專利名稱：一種測(cè)定抗癲癇藥物血藥濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及體內(nèi)藥物的分析測(cè)定方法，具體涉及一種測(cè)定抗癲癇藥物血藥濃度的方法。
背景技術(shù)：
苯巴比妥(Phenobarbital，PB)、拉莫三嗪(Lamotrigine，LTG)、奧卡西平(Oxcarbazepine，OXC)是臨床上常用的抗癲癇藥物。其中，奧卡西平OXC在體內(nèi)可迅速代謝為活性代謝產(chǎn)物單羥奧卡西平(Monohydroxycarbazepine，MHD)。由于這些藥物的藥動(dòng)學(xué)個(gè)體間差異大，治療窗窄且藥動(dòng)學(xué)特征、抗癲癇效果與藥物不良反應(yīng)有相關(guān)關(guān)系，因此開展上述藥物的治療藥物監(jiān)測(cè)有重要的臨床意義。
目前國內(nèi)外測(cè)定抗癲癇藥物血藥濃度的方法主要是有高效液相色譜法(HPLC)和免疫法。免疫法只能測(cè)定PB，其他藥物的測(cè)定只能采用HPLC法。文獻(xiàn)報(bào)道的方法存在種種弊端如操作繁瑣費(fèi)時(shí)，效率低，測(cè)定周期長，所需儀器設(shè)備或試劑價(jià)格昂貴，分析成本高，不適合常規(guī)治療藥物濃度監(jiān)測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便、快速測(cè)定抗癲癇藥物血藥濃度的方法。本方法用于測(cè)定人血漿、血清中苯巴比妥(PB)、拉莫三嗪(LTG)、奧卡西平(OXC)和單羥奧卡西平(MHD)的定量濃度。
本方法無需昂貴的設(shè)備和試劑，具有操作簡(jiǎn)便，快速，靈敏度高，血漿用量少，成本低等優(yōu)點(diǎn)，適合常規(guī)治療藥物濃度監(jiān)測(cè)。
本方法將待測(cè)樣品預(yù)處理后，經(jīng)酸性流動(dòng)相在色譜柱分離后，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，采用下述步驟進(jìn)行1)樣品預(yù)處理定量分取血漿或血清樣品，加入有機(jī)溶媒蛋白沉淀劑進(jìn)行蛋白沉淀，所述的蛋白沉淀劑選自甲醇或乙腈或甲醇和乙腈混合物；2)樣品分離與分析采用通用型的液相色譜柱，其填料為ZORBAX Eclipse XDBC18.高效液相系統(tǒng)采用通用型的紫外檢測(cè)器以及高壓泵，流動(dòng)相采用甲醇和酸性水溶液的混合物為流動(dòng)相，等度洗脫；3)紫外檢測(cè)器檢測(cè)，測(cè)峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程換算濃度。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本方法具有以下特點(diǎn)1、預(yù)處理方法簡(jiǎn)單的一步有機(jī)溶媒蛋白沉淀法，操作簡(jiǎn)便、價(jià)廉，適用于臨床常規(guī)檢測(cè)。
2、分離條件分離采用填料為ZORBAX Eclipse XDB C18的色譜柱為固定相，甲醇和水(pH＝2.1～2.5)的混合物為流動(dòng)相，等度洗脫，10分鐘內(nèi)完成(PB)、(LTG)、(OXC)(MHD)四種抗癲癇藥物的分離，內(nèi)源性物質(zhì)和常用合并用藥不干擾上述四種藥物的測(cè)定。
3、檢測(cè)時(shí)針對(duì)不同的待測(cè)藥物采用不同的波長，避免內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，獲得最佳的響應(yīng)信號(hào)。
4、內(nèi)標(biāo)采用價(jià)廉易得的藥物氯唑沙宗，安全性好且有合適的保留時(shí)間。
本發(fā)明方法快速準(zhǔn)確、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、成本低、適合于臨床常規(guī)監(jiān)測(cè)。PB、LTG、OXC和MHD線性范圍分別為5～100，1～50，0.5～50，2～100mg/L，線性相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999，方法平均回收率分別為101.3％，100.7％，96.7％和101.5％，日內(nèi)和日間精密度RSD分別小于5.01％，8.16％，10.54％和9.04％。


