專利名稱：用于免疫可比性的體內(nèi)模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體內(nèi)模型，其用于評(píng)估基于抗體的不同治療或診斷制劑的相對(duì)免疫原性。免疫原性是通過(guò)包含如下步驟的方法進(jìn)行比較的a)產(chǎn)生抗體轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物，b)將所述轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物與外源抗體接觸，在此所述的外源抗體是(a)中轉(zhuǎn)基因抗體或其變體的標(biāo)準(zhǔn)制劑，和c)測(cè)定由(b)的外源抗體引發(fā)的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的免疫應(yīng)答。
背景技術(shù)：
1986年，隨著重組鼠抗體Orthoclone即OKT-3(適應(yīng)癥為預(yù)防腎移植中同種異體移植物的排斥)的批準(zhǔn)，治療性單克隆抗體被引入臨床實(shí)踐[Proceedings of an international symposium on monoclonal antibody therapywith orthoclone OKT3 in renal transplantation.Transplant Proc，1986.18(4)p.923-56；Burdick，J.F.等人，Reversal if progressive renal allograftdysfunction with OKT3.Nephron，1987.46 Suppl 1p.52-5；Farges，O.等人，A randomized trial of OKT3-based versus cyclosporine-basedimmunoprophylaxis after liver transplantation.Long-term results of aEuropean and Australian multicenter study.Transplantation，1994.58(8)p.891-8；Farrell，M.L.，Orthoclone OKT3a treatment for acute renal allograftrejection.Anna J，1987.15(6)p.373-6；Friedman，J.等人，OrthocloneOKT3 treatment of acute renal allograft rejection.Transplant Proc，1987.19(2 Suppl 2)p.46；Gordon，R.D.等人，Experience with Orthoclone OKT3monoclonal antibody in liver transplantation.Am J Kidney Dis，1988.11(2)p.141-4；Smith，S.L.，Ten years of Orthoclone OKT3(muromonab-CD3)areview.J Transpl Coord，1996.6(3)p.109-19；quiz 120-1]。1994年，F(xiàn)DA正式批準(zhǔn)了ReoPro[Tcheng，J.E.，Dosing and administration of ReoPro(c7E3 Fab).J Invasive Cardiol，1994.6 Suppl Ap.29A-33A；discussion51A-54A；Faulds，D.和E.M.Sorkin，Abciximab(c7E3 Fab).Areview of itspharmacology and therapeutic potential in ischaemic heart disease.Drugs，1994.48(4)p.583-98；Huston，J.S.和A.J.George，Engineered antibodiestake center stage.Hum Antibodies，2001.10(3-4)p.127-42]，這表明制藥工業(yè)對(duì)治療性抗體的治療劑潛力以及商業(yè)潛力的接受最初很緩慢。與生物治療劑的大規(guī)模生產(chǎn)相關(guān)的技術(shù)挑戰(zhàn)，癌癥治療的早期挫折，以及對(duì)于治療劑在人體內(nèi)引發(fā)的免疫反應(yīng)的關(guān)注，這些都在很大程度上解釋了這些新的治療劑的延遲發(fā)展。
近來(lái)，通過(guò)在抗體產(chǎn)生、發(fā)展和生產(chǎn)技術(shù)方面的改進(jìn)，已克服了很多與治療性抗體相關(guān)的早期困難[Kipriyanov，S.M.和F.Le Gall，Generationand production of engineered antibodies.Mol Biotechnol，2004.26(1)p.39-60]。2002年，美國(guó)正式批準(zhǔn)了13種基于單克隆抗體的治療劑，另有400種產(chǎn)品處于臨床試驗(yàn)階段[Gura，T.，Therapeutic antibodiesmagicbullets hit the target.Nature，2002.417(6889)p.584-6]。然而，關(guān)于針對(duì)很多這些治療劑所產(chǎn)生的免疫原性應(yīng)答的可獲得信息仍然有限[Schellekens，H.，Bioequivalence and the immunogenicity of biopharmaceuticals.Nat RevDrug Discov，2002.1(6)p.457-62；Schellekens，H.，When biotech proteinsgo off-patent.Trends Biotechnol，2004.22(8)p.406-10]。
與小分子藥物形成對(duì)照，治療性抗體是具有高度復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)的大分子。雖然使用靈敏的物理化學(xué)分析方法能較好地表征合成藥物，但僅僅使用物理化學(xué)方法不能充分地表征重組蛋白質(zhì)。重組生物蛋白質(zhì)由內(nèi)在可變的遺傳修飾細(xì)胞分泌。產(chǎn)物能以不同的異構(gòu)體產(chǎn)生，或可形成團(tuán)聚體。糖基化作用和其它翻譯后修飾是導(dǎo)致異質(zhì)性的其它復(fù)雜因素。用于生物治療劑的生產(chǎn)方法遠(yuǎn)比用于合成藥物產(chǎn)品的方法復(fù)雜得多。因此生物治療性蛋白質(zhì)的最終性質(zhì)很大程度上取決于生產(chǎn)方法[Rosenberg，A.S.，Immunogenicity of biological therapeuticsa hierarchy of concerns.Dev Biol(Basel)，2003.112p.15-21]，并且也可能受劑型的影響。批次到批次(Batch-to-batch)的變化是很普遍的，這使得重復(fù)性成為評(píng)估產(chǎn)品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一。由于物理化學(xué)方法不能充分表征生物治療性產(chǎn)品，因此需要生物系統(tǒng)與物理化學(xué)數(shù)據(jù)相補(bǔ)充來(lái)表征該產(chǎn)品[Schellekens，H.，Bioequivalenceand the immunogenicity of biopharmaceuticals.Nat Rev Drug Discov，2002.1(6)p.457-62]。確保不同生產(chǎn)批次在它們的內(nèi)在免疫學(xué)性質(zhì)上具有可比性已成為生物治療劑生產(chǎn)中所面臨的最嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)之一。
當(dāng)將治療性蛋白質(zhì)施與患者時(shí)，它們大多數(shù)都能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[Ryff，J.C.和H.Schellekens，Immunogenicity of rDNA-derived pharmaceuticals.Trends Pharmacol Sci，2002.23(6)p.254-6]，治療性抗體也不例外[Ryff，J.C.和H.Schellekens，Immunogenicity of rDNA-derived pharmaceuticals.Trends Pharmacol Sci，2002.23(6)p.254-6]。然而，抗產(chǎn)品抗體的發(fā)生在不同產(chǎn)品之間大為不同，有些在大多數(shù)個(gè)體中都能誘導(dǎo)抗體，而對(duì)于其它的來(lái)說(shuō)很少發(fā)生免疫反應(yīng)[Schellekens，H.，Immunogenicity of therapeuticproteinsclinical implications and future prospects.Clin Ther，2002.24(11)p.1720-40；discussion 1719]。很多因素影響免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，它們可能是抗體結(jié)構(gòu)內(nèi)非人氨基酸序列的存在、靶分子的性質(zhì)、應(yīng)用途徑或作為治療劑適應(yīng)癥的疾病類型。在含有完全相同的氨基酸一級(jí)序列的相同產(chǎn)品的兩次裝料(charges)中，團(tuán)聚體的形成、蛋白質(zhì)的差異折疊的三維結(jié)構(gòu)的存在，或雜質(zhì)的存在都可以嚴(yán)重影響免疫原性[Schellekens，H.