、反引物的最終濃度為1-100uM。反應中正、反引物的解鏈溫度為85-92℃，PCR反應的引物長度可為25-50鹼基。PCR反應包括高溫模板變性、引物與模板退火延伸兩步。退火延伸溫度為72-82℃。并可以將染色劑SYBR金與PCR樣品混合后一起進行電泳，然后定量測定電泳凝膠上PCR產(chǎn)物條帶的強度，SYBR金在加樣緩沖液中的重量百分比濃度為萬分之一至百分之一。PCR反應更為穩(wěn)定，使PCR平坡出現(xiàn)推遲，目標產(chǎn)物直線累積期增長。從而使經(jīng)典PCR能在完全保持其簡單、快速和專一的優(yōu)點的同時，實現(xiàn)了定量功能的突破。將SYBR金與樣品混合一起進行電泳的作法，則不僅提高了定量染色靈敏度，擴展了定量測定的線性范圍，而且省略了染色步驟，減少了染色劑用量。
目前美國農(nóng)業(yè)部、Georgia大學和一些種子企業(yè)的科學家均已研究出瓜類細菌性果實腐斑病菌基因組專一的引物，這些引物主要為瓜類細菌性果實腐斑病基因組的hrp基因，16SrRNA基因和16S-23SrRNA間隔區(qū)。此法雖然其檢測的靈敏度高、速度快，但需要較多的一次性投入。
吸附介質(zhì)廣泛用于生物化學及分子生物學領(lǐng)域分離純化核酸、蛋白質(zhì)等生物分子，但未見用于植物病原菌鑒定的報道。免疫磁珠及是一種較先進的吸附介質(zhì)，它是利用免疫學原理將抗體與惰性有機大分子相偶聯(lián)而形成的一種特異吸附抗原的物質(zhì)，它能像磁鐵吸附鐵一樣，特異撲捉和濃縮相對應的抗原，如蛋白質(zhì)、酶、細菌、真菌、病毒等，將該磁珠與其它技術(shù)相結(jié)合，如ELISA、PCR等，可用于病原菌的快速診斷，極大提高診斷的特異性和靈敏度。如中國專利CN99252058.4，公開一種空腸彎曲菌的實時熒光PCR檢測方法，應用抗血清和磁性微珠制備空腸彎曲菌免疫磁珠，利用免疫磁珠直接捕獲檢樣中的空腸彎曲菌，煮沸法提取空腸彎曲菌的DNA，設計合成用于擴增空腸彎曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因的引物與探針和/或空腸彎曲菌的馬尿酸酶(hipO)基因的引物與探針，通過熒光PCR技術(shù)檢測得到擴增產(chǎn)物的熒光信號；又如中國專利法，包括傳感器、信號放大電路、信號處理電路、檢測顯示器和偏置磁場，傳感器包括各AMR薄膜構(gòu)成的惠斯登電橋；電橋的輸入端與恒流電源相連接，輸出端與信號放大電路的輸入端相連接，電橋固定地或可位移地置于偏置磁場中；偏置磁場為電磁線圈產(chǎn)生的單向交變磁場，包括產(chǎn)生交變磁場的變磁線圈；信號放大電路包括鎖相放大電路、電流放大器；鎖相放大電路還與一信號發(fā)生器的輸出端相連接，信號發(fā)生器的輸出端一方面向鎖相放大電路提供參考電壓信號，另一方面與電流放大器相連接，而電流放大器與變磁線圈相連接。本發(fā)明的檢測裝置生產(chǎn)成本低、靈敏度高、能探測免疫磁微球產(chǎn)生的磁場微弱信號。
綜上所述，利用免疫磁珠技術(shù)，建立BFB的快速檢測是控制該病傳播的有效措施。該項技術(shù)研究的主要目標是建立BFB的免疫吸附分離-聚合酶鏈式反應，即研制IAS-PCR快速檢測技術(shù)及試劑盒，其核心技術(shù)是BFB免疫磁珠的設計與研制。
二
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，設計與研制，并提出一種BFB免疫磁珠，即一種瓜類細菌性果實腐癍病免疫磁珠及制備方法。
實現(xiàn)本發(fā)明目的的措施在于1、制備BFB免疫抗體；將標準的BFB病原擴大培養(yǎng)及收集菌體，超聲波峰提取菌體蛋白，制成佐劑BFB抗原，免疫家兔，待效價達到1∶64，放血獲得抗BFB血清，用硫酸銨鹽析，F(xiàn)pLc蛋白酶A柱純化得到BFB抗體IgG。
2、制作BFB免疫磁珠；