圖1是典型色譜圖其中，A空白血漿(A1240nm，A2215nm)；B空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)品(B1240nm，B2215nm)；C服用奧卡西平200mg tid的癲癇患者的色譜圖(C1240nm，C2215nm)；D服用苯巴比妥30mg qd和拉莫三嗪125mg tid的癲癇患者的色譜圖(D1240nm，D2215nm)；圖中1拉莫三嗪，2苯巴比妥，3單羥奧卡西平，4奧卡西平，5內(nèi)標(biāo)，氯唑沙宗。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1色譜條件
Waters 2690 HPLC系統(tǒng)，Waters 2487雙波長紫外檢測(cè)器、Millennium 32色譜工作站(Version 4.0)；色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse XDBXDB C18(150mm×4.6mm，5μm)；柱溫40℃；流動(dòng)相甲醇0.1％乙酸液(pH 2.3±0.2)(38∶62，V/V)；流速1.5mL/min；215nm測(cè)定PB和MHD的濃度，240nm測(cè)定LMG和OXC的濃度。
血漿樣品預(yù)處理精密吸取100μL血漿置1.5mL Eppendorf管中，加20μg·mL-1氯唑沙宗甲醇工作液300μL，渦旋振蕩10s，離心(12000×g，4℃)10min，取上清液20μL進(jìn)樣。內(nèi)標(biāo)法以峰面積定量。
選擇性取不同來源的10位健康志愿者的血樣和未服用PB、LTG、OXC和MHD的癲癇患者的20例血樣，按照上述樣品制備和測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，未發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)上述測(cè)定組分有干擾。由于癲癇患者中合并用藥現(xiàn)象較為常見，故對(duì)常見合并用抗癲癇藥卡馬西平、苯妥英、丙戊酸、安定、硝基安定、氯硝基安定、撲米酮以及其他常用藥物對(duì)乙酰氨基酚、乙酰水楊酸、安替比林、胃復(fù)安等進(jìn)行考察。結(jié)果未發(fā)現(xiàn)上述常見合并用藥對(duì)測(cè)定組分有干擾。結(jié)果顯示，內(nèi)標(biāo)氯唑沙宗、PB、LTG、OXC和MHD的典型色譜保留時(shí)間分別為8.0，4.5，3.2，7.0和5.2min，各測(cè)試組分峰形良好、分離完全。整個(gè)色譜分析過程時(shí)間為9min。
線性試驗(yàn)分別配制含1000mg/L PB、LTG、OXC和MHD的甲醇標(biāo)準(zhǔn)工作液，并稀釋成合適的濃度梯度，空白血漿稀釋定容至4mL，配成含PB 5，15，25，50，75，100mg/L，LTG 1，5，12.5，25，37.5，50mg/L，OXC 0.5，2.5，12.5，25，37.5，50mg/L，MHD 2，10，25，50，75，100mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線血樣。各取血漿100μL，按“血漿樣品預(yù)處理”方法操作。以待測(cè)組分與內(nèi)標(biāo)峰面積比(A)和待測(cè)組分的濃度(C)作加權(quán)(l/C)線性回歸，得PB、LTG、OXC和MHD標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為A＝0.01566 C+1.377×10-2，A＝0.05980 C+6.243×10-3，A＝0.05845 C+7.290×10-5，A＝0.02196 C-3.770×10-3，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999。PB、LTG、OXC和MHD的線性范圍分別為5～100mg/L，1～50mg/L，0.5～50mg/L和2～100mg/L。PB、LTG、OXC和MHD的最低檢測(cè)限(信噪比＞3)分別為2.5，0.5，0.25和1mg/L。
