專利名稱：一種檢測人血清中組織激肽釋放酶的試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體的說是一種檢測人血清中組織激肽釋放 酶的試劑盒及其制備方法。
技術背景進入二十一世紀以來，得益于醫(yī)藥行業(yè)的突破和醫(yī)療手段的進步，人民 的生活水平、健康狀況、生存壽命都極大的提高了。上一個世紀抗生素的 發(fā)現(xiàn)及各種疫苗的出現(xiàn)，使許多致命的疾病如肺結核、天花等得到控制， 但同時新的致命疾病及難以治愈的疾病也不斷出現(xiàn)。其中，較為突出的就 是各種缺血性疾病，如缺血性腦中風、缺血性心肌病等，而且這些疾病的 發(fā)病率還正不斷上升。由于這類缺血性疾病的發(fā)病是一個漸進的過程，一 旦診斷延誤，發(fā)病受損的組織難以逆轉(zhuǎn)，如中風引起的半身不遂及失語等， 給患者及家屬帶來極大痛苦。盡早診斷是控制其發(fā)生、發(fā)展的有效手段。 目前診斷此類疾病國內(nèi)外多釆用腦血管造影等手段，其價格昂貴，且必須 在有條件的醫(yī)療機構才能進行，縣級以下普通門診一般都不具備其設施， 不利于大多數(shù)普通人群的普遍篩查。組織激肽釋放酶水平與缺血性腦中風 有很大相關性，血清中組織激肽釋放酶水平與頸動脈梗阻分級成明顯正相 關關系，也與腦缺血治療指征成正相關性等。因此，可利用人組織激肽釋放酶作為標記物，以ELISA方法測量外周血中組織激肽釋放酶的水平，可 以對多種疾病的診斷和愈后提供幫助。還有，隨著生命科學技術的飛速發(fā) 展，近年來人們正在利用基因工程的手段，進行表達人組織激肽釋放酶的 科學研究，也迫切需要一種隨時檢測表達量的簡便方法。而本試劑盒檢測 成本低、操作簡單、靈敏度高、特異性及穩(wěn)定性好，可普遍用于臨床檢測 及基礎醫(yī)學研究。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的，在于提供一種成本低、操作簡單、靈敏度高、特異性 及穩(wěn)定性好的檢測人血清中組織激肽釋放酶的試劑盒及其制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的所采用的技術方案為試劑盒包括包被人組織激肽釋放酶抗血清的酶聯(lián)反應板、檢測人組 織激肽釋放酶抗血清的酶抗體、標準人組織激肽釋放酶抗血清的酶樣品、 親和素-過氧化物酶、底物緩沖液和終止液。所述檢測人組織激肽釋放酶抗血清的酶抗體為連接生物素的人組織激 肽釋放酶抗血清，抗體濃度為0.5—2ug/ul;標準樣品為從人尿中提取的組 織激肽釋放酶0. 05 — 24 ng/ml;親和素-過氧化物酶為Pero-avidin用PBS 稀釋成0. 5 — 2ul/lug濃度;底物緩沖液為緩沖液A: Na2HP04. 12H 0 23—25g、檸檬酸.H20 9一10g, 30%H2O2 900 — 1100uL,雙蒸水900—1100ml調(diào) pH至4.8 —5. 2;緩沖液B:酵30—50ml， TMBO. 09 —0. llg,雙蒸水90— ll.OmL;終止液為0. 5-2M &304溶液；濃洗滌液為10-15倍的PBS,內(nèi)含 體積O. 1%吐溫20;稀釋液為重量體積濃度1-5%牛血清白蛋白的PBS。 試劑盒的制備方法 一 l)抗原合成收集尿液超濾濃縮，貯存于-20度，反復凍融3—5次， 經(jīng)紗布和Nitex膜過濾，離心，沉淀經(jīng)35-80%硫酸銨鹽析，離心收集沉淀， 用20mMTris-Hcl重溶解后透析，透析液經(jīng)過DE-52纖維素層析柱，以 0. 1-0. 