2、制作BFB免疫磁珠；將上述BFB抗體IgG，與固相載體相偶聯(lián)后即為BFB免疫磁珠，制作路線如下(1)、選擇不溶于水的惰性物作為固相載體；(2)、固相載體與離子交換基團交鏈，形成離子交換固相載體；(3)、通過離子交換活化固相載體，使其帶有大量可交換的負離子；(4)、活化離子交換固相載體與BFB免疫抗體交鏈而得到BFB免疫磁珠。
本發(fā)明的優(yōu)點在于將廣泛用于生物化學及分子生物學領(lǐng)域分離純化細菌、病毒核酸、蛋白質(zhì)等生物分子的吸附介質(zhì)技術(shù)，用于植物病原菌鑒定。它是利用免疫學原理將抗體與惰性有機大分子相偶聯(lián)而形成的一種特異吸附抗原的物質(zhì)。利用免疫磁珠技術(shù)，建立BFB的快速檢測是控制該病傳播的有效措施，實現(xiàn)多種相關(guān)檢測技術(shù)優(yōu)點的整合，由于這一技術(shù)具有快速簡便、靈敏度高、特異性強的優(yōu)點，極大提高診斷的特異性和靈敏度。
具體實施例方式
實施例11、制備BFB免疫抗體；將標準的BFB病原擴大培養(yǎng)及收集菌體，超聲波峰提取菌體蛋白，制成佐劑BFB抗原，免疫家兔，待效價達到1∶64，放血獲得抗BFB血清，用硫酸銨鹽析，F(xiàn)pLc蛋白酶A柱純化得到BFB抗體IgG。
2、制作BFB免疫磁珠將上述BFB抗體IgG，與固相載體相偶聯(lián)后即為BFB免疫磁珠，制作路線如下(1)、固相載體的選擇。這種載體為多糖聚合物，選擇SephadexCellulose或Sephadex-agrose等均可。
(2)、固相載體與離子交換基團二乙基氨基乙基交鏈，形成離子交換固相載體。反應如下 (3)、離子交換固相載體的活化。
(4)、活化離子交換固相載體與BFB抗體交鏈得到BFB免疫磁珠。
實施例2本發(fā)明的瓜類細菌性果實腐斑病免疫磁珠制備方法為1、將標準的BFB病原擴大培養(yǎng)及收集菌體，超聲波破碎提取菌體蛋白，制成佐劑BFB抗原，免疫家兔，待效價達到1∶64，放血獲得抗BFB血清，用硫酸銨鹽析，F(xiàn)pLc蛋白酶A柱純化得到BFB抗體IgG。
2、取帶有陰離子交換基因固體載體Sephadex或Cellulose等5克，加入無菌水250ml，過夜，充分溶脹。
3、將上述膠1ml裝入小層析柱中，用pH6.8，0.01mol/L的TB含0.4mol/L NaCl洗脫10ml，之后改用pH6.8，0.01mol/L TB液平衡洗脫20ml。
4、取純化的含蛋白量5mg的BFB抗體0.5ml，加入上述小層析柱中，待BFB免體進入柱床后，此時BFB病原菌特異地被載體上的BFB抗體吸附，而后改用pH6.8，0.01mol/L TB洗脫約10ml，至洗脫液中無蛋白質(zhì)為止。層析柱中的膠即為含BFB抗體IgG的BFB免疫磁珠。取出后懸浮5ml pH6.8，0.01mol/L TB中，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 經(jīng)上述制作過程最后得到了BFB免疫磁珠，這種磁珠能有效地捕捉，濃縮種子提取液中的BFB病原。
BFB免疫磁珠應用實例1、取待檢測疑帶菌種子2000粒三角開口，加pH6.8 PB0.01mol/L200ml，37℃真空抽提4小時，此時種子中的BFB進入200ml抽提液中并能擴增BFB。
2、加入BFB免疫磁珠0.1ml懸浮液，輕輕攪拌10分鐘，此時200ml抽提液中如存在BFB病原，則全部吸附在磁珠表面。500rpm離心5分鐘，棄去上清，沉淀為可能吸附BFB病原的BFB免疫磁珠，加100μl裂解液，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 3、取上述可能吸附BFB病原的BFB免疫磁珠50μl加置100℃裂解15min。
4、向上述可能吸附BFB病原的BFB免疫磁珠中，加入PCR擴增所需的試劑和擴增的條件擴增。
5、擴增后，電泳出現(xiàn)360bp特異帶，為待測樣品帶有BFB病原菌。
上述內(nèi)容中的離子交換固相載體，可以應用于任何細菌、病毒、蛋白質(zhì)及酶的特異性免疫磁珠。
權(quán)利要求
