專利名稱：：一種新穎酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(e-lamp)的建立與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(E-LAMP)用于HCVRNA病毒檢測(cè)。用于RNA病毒在各種生物制品、獻(xiàn)血者、病人血液標(biāo)本等的監(jiān)測(cè)。應(yīng)用范圍包括人用、獸用及其他生物^用。
背景技術(shù)：
：1、病毒基因檢測(cè)技術(shù)的現(xiàn)狀自核酸的體外擴(kuò)增變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)以來，各種核酸擴(kuò)增酶與核酸擴(kuò)增方法層出不窮，基因診斷技術(shù)也被愈加廣泛地用于疾病監(jiān)控、基因突變和基因特征的分析等研究中。迄今，建立的靶基因擴(kuò)增放大方法主要有最廣泛使用的PCR、bDNA、SDA、3SR、NASBA等。盡管這些方法都具有很強(qiáng)的核酸放大能力，但在儀器需求和實(shí)驗(yàn)的可操作性方面存在很多弊端。臂如PCR需要對(duì)雙鏈進(jìn)行熱變性過程才能啟動(dòng)下一輪的擴(kuò)增反應(yīng)；在NASBA和3SR技術(shù)中通過--些特殊的轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄過程才能進(jìn)行核酸的擴(kuò)增，雖然省去了核酸的變復(fù)性過程，但在引物設(shè)計(jì)時(shí)還要加入轉(zhuǎn)錄酵的特異性結(jié)合位點(diǎn)；SDA和bDNA檢測(cè)技術(shù)則通過特殊內(nèi)切酶的使用在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增和信號(hào)放大。相形之下，兩種近年發(fā)展起來的環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)與滾環(huán)復(fù)制放大技術(shù)(RCA)，具有更高的靈敏度和特異性，而且在擴(kuò)增時(shí)間和可操作性方面顯^出強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)。在這兩種技術(shù)中分別使用了特異對(duì)應(yīng)于靶序列的引物或探針，在連接酶(或反轉(zhuǎn)錄酶)和BstDNA聚合酶的作用下對(duì)靶序列進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增。整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)并不需要核酸的變復(fù)性過程和特殊儀器，在1.5-3小時(shí)內(nèi)即可完成。這兩種檢測(cè)技術(shù)在可操作性、靈敏度以及特異性方面表現(xiàn)出來的優(yōu)越性使其倍受研究者的青睞，并已成功應(yīng)用于各種基因的檢測(cè)。2、丙型肝炎病毒全世界有1.7億HCV的慢性感染者，每年新增IO萬(wàn)人以上的肝癌患者。眾所周知，肝癌與慢性肝炎是密不可分的。根據(jù)WHO在2002年發(fā)布的一項(xiàng)報(bào)告顯示，在2001年由于慢性肝炎引起的死亡人數(shù)達(dá)到140萬(wàn)，其中至少20%(28萬(wàn)人以上)是因丙型肝炎引起的。盡管在丙型肝炎的診斷和治療方面的研究已經(jīng)有了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但在發(fā)展中國(guó)家，由于丙型肝炎不能得到及時(shí)的診斷和治療而引起的病死率還在不斷增加。HCV感染的診斷主要依賴于血清抗體的ELISA檢測(cè)和病毒基因的檢測(cè)，但由于感染初期抗體水平很低，抗體的檢測(cè)總會(huì)使-些窗口期傳染源漏檢，尤其在免疫抑制型患者(如合并HIV感染的患者)中更易表現(xiàn)為假陰性，而利用抗體檢測(cè)核心抗原的技術(shù)一直是一個(gè)很難突破的瓶頸?