專利名稱：Cyp3a檢測(cè)芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物基因檢測(cè)芯片，尤其涉及一種CYP3A(cytochrome P450 3A，細(xì)胞色素P450 3A)檢測(cè)芯片及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
CYP3A是人體肝臟和小腸中含量最豐富的CYP亞家族，包括CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43。CYP3A43是最后一位被鑒定的CYP3A家族成員，被認(rèn)為對(duì)肝臟CYP3A表達(dá)貢獻(xiàn)不大，人體肝臟和小腸中絕大部分的CYP3A是CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7。CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7參與了大約50％常用藥物在體內(nèi)的代謝[Wojnowski L，Kamdem LK.Clinical implications of CYP3A polymorphisms.Expert Opin Drug Metab Toxicol.2006，2171-182]，如免疫抑制劑、腫瘤化療藥、降脂藥、鈣離子通道阻斷劑、鎮(zhèn)定劑等藥物。此外，還參與部分前致癌物的活化。因此CYP3A活性的個(gè)體差異對(duì)于大多數(shù)藥物的代謝和藥物動(dòng)力學(xué)具有重大影響。雖然環(huán)境和藥物也可引起CYP3A活性的個(gè)體差異，然而在更大程度上是受遺傳因素的影響[Rodriguez-Antona C，Ingelman-Sundberg M.Cytochrome P450 pharmacogenetics and cancer.Oncogene.2006，251679-1691]。
許多遺傳變異能改變CYP基因的表達(dá)水平或其編碼的酶活性，導(dǎo)致這些酶底物的藥物動(dòng)力學(xué)的顯著性改變，從而產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用或?qū)е轮委煙o(wú)效。根據(jù)P450的酶活性，可以將個(gè)體的表型分為慢代謝型(poor metabolizer，PM)、中間代謝型(intermediate metabolizer，IM)、快代謝型(extensive metabolizer，EM)或超快代謝型(ultrarapid metabolizer，UM)。EM被定義為野生型的純合子個(gè)體，攜帶一個(gè)活性等位基因和一個(gè)無(wú)效等位基因的雜合子個(gè)體為IM，攜帶二個(gè)缺陷性等位基因的個(gè)體為PM，UM通常攜帶有多個(gè)拷貝的活性等位基因。PM使藥物滅活較緩慢，導(dǎo)致血漿藥物濃度過(guò)高，因此較容易產(chǎn)生毒副作用，而UM使藥物快速滅活，引起血漿藥物濃度過(guò)低而沒(méi)有療效。由于無(wú)法對(duì)大多數(shù)人進(jìn)行基因分型，對(duì)于特定藥物的治療反應(yīng)往往難以預(yù)測(cè)。例如，相比于EM個(gè)體，常規(guī)劑量服用文拉法新引發(fā)的心血管毒性和三環(huán)類抗抑郁劑產(chǎn)生的毒副作用[Bertilsson L，Dahl ML，Dalen P，Al-Shurbaji A.Molecular genetics of CYP2D6clinical relevance with focus on psychotropicdrugs.Br J Clin Pharmacol，2002，53111-122]在PM個(gè)體中更為常見。在使用質(zhì)子泵抑制劑和阿莫西林治療幽門螺桿菌感染時(shí)，其治愈率取決于患者CYP2C19的代謝表型。EM患者使用奧美拉唑的治愈率是28.6％，IM患者為60％，PM患者為100％，而這種療效差異在使用三聯(lián)藥物(質(zhì)子泵抑制劑，阿莫西林和克拉霉素或甲硝唑)治療時(shí)較小[Wilkinson GR.Drug metabolism and variability among patients in drugresponse.N Engl J Med，2005，3522211-2221]。標(biāo)準(zhǔn)治療方案無(wú)效的患者可能是UM，通常需加大劑量才能治愈。顯然，根據(jù)基因型-表型的分類調(diào)整藥物劑量有助于提高藥物的療效和減少ADR(藥物不良反應(yīng))，特別是那些治療指數(shù)低、安全范圍窄的藥物。
CYP3A4是成人肝微粒體CYP中最重要的成分，約占CYP總量的30-40％，居第一位，并且CYP3A4對(duì)許多藥物的特異性要高于CYP3A5和CYP3A7。至今大約有40個(gè)等位基因被鑒定。CYP3A4*1B在高加索人中的頻率為3.6-9.6％，黑人中的頻率為53-67％，不存在東方人中。CYP3A4*1B與一些腫瘤的易感性和進(jìn)展等相關(guān)，但功能研究未發(fā)現(xiàn)有CYP3A4*1B與其底物藥物動(dòng)力學(xué)之間的相關(guān)性，因此推測(cè)認(rèn)為CYP3A4*1B與腫瘤的易感性和進(jìn)展等相關(guān)的多態(tài)緊密連鎖。CYP3A4基因缺陷性等位基因有CYP3A4*8、CYP3A4*11、CYP3A4*13、CYP3A4*16和CYP3A4*17，無(wú)效等位基因有CYP3A4*20，而CYP3A4*18A編碼的酶活性較CYP3A4.1高，但這些等位基因的頻率均較低。由于大多數(shù)CYP3A4等位基因沒(méi)有功能效應(yīng)，或是非常罕見不足以造成CYP3A4基因表達(dá)的顯著性個(gè)體差異，CYP3A4基因的多態(tài)性無(wú)法解釋其表達(dá)的高度可變性。孕烷X受體(pregnane Xreceptor，PXR)基因調(diào)節(jié)CYP3A4基因的轉(zhuǎn)錄，其多態(tài)性可引起CYP3A4表達(dá)水平的改變，可能是CYP3A4表達(dá)個(gè)體差異的原因之一[Bosch TM，Meijerman I，Beijnen JH，Schellens JH.Genetic polymorphisms of drug-metabolising enzymes and drugtransporters in the chemotherapeutic treatment of cancer.Clin Pharmacokinet.2006，45253-285]。另一個(gè)原因可能是CYP3A4和CYP3A5基因的遺傳變異之間存在很強(qiáng)的連鎖不平衡。