5M氯化鈉-磷酸鹽緩沖液進行洗脫，收集具有Tos-Arg-0me酯酶活性 的流出峰，以0. 2M氯化鈉-磷酸鹽緩沖液對流出峰進行透析，透析液經(jīng)過 以抑酶肽為配體的瓊脂糖凝膠親和柱，以透析緩沖液洗脫直至流出液中無 蛋白，再以乙酸鈉緩沖液洗脫組織激肽釋放酶，親和洗脫的具有 Tos-Arg-0me酯酶活性的流出峰再經(jīng)過Sephacryl S-200進一步純化，得到 組織激肽釋放酶抗原；2 )包被抗原將組織激肽釋放酶抗原和兔血清進行偶聯(lián)得到包被抗原；3) 檢測人組織激肽釋放酶抗血清的酶抗體將100亳克純化的組織激肽釋放酶和等量氟氏完全佐劑研缽中研磨乳化；而后將研磨的乳液多點注 射到每只雌性新西蘭白兔背部；20-30天對白兔加強免疫50毫克乳液；末 次免疫后1-2月由耳緣靜脈收集血樣于坡璃試管中以1500g/分鐘離心15分 鐘，血清儲存于-20度；將15-20毫升抗血清樣品通過蛋白A-sepharose凝 膠柱，以0. 5M磷酸緩沖液洗脫至基線，以0. 1 M甘氨酸緩沖液洗脫免疫球 蛋白，洗脫條件為34滴/分鐘，100滴/試管，洗脫液以0. 5MTris堿中加， 收集280mn吸光度大于0. 15的樣品；4) 檢測人組織激肽釋放酶抗血清的酶抗體標記生物素將2mg/ml純化 的步驟3中的產(chǎn)物于4T對0. lmol/L碳酸氫鈉1000ml透析24小時，加入 1(^1新鮮.配制的生物素-N-羥基琥珀酸亞胺酯，室溫反應1小時后于4。C下 對1000ml磷酸鹽緩沖液透析24小時，透析后加入等體積的滅菌甘油，分 裝，貯存于-2(TC備用；而后將辣根過氧化物酶的親和素與標記有生物素的 檢測人組織激肽釋放酶抗血清的酶抗體偶聯(lián)；5) 酶反應板制備用緩沖溶液將人組織激肽釋放酶抗血清的酶稀釋成 0. 5 — 3jig/m1,微孔板每孔加入100fil， 4。C過夜包被，用洗滌機洗板三次， 每孔250uL,然后稱取lg BSA,加入80 ml PBS溶解，定容至100 ml,無 菌過濾，加入各孔中，每孔加入200pl，放入濕盒中37。C反應l小時，棄 去液體，以洗滌液洗板三次，每孔加洗滌液300|il; 4-16匸冷風干燥2小時， 放入有千燥劑的包裝袋中抽真空封口，保存于4r。本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明用從人尿中提取的人組織激肽釋放酶、由組織激肽釋放酶免疫 動物制備的特異性免疫球蛋白、制成了組織激肽釋放酶檢測試劑盒。其檢
測成本低，特別有益于不完全性腦阻塞患者的早期發(fā)現(xiàn)，亦適用于不完全性心肌梗塞等缺血性疾病的早期發(fā)現(xiàn)。診斷特異性達90%，靈敏采用標準 陽性對照檢測靈敏度達到0. 05pIU/ml。穩(wěn)定；經(jīng)穩(wěn)定性實驗，本發(fā)明于4 X:保存，至24個月時經(jīng)檢測，偏差±20%。試劑配套，使用方便，價格便 宜，易于臨床檢驗。利用本發(fā)明試劑盒，可為生物工程中細胞表達組織激 肽釋放酶的量進行跟蹤檢測。以便于細胞培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基的改良，添加 劑的增減，培養(yǎng)條件的選擇時，可獲得一個重要的檢測指標"


圖1為本發(fā)明標準物的濃度與OD值的標準曲線，其中HUK濃度 0. lng/ml ~ 3. 255ng/ml， r=0. 9948。
具體實施方式