，When biotechproteins go off-patent.Trends Biotechnol，2004.22(8)p.406-10]。當(dāng)抗產(chǎn)品抗體與患者的內(nèi)源性蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)時(shí)，令人印象深刻地觀察到了驚人的免疫原性后果，這在重組促紅細(xì)胞生成素-α的劑型變化后觀察到[Casadevall，N.，Antibodies against rHuEPOnative and recombinant.Nephrol Dial Transplant，2002.17 Suppl 5p.42-7；Casadevall，N.，Purered cell aplasia and anti-erythropoietin antibodies in patients treated withepoetin.Nephrol Dial Transplant，2003.18 Suppl 8p.viii37-41；Casadevall，N.和L.Croisille，[Erythropoiesis disorders and other central autoimmuneanemias].Rev Prat，2001.51(14)p.1547-51；Casadevall，N.等人，Purered-cell aplasia and antierythropoietin antibodies in patients treated withrecombinant erythropoietin.N Engl J Med，2002.346(7)p.469-75]。因此迫切需要監(jiān)測(cè)生產(chǎn)變化對(duì)產(chǎn)品就免疫原性而言的質(zhì)量所產(chǎn)生的結(jié)果的系統(tǒng)。
使用包括分離的人樹(shù)突細(xì)胞和人T輔助淋巴細(xì)胞的體外系統(tǒng)能夠很容易地監(jiān)測(cè)到蛋白質(zhì)的一級(jí)序列變化[Stickler，M.M.，D.A.Estell和F.A.Harding，CD4+T-cell epitope determination using unexposed human donorperipheral blood mononuclear cells.J Immunother，2000.23(6)p.654-60]。這些模型可受T細(xì)胞前體發(fā)生頻率中供體-到-供體的差異和MHC多態(tài)性的限制，因此迫使人們研究大量具有不同MHC基因型的供體以得出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果。更重要的是，在分離的體外系統(tǒng)中不能監(jiān)測(cè)到除了一級(jí)結(jié)構(gòu)之外的但涉及蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的更微小的變化，因此需要更為完整的免疫系統(tǒng)模型。通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物系統(tǒng)能夠提供這樣的模型。
特別是，人同系物在動(dòng)物體內(nèi)是免疫原性的，同樣，在動(dòng)物體內(nèi)測(cè)試人抗體很難預(yù)測(cè)它們?cè)谌梭w內(nèi)的免疫原性潛力[Schellekens，H.，Bioequivalence and the immunogenicity of biopharmaceuticals.Nat RevDrug Discov，2002.1(6)p.457-62]。然而，在有些情況中可以評(píng)估不同制劑的相對(duì)免疫原性[Palleroni，A.V.，等，Interferon immunogenicitypreclinical evaluation of interferon-alpha 2a.J Interferon Cytokine Res，1997.17 Suppl 1p.S23-7]。雖然人蛋白質(zhì)對(duì)動(dòng)物來(lái)說(shuō)是外來(lái)的并因此將引起免疫應(yīng)答，但已被轉(zhuǎn)入了目的人蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將把該轉(zhuǎn)基因識(shí)別為自身的(基因)并對(duì)由該轉(zhuǎn)基因所編碼的蛋白質(zhì)變得耐受。雖然目前沒(méi)有動(dòng)物模型或體外系統(tǒng)能預(yù)測(cè)針對(duì)人體內(nèi)治療性蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答(這只能在臨床試驗(yàn)中排他且可靠地測(cè)定)，但人抗體轉(zhuǎn)基因小鼠[Storb，U.，Transgenic mice with immunoglobulin genes.Annu Rev Immunol，1987.5p.151-74]是評(píng)價(jià)造成破壞B細(xì)胞針對(duì)治療性抗體的耐受性的因素的最好的模型，并將因此構(gòu)成評(píng)估免疫可比性的重要工具，也就是，評(píng)估生產(chǎn)變化對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)治療性抗體的相對(duì)免疫原性性能的影響。
抗體轉(zhuǎn)基因小鼠是本領(lǐng)域眾所周知的；然而，尚未采用它們來(lái)解決治療性抗體的免疫可比性評(píng)估的問(wèn)題。本發(fā)明致力于解決在人體外系統(tǒng)中所遇到的缺陷，并為目前尚未解決的確保治療性抗體的免疫可比性的問(wèn)題提供一種解決方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于評(píng)估抗體的免疫可比性的方法，由此能夠確定抗體制劑相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)抗體制劑來(lái)說(shuō)引起免疫應(yīng)答與否(相對(duì)免疫原性)。
本發(fā)明提供一種用于確定外源抗體的相對(duì)免疫原性的方法，其包括如下步驟a)產(chǎn)生對(duì)標(biāo)準(zhǔn)抗體轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物，b)將所述轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物與外源抗體接觸，此處所述的外源抗體是轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)抗體的變體，和c)確定由(b)的外源抗體引起的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的免疫應(yīng)答。
外源抗體可以是治療性抗體。優(yōu)選地，外源抗體是人的、人源化的或嵌合抗體。更優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因抗體是免疫球蛋白γ(IgG)。甚至更優(yōu)選地，該抗體是抗人淀粉狀蛋白β-肽或其變體的抗體。最優(yōu)選的抗體是抗-AβIgG的變體。該抗-AβIgG詳細(xì)描述于專利申請(qǐng)WO03/070760之中，其在此完整引用作為參考。
優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)抗體是人的、人源化的或嵌合抗體。更優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因抗體是免疫球蛋白γ(IgG)。甚至更優(yōu)選地，該抗體是抗人淀粉狀蛋白β-肽的抗體。最優(yōu)選的抗體是抗-AβIgG。
轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物可以是任何非人動(dòng)物。優(yōu)選的非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。更優(yōu)選地，該非人動(dòng)物是嚙齒類動(dòng)物，例如小鼠或大鼠。
如文中所用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)準(zhǔn)抗體”指的是在確定條件下產(chǎn)生的抗體，其用作定量或定性值比較的公認(rèn)量度。
如文中所用的術(shù)語(yǔ)“變體”或“抗體變體”指的是在結(jié)構(gòu)特征、制備方法、劑型、或保存條件方面與標(biāo)準(zhǔn)抗體不同的抗體。結(jié)構(gòu)變體可包含一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變異(即構(gòu)象變化)、氨基酸的糖基化作用和化學(xué)修飾。進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)變異即是備選的結(jié)構(gòu)域間構(gòu)建體(VL/VL，VH/VH)、二聚體、寡聚體和較大的團(tuán)聚體。