CYP3A5基因的表達(dá)是高度多態(tài)性的，約10-20％高加索人、33％日本人及55％美國(guó)非洲裔具有較容易檢測(cè)的表達(dá)水平，這些人肝臟中的CYP3A5約占CYP3A總量的6-99％[Lamba JK，Lin YS，Schuetz EG，Thummel KE.Genetic contribution to variablehuman CYP3A-mediated metabolism.Adv Drug Deliv Rev，2002，541271-1294]。CYP3A5多態(tài)性表達(dá)主要是由于第3個(gè)內(nèi)含子中的一個(gè)SNP 6986A＞G(CYP3A5*3)所致，該SNP雖然能引起異常剪切，但仍有少量的功能性蛋白被翻譯，因此CYP3A5*3是低表達(dá)等位基因。CYP3A5*3在高加索人、亞洲人和非洲人中的發(fā)生率分別是88％，75％和35％。其它的缺陷性等位基因尚有CYP3A5*6、CYP3A5*8、CYP3A5*9、CYP3A5*10和CYP3A5*11等，其中CYP3A5*10和CYP3A5*11均與SNP 6986A＞G連鎖，處于同一個(gè)單倍型(haplotype)中。由于CYP3A5*6和CYP3A5*7在非洲人和美國(guó)非洲裔中的頻率較高(10-20％)，有必要通過(guò)單倍型分析確定這2個(gè)SNP是否與CYP3A5*3存在于同一個(gè)單倍型中。
由于缺乏特異性抗體，CYP3A7一直被誤認(rèn)為僅存在胎兒肝臟中。與CYP3A5相似，CYP3A7的表達(dá)亦呈現(xiàn)為多態(tài)性，約10-20％高加索人為CYP3A7高表達(dá)者。在CYP3A7高表達(dá)者中，CYP3A7的量約占CYP3A總量的9-36％，可能與CYP3A5高表達(dá)者的CYP3A5酶量相當(dāng)，甚或超過(guò)。主要的CYP3A7等位基因有CYP3A7*1C、CYP3A7*1B、CYP3A7*2和CYP3A7*3。CYP3A7*1C和CYP3A7*1B能提高CYP3A7基因的轉(zhuǎn)錄活性，兩者大約與67％高加索人CYP3A7高表達(dá)者相關(guān)。CYP3A7*2不影響基因表達(dá)，但其編碼的酶的催化活性明顯高于CYP3A7.1，CYP3A7*2在白人、沙特阿拉伯人、中國(guó)人和坦桑尼亞人中的頻率分別為8％、17％、28％和62％[Rodriguez-Antona C，Jande M，Rane A，Ingelman-Sundberg M.Identification and phenotype characterization of two CYP3A haplotypes causingdifferent enzymatic capacity in fetal livers.Clin Pharmacol Ther，2005，77259-270]。CYP3A7*3等其他等位基因?qū)虮磉_(dá)和酶活力的影響尚不清楚。
CYP基因的多態(tài)性是造成個(gè)體對(duì)藥物治療反應(yīng)的差異的主要原因之一，因此若能將藥物遺傳學(xué)的研究結(jié)果應(yīng)用于疾病治療，通過(guò)檢測(cè)患者的CYP基因的遺傳變異，使臨床醫(yī)生獲得病人的遺傳信息，以判斷哪些藥物治療有效，有針對(duì)性地使用藥物和劑量，有效地提高藥物的療效和降低藥物的毒副作用，從而有望大幅降低醫(yī)療費(fèi)用。而對(duì)于醫(yī)藥企業(yè)，根據(jù)藥物遺傳學(xué)和藥物基因組學(xué)的信息，以及藥物靶點(diǎn)和藥物代謝的途徑，選擇合適的臨床試驗(yàn)的人群，以提高藥物對(duì)疾病治療的療效，縮短藥物的研究與開發(fā)的周期，提高藥物的臨床批準(zhǔn)率；根據(jù)本國(guó)人的遺傳結(jié)構(gòu)，進(jìn)行藥物衍生物或同類藥物開發(fā)。
檢測(cè)單個(gè)CYP基因的遺傳變異，由于所能分型的基因型有限，臨床檢測(cè)診斷的實(shí)用性較低。只有集合CYP超基因家族中多個(gè)重要基因的遺傳變異，盡可能分型所有功能相關(guān)基因型，方能對(duì)個(gè)體的代謝表型做出準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，達(dá)到臨床檢測(cè)診斷的目的。并且由于CYP基因的高度多態(tài)性，所涉及的遺傳變異在幾十至幾百不等，顯然傳統(tǒng)的檢測(cè)方法由于通量水平低，難以應(yīng)用于個(gè)性化醫(yī)療中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種CYP3A檢測(cè)芯片，能有效檢測(cè)分型CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7的遺傳變異，由此獲取的個(gè)體代謝表型，能輔助醫(yī)生及時(shí)找到正確的用藥方案。為此，本發(fā)明還要提供應(yīng)用該芯片檢測(cè)CYP3A基因的方法。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種CYP3A檢測(cè)芯片，包括固相載體和探針，所述探針與待測(cè)CYP3A基因的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交。