；赑CR的基因檢測(cè)技術(shù)(NAT)具有更高的靈敏度，尤其在轉(zhuǎn)氨酶為正常水平，抗體尚未出現(xiàn)時(shí)，此技術(shù)便成為—種可信賴的丙型肝炎實(shí)驗(yàn)室診斷方法。因此，歐洲藥管局已將HCV-RNA的檢測(cè)列為HCV病毒檢測(cè)的強(qiáng)制執(zhí)行項(xiàng)目。在丙型肝炎的傳播中輸血也是一個(gè)最重要的途徑之一，這為丙型肝炎的預(yù)防工作帶來很大壓力。雖然通過對(duì)獻(xiàn)血員嚴(yán)格的監(jiān)測(cè)和篩査使這種危險(xiǎn)已大幅度減弱，但在輸血過程中丙肝病毒傳播"零危險(xiǎn)"的目標(biāo)也很難達(dá)到。隨著NAT技術(shù)的日趨完善，一些發(fā)達(dá)國(guó)家已將此技術(shù)用于血庫(kù)的常規(guī)篩査項(xiàng)目，這使窗口期病人的漏檢率有了顯著的降低。據(jù)報(bào)道，較免疫學(xué)檢測(cè)，NAT技術(shù)可將HCV的平均窗口期提前25天以上，使獻(xiàn)血員傳播HCV的概率降低72%左右。因此，現(xiàn)階段在世界范圍內(nèi)開展大規(guī)模血液篩査也多采用NAT技術(shù)。目前HCV的NAT檢測(cè)中，PCR和熒光PCR(TaqMan)最為常見。雖然這兩種技術(shù)檢測(cè)靈敏度高，但因其費(fèi)用昂貴、操作復(fù)雜，在發(fā)展中國(guó)家很難作為血庫(kù)的常規(guī)檢測(cè)推廣。因此，簡(jiǎn)化操作手段和縮短檢測(cè)時(shí)間成為發(fā)展和改造基因檢測(cè)方法的重點(diǎn)，本發(fā)明中所研究和建立的方法正是迎合這兩個(gè)重點(diǎn)進(jìn)行的。3、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)，核酸擴(kuò)場(chǎng)技術(shù)(RT-LAMP)逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)最初由Notomi等人設(shè)計(jì)并應(yīng)用于病毒檢測(cè)。在檢測(cè)過程中核酸鏈通過等溫環(huán)境中的循環(huán)置換擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)對(duì)靶序列的放大。由于反應(yīng)中使用了三對(duì)特異性引物，只有在三對(duì)引物均與特異的靶序列結(jié)合時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)才能進(jìn)行，因此這種檢測(cè)方法的特異性很高。其中一對(duì)引物的5'端含有一段與下游擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的序列，因此，這對(duì)引物的單鏈產(chǎn)物就可形成一個(gè)類似啞鈴狀回文結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)正好為下一步等溫置換擴(kuò)增反應(yīng)提供了一個(gè)可被周而復(fù)始利用的模板，從而保證了擴(kuò)增的持續(xù)進(jìn)行。相對(duì)于其他傳統(tǒng)擴(kuò)增方法，尤其對(duì)RNA的擴(kuò)增，這種擴(kuò)增很大程度上提高了檢測(cè)的靈敏度并節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間。因?yàn)槠渲械?—對(duì)引物專門用于增加擴(kuò)增模板減少反應(yīng)時(shí)間，加之反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)在等溫統(tǒng)一環(huán)境中一步完成，省去了反轉(zhuǎn)錄步驟和改變溫度所需的時(shí)間。整個(gè)檢測(cè)過程在65"C等溫條件下只需l-2小時(shí)就可完成。最終的擴(kuò)增產(chǎn)物在核酸電泳的凝膠上呈現(xiàn)出典型的階梯狀條帶。值得一提的是RT-LAMP的擴(kuò)增反應(yīng)中可以形成可視的焦磷酸鎂沉淀，因此肉眼也可觀察到陽(yáng)性反應(yīng)管中的白色混濁物。