可能影響相對(duì)免疫原性性能的因素可包含藥物物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變、藥品的劑型、雜質(zhì)和污染物。特別關(guān)注的是，可能由下游加工、儲(chǔ)存、配制和處理的改變而引起的天然蛋白質(zhì)及其結(jié)構(gòu)變體之間免疫原性的差別[Sharma，V.K.和D.S.Kalonia，Temperature- and pH-induced multiplepartially unfolded states of recombinant human interferon-alpha2apossibleimplications in protein stability.Pharm Res，2003.20(11)p.1721-9；Chirino，A.J.和A.Mire-Sluis，Characterizing biological products and assessingcomparability following manufacturing changes.Nat Biotechnol，2004.22(11)p.1383-91]。這些變異包括一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，例如氨基酸交換，糖基化變體和化學(xué)修飾，例如乙?；饔?，天冬酰胺脫氨基作用，甲硫氨酸、組氨酸或色氨酸氧化作用或者其它由例如氧化或光應(yīng)激、具有誘導(dǎo)衍生作用潛能的賦形劑或雜質(zhì)導(dǎo)致的化學(xué)修飾[Moss，C.X.等人，Asparaginedeamidation perturbs antigen presentation on class II MHC molecules.J BiolChem，2005；Mamula，M.J.等人，Isoaspartyl post-translational modificationtriggers autoimmune responses to self-proteins.J Biol Chem，1999.274(32)p.22321-7；Duenas，E.T.等人，Comparison between light induced andchemically induced oxidation of rhVEGF.Pharm Res，2001.18(10)p.1455-60；Gribben，J.G.等人，Development of antibodies to unprotectedglycosylation sites on recombinant human GM-CSF.Lancet，1990.335(8687)p.434-7；Mimura，Y.等人，Role of oligosaccharide residues of IgG1-Fc in Fcgamma RIIb binding.J Biol Chem，2001.276(49)p.45539-47；Chianese-Bullock，K.A.等人，Antigen processing of two H2-IEd-restrictedepitopes is differentially influenced by the structural changes in a viralglycoprotein.J Immunol，1998.161(4)p.1599-607；Khossravi M，Shire SJ，Borchardt RT.Evidence for the involyement of histidine A(12)in theaggregation and precipitation of human relaxin induced by metal-catalyzedoxidation.Biochemistry.2000 May 16；39(19)5876-85；Margiloff L，ChapliaL，Chow A，Singhal PC，Mattana J.Metal-catalyzed oxidation ofimmunoglobulin G impairs Fc receptor-mediated binding to macrophages.Free Radic Biol Med.1998 Nov 1；25(7)780-5；Duenas，E.T.等人，Comparison between light induced and chemically induced oxidation ofrhVEGF.Pharm Res，2001.18(10)p.1455-60]。通過(guò)全部或部分還原、分子內(nèi)二硫橋鍵的改變(“不規(guī)則性”)，或分子內(nèi)共價(jià)交聯(lián)，二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的變體例如能作為一級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾結(jié)果出現(xiàn)。例如通過(guò)熱應(yīng)激、pH短暫改變或與有機(jī)溶劑孵育，能形成一級(jí)序列與天然蛋白相同的構(gòu)象異構(gòu)體[Sharma，V.K.和D.S.Kalonia，Temperature- and pH-induced multiplepartially unfolded states of recombinant human interferon-alpha2apossibleimplications in protein stability.Pharm Res，2003.20(11)p.1721-9；Vermeer，A.W.和W.Norde，The thermal stability of immunoglobulinunfolding and aggregation of a multi-domain protein.Biophys J，2000.78(1)p.394-404；Ronnelid，J.等人，Immune complexes from SLE sera induceIL10 production from normal peripheral blood mononuclear cells by anFcgammaRII dependent mechanismimplications for a possible vicious cyclemaintaining B cell hyperactivity in SLE.Ann Rheum Dis，2003.62(1)p.37-42；Melnikova，Y.I.等人，Antigen-binding activity of monoclonalantibodies after incubation with organic solvents.Biochemistry(Mosc)，2000.65(11)p.1256-65；Reed MA等人，The denatured state under nativeconditionsa non-native-like collapsed state of N-PGK.J Mol Biol.2006 Mar24；357(2)365-72]。例如通過(guò)氧化應(yīng)激，和/或具有誘導(dǎo)分子間交聯(lián)潛能的賦形劑或雜質(zhì)存在時(shí)誘導(dǎo)的共價(jià)分子間交聯(lián)能形成更高級(jí)別的結(jié)構(gòu)變異，像備選的結(jié)構(gòu)域間構(gòu)建體(VL/VL，VH/VH)、二聚體、寡聚體和較大的團(tuán)聚體。二聚體、寡聚體和較大的團(tuán)聚體也能通過(guò)非共價(jià)分子間相互作用形成，例如作為非天然構(gòu)象異構(gòu)體的形成、膠束形成或一級(jí)結(jié)構(gòu)修飾的結(jié)果。
特別關(guān)注的是較大的團(tuán)聚體，因?yàn)樗鼈兊闹貜?fù)表位特征，除了構(gòu)象變化之外，已知它們還能增強(qiáng)多種治療性蛋白質(zhì)的免疫原性(Braun，A.等人，Protein aggregates seem to play a key role among the parameters influencingthe antigenicity of interferon alpha(IFN-alpha)in normal and transgenicmice.Pharm Res，1997.14(10)p.1472-8；Hochuli，E.，Interferonimmunogenicitytechnical evaluation of interferon-alpha 2a.J InterferonCytokine Res，1997.17 Suppl 1p.S15-21；Hermeling S等人，Structuralcharacterization and immunogenicity in wild-type and immune tolerant miceof degraded recombinant human interferon alpha2b.Pharm Res.2005 Dec；22(12)1997-2006)。已知通過(guò)例如暴露于光、物理應(yīng)力(震動(dòng)或攪拌)能促進(jìn)團(tuán)聚體的形成，并且團(tuán)聚體形成可以在長(zhǎng)期儲(chǔ)存期間特別是在溫度升高情況下或者是對(duì)藥品的不適當(dāng)處理下發(fā)生(Wang，W.Protein aggregation andits inhibition in biopharmaceutics.Int J Pharm.2005 Jan 31，289(1-2)1-30，以及文中引用的文獻(xiàn))。
術(shù)語(yǔ)“免疫反應(yīng)”用于本文中指的是免疫系統(tǒng)對(duì)抗原性刺激的任何反應(yīng)，包括抗體產(chǎn)生、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫以及免疫耐受。
術(shù)語(yǔ)“治療性抗體”用于本文中指的是可以用于處理、治療和診斷疾病的單克隆抗體。治療性抗體可以是任何動(dòng)物作為對(duì)抗原免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體。優(yōu)選地，治療性抗體通過(guò)嚙齒類動(dòng)物產(chǎn)生，更優(yōu)選通過(guò)小鼠產(chǎn)生。治療性抗體也可以是通過(guò)遺傳工程產(chǎn)生的抗體。適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ潜绢I(lǐng)域公知的，也就是噬菌體展示(Brekke OH和Loset GA，New technologies intherapeutic antibody development Curr Opin Pharmaco.2003 Oct3(5)544-50.)。優(yōu)選地，治療性抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于評(píng)估治療性抗體的免疫可比性的方法，包括如下步驟a)產(chǎn)生對(duì)標(biāo)準(zhǔn)抗體轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物，b)用治療性抗體免疫所述轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述治療性抗體是標(biāo)準(zhǔn)抗體的變體，c)收集被免疫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的血清，