本發(fā)明中所述固相載體可選用領(lǐng)域周知的載體，只要所述載體與所述反應(yīng)物相容，不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果就可以。優(yōu)選的，本發(fā)明所述固相載體選材為玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜和高分子材料中的一種或它們的任意組合。
所述待測(cè)CYP3A基因包括CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7基因。
所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其衍生物。所述探針的長(zhǎng)度是沒(méi)有限制的，只要能完成特異性雜交的功能，與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長(zhǎng)度都可以。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述探針的長(zhǎng)度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長(zhǎng)一般不超過(guò)30個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度以15-25個(gè)堿基對(duì)之間的為最佳。所述探針的自身互補(bǔ)序列最好少于6個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效率。如果所述探針中可能還有一定程度的錯(cuò)配堿基，則所述探針可以加大長(zhǎng)度來(lái)抵消錯(cuò)配堿基的不利影響，以提高雜交效率。
本發(fā)明檢測(cè)芯片的探針為DNA，包括(1)與待測(cè)CYP3A4基因雜交的(a)SEQ IDNO1～SEQ ID NO30所示序列，(b)SEQ ID NO1～SEQ ID NO30所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO1～SEQ ID NO30所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(2)與待測(cè)CYP3A5基因雜交的(a)SEQ ID NO31～SEQ ID NO63所示序列，(b)SEQID NO31～SEQ ID NO63所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO31～SEQID NO63所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；
(3)與待測(cè)CYP3A7基因雜交的(a)SEQ ID NO64～SEQ ID NO109所示序列，(b)SEQ ID NO64～SEQ ID NO109所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO64～SEQ ID NO109所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列。
優(yōu)選的，本發(fā)明檢測(cè)芯片的探針選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO109所示序列。
所述探針序列可包含1～10個(gè)錯(cuò)配堿基，較佳地，可包含1～5個(gè)錯(cuò)配堿基，更佳地，可包含1～2個(gè)錯(cuò)配堿基。
本發(fā)明檢測(cè)芯片還包括至少一種對(duì)照探針，所述對(duì)照探針選自陰性對(duì)照探針、陽(yáng)性對(duì)照探針、雜交對(duì)照探針和固定化對(duì)照探針。
所述探針可用多種方法固定于載體上，如點(diǎn)樣法(USA Patent No.5288514，USAPatent No.5556752)、光介導(dǎo)法(USA Patent No.5143854，5384261和5561071)、磁珠法(USA Patent No.5541061)等。所述探針可以通過(guò)化學(xué)或物理的方法，固定于載體上，如通過(guò)離子鍵、共價(jià)化合或其它已知的力吸附在載體上，如可用紫外交聯(lián)儀將所述探針固定于載體上。
所述探針可通過(guò)連接臂固定于固相載體上。連接臂可以為探針形成雙鏈的部分提供一個(gè)自由的空間以減少空間位阻，有助于雜交反應(yīng)的進(jìn)行[Afanassiev V，HanemannV，Wolfl S.Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slidescoated with an agarose film.Nucleic Acids Res.2000，28e66；USA Patent No.5556752]。連接臂越長(zhǎng)，雜交效率越高。典型的連接臂包括15～30個(gè)功能基團(tuán)長(zhǎng)度。連接臂可以選用適當(dāng)形式的功能基團(tuán)，如Poly T(A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇與Poly T(A、C或G)的嵌合體、聚乙醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其組合物。
所述探針或連接臂通過(guò)連接分子固定于固相載體上。探針固定到載體上可以通過(guò)C-C鍵實(shí)現(xiàn)，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧烷鍵(玻璃或二氧化硅作支持物時(shí)使用)。硅氧烷鍵鍵合可以通過(guò)支持物和連接分子的三氯甲硅烷基或三烷氧基甲硅烷基等基團(tuán)反應(yīng)完成。氨基烷基硅烷、輕基烷基硅烷、2一輕乙基一氨丙基三乙氧基硅烷、輕乙基一氨丙基三乙氧基硅烷或輕丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基團(tuán)。