4、LAMP在病毒基因檢潿方面的應(yīng)用基因診斷技術(shù)被廣泛地用于疾病監(jiān)控，基因突變和基因特征的分析等研究中。迄今，建立的靶基因擴(kuò)增放大的方法主要有最廣泛使用的PCR，支鏈DNA擴(kuò)增技術(shù)(bDNA)，向主復(fù)制系統(tǒng)(3SR)，基于核酸序列的放大系統(tǒng)(NASBA)，這些技術(shù)在基因檢測(cè)方面都有各自的擴(kuò)增特點(diǎn)和優(yōu)劣性。臂如，PCR需要對(duì)雙鏈進(jìn)行升溫變性過程后才能啟動(dòng)下一輪的擴(kuò)增反應(yīng)。在NASBA和3SR技術(shù)中雖然省去了核酸的變復(fù)性過程，但也需要通過一些特殊的轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)行核酸的擴(kuò)增；SDA和bDNA檢測(cè)技術(shù)則通過特殊的內(nèi)切酶等的使用在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增和信號(hào)放大。文中表l總結(jié)和比較了近年來發(fā)展起來的一些擴(kuò)增技術(shù)的基本特征。表l.不同核酸擴(kuò)增技術(shù)的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>盡管這些方法都具有很強(qiáng)的放大能力，但在儀器需求和可操作性方面都存在不同的弊端。而LAMP檢測(cè)技術(shù)無論在可操作性、靈敏度以及特異性方面表現(xiàn)出來的優(yōu)越性使其越來越受到研究者們的青睞。近年來已有許多在基因檢測(cè)方面成功應(yīng)用的報(bào)道。在病毒基因檢測(cè)方面，Parida等人利用RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)了西尼羅病毒的RNA,并與普通RT-PCR進(jìn)行了靈敏度比較，發(fā)現(xiàn)RT-LAMP的靈敏度髙于RT-PCR方法10倍以上。在SARS病毒的檢測(cè)中Thai等人也將常規(guī)RT-PCR與RT-LAMP作了比較，它們的樣本檢出率分別為87%和100%，而且他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了RT-LAMP的靈敏度是RT-PCR的100倍。與此同時(shí)，其他研究者利用該技術(shù)進(jìn)行了麻疹、新城疫和口蹄疫等病毒的檢測(cè)。LAMP也被成功用于檢測(cè)過不同的植物病毒，如Fukuta等人利用該技術(shù)成功的檢測(cè)了菊花中的番茄斑枯病毒和繁殖體中的山藥嵌紋病毒。LAMP技術(shù)在病毒基因檢測(cè)方面的優(yōu)勢(shì)已毋庸置疑，因其具有獨(dú)特的核酸擴(kuò)增機(jī)制，使該技術(shù)在其它檢測(cè)領(lǐng)域也擁有廣泛的應(yīng)用前景。最近巳有不少學(xué)者在這方面作了許多有益的嘗試。Fukuta等人在檢測(cè)菊花中的番茄斑枯病毒就將免疫捕捉技術(shù)與RT-LAMP有機(jī)結(jié)合并獲得了成功。還有人分別報(bào)道了利用該技術(shù)檢測(cè)虹鱒魚造血組織壞死病毒、出血性敗血癥病毒和犬瘟病毒的實(shí)例。為了發(fā)展可供臨床上使用且簡(jiǎn)便易行的基因檢測(cè)技術(shù)，Notomi的研究小組預(yù)先將可與LAMP中產(chǎn)物雜交的探針進(jìn)行熒光標(biāo)記，并在LAMP反應(yīng)體系中加入了陽(yáng)離子聚合物聚乙烯胺(PEI),最終可與擴(kuò)增產(chǎn)物形成復(fù)合物沉淀，而雜交至擴(kuò)增產(chǎn)物上的熒光標(biāo)記物使該沉淀在紫外光下呈現(xiàn)出不同的顏色，進(jìn)一步方便了LAMP技術(shù)在臨床監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。由于LAMP擴(kuò)增可在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大于500jig/ml的DNA，因此這個(gè)研究組還使用特異寡核苷酸引物和T印Rl內(nèi)切酶以LAMP的特異性產(chǎn)物為模板擴(kuò)增出特異性的單鏈DNA,這種方法的成功也為L(zhǎng)AMP與微陣列等技術(shù)的結(jié)合提供了可行性依據(jù)。