d)測(cè)量血清中針對(duì)所述治療性抗體的抗體。
血清中針對(duì)所述治療性抗體的抗體是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為針對(duì)所述治療性抗體的免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體。
產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的方法是本領(lǐng)域公知的。合適的方法即是HoganB.，Beddington R.，Costantini F.& Lacy E.Manipulating the mouseembryo.A laboratory manual.第2版(1994).Cold Spring HarborLaboratory Press中描述的方法。
轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物中抗體的表達(dá)可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。優(yōu)選該抗體的表達(dá)是組成型的。
用于評(píng)估免疫應(yīng)答的方法是本領(lǐng)域公知的。合適的方法是例如ELISA；更多的方法可在Harlow E.& Lane D.Antibodies.A laboratorymanual.(1988)Cold Spring Harbor Laboratory Press中找到。
此外，本發(fā)明涉及標(biāo)準(zhǔn)抗體轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物及其用于確定外源抗體的相對(duì)免疫原性的用途，其中所述外源抗體是轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)抗體的變體，優(yōu)選是治療性抗體的變體。
轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物可以是任何非人動(dòng)物。優(yōu)選的非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。更優(yōu)選地，該非人動(dòng)物是嚙齒類動(dòng)物，例如小鼠或大鼠。用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的方法是本領(lǐng)域公知的。合適的方法即是Hogan B.，BeddingtonR.，Costantini F.& Lacy E.Manipulating the mouse embryo.A laboratorymanual.第2版(1994).Cold Spring Harbor Laboratory Press中的方法。
用于評(píng)估免疫應(yīng)答的方法也是本領(lǐng)域公知的。合適的方法例如是ELISA；更多的方法可在Harlow E.& Lane D.Antibodies.A laboratorymanual.(1988)Cold Spring Harbor Laboratory Press中找到。
外源抗體可以是治療性抗體。優(yōu)選地，外源抗體是人的、人源化的或嵌合抗體。更優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因抗體是免疫球蛋白γ(IgG)。甚至更優(yōu)選地，抗體是抗人淀粉狀蛋白β肽或其結(jié)構(gòu)變體的抗體。最優(yōu)選的抗體是抗-AβIgG的變體?？?AβIgG詳細(xì)描述于專利申請(qǐng)WO03/070760中，其在此完整引用作為參考。
優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)抗體是人的、人源化的或嵌合抗體。更優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因抗體是免疫球蛋白γ(IgG)。甚至更優(yōu)選地，抗體是針對(duì)人淀粉狀蛋白β肽的抗體。最優(yōu)選的抗體是抗-AβIgG。
現(xiàn)在已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了一般性描述，參考特定實(shí)施例將會(huì)更好地理解這些內(nèi)容，除非另有說(shuō)明，納入本發(fā)明中的這些特定實(shí)施例與下面的附圖相結(jié)合只是用于闡明的目的而非旨在限制。


圖1顯示了特異于克隆入表達(dá)載體pHSE3′用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的人Aβ的人Igγ1基因的完整編碼序列。用于PCR擴(kuò)增的引物的位置和名稱顯示于相應(yīng)序列的上面或下面。終止密碼子以粗體顯示。
圖2顯示了特異于克隆入表達(dá)載體pHSE3′用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的人Aβ的人Igκ基因的完整編碼序列。用于PCR擴(kuò)增的引物的位置和名稱顯示于相應(yīng)序列的上面或下面。終止密碼子以粗體顯示。
圖3顯示了轉(zhuǎn)基因小鼠血清分析的圖示。進(jìn)行了對(duì)人κ輕鏈和人γ重鏈特異的夾心ELISA。MS小鼠血清。hIgG1γ1同種型的重組人免疫球蛋白。F2F建立者小鼠2F。NegPCR-陰性同窩仔畜對(duì)照。Tg 5M+轉(zhuǎn)基因小鼠5M+。Tg 7M+轉(zhuǎn)基因小鼠7M+。轉(zhuǎn)基因小鼠在同一分子內(nèi)表達(dá)兩個(gè)抗體鏈。
圖4顯示了用FACS(熒光激活細(xì)胞分選術(shù))評(píng)估淋巴細(xì)胞亞群的圖示。用特異于B細(xì)胞、T細(xì)胞和T輔助細(xì)胞以及細(xì)胞毒素T細(xì)胞的抗體對(duì)來(lái)自野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠的外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色。在野生型和hIgG1-轉(zhuǎn)基因小鼠的淋巴細(xì)胞亞群之間未能檢測(cè)到顯著差異。A)野生型B1/6，B)轉(zhuǎn)基因小鼠。
圖5為顯示野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因(TG)小鼠體內(nèi)的抗-KLH抗體滴度的圖示。在第0天用KLH免疫野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠。在第7天和第12天，評(píng)估抗-KLH抗體的滴度。在KLH刺激時(shí)，轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠反應(yīng)相似。
圖6為顯示轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)抗-HUMIRA滴度的圖示。在第0天用人IgG1抗體HUMIRA免疫轉(zhuǎn)基因小鼠。在第7、12、21和35天，測(cè)量血清抗-HUMIRA的滴定度。轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生了針對(duì)HUMIRA的應(yīng)答。
圖7顯示了A)分子量標(biāo)準(zhǔn)B)Mab11空白對(duì)照劑和C)Mab11的大小排阻層析圖(SEC)。設(shè)備、運(yùn)行條件以及操作描述于方法部分。
圖8顯示了A)Mab11空白對(duì)照劑和B)Mab11的離子交換層析圖。設(shè)備、運(yùn)行條件以及操作描述于方法部分。
圖9顯示了在A)非還原和B)還原條件下，Mab11和還原的/烷基化的Mab11(RA-Mab11)在4-12％Bis-Tris凝膠上跑樣的SDS-PAGE圖。
圖10為還原的/烷基化的Mab11(RA-Mab11)的LC/MS分析的圖示。A)C8RP-HPLC，UV-追蹤(214nm)，B)去卷積(deconvoluted)質(zhì)譜。C)B)中HMW質(zhì)量峰局部放大區(qū)域。有關(guān)觀察到和計(jì)算的質(zhì)量分配參見(jiàn)表3。
圖11顯示野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因(TG)動(dòng)物中抗Mab-11滴度的圖示。在第0天用天然Mab-11免疫野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠。在第7、12、21和35天，評(píng)估抗-Mab-11抗體的滴度。轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)Mab-11的刺激表現(xiàn)出耐受性。
