專利名稱：：一種檢測乙肝病毒前s1抗體的酶聯(lián)免疫測定試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥
技術領域：
，具體涉及一種檢測血清中乙肝病毒前S1抗體的酶聯(lián)免疫測定試劑盒及其制備方法和應用。
背景技術：
：乙型肝炎病毒(HBV)基因組包含4個開放的讀碼框架(0RFs)，即Pre-S/SORF、Pre-C/CORF、PolORF和X0RF，分別編碼包膜蛋白(HBsAg)、HBeAg及核心抗原(HBcAg)、HBV多聚酶(Pol)和X多肽(HBx)。Pre-S/SORF編碼的HBsAg包括小(SHBs)，中(MHBs)，和大(LHBs)蛋白，它們分別由同一閱讀框內(nèi)的3個不同部位的ATG起始編碼，具有相同的C末端。LHBs在MHBs起始密碼子上游開始翻譯，它比MHBs分子的N端多一段長度為119或108個氨基酸序列(根據(jù)不同的亞型和基因型)的前Sl區(qū)域。乙肝前Sl區(qū)域為乙型肝炎病毒外膜蛋白的重要組成部分，主要存在于Dane顆粒和管型顆粒上，參與HBV的組裝、分泌和侵入肝細胞的機制。在前S1編碼區(qū)內(nèi)，有著重要的B和T細胞的抗原位點，其中主要的B細胞表位位于2735、7278、95107位氨基酸殘基，主要的T細胞表位位于2148、81108位氨基酸殘基，這些表位在乙肝病毒感染后的恢復和感染的保護方面起著重要的作用，有研究表明，前S1抗體的產(chǎn)生對于乙肝急性感染的恢復和慢性乙肝患者病情的緩解具有重要意義。黑猩猩的感染實驗證明，血清中前S1抗體最早可在感染后的第8周出現(xiàn)，直至第36周的整個觀察期內(nèi)始終呈陽性，而抗HBs在第33周時才出現(xiàn)，因為乙型肝炎的潛伏期一般為6周6個月，因此大多數(shù)急性乙肝在發(fā)病時，前S1抗體就可呈現(xiàn)陽性結果，它是乙肝早期診斷的可靠標志?？筆reSl抗體檢測的方法已有相關文獻報道，基本上是以人工合成PreSl肽段或重組抗原作為包被抗原的間接ELISA，但往往在靈敏度、穩(wěn)定性等方面尚有不足之處。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術問題在于克服上述不足，提供一種能達到實際臨床檢驗要求、操作簡便、適合各醫(yī)療單位使用的可檢測血清中乙肝病毒前S1抗體的酶聯(lián)免疫測定試劑盒及其制備方法和應用。本發(fā)明提供了一種乙肝病毒前S1抗體的酶聯(lián)免疫測定試劑盒，其組分包括重組乙肝病毒前Sl抗原預包被的微孔板、辣根過氧化物酶標記的重組乙肝病毒前Sl抗原，陽性對照液、陰性對照液、20倍濃縮洗滌液、底物液A、底物液B及終止液。本發(fā)明的技術方案是血清樣本加入到微孔板中，樣本中的乙肝病毒前S1抗體被預包被在微孔板上的重組乙肝病毒前Sl抗原吸附，形成固相前Sl抗體前Sl抗原復合物，該復合物中的前S1抗體可與加入的辣根過氧化物酶標記的重組乙肝病毒前Sl抗原結合，形成雙抗原夾心，辣根過氧化物酶與后續(xù)步驟中加入的底物反應，最終達到檢測乙肝前S1抗體的目的。