實施例1檢測人血清中組織激肽釋放酶的試劑盒包括包被人組織激肽釋放酶 抗血清的酶聯(lián)反應板、檢測人組織激肽釋放酶抗血清的酶抗體、標準人組 織激肽釋放酶抗血清的酶樣品、親和素-過氧化物酶、底物緩沖液、終止液。所述檢測人組織激肽釋放酶抗血清的酶抗體為連接生物素的人組織激 肽釋放酶抗血清lug/ul;標準樣品為從人尿中提取的組織激肽釋放酶0. 20—3. 25ng/ml;親和素-過氧化物酶Pero-avidin用PBS稀釋成lug/lul;底物緩沖液為0. 1M檸檬酸Ph5. 0+0. 03%過氧化氫(緩沖液A: Na2HP0"12H20 23 —25g、梓檬酸.H20 9一10g, 30%H2O2 900—-1100uL，雙蒸 水900—1100ml調(diào)pH至4. 8 — 5. 2;)和0. 1%TMB+40%DMF (緩沖液B: ,30 一50ml, TMBO. 09—0. llg,雙蒸水90—110mL;),按9: l比例配制。終止液為2. 45%紐2304溶液；濃洗滌液為IO倍的PBS,內(nèi)含O. 1%吐溫20;稀釋液為重量體積濃度"/。牛血清白蛋白的PBS;檢測人血清中組織激肽釋放酶的試劑盒的制備方法步驟為l)抗原合成收集12升尿液超濾濃縮至300亳升，貯存于-20度， 反復凍融5次，經(jīng)三層紗布和Nitex膜過濾，5000g離心30分鐘，沉淀經(jīng) 35-80%硫酸銨鹽析，離心收集沉淀，重溶解后透析，透析液經(jīng)過DE-52纖 維素層析柱，以0. 1-0. 5M氯化鈉？ -0.謹磷酸鹽緩沖液(pH 6. 5 )進行洗 脫，收集具有Tos-Arg-Ome酯酶活性的流出峰，以0. 2M氯化鈉？ -0. 1M磷 酸鹽緩沖液(pH 6.5)對流出峰進行透析，透析液經(jīng)過以抑酶肽為配體的 瓊脂糖凝膠親和柱，以透析緩沖液洗脫直至流出液中無蛋白，再以0. ] M 乙酸鈉緩沖液(pH3. 5 )洗脫組織激肽釋放酶，親和洗脫的具有Tos-Arg-Ome 酯酶活性的流出峰再經(jīng)過Sephacryl S-200進一步純化，得到組織激肽釋 放酶抗原；將組織激肽釋放酶抗原由聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白純度， 經(jīng)過上述過程由原尿到純化的蛋白，組織激肽釋放酶被純化了 2114倍。建
立人組織激肽釋放酶參考品的質(zhì)量標準如下分子量經(jīng)過SDS-聚丙烯酰 胺凝膠電泳鑒定分子量為39, 500爾頓?；钚砸院铣傻孜颰os-Arg-Met測 定組織激肽釋放酶活性為74. OEU/mg蛋白，以天然底物牛低分子量激肽原 測定組織激肽釋放酶活性為22ng激肽/ nig蛋白。純度經(jīng)過SDS-聚丙烯 酰胺凝膠電泳檢測純度大于99%。蛋白濃度測定利用280nm消光系數(shù)E (280 )測定，組織激肽釋放酶E( 280 )4.5,即利用lcm比色杯測定280nm 處lmg/ml HUK溶液的吸光度為1.5。利用上述方法測定人組織激肽釋放酶 參考品的濃度。為利用親和色譜方法從人尿液中提取純化得到，經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測純度大干99%，利用280rnn消光系數(shù)E ( 280 )測 定蛋白濃度，稀釋后(3. 25ng/^U)無菌過濾后分裝。2 )包被抗原將組織激肽釋放酶抗原和兔血清進行偶聯(lián)得到包被抗原；3) 檢測人組織激肽釋放酶抗血清的酶抗體將100亳克純化的組織激 肽釋放酶和等量氟氏完全佐劑研缽中研磨乳化；而后將研磨的乳液多點注 射到每只雌性新西蘭白兔背部；20-30天對白兔加強免疫50毫克乳液；末 次免疫后1-2月由耳緣靜脈收集血樣于玻璃試管中以1500g/分鐘離心15分 鐘，血清儲存于-2Q度；將15-20亳升抗血清樣品通過蛋白A-s印harose凝 膠柱，以0. 