所述探針可以被修飾，修飾方法可以是5’-NH2修飾、5’-SH修飾、5’-Poly T(A、C或G)修飾、5’-生物素修飾、3’-NH2修飾、3’-SH修飾、3’-Poly T(A、C或G)修飾和3’-生物素修飾等。
所述探針可以有一條或幾條，甚至全部都是經(jīng)過(guò)標(biāo)記的，所述標(biāo)記包括熒光素標(biāo)記、生物素標(biāo)記、放射性元素標(biāo)記、酶標(biāo)記和熒光共振能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種應(yīng)用上述芯片檢測(cè)CYP3A基因的方法，包括如下步驟(1)在固相載體表面點(diǎn)載與待測(cè)CYP3A基因的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交的探針；(2)抽提待測(cè)CYP3A基因的核酸；(3)制備待測(cè)CYP3A基因的目的核苷酸序列；(4)標(biāo)記步驟(3)的目的核苷酸序列；(5)在適于與步驟(1)所述的點(diǎn)載在固相載體上的探針進(jìn)行雜交的條件下，加入經(jīng)標(biāo)記的目的核苷酸序列，并使其反應(yīng)足夠時(shí)間；(6)檢測(cè)雜交反應(yīng)的結(jié)果。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種應(yīng)用上述芯片檢測(cè)CYP3A基因的方法，包括如下步驟(1)標(biāo)記與待測(cè)CYP3A基因的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交的探針；(2)抽提待測(cè)CYP3A基因的核酸；(3)制備待測(cè)CYP3A基因的目的核苷酸序列；(4)在固相載體表面點(diǎn)載步驟(3)所述的目的核苷酸序列；(5)在適于與步驟(4)所述的點(diǎn)載在固相載體上的目的核苷酸序列進(jìn)行雜交的條件下，加入經(jīng)標(biāo)記的探針，并使其反應(yīng)足夠時(shí)間；(6)檢測(cè)雜交反應(yīng)的結(jié)果。
本發(fā)明的方法中所述合適樣品包括來(lái)自于人類和動(dòng)物的血液、唾液、毛發(fā)及其它任何含有核酸的組織、以及來(lái)自植物和環(huán)境產(chǎn)物(如泥土或水)的樣品。
樣本的核酸能用任何合適的方法從樣品中被抽提出來(lái)。例如，樣本核酸能用磁珠從樣品中抽提出來(lái)，很多生物公司能提供核酸抽提的試劑盒，如Qiagen，Invitron等。
由于技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)在已可以不經(jīng)核酸抽提，直接用靶樣本中的含核酸的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。靶樣本的含核酸的細(xì)胞能用任何合適的方法從樣品中被抽提出來(lái)。例如，靶樣本中含核酸的細(xì)胞能用磁珠從樣品中分離出來(lái)。
所述目的核苷酸序列的制備可包括擴(kuò)增的步驟，用分離的靶樣本中含核酸的細(xì)胞直接擴(kuò)增，也可用抽提的靶核酸直接擴(kuò)增。如用磁珠從全血中分離白細(xì)胞，直接用分離的白細(xì)胞或用全血抽提的核酸作模板，擴(kuò)增目的核酸序列。擴(kuò)增得到的單鏈或雙鏈的DNA或RNA可含有熒光或生物素標(biāo)記，標(biāo)記的DNA或RNA可不經(jīng)純化直接用于雜交。與本發(fā)明中所述芯片雜交的優(yōu)選靶核苷酸分子是單鏈核酸分子，雙鏈核酸分子經(jīng)過(guò)變性等處理后也于本發(fā)明所述芯片雜交。
目的核苷酸序列可使用任何適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增方法進(jìn)行富集，如聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，多重PCR，連接酶鏈反應(yīng)(ligase chainreaction，LCR)，滾環(huán)擴(kuò)增(rolling cycle amplifiication，RCA)，基于核酸序列的擴(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，鏈置換擴(kuò)增(stranddisplacement amplification，SDA)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(transcription medicatedamplification，TMA)等。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，目的核苷酸序列的制備采用PCR擴(kuò)增方法，該方法所用引物含有SEQ ID NO110～SEQ ID NO143所示序列的核苷酸鏈或其互補(bǔ)鏈。
只要用于雜交的目的核苷酸序列的長(zhǎng)度足夠以產(chǎn)生特異性雜交，所述目的核苷酸序列長(zhǎng)度在上下游方向上并無(wú)限制。合適的目的核苷酸序列長(zhǎng)度從30到200堿基對(duì)長(zhǎng)度。雜交用的靶核苷酸序列過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，會(huì)影響雜交效率，并使得雜交在探針上的靶核苷酸序列易于被洗脫下來(lái)，導(dǎo)致熒光信號(hào)過(guò)弱或丟失。較長(zhǎng)的DNA片段，可用DNase I進(jìn)行片段化處理，或者在反應(yīng)體系中加入適當(dāng)比例的脫氧尿嘧啶，然后PCR產(chǎn)物用尿嘧啶DNA糖苷酶處理，片段化DNA片段。至于RNA，處理方法較為簡(jiǎn)單，直接用高鹽和高溫處理即可。
所述探針和目的核苷酸序列之間的雜交可同源，也可非同源。
所述探針或目的核苷酸序列都適合用于標(biāo)記。探針在合成引入標(biāo)記，目的核苷酸序列可以在擴(kuò)增中引入標(biāo)記，或者擴(kuò)增后用合適的方法引入標(biāo)記。