本發(fā)明的另一目的是提供了一種乙肝病毒前Sl抗體的酶聯(lián)免疫測定試劑盒的制備方法，該方法包括下列步驟(l)重組乙肝病毒前Sl抗原預包被微孔板的制備①包被Na2C031.6gNaHC032.9g去離子水1000ml調(diào)整PH至9.6，加入適量重組乙肝病毒前S1抗原，混勻后按每孔lOOul的量加入到微孔板各孔中，于4'C環(huán)境下放置過夜，然后甩去孔內(nèi)液體，拍干；②洗滌NaHP04.12H203.72gKH2P04NaClTween-20去離子水0.43g6.8g0.5ml1000ml調(diào)整PH至7.2，按每孔150ul的量加入到微孔板各孔中，靜置10秒后甩凈、拍干，除去未與微孔板結合的殘余重組乙肝病毒前Sl抗原；③封閉牛血清白蛋白NaHP04.12H20KH2P04NaCl去離子水10g3.72g0.43g6.8g1000ml按每孔200ul的量加入到微孔板中，于4'C環(huán)境下放置過夜；干燥封閉好的微孔板甩去孔內(nèi)液體、拍干，于室溫環(huán)境下放置過夜，然后放入有干燥劑的塑料袋封口，保存于4'C環(huán)境中；(2)酶標抗原工作液的制備牛血清白蛋白NaHP04.12H20KH2P04NaCl去離子水10g3.72g0.43g6.8g1000ml調(diào)整PH至7.2，加入適量辣根過氧化物酶標記的重組乙肝病毒前S1抗原，保存于4'C環(huán)境中；(3)陽性對照液的制備取A值(450/630)>2.0的滴定效價2倍濃度的羊抗重組前Sl抗原抗血清為陽性對照液，加萬分之五的硫柳汞，保存于4";(4)陰性對照液的制備乙肝兩對半檢測結果全陰且用本發(fā)明的乙肝病毒前Sl抗體酶聯(lián)免疫測定試劑盒測定為前S1抗體陰性(A值O.l)的人血清，加萬分之五的硫柳汞，保存于4'C;(5)底物液ANa2HP04.12H2018g檸檬酸丑205g3%H2020.4ml去離子水1000ml調(diào)整PH至5.2;(6)底物液B將150mgEDTA加入到1000ml溫度為9(TC的雙蒸水中，待溶解完全并冷卻后加入lg檸檬酸，再加入5mlDMSO(二甲亞砜)內(nèi)溶解有250mgTMB(3，3,5，5-四甲基聯(lián)苯胺)；(7)終止液濃H2S04100ml雙蒸水800ml;(8)20x濃縮洗滌液Tris(三羥甲基氨基甲烷)24gNacl150gTween-20(吐溫20)20ml去離子水1000ml調(diào)整ra至7.2。本發(fā)明的又一目的是提供一種檢測血清中乙肝病毒前S1抗體的方法。本發(fā)明的試劑盒在使用時可以按下列步驟操作1、取出重組乙肝病毒前S1抗原預包被的微孔板，加入50ul待檢血清樣本，再加入50ul辣根過氧化物酶標記的重組乙肝前Sl抗原，各板設陽性對照1孔(50ul)、陰性對照1孔(50ul)及空白對照1孔[加PBS(磷酸緩沖液)50ul]，置于37'C環(huán)境中反應60分鐘；2、取出反應板甩去孔內(nèi)液體，將各孔注入洗滌液(20倍濃縮洗滌液lml+19ml去離子水即為工作洗滌液)，停留30秒鐘后甩去洗滌液、拍干，重復洗滌5次；3、各孔滴加底物液A、B各50ul，置于37。C環(huán)境中避光顯色10-15分鐘后再每孔滴加終止液50ul，置酶標儀中450nm波長參照630nm波長讀數(shù)。本發(fā)明具有如下特點1、采用雙抗原夾心一步法進行檢測，簡化了操作過程，避免了間接法中諸多干擾因素，使整個檢測的特異性和靈敏度得到提高。2、操作簡便，實用性強，可與乙肝'兩對半'試劑及乙肝前S1抗原同步檢測，適合各基層醫(yī)療單位使用。具體實施例方式實例1、重組乙肝病毒前Sl抗原預包被微孔板的制備1、包被Na2C031.6gNaHC032.9g去離子水1000ml調(diào)整PH至9.6，加入適量重組乙肝病毒前Sl抗原，混勻后按每孔lOOul的量加入到微孔板各孔中，于4'C環(huán)境下放置過夜，然后甩去孔內(nèi)液體，拍干。