5M磷酸緩沖液(pH8. 0)洗脫至基線，以O. 1M甘氨酸緩沖液(pH3. 0)洗脫免疫球蛋白，洗脫條件為34滴/分鐘，100滴/試管，洗脫液 以0.5MTris堿 (pH9.0)中和,收集280nm吸光度大于0. 15的樣品；測 定抗體溶液濃度為3.6mg/ml，利用SDS-PAGE檢測純化抗體的純度大于 99%。利用被比稀釋測定效價大于1: 100000。4) 檢測人組織激肽釋放酶抗血清的酶抗體標記生物素將2mg/ml純化 的步驟3中的產(chǎn)物于4。C在0. lraol/L碳酸氫鈉(pH9. 5 ) 1000ml透析24小 時，加入10)il新鮮配制的生物素-N-羥基琥珀酸亞胺酯(BNHS, 10mg/lml DMSO),室溫反應1小時后于化下對1000ml磷酸鹽緩沖液透析24小時， 透析后加入等體積的滅菌甘油，分裝，貯存于-2(TC備用；而后將辣根過氧 化物酶的親和素與標記有生物素的檢測人組織激肽釋放酶抗血清的酶抗體 偶聯(lián)；采用方陣滴定法測定抗體工作濃度為2ug/mL5) 酶反應板制備用緩沖溶液將人組織激肽釋放酶抗血清的酶稀釋成 l網(wǎng)/ml,微孔板每孔加入lOOpl, 4。C過夜包被，用洗滌機洗板三次，每孔 250uL,然后稱取lg BSA,加入80 ml PBS溶解，定容至l()O ml,無菌過 濾，加入各孔中，每孔加入200p1,放入濕盒中37。C反應l小時，棄去液 體，以洗滌液洗板三次，每孔加洗滌液300pl。 16。C冷風干燥2小時，放入 有干燥劑的包裝袋中抽真空封口，保存于4"C。試劑盒使用方法1) 配液將濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水10倍稀釋。2) 編號將樣品對應微孔按序編號，每板應設空白對照l孔、陰性對 照3孔、標準血清5孔。
4)預洗用洗滌液將酶標板洗滌3遍。5 )加樣分別在相應孔中加入陰性對照(3孔)、標準血清(5孔)及 待檢血清各lQGu 1。6) 溫育用封板膜封板后置3rc土rc溫育u0士2分鐘。7) 洗滌小心將封板膜揭掉，使用洗板機吸干孔內(nèi)液體，用洗滌液洗 滌3遍。8) 加抗體每孔加入生物素化抗體100ul，空白孔除外。9) 溫育用封板膜封板后置37。C土rC溫育60土2分鐘。10) 洗滌小心將封板膜揭掉，使用洗板機吸干孔內(nèi)液體，用洗滌液 洗滌3遍。11) 加酶每孔加入酶標記物lOOul,空白孔除外。12) 溫育用封板膜封板后置37。C土rC溫育30±2分鐘。13) 洗滌小心將封板膜揭掉，使用洗板機吸干孔內(nèi)液體，用洗滌液 充分洗滌5遍，最后一次盡量扣千。14) 顯色每孔加入底物a、 B液各90和10jj1,輕輕震蕩混勻，用封板膜封板后置37°c ± rc避光溫育10分鐘。15) 測定每孔加終止液lOOpl,輕輕振蕩混勻，設定酶標儀波長為 450nm (建議使用雙波長檢測)，測定各OD值。結果判定以標準物的濃度為橫坐標(對數(shù)坐標)，OD值為縱坐標(普通坐標)(參 見圖l),在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查 出相應的濃度；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程 式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度。經(jīng)檢測產(chǎn)品性能指標為 靈敏度0. 05juIU/ml,標準曲線R>0. 98,精密性CV《10% ( n=10 )， 正常值0. 3~10jiIU/ml,測定范圍0. 1 ~ 30 p IU/ml。