圖12顯示在野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因(TG)小鼠中抗-RA Mab-11滴度(RA＝還原的-烷基化的)的圖示。在第0天用RA Mab-11免疫野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠。在第7、12、21和35天，評(píng)估抗-RA Mab-11的滴度。野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠都對(duì)RA Mab-11應(yīng)答。
圖13顯示轉(zhuǎn)基因(TG)小鼠對(duì)Mab-11(◆)和還原的-烷基化的(RA)-Mab-11(●)的抗體反應(yīng)的圖示。用天然的Mab-11和RA Mab-11免疫轉(zhuǎn)基因小鼠。第一次免疫后3個(gè)月，用天然Mab-11加強(qiáng)動(dòng)物。評(píng)估加強(qiáng)前后對(duì)天然Mab-11的抗體應(yīng)答。2/5小鼠顯示出與天然Mab-11的交叉反應(yīng)。
實(shí)施例除非另有說(shuō)明，根據(jù)廠商的說(shuō)明來(lái)使用實(shí)施例中涉及的商業(yè)可獲得的試劑。
實(shí)施例1人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生構(gòu)建體的產(chǎn)生使用對(duì)人Ab肽具有特異性的編碼同種型γ1的免疫球蛋白(Ig)重鏈(H)的cDNA(SEQ.ID.NO1)和編碼同種型κ輕鏈(L)的cDNA(SEQ.ID.NO2)[Bardroff，M.e.a.，Anti-amyloid beta antibodies and their use.EP03001759EP，2003]。使用表1中的引物，通過(guò)PCR反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增這些cDNAs。為直接插入到pHSE3′載體中，5′引物含有SalI(或相容的XhoI)位點(diǎn)，并且3′引物含有BamHI(或相容的BglII)位點(diǎn)[Pircher，H.等人，Tcell tolerance toMlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.1 chain transgenic mice.Embo J，1989.8(3)p.719-27]。首先用兩個(gè)限制性內(nèi)切酶SalI和BamHI來(lái)酶切PCR擴(kuò)增的cDNAs，然后將它們分別插入載體pHSE3′的相應(yīng)位點(diǎn)。pHSE3′內(nèi)Ig cDNAs的表達(dá)由MHC I類基因H-2k的鼠源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，并由位于該克隆基因3′的鼠源Ig H基因增強(qiáng)子增強(qiáng)[Pircher，H.等人，T celltolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.1 chaintransgenic mice.Embo J，1989.8(3)p.719-27]。該表達(dá)載體確保了在轉(zhuǎn)基因小鼠的T和B淋巴細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)插入的基因產(chǎn)物的高水平產(chǎn)生([Pircher，H.等人，T cell tolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.1chain transgenic mice.Embo J，1989.8(3)p.719-27]以及未發(fā)表的資料)。隨后將包括(從5′到3′)H-2K啟動(dòng)子、插入的cDNA、poly-A和剪接位點(diǎn)以及Ig H基因增強(qiáng)子元件的完整的表達(dá)盒通過(guò)限制性內(nèi)切酶XhoI切割從載體上切除，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠純化，然后制備成適合微量注射到受精小鼠卵母細(xì)胞的足夠濃度(溶于10mM TrisHCl/0.1mM EDTA，pH 7，2μg/ml)。通過(guò)測(cè)序編碼抗-AβIg H和L基因的完整cDNAs來(lái)證實(shí)cDNA的編碼潛力(參見(jiàn)圖1)。
表1.克隆引物的序列

抗-AβIgG1轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生用前面部分描述的純化的編碼Ig H和L基因的XhoI片段的1∶1混合物顯微注射來(lái)自C57BL/6雌性供體的受精卵母細(xì)胞以獲得雙轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。通過(guò)用特異性引物擴(kuò)增從尾部活組織檢查制備的基因組DNA，來(lái)篩選這些由顯微注射的卵母細(xì)胞產(chǎn)生的幼畜中轉(zhuǎn)基因的存在。所使用的引物顯示于表2。
表2.用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的引物序列

使用1μl(大約100ng)得自尾部活組織檢查的總DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件如下90℃1分鐘，30×[94℃10秒，64℃30秒，72℃90秒]，72℃7分鐘。最后用1.5％瓊脂糖凝膠觀察到了分別對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)基因IgH和L基因的大約660bp的PCR擴(kuò)增的DNA片段。
總計(jì)產(chǎn)生了5只攜帶Ig H和L基因的轉(zhuǎn)基因小鼠和一只僅攜帶IgH基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，并對(duì)它們進(jìn)行繁育。
實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因小鼠的表型特征血清分析通過(guò)尾部靜脈穿刺獲得血液。并于室溫過(guò)夜進(jìn)行凝固。以500xg離心10分鐘分離血清并于-20℃凍存待進(jìn)一步分析。
為確定轉(zhuǎn)基因小鼠是否表達(dá)完整的人抗體，開(kāi)發(fā)了ELISA系統(tǒng)。使用多克隆山羊-抗-人κ鏈特異性抗體(Sigma K 3502)來(lái)捕獲人抗體。用偶聯(lián)于過(guò)氧化物酶(POD，Sigma A 0170)的單克隆小鼠-抗-人γ鏈特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。如圖5所示，轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)完整的人免疫球蛋白。
用FACS檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群。通過(guò)尾部靜脈穿刺獲得血液并將其收集于肝素包被的管(Sarstedt)內(nèi)。像廠商描述的那樣在裂解緩沖液(緩沖液EL，Cat.No.70217，Qiagen)中裂解紅細(xì)胞。將細(xì)胞重懸于FACS-緩沖液(PBS，0.05％NaN3，3％FCS)中，根據(jù)廠商的建議(Becton-Dickinson)進(jìn)行抗體染色。如圖4所示，野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠都含有相當(dāng)比率的B細(xì)胞(B220+)、T-細(xì)胞(CD5+)、CD4+T輔助細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞。因此，轉(zhuǎn)基因人IgG1的表達(dá)不影響淋巴細(xì)胞亞群。
為評(píng)估免疫能力，用模型抗原KLH(匙孔血藍(lán)蛋白，Sigma，H-7017，Lot 121K4838)免疫5只轉(zhuǎn)基因和野生型同窩對(duì)照小鼠的組。通過(guò)ELISA測(cè)定抗-KLH的滴度，使用包被在maxisorp板(Nunc)上的KLH來(lái)捕獲，并使用抗-小鼠IgG1(BD Pharmigen)來(lái)檢測(cè)。野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)KLH產(chǎn)生了相當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)(圖5)。因此hIgG1轉(zhuǎn)基因小鼠具有免疫能力。
通過(guò)用人IgG1抗體HUMIRA(Abbott)免疫來(lái)評(píng)估針對(duì)密切相關(guān)抗原的應(yīng)答。將10μgHUMIRA乳化于200μl Rehydragel HPA(Reheis)中。在第0天腹膜內(nèi)(i.p.)免疫動(dòng)物，在第7、12、21和35天通過(guò)尾部靜脈穿刺抽血，制備血清，并通過(guò)ELISA測(cè)定抗-HUMIRA滴度，通過(guò)用HUMIRA包被maxisorp板(Nunc)來(lái)捕獲，并通過(guò)抗-小鼠IgG(BD Pharmigen)來(lái)檢測(cè)抗-HUMIRA抗體。如圖6所示，轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生了針對(duì)密切相關(guān)的人IgG1抗體HUMIRA的應(yīng)答。