2、洗滌NaHP04.12H20KH2P04NaClTween-20去離子水3.72g0.43g6.8g0.5ml1000ml調(diào)整PH至7.2，按每孔150ul的量加入到微孔板各孔中，靜置10秒后甩凈、南干，除去未與微孔板結合的殘余重組乙肝病毒前S1抗原。3、封閉牛血清白蛋白NaHP04.12H20KH2P04NaCl去離子水10g3.72g0.43g6.8g畫ml按每孔200ul的量加入到微孔板中，于4'C環(huán)境下放置過夜。4、干燥封閉好的微孔板甩去孔內(nèi)液體、拍干，于室溫環(huán)境下放置過夜，然后放入有干燥劑的塑料袋封口，保存于4"C環(huán)境中。實例2、酶標抗原工作液的制備牛血清白蛋白10gNaHP04.12H203.72gKH2P040.43gNaCl6.8g去離子水1000ml調(diào)整PH至7.2，加入適量辣根過氧化物酶標記的重組乙肝病毒前S1抗原，保存于4'C環(huán)境中。實例3、陽性對照液的制備取羊抗重組前SI抗原抗血清作ELISA前SI抗體效價測定，取A450/630〉2.0的滴定效價的2倍濃度為陽性對照液，加萬分之五的硫柳汞，保存于4。C。實例4、陰性對照液的制備乙肝兩對半檢測結果全陰且用本發(fā)明的乙肝病毒前SI抗體酶聯(lián)免疫測定試劑盒測定為前S1抗體陰性(A值O.l)的人血清，加萬分之五的硫柳汞，保存于4'C。實例5、底物液ANa2HP04.12H2018g檸檬酸.H;jO5g30/oH2020.4ml去離子水1000ml.調(diào)整PH至5.2。實例6、底物液B將150mgEDTA加入到1000ml溫度為90'C的雙蒸水中，待溶解完全并冷卻后加入lg檸檬酸，再加入5mlDMSO(內(nèi)溶解有250mgTMB)。實例7、終止液濃H2S04100ml雙蒸水800ml實例8、20x濃縮洗滌液Tris24gNacl150gTween-2020ml去離子水1000ml調(diào)整PH至7.2。實例9、本發(fā)明的試劑盒臨床應用結果如下①收集臨床血清標本480份，用本發(fā)明的"乙型肝炎病毒前SI抗體酶聯(lián)免疫測定試劑盒"進行前S1抗體檢測，具體結果如下所示表一、不同感染時相血清前S1抗體陽性率<formula>complextableseeoriginaldocumentpage12</formula>②對17例急性乙肝患者進行臨床跟蹤觀察，共收集血清標本75份，用本發(fā)明的"乙型肝炎病毒前Sl抗體酶聯(lián)免疫測定試劑盒"進行前Sl抗體檢測，具體結果如下所示-表二急性乙型肝炎前S1抗體動態(tài)變化病程例數(shù)檢測血清份數(shù)前Sl抗體(+)數(shù)陽性率(％)卜217171482.4%3~817372670.1%9~2015211466.7%以上結果表明，本發(fā)明用于檢測血清中乙肝病毒前Sl抗體具有良好的靈敏度和特異性，可反應病人體內(nèi)乙肝病毒的清除和病情的痊愈，對臨床上更好的診斷乙肝患者的病程具有輔助作用，且操作簡便，適合各基層醫(yī)療單位使用。權利要求1、一種檢測乙肝病毒前S1抗體的酶聯(lián)免疫測定試劑盒，其特征在于該試劑盒包括重組乙肝病毒前S1抗原預包被的微孔板、辣根過氧化物酶標記的重組乙肝病毒前S1抗原，陽性對照液、陰性對照液、20倍濃縮洗滌液、底物液A、底物液B及終止液組成。