合適的標(biāo)記包括熒光標(biāo)記、放射性同位素標(biāo)記、發(fā)色團(tuán)、發(fā)光體、FRET、酶、生物素或有特殊結(jié)合配體的配基。
本發(fā)明方法的雜交可以在任何雜交液中進(jìn)行，如含有SSPE和表面活性劑的雜交液。雜交液可以含有任何濃度的SSPE，例如1～10×SSPE。也可以使用任何適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣?，如Triton-100，SDS，SLS(十二烷基肌氨酸鈉)，CTAB(六烷基三甲基溴化銨)等。雜交液中也可有任何濃度的表面活性劑，如0.01～1％(w/w)。所述的雜交可在任何適當(dāng)?shù)臏囟认逻M(jìn)行，如25℃～65℃，所述雜交時(shí)間為2分鐘～18小時(shí)?？梢愿淖冸s交條件以提高或降低雜交的嚴(yán)謹(jǐn)程度、雜交特異性。
所述雜交結(jié)果在檢測(cè)前的洗滌可使用任何適當(dāng)?shù)南礈煲?，該洗滌液可含?～3％(w/w)的表面活性劑，洗滌可持續(xù)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，如1～30分鐘?？梢杂檬覝氐南礈煲哼M(jìn)行洗滌，或預(yù)熱后洗滌，如42℃?？捎貌煌南礈煲合群筮M(jìn)行洗滌。
所述探針和目的核苷酸序列之間的雜交可以采用任何已知的方法進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)標(biāo)記的不同，可以選用合適的檢測(cè)方法，例如熒光標(biāo)記的探針或目的核苷酸序列可以用激光掃描儀或熒光儀檢測(cè)，放射性元素標(biāo)記的探針或目的核苷酸序列可以用放射自顯影檢測(cè)。
總體雜交特異性可以用任何適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)來(lái)確定，例如可按中國(guó)專利CN1566366A描述的方法來(lái)確定。
芯片的陽(yáng)性信號(hào)可以用任何適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)來(lái)確定，例如可按中國(guó)專利CN1566366A描述的方法來(lái)確定，或以雜交信號(hào)大于平均陰性對(duì)照探針與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和的方法來(lái)確定。
本發(fā)明也可用于目的基因的拷貝數(shù)檢測(cè)。結(jié)合于芯片探針上的目的核苷酸序列的數(shù)量能夠被檢測(cè)，并且與目的基因的拷貝數(shù)相關(guān)。根據(jù)含有已知拷貝數(shù)的對(duì)照基因的核苷酸序列的數(shù)量可以對(duì)目的基因的拷貝數(shù)進(jìn)行定量。熒光能用光電倍增管CCD或激光掃描探測(cè)。
本發(fā)明的CYP3A檢測(cè)芯片及其應(yīng)用，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，對(duì)CYP3A基因篩檢具有高通量，平行性和微量化等優(yōu)點(diǎn)，使醫(yī)務(wù)人員及時(shí)掌握患者大量遺傳信息，指導(dǎo)患者合理用藥，實(shí)現(xiàn)個(gè)性化醫(yī)療。對(duì)于醫(yī)藥企業(yè)，本發(fā)明的CYP3A檢測(cè)芯片可使其選擇合適的臨床試驗(yàn)人群，從而提高藥物療效，降低藥物的無(wú)效率和毒副作用，縮短藥物的研發(fā)周期。


附圖是本發(fā)明實(shí)施例1的CYP3A檢測(cè)芯片的雜交結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
實(shí)施例1反向雜交
1.基因芯片的制備(1)探針溶解每條探針用TE溶液稀釋，終濃度為10mM。將濃度為10mM的探針與濃度為200mM的PBS溶液于384孔板中等體積混合，以粘膠片封好384孔板，室溫下振蕩2分鐘，離心，-20℃保存，以備點(diǎn)樣使用。
(2)點(diǎn)樣將預(yù)先設(shè)計(jì)并合成好的探針通過(guò)接觸式點(diǎn)樣或噴墨式點(diǎn)樣點(diǎn)載到玻片、硅片等材質(zhì)的固相載體片基上。片基采用Cell Associates CSS-100醛基片基，GeneMachine公司的Ominigrid 100型號(hào)的點(diǎn)樣儀，在濕度65-75％(以FullMoon片基為準(zhǔn))，溫度為25℃的條件下點(diǎn)樣，探針點(diǎn)樣的排布格式如表1所示，點(diǎn)樣完畢后，放置半小時(shí)后，將芯片取出，室溫干燥保存。
表1探針排布

2.待測(cè)樣品的處理和標(biāo)記(1)人基因組DNA抽提及目的基因的擴(kuò)增采用FlexiGene DNA Kit(250)(QIAGEN，Cat.No.51206)試劑盒抽提人外周血中基因組DNA，具體步驟如下1)將ACD(枸櫞酸8g/L，枸櫞酸鈉22g/L，葡萄糖24.5g/L)抗凝的外周全血混勻取1ml入15ml離心管，加入2.5ml緩沖液FG1，充分顛倒混勻；2)2000g離心5分鐘，棄去上清。靜置2分鐘；
3)加入500ul緩沖液FG2/QIAGEN蛋白酶混合試劑，立即混勻，直至原有的沉淀完全消失；4)65℃水浴10分鐘，40次/分勻速振蕩；5)加入500ul 100％異丙醇充分混勻，直至出現(xiàn)可見的DNA絮狀沉淀；6)3000g離心5分鐘，棄去上清，倒置2分鐘；7)加入500ul 70％乙醇，振蕩；8)3000g離心5分鐘，棄去上清，倒置約1小時(shí)，直至管內(nèi)不再有水珠；9)加入200ul緩沖液FG3溶解DNA，輕輕振蕩，溶解過(guò)夜；10)將抽提溶解好的DNA移入高壓滅菌過(guò)的1.5ml離心管中，取1ul進(jìn)行電泳(1％瓊脂糖凝膠，0.5×TBE，EB，80MV，1.5小時(shí)電泳)，在FR-200紫外與可見分析裝置上拍攝照片，并對(duì)照marker(Lambda DNA/EcoRI+HindIII)進(jìn)行定量。