實(shí)施例3Mab11(也稱之為抗-Aβ-IgG1)的產(chǎn)生、純化和表征細(xì)胞培養(yǎng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Hoffmann-La Roche，瑞士)經(jīng)改造適合在自制的DHI培養(yǎng)基制劑(Invitrogen)內(nèi)進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)，該培養(yǎng)基制劑是DMEM、Ham’s F12和IMDM分別以1∶1∶2(v∶v∶v)比例的混合物(Schlaeger &Schumpp 1992)，并含有0.2％大豆HyPep 1510和0.2％稻HyPep 4601的植物水解產(chǎn)物(Kerry Bioscience)。使用大約70％推薦的工作體積以80-100rpm將這些細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于旋轉(zhuǎn)燒瓶(Bellco，Inotech AG，Dotlikon，Switzerland)內(nèi)。大規(guī)模的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染也可在6L旋轉(zhuǎn)燒瓶或5到14升攪拌釜生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行(Chemap，MBR，Zürich，and Infors，Bottmingen，瑞士)。使用商業(yè)可獲得的試劑盒(Nucleobond Ax，Macherey-Nagel AG，瑞士)進(jìn)行pMAb-11的質(zhì)粒制備。以pUC18DNA(Pharmacia Biotech，Zürich，瑞士)為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)分光光度法測(cè)定并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳估計(jì)質(zhì)粒的濃度。
轉(zhuǎn)染操作為進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，將生長(zhǎng)于DHI培養(yǎng)基內(nèi)的懸浮CHO細(xì)胞以1×106/ml的密度接種于最終容器中，并培養(yǎng)至密度為2-3×106個(gè)細(xì)胞/ml(1-2天)。然后用新鮮的DHI培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度再調(diào)整至1-1.5×106個(gè)細(xì)胞/ml，并在進(jìn)行轉(zhuǎn)染之前讓培養(yǎng)物生長(zhǎng)3-4h。在加入轉(zhuǎn)染復(fù)合體后，將細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后于37℃培養(yǎng)24小時(shí)。從24小時(shí)開(kāi)始，將剩余培養(yǎng)物的溫度轉(zhuǎn)變?yōu)?3℃，并培養(yǎng)5-6天。每24小時(shí)常規(guī)收獲上清液樣品，并通過(guò)蛋白A親和層析法(Amersham，Aekta FPLC系統(tǒng))來(lái)測(cè)定單克隆抗體(mAb)的含量。通過(guò)過(guò)濾收集上清液，并將其直接上樣到裝有蛋白A樹(shù)脂的第一個(gè)純化柱(mAbSelect，Amersham，GE)上。
轉(zhuǎn)染復(fù)合體的制備DNA復(fù)合體在室溫以1/10培養(yǎng)體積形成于不含肝素的HL培養(yǎng)基內(nèi)(Schlaeger & Schumpp 1990，Schlaeger 1996)。在優(yōu)化的用于CHO細(xì)胞的基因遞送條件下，將0.7μg DNA/ml細(xì)胞加入0.1ml新鮮培養(yǎng)基中并輕輕混合。兩分鐘后，加入1μl Ro1539Xtreme Gene(Roche Applied Science，Indianapolis，USA)并混合。室溫孵育15分鐘后，將轉(zhuǎn)染復(fù)合體轉(zhuǎn)至等量的細(xì)胞，也就是在生物反應(yīng)器或旋轉(zhuǎn)燒瓶中的細(xì)胞。
從發(fā)酵上清液分離和純化Mab11所有步驟都是在無(wú)內(nèi)毒素的條件下通過(guò)只使用回火的玻璃儀器進(jìn)行，所有設(shè)備包括柱子的衛(wèi)生處理都是用0.5M NaOH進(jìn)行，并且所有緩沖液都過(guò)濾除菌(0.22μm)。只使用新鮮的凝膠材料。
第一步蛋白A親合層析先用3倍凝膠體積(GV)的平衡緩沖液(25mM Tris/HCl；25mM NaCl，5mM EDTA pH 7.1)來(lái)洗滌BioRad econo柱(BioRad)內(nèi)的Mab Select凝膠(Amersham)，然后用2GV再生緩沖液(2M Guanidin，100mM Tris pH 7.5)接著用5GV平衡緩沖液洗滌。預(yù)運(yùn)行后，將最多20mg Mab/ml上樣凝膠。先用3GV平衡緩沖液洗滌柱子，然后用4GV洗滌緩沖液(1M Tris/HCl pH7.2)和3GV平衡緩沖液洗滌。用100mM HAc pH 2.9洗脫蛋白A結(jié)合的抗體。為滅活病毒，用HAc將洗脫液調(diào)節(jié)至pH≤3.6，然后室溫孵育15分鐘。然后用1M Tris于室溫調(diào)節(jié)至pH 4.0。
第二步離子交換層析(陽(yáng)離子交換層析)先用2GV再生緩沖液(0.5M NaOH，1M NaCl)和3GV再生緩沖液緩沖液A(50mM HAc，pH 5.0)洗滌BioRad econo柱(BioRad)內(nèi)的SP-Toyopearl 650M(Tosoh)。預(yù)運(yùn)行后，將最多10mg Mab/ml上樣凝膠。先用0.5GV緩沖液A洗滌柱，然后用0-100％的緩沖液B(50mM HAc，1MNaCl pH 5.0)進(jìn)行梯度洗脫。收集洗脫的蛋白質(zhì)級(jí)分并通過(guò)IEX和SECHPLC分析。
第三步大小排阻層析(Flow-though陰離子交換層析)通過(guò)超濾濃縮第二步的級(jí)分，將其pH值調(diào)節(jié)至7.5并上樣至BioRadecono柱(BioRad)內(nèi)的Q-Sepharose FF凝膠(Biorad)。使用25mM Tris/HCl，80mM乙酸鈉，pH 7.5作為流動(dòng)相進(jìn)行SEC層析。根據(jù)UV信號(hào)分級(jí)分離流出液，并將其pH調(diào)節(jié)至5.5。在Amicon攪拌室內(nèi)使用10kDa膜將緩沖液交換成含有20mM組氨酸/140mM NaCl，pH 5.5的Mab11空白對(duì)照劑并調(diào)節(jié)濃度。最后將該溶液通過(guò)0.22μm Millex-GV無(wú)菌過(guò)濾器(Millipore)過(guò)濾，并等份保存于-80℃。
Mab11的表征大小排阻層析使用Jasco PU-980HPLC系統(tǒng)，通過(guò)大小排阻層析來(lái)分析純化的Mab11樣品。將這些樣品在TSK-Gel G3000SWXL，7.8×300mm，5μm柱(Tosho Biosciences)上層析，以0.2M K2HPO4，0.25M KCl，pH 7.0作為流動(dòng)相。流速設(shè)為0.5ml/分鐘。使用連到Merck-Hitachi D-2500記錄系統(tǒng)的Jasco UV-975檢測(cè)器來(lái)監(jiān)測(cè)220nm處的吸收。
平衡柱子直到獲得穩(wěn)定的基線。序列注入相應(yīng)的凝膠過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)(BioRad，151-1901，包括670kD牛甲狀腺球蛋白、158kD牛IgG、44kD OVA、17kD馬肌紅蛋白、1.35kD維生素B12)、Mab11空白對(duì)照劑(陰性對(duì)照沒(méi)有Mab11的緩沖液)、Mab11樣品。注入的量對(duì)應(yīng)于約50μg樣品。代表性的大小排阻層析圖顯示于圖7。結(jié)果在保留時(shí)間內(nèi)對(duì)稱峰對(duì)應(yīng)155-160kDa。未檢測(cè)到團(tuán)聚體或片段。
離子交換層折使用Jasco PU-980HPLC系統(tǒng)，通過(guò)離子交換層析來(lái)分析純化的Mab11樣品。20分鐘內(nèi)通過(guò)使用0％B到52％B的梯度將樣品在Mono S5/50GL柱(Amersham Biosciences)上層析(流動(dòng)相A50mM溶于水的丙二酸/丙二酸鹽，pH5.3；流動(dòng)相B溶于流動(dòng)相A的1M乙酸鈉，pH 5.3)。流速設(shè)為1ml/分鐘。使用連接到Merck-Hitachi D-2500記錄系統(tǒng)的JascoUV-975檢測(cè)器來(lái)監(jiān)測(cè)在280nm處的吸收。
用流動(dòng)相A平衡柱子直到獲得穩(wěn)定的基線。序列注入相應(yīng)的Mab11空白對(duì)照劑和Mab11樣品。Mab11的注入量對(duì)應(yīng)于約50μg。代表性的離子交換層析圖(IEC)顯示于圖8。結(jié)果在較高的保留時(shí)間內(nèi)，95％的Mab11樣品洗脫成單一峰，其具有不可分辨的肩峰。大約5％洗脫具有較短的保留時(shí)間。