2、根據(jù)權利要求1所述的一種檢測乙肝病毒前Sl抗體的酶聯(lián)免疫測定試劑盒的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(l)重組乙肝病毒前Sl抗原預包被微孔板的制備①包被Na2C031.6gNaHC032.9g去離子水1000ml調(diào)整PH至9.6，加入適量重組乙肝病毒前S1抗原，混勻后按每孔lOOul的量加入到微孔板各孔中，于4'C環(huán)境下放置過夜，然后甩去孔內(nèi)液體，拍干；②洗錄NaHP04.12H203.72gKH2P040.43gNaCl6.8gTween-200.5ml去離子水1000ml調(diào)整PH至7.2，按每孔150ul的量加入到微孔板各孔中，靜置10秒后甩凈、拍干，除去未與微孔板結合的殘余重組乙肝病毒前Sl抗原；③封閉牛血清白蛋白10gNaHP04.12H203.72gKH2P040.43gNaCl6.8g去離子水1000ml按每孔200ul的量加入到微孔板中，于4i:環(huán)境下放置過夜；干燥封閉好的微孔板甩去孔內(nèi)液體、拍干，于室溫環(huán)境下放置過夜，然后放入有干燥劑的塑料袋封口，保存于4'C環(huán)境中；(2)酶標抗原工作液的制備牛血清白蛋白10gNaHP04.12H203.72gKH2P040.43gNaCl6.8g去離子水1000ml調(diào)整PH至7.2，加入適量辣根過氧化物酶標記的重組乙肝病毒前S1抗原，保存于4'C環(huán)境中；(3)陽性對照液的制備取A值〉2.0的滴定效價2倍濃度的羊抗重組前SI抗原抗血清為陽性對照液，加萬分之五的硫柳汞，保存于4'C;(4)陰性對照液的制備乙肝兩對半檢測結果全陰且用本發(fā)明的乙肝病毒前Sl抗體酶聯(lián)免疫測定試劑盒測定為前Sl抗體陰性A值O.l的人血清，加萬分之五的硫柳汞，保存于4t:;(5)底物液ANa2HP04.12H2018g檸檬酸.H205g3%H2020.4ml去離子水1000ml調(diào)整PH至5.2;(6)底物液B將150mgEDTA加入到1000ml礙度為90。C的雙蒸水中，待溶解完全并冷卻后加入lg檸檬酸，再加入5ml二甲亞砜內(nèi)溶解有250mg3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺；(7)終止液濃H2S04100ml雙蒸水800ml;(8)20x濃縮洗滌液三羥甲基氨基甲烷24gNacl150g吐溫-2020ml去離子水1000ml調(diào)整PH至7.2。3、一種檢測血清中乙肝病毒前S1抗體的方法，其特征在于該方法包括下列步驟①取出重組乙肝病毒前S1抗原預包被的微孔板，加入50ul待檢血清樣本，再加入50ul辣根過氧化物酶標記的重組乙肝前Sl抗原，各板設陽性對照1孔50ul、陰性對照1孔50ul及空白對照1孔加磷酸緩沖液50ul，置于37'C環(huán)境中反應60分鐘；②取出反應板甩去孔內(nèi)液體，將各孔注入洗滌液，即20倍濃縮洗滌液lml+19ml去離子水即為工作洗滌液，停留30秒鐘后甩去洗滌液、拍干，重復洗滌5次；③各孔滴加底物液A、B各50ul，置于37'C環(huán)境中避光顯色10-15分鐘后再每孔滴加終止液50ul,置酶標儀中450nm波長參照630nm波長讀數(shù)。全文摘要本發(fā)明提供了一種乙肝病毒前S1抗體的酶聯(lián)免疫測定試劑盒，其組分包括重組乙肝病毒前S1抗原預包被的微孔板、辣根過氧化物酶標記的重組乙肝病毒前S1抗原，陽性對照液、陰性對照液、20倍濃縮洗滌液、底物液A、底物液B及終止液。本發(fā)明還提供了它的制備方法和應用。文檔編號G01N33/576GK101196519SQ200610119300公開日2008年6月11日申請日期2006年12月7日優(yōu)先權日2006年12月7日發(fā)明者龔育平申請人:上海復星醫(yī)藥(集團)股份有限公司;上海復星長征醫(yī)學科學有限公司