用CYP3A4的引物(SEQ ID NO110～SEQ ID NO121)、CYP3A5的引物(SEQ IDNO122～SEQ ID NO137)和CYP3A7的引物(SEQ ID NO138～SEQ ID NO143)進(jìn)行目的核苷酸序列的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增用30μl反應(yīng)體系進(jìn)行，反應(yīng)體系是0.3mM dNTP、10mM Tris-HCl、50mM KCl、2mM MgCl2、20％Q solution(Qiagen)、上游和下游引物的濃度0.16μM、基因組DNA 10ng，Taq酶0.6U(Takara)。應(yīng)用Touch-down PCR反應(yīng)程序[Don RH，Cox PT，Wainwright BJ，Baker K，Mattick JS.’Touchdown’PCRto circumvent spurious priming during gene amplification.Nucleic Acids Res.1991，194008]94℃變性5min；94℃變性40s，64℃退火1min，每個(gè)循環(huán)降低0.5℃，72℃延伸50s，共10個(gè)循環(huán)；然后94℃變性40s，59℃退火40s，72℃延伸50s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。PCR結(jié)束后用1.5％瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。
當(dāng)進(jìn)行多重PCR反應(yīng)時(shí)，將SEQ ID NO110～SEQ ID NO143所示序列的引物放入一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，體系為50μl。多重PCR的反應(yīng)體系為每種dNTP 0.3μmol/L，Tricine-KOH(PH8.7)40mmol/L，KCl 16mmol/L，MgCl23.5mmol/L，BSA 3.75μg/ml，每條引物2μmol/L，DNA 80ng和2.2×Titanium Taq DNA聚合酶(ClontechLaboratories Inc.，USA)。多重PCR反應(yīng)條件95℃變性3min；95℃變性30s，66℃退火2.5min，68℃延伸4min，共40個(gè)循環(huán)；最后68℃延長(zhǎng)10min。PCR擴(kuò)增后，取3μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳。這些PCR產(chǎn)物經(jīng)處理后可用于下面的雜交步驟。
(2)PCR產(chǎn)物純化和片段化每個(gè)樣品的所有PCR產(chǎn)物混合，用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Cat.No.28106)純化，具體步驟如下1)加入5倍PCR產(chǎn)物體積的緩沖液PB，混勻，無(wú)需去除石蠟油或煤油；2)將QIAquick離心柱放置于試劑盒提供的2ml收集管子中；3)將樣本加入QIAquick離心柱中，離心30-60s，以結(jié)合DNA；4)倒掉2ml收集管子中的離心液體，將QIAquick離心柱放到原收集管子中；5)將0.75ml緩沖液PE加入到QIAquick離心柱中進(jìn)行洗滌，離心30-60s；6)倒掉2ml收集管子中的離心液體，將QIAquick離心柱放到原收集管子中，離心1min；7)將QIAquick離心柱放置于高壓滅菌的1.5ml的離心管子中；8)在9IAquick膜中央加入50μl緩沖液EB(10mM Tris-Cl，pH 8.5)或H2O以洗脫DNA，離心1min，為了提高DNA的濃度，可在QIAquick膜中央只加入30μl洗脫緩沖液，靜置1min，然后離心。
純化的PCR經(jīng)測(cè)定濃度后，用DNaseI進(jìn)行片段化。片段化的反應(yīng)體系包括30μl純化PCR產(chǎn)物(10μg)，4μl的10×DNaseI緩沖液，0.12μl的DNase I，5.88μl的ddH2O。反應(yīng)條件為37℃溫浴5min，然后95℃15min。片段化后的產(chǎn)物跑4％瓊脂糖凝膠，保證絕大多數(shù)的片段處于30-200個(gè)堿基對(duì)。
(3)熒光素標(biāo)記利用脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在3’末端進(jìn)行熒光素標(biāo)記，標(biāo)記的40μl反應(yīng)體系包括25μl片段化PCR產(chǎn)物，8μl的5×脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶緩沖液，1μl的CY3-N6-ddCTP(1mM)，3μl的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(20U/μl)，3μl的ddH2O。反應(yīng)條件為37℃溫浴120min，然后95℃加熱15min。
3.雜交、洗滌和結(jié)果檢測(cè)熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物95℃變性10min，立即置于冰上，用于雜交，雜交反應(yīng)20μl體系包括熒光素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物15μl，20×SSPE1.2μl，1％Triton0.2μl， 10×Denhandts 0.9μl，甲酰胺0.5μl，ddH2O 2.2μl。反應(yīng)條件為48℃溫浴120min，然后相繼用1×洗滌緩沖液I(5×SSC，0.1％SDS)、1×洗滌緩沖液II(2×SSC，0.1％SDS)和1×洗滌緩沖液III(1×SSC)在42℃各洗滌10min，最后用ddH20洗滌0.5min。
洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，用GenePix4000B共聚焦激光掃描儀進(jìn)行掃描(也可以用其他的激光掃描儀)。掃描雜交后的芯片得到的雜交結(jié)果如附圖所示，再用GenePix Pro處理圖像得到數(shù)據(jù)文件，然后對(duì)數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析就可以得到目的基因的基因型，分型結(jié)果是CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7。
實(shí)施例2正向雜交1.CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7基因擴(kuò)增和芯片制備用CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7引物(SEQ ID NO110～SEQ ID NO143)擴(kuò)增基因。PCR擴(kuò)增用100μl反應(yīng)體系進(jìn)行，反應(yīng)體系是0.3mM dNTP，10mM Tris-HCl，50mMKCl，2mM MgCl2，20％Q solution(Qiagen)，0.01μM SHV-F，0.2μM SHV-R，100ng基因組DNA，3 U Ex Taq酶(Takara)。循環(huán)參數(shù)94℃變性5min；94℃變性40s，65℃退火1min，72℃延伸1min，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Cat.No.28106)純化。將純化的PCR產(chǎn)物濃度調(diào)整至400ng/μl。
將濃度為400ng/μl的PCR產(chǎn)物與100％的DMSO于384孔板中等體積混合，以粘膠片封好384孔板，室溫下振蕩2分鐘，離心。將200ng/μl的PCR產(chǎn)物通過(guò)接觸式點(diǎn)樣或噴墨式點(diǎn)樣點(diǎn)載到玻片、硅片等材質(zhì)的固相載體片基上。采用GeneMachine公司的Ominigrid100型號(hào)的點(diǎn)樣儀，在濕度65-75％(以FullMoon片基為準(zhǔn))，溫度為25℃的條件下點(diǎn)樣，點(diǎn)樣完畢放置半小時(shí)后，將芯片放于飽和食鹽水盒中，37℃水化過(guò)夜，次日取出，600mJ交聯(lián)，交聯(lián)完畢之芯片即可使用。
2.芯片雜交雜交反應(yīng)體系包括2nM熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，1.2μl 20×SSPE，0.2μl1％Triton，0.9μl 10×Denhandts，0.5μl甲酰胺，2.2μl ddH2O。反應(yīng)條件為50℃溫浴2小時(shí)，然后相繼用1×洗滌緩沖液I(5×SSC，0.1％SDS)、1×洗滌緩沖液II(2×SSC，0.1％SDS)和1×洗滌緩沖液III(1×SSC)在42℃各洗滌10min，最后用ddH2O洗滌10秒。洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，用GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀進(jìn)行掃描(也可以用其他的激光掃描儀)。
序列表<110>上海生物芯片有限公司<120>CYP3A檢測(cè)芯片及其應(yīng)用<130>NP-11108<160>143<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2catgtgatca gtagcacatc a21<210>3<213>人工序列<400>3catgtgatca ttagcacatc a21<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4aagagattac gatcattgct gt 22<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>5gaagagatta caatcattgc tgt 23<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>6gaagagatta ctatcattgc tgt 23<210>7<211>21
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<221>misc_feature<223>引物<400>143ctgggtgatg cctacacgct at 2權(quán)利要求
1.一種CYP3A檢測(cè)芯片，包括固相載體和探針，其特征在于，所述探針與待測(cè)CYP3A基因的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)芯片，其特征在于，所述待測(cè)CYP3A基因包括CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7基因。
3.如權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)芯片，其特征在于，所述探針為DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其衍生物。