實施例2與實施例1不同之處在于釆用人組織激肽釋放酶免疫動物制備的抗體(HUK-IgG)包被酶聯(lián)反應 板，從人尿中提取純化的人組織激肽釋放酶為抗原(HUK),生物素標記的 組織激肽釋放酶抗體加入保護劑，親和素加入保護劑，以1%牛血清白蛋白 的PBS為稀釋液，以檸檬酸、過氧化氫、四甲基苯(TMB)配制的顯色物，利 用了雙抗夾心ELISA法原理組裝了試劑盒，同時準備了詳細使用說明書。 稀釋液的制備用PBSPh7. 2+l%BSA+0. 05°/ 吐溫+0. 05%ProCl ion-300。 酶聯(lián)反應板的制備取美國南卡醫(yī)學院提供的人組織激肽釋放酶免疫 動物制備的抗體(HUK-IgG),加入到PBS(Ph7. 2)緩沖液中，配制成lug/ml 溶液。在96孔板中每孔加入lOOul,置于4。C中16h 。取出包被板，在洗 板機上用含0. 1%吐溫-20的PBS緩沖液，250ul/孔，沖洗3次，拍干。1%BSA 的溶液，200ul/孔封閉，37i:中l(wèi)h。取出封閉板，在洗板機上用含0.1。/。吐 溫-M的PBS緩沖液，2S0ul/孔，沖洗3次，拍千。17。C中風干2h,真空干
燥封閉，儲存于4匸中備用。標準品(HUK)的制備取美國南卡醫(yī)學院提供的人組織激肽釋放酶 (HUK),用稀釋液加入1. 25%2M EDTA，稀釋至3. 25ng/ml，分裝，儲存于4"C中備用。生物素標記組織激肽釋放抗體(Biotin-HUK IgG)的制備取5. 5mg/ml 抗體(HUK-IgG) lml,加入1. 5mlPBS混勻，注入透析袋，在0. 1M NaHC03 Ph9. 5 1000ml溶液中，4。C條件下透析24小時。將透析后的IgG 2. 5ml取 出放入ep管中，加入新鮮配制的0. 1M Bio Tinamidocaprpate25u1, 23°C 水洛1小時。將液體全部取出重新注入透析袋，在PBS中4。C條件下透析 24小時。將將透析后的Bio-IgG液體全部取出，加入等體積的無菌甘油， 混勻，分裝，-2(TC保存?zhèn)溆?。取Biotin-HUKIgG,用稀釋液含O. 1%苯酚，稀 釋至lug/ml,分裝，儲存于4。C中備用。親和素-過氧化物酶(Pero-avidin)的制備取Pero-avidin用PBS 稀釋成lul/lug濃度分裝，儲存于-2(TC中備用。取lul/lugPero-avidin， 用稀釋液含O. 1%苯酴，稀釋至lug/ml，分裝，儲存于4i:中備用。顯色系統(tǒng)以0. 1M檸檬酸Ph5. 0+0. 03°/。過氧化氫和0. 1%TMB+40%DMF, 按9: 1比例配制。
權利要求
1. 一種檢測人血清中組織激肽釋放酶的試劑盒，其特征在于包括，包被人組織激肽釋放酶抗血清的酶聯(lián)反應板、檢測人組織激肽釋放酶抗血清的酶抗體、標準人組織激肽釋放酶抗血清的酶樣品、親和素-過氧化物酶、底物緩沖液和終止液。
2. 按照權利要求1所述的檢測人血清中組織激肽釋放酶的試劑盒，其 特征在于所述檢測人組織激肽釋放酶抗血清的酶抗體為連接生物素的人 組織激肽釋放酶抗血清，抗體濃度為Q. 5 — 2ug/ul;標準樣品為從人尿中提取的組織激肽釋放酶0. 05 — 24 ng/ml 親和素-過氧化物酶為Pero-avidin用PBS稀釋成0. 5 — 2ui/lug濃度； 底物緩沖液為緩沖液A: Na2HP04. 12H20 23 — 25g、檸檬酸.H20 9 — 10g,30%H2O2 900—1100uL，雙蒸水900—1100ml調(diào)pH至4. 8 — 5. 2;緩沖液B:腳30—50ml， TMBO-09—0. llg,雙蒸水90—110mL; 終止液為0. 5-2M H2S0r溶液；濃洗滌液為10-15倍的PBS,內(nèi)含體積O. 1%吐溫20;稀釋液為重量體積濃度1-5%牛血清白蛋白的PBS。