十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳使用Xcell Mini-Cell II Gelsystem(Invitrogen)，通過(guò)SDS-PAGE來(lái)分析純化的Mab11樣品。將事先稀釋的樣品與還原或非還原樣品緩沖液混合至濃度為2-8μg/20μL。根據(jù)廠商的指導(dǎo)將NuPAGE LDS樣品緩沖液(Invitrogen)與NuPAGE還原劑(Invitrogen)混合制備還原樣品緩沖液。將還原樣品緩沖液中的樣品于70℃孵育10分鐘。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)上樣于NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝膠，10孔梳，1.0mm厚(Invitrogen，#NP0301BOX)。使用覆蓋200-2.5kDa的Mark12TM分子量標(biāo)準(zhǔn)(Invitrogen，#LC5677)作為標(biāo)準(zhǔn)物。使用NuPAGE MOPS SDS跑樣緩沖液(Invitrogen)在200V進(jìn)行凝膠跑樣。用StainEase凝膠染色托盤(Invitrogen)對(duì)凝膠染色過(guò)夜，并通過(guò)光密度法進(jìn)行掃描和分析。參考從在同一凝膠上電泳的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)獲得的標(biāo)準(zhǔn)樣品曲線來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果在還原條件下的SDS-PAGE顯示出對(duì)應(yīng)于IgG1H-鏈和L-鏈的分子量的兩條帶。未檢測(cè)到團(tuán)聚體和片段(參見(jiàn)圖9)。
質(zhì)譜為進(jìn)行質(zhì)譜分析，根據(jù)實(shí)施例5中描述的方法制備還原的/羧甲基化的抗體。通過(guò)使用Agilent 1100Capillary-HPLC系統(tǒng)，對(duì)樣品進(jìn)行分析性RP-HPLC分析。應(yīng)用梯度系統(tǒng)(A水0.1％甲酸，B乙腈0.1％甲酸)將樣品在Agilent Poroshell C8-反相柱(0.5×75mm)上層析。流速設(shè)為15μl/分鐘，柱溫設(shè)為70℃。隨后將層析流應(yīng)用于質(zhì)譜儀的ESI離子源。在ESI-Q-TOF質(zhì)譜儀(Micromass/Waters Q-TOF Ultima，Manchester，UK)上以陽(yáng)性模式和lockspray質(zhì)量校正進(jìn)行測(cè)量。用Masslynx MaxEnt1模塊對(duì)蛋白質(zhì)光譜去卷積。
RA-Mab11的LC/MS分析顯示于圖10，觀察到的和計(jì)算的質(zhì)量在表3中予以分配。
表3.RA-Mab11的LC/MS分析結(jié)果，觀察到的質(zhì)量分配(參見(jiàn)圖10)。
L-鏈＝輕鏈，H-鏈＝重鏈

結(jié)果檢測(cè)的質(zhì)量與具有Mab11一級(jí)序列的抗體的理論上預(yù)期的還原的&羧甲基化的H-和L-鏈相匹配，其中H-鏈內(nèi)帶有一個(gè)pyro-Glu以及一個(gè)Lys缺失。該H-鏈主要是G0和G1糖基化的，G2只是很小程度地糖基化。
實(shí)施例4耐受性的免疫評(píng)估用乳化于200μl Rehydragel-HPA(Reheis)的10μg重組Mab-11通過(guò)腹膜內(nèi)(i.p.)途徑免疫5只轉(zhuǎn)基因和野生型同窩對(duì)照小鼠的組。在第7、12、21和35天，通過(guò)尾部靜脈穿刺獲得血液。通過(guò)凝結(jié)制備血清，用ELISA方法，通過(guò)將Mab-11包被于maxisorp板(Nunc)上，并通過(guò)抗-小鼠IgG(BDPharmingen)檢測(cè)抗Mab-11抗體來(lái)測(cè)定血清抗-Mab-11滴度。ELISA分析揭示了在野生型動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)Mab-11的強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，而hIgG1-轉(zhuǎn)基因動(dòng)物不能產(chǎn)生對(duì)rhIgG1的免疫應(yīng)答(圖11)。因此，hIgG1轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)外源供應(yīng)的相同同種型和特異性的抗體，例如，對(duì)它們的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物是耐受的。
實(shí)施例5藥物物質(zhì)變體的產(chǎn)生作為結(jié)構(gòu)變體，選擇還原的/烷基化的Mab11，這是因?yàn)檫@些衍生物是充分確定的而且適于全面的物理化學(xué)表征。通過(guò)鏈間二硫鍵的還原切割，將抗體切割成重鏈和輕鏈。自由巰基隨后用碘乙酸烷基化從而阻止通過(guò)再氧化的聚合作用。
還原的/烷基化Mab11的產(chǎn)生和表征為制備完全還原和羧甲基化的Mab11，將二硫蘇糖醇(DTT)溶于去離子水至0.1g/ml，并加到溶于6M鹽酸胍0.3M Tris/HCl pH 8.5中的1mg/mlMab11至終濃度20mM。于50℃+/-3℃孵育60分鐘后，加入剛?cè)芙庥谌ルx子水的碘乙酸(IAA)0.33g/ml至終濃度50mM。在黑暗中于室溫進(jìn)行烷基化30分鐘。通過(guò)加入相對(duì)于IAA 1.5倍摩爾過(guò)量DTT來(lái)鈍化碘乙酸并將其于室溫孵育10分鐘。
根據(jù)廠商的教導(dǎo)，使用PD-10脫鹽柱(Aemrsham)純化還原的/烷基化的抗體(RA-Mab-11)，以20mM Tris/HCl緩沖液pH 8.5為流動(dòng)相，最大樣品負(fù)荷為每柱1.5ml。使用PD-10或NAP-5脫鹽柱(Amersham)，以PBSpH 7.4或Mab11空白對(duì)照劑為流動(dòng)相，再次純化含蛋白質(zhì)的流出液。收集合蛋白質(zhì)的級(jí)分，并將其在層流下無(wú)菌過(guò)濾，將其等分于無(wú)菌聚丙烯管內(nèi)并貯存于-80℃。產(chǎn)物對(duì)照和還原的/羧甲基化的抗體的蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定如實(shí)施例3中所概述的那樣通過(guò)毛細(xì)管LC-QTOF-MS和SDS-PAGE進(jìn)行。
RA-Mab11的表征，結(jié)果在還原條件下的SDS-PAGE顯示出對(duì)應(yīng)于IgG1H-和L-鏈分子量的兩條帶。未檢測(cè)到團(tuán)聚體或片段(參見(jiàn)圖9)。質(zhì)譜分析的結(jié)果參見(jiàn)實(shí)施例3(表3和圖10)。
實(shí)施例6評(píng)價(jià)Mab-11轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因同窩小鼠體內(nèi)Mab-11的還原的/烷基化的(RA-)變體的免疫原性為確定與天然蛋白質(zhì)相比構(gòu)象的變化是否對(duì)體內(nèi)轉(zhuǎn)基因小鼠模型中致敏發(fā)揮關(guān)鍵作用，我們使用通過(guò)完全或部分還原和烷基化二硫鍵制備的Mab-11的衍生物來(lái)免疫轉(zhuǎn)基因小鼠及非轉(zhuǎn)基因同窩小鼠。通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)對(duì)天然蛋白質(zhì)及其結(jié)構(gòu)變體的體液免疫反應(yīng)的幅度。
在第0天，通過(guò)腹膜內(nèi)途徑，使用乳化于200μl Rehydragel-HPA(Reheis)的10μg RA-Mab-11免疫野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠組(N＝5)。在第7、12、21和35天，通過(guò)尾部靜脈穿刺抽取血液。通過(guò)凝固制備血清并貯存于-20℃。
通過(guò)ELISA檢測(cè)結(jié)合RA-Mab-11的抗體。用溶于PBS的RA-Mab-11在4℃過(guò)夜包被96孔MaxiSorpTM板(Nunc)的孔。用含有0.05％Tween 20的PBS(PBST)中的2％BSA進(jìn)行封閉。PBST用于洗滌，溶于PBST的0.5％BSA用作稀釋液。洗滌3次后，將100μl稀釋的血清樣品加入包被的孔內(nèi)并于37℃孵育1小時(shí)。使用抗-小鼠IgG1抗體(BD Pharmigen)來(lái)評(píng)價(jià)抗體水平。在用ABTS底物溶液(Roche)顯影后，使用自動(dòng)平板讀數(shù)器在450nm處檢測(cè)抗體的結(jié)合。
ELISA分析顯示RA-Mab-11在Mab-11轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因的同窩小鼠中引起了強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答(圖12)，而Mab-11轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)天然的、重組Mab-11的處理卻是耐受的(圖11)。然而，天然Mab-11在野生型同窩小鼠中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(圖11)。有趣的是，由于當(dāng)用RA-Mab-11免疫時(shí)，小鼠產(chǎn)生針對(duì)天然Mab-11的交叉反應(yīng)抗體，因此用RA-Mab-11免疫破壞了一些動(dòng)物體內(nèi)針對(duì)自身天然蛋白質(zhì)的耐受性。在初次免疫后三個(gè)月用天然Mab-11加強(qiáng)，誘導(dǎo)了以交叉反應(yīng)性抗-RA-Mab-11為特征的記憶B細(xì)胞反應(yīng)，以及以前在相同的交叉反應(yīng)小鼠內(nèi)檢測(cè)到的抗-Mab-11滴度(圖13)。這些結(jié)果清楚表明Mab-11的結(jié)構(gòu)變體在轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)誘導(dǎo)了免疫應(yīng)答，所述轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)未改變的天然蛋白質(zhì)是耐受的。因此Mab-11轉(zhuǎn)基因小鼠是檢測(cè)抗體二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)變化的合適的系統(tǒng)。