4.如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)芯片，其特征在于，所述探針為DNA，包括(1)與待測(cè)CYP3A4基因雜交的(a)SEQ ID NO1～SEQ ID NO30所示序列，(b)SEQID NO1～SEQ ID NO30所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO1～SEQ IDNO30所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(2)與待測(cè)CYP3A5基因雜交的(a)SEQ ID NO31～SEQ ID NO63所示序列，(b)SEQID NO31～SEQ ID NO63所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO31～SEQID NO63所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(3)與待測(cè)CYP3A7基因雜交的(a)SEQ ID NO64～SEQ ID NO109所示序列，(b)SEQ ID NO64～SEQ ID NO109所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，(c)與SEQ ID NO64～SEQ ID NO109所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)芯片，其特征在于，所述探針選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO109所示序列。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)芯片，其特征在于，所述探針可設(shè)有連接臂，且所述探針可被修飾。
7.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)芯片，其特征在于，所述固相載體選材為玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜和高分子材料中的一種或它們的任意組合。
8.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述芯片檢測(cè)CYP3A基因的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)在固相載體表面點(diǎn)載權(quán)利要求1所述的探針；(2)抽提待測(cè)CYP3A基因的核酸；(3)制備待測(cè)CYP3A基因的目的核苷酸序列；(4)標(biāo)記步驟(3)的目的核苷酸序列；(5)在適于與步驟(1)所述的點(diǎn)載在固相載體上的探針進(jìn)行雜交的條件下，加入經(jīng)標(biāo)記的目的核苷酸序列，并使其反應(yīng)足夠時(shí)間；(6)檢測(cè)雜交反應(yīng)的結(jié)果。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述目的核苷酸序列的制備包括PCR擴(kuò)增反應(yīng)，該反應(yīng)所用引物含有SEQ ID NO110～SEQ ID NO143所示序列的核苷酸鏈或其互補(bǔ)鏈。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述目的核苷酸序列的標(biāo)記采用包括熒光素標(biāo)記、生物素標(biāo)記、放射性元素標(biāo)記或酶標(biāo)記。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中的雜交溫度為25℃～65℃，雜交時(shí)間為2分鐘～18小時(shí)。
12.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述芯片檢測(cè)CYP3A基因的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)標(biāo)記權(quán)利要求1所述的探針；(2)抽提待測(cè)CYP3A基因的核酸；(3)制備待測(cè)CYP3A基因的目的核苷酸序列；(4)在固相載體表面點(diǎn)載步驟(3)所述的目的核苷酸序列；(5)在適于與步驟(4)所述的點(diǎn)載在固相載體上的目的核苷酸序列進(jìn)行雜交的條件下，加入經(jīng)標(biāo)記的探針，并使其反應(yīng)足夠時(shí)間；(6)檢測(cè)雜交反應(yīng)的結(jié)果。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述的探針標(biāo)記采用包括熒光素標(biāo)記、生物素標(biāo)記、熒光共振能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記、放射性元素標(biāo)記或酶標(biāo)記。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述目的核苷酸序列的制備包括PCR擴(kuò)增反應(yīng)，該反應(yīng)所用引物含有SEQ ID NO110～SEQ ID NO143所示序列的核苷酸鏈或其互補(bǔ)鏈。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中的雜交溫度為25℃～65℃，雜交時(shí)間為2分鐘～18小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物基因檢測(cè)芯片，公開了一種CYP3A檢測(cè)芯片，包括固相載體和探針，所述探針與待測(cè)CYP3A基因的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交。本發(fā)明還公開了所述芯片用于檢測(cè)CYP3A基因的方法。本發(fā)明的CYP3A檢測(cè)芯片能有效檢測(cè)分型CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7的遺傳變異，對(duì)臨床常用藥物的治療效應(yīng)做出預(yù)測(cè)，以實(shí)現(xiàn)個(gè)性化醫(yī)療。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101067149SQ20061011955
公開日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2006年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月13日
發(fā)明者盛海輝, 肖華勝 申請(qǐng)人:上海生物芯片有限公司