準(zhǔn)確度和精密度分別精密吸取PB、LTG、OXC和MHD的甲醇標(biāo)準(zhǔn)工作液，用適量空白血漿稀釋配制成含PB 10，40，80mg/L，LTG 2，20，40mg/L，OXC 1，20，40mg/L，MHD 4，40，80mg/L的系列質(zhì)控血樣。各取血漿100μL，按”血漿樣品預(yù)處理”方法操作。根據(jù)線性回歸方程計(jì)算其實(shí)測(cè)濃度，計(jì)算每種濃度的實(shí)測(cè)平均值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示，(C實(shí)測(cè)/C理論)×100％即為回收率。
經(jīng)實(shí)際患者血藥濃度測(cè)定，結(jié)果證實(shí)，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾拉莫三嗪，苯巴比妥，單羥奧卡西平，奧卡西平和氯唑沙宗的測(cè)定。且上述待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰形對(duì)稱，分離良好。
表1是血漿中苯巴比妥、拉莫三嗪、奧卡西平和單羥奧卡西平濃度的日內(nèi)、日間精密度和方法回收率。
表1

權(quán)利要求
1.一種測(cè)定抗癲癇藥物血藥濃度的方法，其特征是待測(cè)樣品預(yù)處理后，經(jīng)酸性流動(dòng)相在色譜柱分離后，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，經(jīng)酸性流動(dòng)相在色譜柱分離后，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，包括下述步驟1)樣品預(yù)處理定量分取血漿或血清樣品，加入有機(jī)溶媒蛋白沉淀劑進(jìn)行蛋白沉淀，所述的蛋白沉淀劑選自甲醇或乙腈或甲醇和乙腈混合物；2)樣品分離與分析采用通用型的液相色譜柱，其填料為ZORBAX Eclipse XDBC18.高效液相系統(tǒng)采用通用型的紫外檢測(cè)器以及高壓泵，流動(dòng)相采用甲醇和酸性水溶液的混合物為流動(dòng)相，等度洗脫；3)紫外檢測(cè)器檢測(cè)，測(cè)峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程換算濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定抗癲癇藥物血藥濃度的方法，其中所述的抗癲癇藥物是苯巴比妥、拉莫三嗪、奧卡西平和/或單羥奧卡西平。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測(cè)定抗癲癇藥物血藥濃度的方法，其特征是所述的步驟2)的色譜條件，其中色譜柱采用Agilent XDB C18150mm×4.6mm，5μm；柱溫40℃；流動(dòng)相采用甲醇∶0.1％乙酸液＝38∶62v/v；流速1.5mL/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測(cè)定抗癲癇藥物血藥濃度的方法，其特征是所述的步驟3)的紫外檢測(cè)器檢測(cè)，其中采用紫外檢測(cè)器215nm測(cè)定苯巴比妥和單羥奧卡西平的峰面積，240nm測(cè)定拉莫三嗪和奧卡西平的的峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程換算成濃度。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及體內(nèi)藥物的分析測(cè)定方法，具體涉及一種測(cè)定抗癲癇藥物血藥濃度的方法。本方法將待測(cè)樣品預(yù)處理后，經(jīng)酸性流動(dòng)相在色譜柱分離后，用紫外檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)抗癲癇藥物苯巴比妥，拉莫三嗪，奧卡西平和單羥奧卡西平的定量濃度，本方法樣品取樣少，前處理簡(jiǎn)單、快速、靈敏，不受內(nèi)源性物質(zhì)和常用合并用藥的干擾，無需昂貴的設(shè)備和試劑，分析周期短，成本低，適合于臨床常規(guī)治療藥物血藥濃度的監(jiān)測(cè)。
文檔編號(hào)G01N30/60GK101093214SQ20061009492
公開日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2006年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日
發(fā)明者焦正, 施孝金 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院