3. —種權利要求1所述的檢測人血清中組織激肽釋放酶試劑盒的制備 方法，其特征在于 _l)抗原合成收集尿液超濾濃縮，貯存于-20度，反復凍融3—5次， 經(jīng)紗布和Nitex膜過濾，離心，沉淀經(jīng)35-80%硫酸銨鹽析，離心收集沉淀， 用20mMTris-Hcl重溶解后透析，透析液經(jīng)過DE-52纖維素層析柱，以 0. 1-0. 5M氯化鈉-磷酸鹽緩沖液進行洗脫，收集具有Tos-Arg-Ome酯酶活性 的流出峰，以0.2M氯化鈉-磷酸鹽緩沖液對流出峰進行透析，透析液經(jīng)過 以抑酶肽為配體的瓊脂糖凝膠親和柱，以透析緩沖液洗脫直至流出液中無 蛋白，再以乙酸鈉緩沖液洗脫組織激肽釋放酶，親和洗脫的具有 Tos-Arg-Ome酯酶活性的流出峰再經(jīng)過Sephacryl S-20G進一步純化，得到 組織激肽釋放酶抗原；2) 包被抗原將組織激肽釋放酶抗原和兔血清進行偶聯(lián)得到包被抗原；3) 檢測人組織激肽釋放酶抗血清的酶抗體將100亳克純化的組織激 肽釋放酶和等量氟氏完全佐劑研缽中研磨乳化；而后將研磨的乳液多點注 射到每只雌性新西蘭白兔背部；20-30天對白兔加強免疫50亳克乳液；末 次免疫后1-2月由耳緣靜脈收集血樣于玻璃試管中以1500g/分鐘離心15分 鐘，血清儲存于-20度；將15-M亳升抗血清樣品通過蛋白A-s印harose凝 膠柱，以0.，磷酸緩沖液洗脫至基線，以0. 1 M甘氨酸緩沖液洗脫免疫球 蛋白，洗脫條件為3"商/分鐘，100滴/試管，洗脫液以0. 5MTris堿中和， 收集280nm吸光度大于0. 15的樣品；
4.檢測人組織激肽釋放酶抗血清的酶抗體標記生物素將2mg/ml純化 的步驟3中的產(chǎn)物于4"C對0. lraol/L碳酸氫鈉1000ml透析24小時，加入 lOjil新鮮配制的生物素-N-羥基琥珀酸亞胺酯，室溫反應1小時后于4'C下 對1000ml磷酸鹽緩沖液透析24小時，透析后加入等體積的滅菌甘油，分 裝，貯存于-2(TC備用；而后將辣根過氧化物酶的親和素與標記有生物素的檢測人組織激肽釋放酶抗血清的酶抗體偶聯(lián)；5)酶反應板制備用緩沖溶液將人組織激肽釋放酶抗血清的酶稀釋成 0. 5 — 3ng/ml，微孔板每孔加入lOOpl, 4。C過夜包被，用洗滌機洗板三次， 每孔250uL，然后稱取lg BSA,加入80 ml PBS溶解，定容至100 ml，無 菌過濾，加入各孔中，每孔加入20(Hi1,放入濕盒中37。C反應1小時，棄 去液體，以洗滌液洗板三次，每孔加洗滌液30(Hxl; 4-16。C冷風干燥2小時， 放入有干燥劑的包裝袋中抽真空封口，保存于4'C。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體的說是一種檢測人血清中組織激肽釋放酶的試劑盒及其制備方法，包括，包被人組織激肽釋放酶抗血清的酶聯(lián)反應板、檢測人組織激肽釋放酶抗血清的酶抗體、標準人組織激肽釋放酶抗血清的酶樣品、親和素-過氧化物酶、底物緩沖液和終止液。本試劑盒可用于缺血性疾病的早期診斷，檢測方法簡便快速、成本低廉、靈敏度及特異性高。本發(fā)明也提供了制備方法。
文檔編號G01N33/573GK101210926SQ200610135109
公開日2008年7月2日 申請日期2006年12月27日 優(yōu)先權日2006年12月27日
發(fā)明者津 張, 張麗華, 張曉丹, 張玉奎, 張維冰, 徐茂蘭, 青 楊, 立 趙 申請人:中國科學院大連化學物理研究所