序列表<110>弗.哈夫曼-拉羅切有限公司<120>用于免疫可比性的體內(nèi)模型<130>23082<160>10<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>1562<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1gcgccaccat gaaacacctg tggttcttcc tcctgctggt ggcagctccc agatgggtcc 60tgtcccaggt ggaattggtg gaaagcggcg gcggcctggt gcaaccgggc ggcagcctgc 120gtctgagctg cgcggcctcc ggatttacct ttagcagcta tgcgatgagc tgggtgcgcc 180aagcccctgg gaagggtcta gagtgggtga gcggtattaa tgctgctggt tttcgtactt 240attatgctga ttctgttaag ggtcgtttta ccatttcacg tgataattcg aaaaacaccc 300tgtatctgca aatgaacagc ctgcgtgcgg aagatacggc cgtgtattat tgcgcgcgtg 360gtaagggtaa tactcataag ccttatggtt atgttcgtta ttttgatgtt tggggccaag 420gcaccctggt gacggttagc tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac 480cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cagccctggg ctgcctggtc aaggactact 540tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct 600tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct 660ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca 720aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc 780
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<223>人工序列的描述G1.11Salfor，人抗-AβIgG1的重鏈的5’末端的引物<400>3acgtgtcgac gccgccacca tgaaacacct g 31<210>4<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述G1.11Bamrev，人抗-AβIgG1的重鏈的3’末端的引物<400>4acgtggatcc tcatttaccc ggagacag 28<210>5<211>31<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述K.11Xhofor，人抗-AβIgG1的輕鏈的5’末端的引物<400>5acgtctcgag gccgccacca tggtgttgca g 31<210>6<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述K.11Bglrev，人抗-AβIgG1的輕鏈的3’末端的引物<400>6acgtagatct ctaacactct cccctgttg 29<210>7<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述5H2KP，人抗-AβIgG1的重鏈基因的PCR引物<400>7atgaattcac agtttcactt ctgcacc 27<210>8<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述G1.0501，人抗-AβIgG1的重鏈基因的PCR引物<400>8tgtactcctt gccattcagc 20
<210>9<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述5H2KP，人抗-AβIgG1的輕鏈基因的PCR引物<400>9atgaattcac agtttcactt ctgcacc27<210>10<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工序列的描述K.44，人抗-AβIgG1的輕鏈基因的PCR引物<400>10gctcatcaga tggcgggaag20
權(quán)利要求
1.用于確定外源抗體的相對(duì)免疫原性的方法，其包括a)產(chǎn)生對(duì)標(biāo)準(zhǔn)抗體轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物，b)將所述轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物與外源抗體接觸，此處所述的外源抗體是所述轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)抗體的變體，c)確定由(b)的外源抗體引起的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的免疫反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述外源抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)抗體是抗人淀粉狀蛋白β肽的抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非人動(dòng)物是嚙齒類動(dòng)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非人動(dòng)物是小鼠。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法，其中所述變體包含一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變異、氨基酸的糖基化和化學(xué)修飾。
9.用于評(píng)估治療性抗體的免疫可比性的方法，其包括a)產(chǎn)生對(duì)標(biāo)準(zhǔn)抗體轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物，b)將所述轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物用治療性抗體免疫，其中該治療性抗體是標(biāo)準(zhǔn)抗體的變體，c)收集經(jīng)免疫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的血清，d)測(cè)量血清中針對(duì)所述治療性抗體的抗體。
10.對(duì)標(biāo)準(zhǔn)抗體轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物用于確定外源抗體的相對(duì)免疫原性的用途，其中該外源抗體是所述轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)抗體的變體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中所述外源抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中所述轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)抗體是抗人淀粉狀蛋白β肽的抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)所述的用途，其中所述非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)所述的用途，其中所述非人動(dòng)物是嚙齒類動(dòng)物。
15.根據(jù)權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)所述的用途，其中所述非人動(dòng)物是小鼠。
16.基本上如本文前面描述、特別是參考前述實(shí)施例描述的方法和用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于確定外源抗體變體的相對(duì)免疫原性的方法，其包括a)產(chǎn)生對(duì)標(biāo)準(zhǔn)抗體轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物，b)將所述轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物與外源抗體接觸，此處所述的外源抗體是a)中所述轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)抗體的變體，和c)確定由(b)的外源抗體所引起的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1891178SQ20061009429
公開(kāi)日2007年1月10日 申請(qǐng)日期2006年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月30日
發(fā)明者H·貝克, A·伊格萊希亞斯, T·施萊特米勒, M·措赫爾 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司