1.一種瓜類細菌性果實腐斑病免疫磁珠及制備方法，其特征在于，1)、制備BFB免疫抗體；將標準的BFB病原擴大培養(yǎng)及收集菌體，超聲波破碎提取菌體蛋白，制成佐劑BFB抗原，免疫家兔，待效價達到1∶64，放血獲得抗BFB血清，用硫酸銨鹽析，F(xiàn)pLc蛋白酶A柱純化得到BFB抗體IgG；2)、制作BFB免疫磁珠；將上述BFB抗體IgG，與固相載體相偶聯(lián)后即為BFB免疫磁珠，制作路線如下(1)、選擇不溶于水的惰性物作為固相載體；(2)、固相載體與離子交換基團交鏈，形成離子交換固相載體。；(3)、通過離子交換活化固相載體，使其帶有大量可交換的負離子；(4)、活化離子交換固相載體與BFB免疫抗體交鏈。
2.如權(quán)利要求1所述的瓜類細菌性果實腐斑病免疫磁珠及制備方法，其特征在于，固相載體的選擇，這種載體為多糖聚合物。
3.如權(quán)利要求2所述的瓜類細菌性果實腐斑病免疫磁珠及制備方法，其特征在于，固相載體選擇Sephadex。
4.如權(quán)利要求2所述的瓜類細菌性果實腐斑病免疫磁珠及制備方法，其特征在于，固相載體選擇Cellulose。
5.如權(quán)利要求2所述的瓜類細菌性果實腐斑病免疫磁珠及制備方法，其特征在于，固相載體選擇Sephadex-agrose。
6.如權(quán)利要求1所述的瓜類細菌性果實腐斑病免疫磁珠及制備方法，其特征在于，固相載體與離子交換基團二乙基氨基乙基交鏈，形成離子交換固相載體，反應如下
7.如權(quán)利要求1所述的瓜類細菌性果實腐斑病免疫磁珠及制備方法，其特征在于，離子交換固相載體的活化，
8.如權(quán)利要求1所述的瓜類細菌性果實腐斑病免疫磁珠及制備方法，其特征在于，活化離子交換固相載體與BFB抗體交鏈得到BFB免疫磁珠，
9.如權(quán)利要求1所述的瓜類細菌性果實腐斑病免疫磁珠及制備方法，其特征在于，1)、將標準的BFB病原擴大培養(yǎng)及收集菌體，超聲波峰提取菌體蛋白，制成佐劑BFB抗原，免疫家兔，待效價達到1∶64，放血獲得抗BFB血清，用硫酸銨鹽析，F(xiàn)pLc蛋白酶A柱純化得到BFB抗體IgG；2)、取帶有陰離子交換基因固體載體Sephadex或Cellulose等5克，加入無菌水250ml，過夜，充分溶脹；3)、將上述膠1ml裝入小層析柱中，用pH6.8，0.01mol/L的TB含0.4mol/L NaCl洗脫10ml，之后改用pH6.8，0.01mol/L TB液平衡洗脫20ml；4)、取純化的含蛋白量5mg的BFB抗體0.5ml，加入上述小層析柱中，待BFB免體進入柱床后，此時BFB病原菌特異地被載體上的BFB抗體吸附，而后改用pH6.8，0.01mol/L TB洗脫約10ml，至洗脫液中無蛋白質(zhì)為止；層析柱中的膠即為含BFB抗體IgG的BFB免疫磁珠；取出后懸浮5ml pH6.8，0.01mol/L TB中，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
一種瓜類細菌性果實腐斑病免疫磁珠及制備方法，屬于一種用于檢測引起的瓜類細菌性果實腐斑病BFB的燕麥嗜酸菌西瓜亞種病菌的試劑及其制備方法，1)制備BFB免疫抗體；2)制作BFB免疫磁珠a.選擇不溶于水的惰性物作為固相載體；b.固相載體與離子交換基團交鏈，形成離子交換固相載體；c.通過離子交換活化固相載體，帶有大量可交換的負離子；d.活化離子交換固相載體與BFB免疫抗體交鏈而得到BFB免疫磁珠。本發(fā)明利用免疫學原理將抗體與惰性有機大分子相偶聯(lián)而形成的一種特異吸附抗原的物質(zhì)，利用免疫磁珠技術(shù)，建立BFB的快速檢測，是控制該病傳播的有效措施，這一技術(shù)具有快速簡便、靈敏度高、特異性強的優(yōu)點，提高BFB檢測的特異性和靈敏度。
文檔編號G01N33/546GK101086498SQ20061009143
公開日2007年12月12日 申請日期2006年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日
發(fā)明者喻梅輝, 張紅, 馬光玉, 王葉筠, 周志成, 丁建軍, 穆全昌, 姜明, 張興平 申請人:新疆西域?qū)崢I(yè)集團有限責任公司