另外，還有該技術(shù)被用于寄生蟲、細(xì)菌以及病原基因分型檢測(cè)(如登革熱病毒的分型)、胚胎性別檢測(cè)和SNP研究的報(bào)道。如Oriel等人就時(shí)，還有肺炎鏈球菌lytA基因和愛德華氏菌被成功檢測(cè)的報(bào)道。該技術(shù)也可對(duì)移植牛胚的性別作出快速鑒定。從上述LAMP的原理和特點(diǎn)不難看出，這種擴(kuò)增技術(shù)在檢測(cè)特異性以及便捷性和靈敏度方面都具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，這種優(yōu)勢(shì)是其它擴(kuò)增技術(shù)無法比擬的。不過它在結(jié)果判定方面仍然不能避免核酸電泳帶來的麻煩和安全性方面的威脅，而且這種方法很難界定一些微量模板檢測(cè)結(jié)果的判斷。目前，為了克服這些弊端，完善此項(xiàng)技術(shù)，該技術(shù)最初的研究者又開發(fā)了一種濁度監(jiān)控儀，可以通過判斷擴(kuò)增過程中形成焦磷酸鎂沉淀的濁度來對(duì)反應(yīng)實(shí)施監(jiān)控和進(jìn)行結(jié)果判斷。但這種儀器類似于Real-timePCR儀，操作比較復(fù)雜而且價(jià)格也比較昂貴，很難作為一種常規(guī)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行推廣。S、酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)増技術(shù)(E-LAMP)本發(fā)明將普通的酶聯(lián)免疫技術(shù)與RT-LAMP有機(jī)結(jié)合，也一并引入了固相載體技術(shù)，通過對(duì)一條引物進(jìn)行生物素標(biāo)記，將RT-LAMP的中產(chǎn)物固相到包被有鏈霉親和素的微孔反應(yīng)板上，再通過辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗地高辛(Digoxin)抗體與標(biāo)記在另一條引物上的地高辛特異性結(jié)合而最終呈現(xiàn)顏色反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了在單管中完成從擴(kuò)增到結(jié)果呈現(xiàn)的全部檢測(cè)過程。它的檢測(cè)時(shí)間可以縮短到兩小時(shí)以內(nèi)，靈敏度可達(dá)到檢測(cè)十個(gè)拷貝以上的病毒核酸分子。除了應(yīng)用一些常用聚合酶外，對(duì)硬件設(shè)備基本無特殊要求，在普通的生物實(shí)驗(yàn)室就可完成這項(xiàng)檢測(cè)工作。在試驗(yàn)實(shí)施中只需一步就可完成實(shí)驗(yàn)操作，減少了污染機(jī)會(huì)并方便了實(shí)驗(yàn)過程中的質(zhì)控工作。基于酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的這一檢測(cè)系統(tǒng)在靈敏度和和特異性方面與普通RT-PCR相同，但其與酶聯(lián)免疫技術(shù)的巧妙結(jié)合，使對(duì)實(shí)驗(yàn)硬件設(shè)備的要求大大降低，只需一個(gè)恒溫水浴箱和一臺(tái)酶標(biāo)儀即可滿足整個(gè)實(shí)驗(yàn)需求。與普通RT-PCR或RT-LAMP相比，在可操作性上顯示出更大的優(yōu)勢(shì)，更易于推廣。
發(fā)明內(nèi)容1、一種新顢,聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫基BT堆技術(shù)(E-LAMP)的建立本發(fā)明旨在克服當(dāng)前在病毒基因檢測(cè)過程中存在的操作復(fù)雜、RNA酶和核酸擴(kuò)增污染嚴(yán)重、實(shí)驗(yàn)硬件設(shè)備要求高、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)而設(shè)計(jì)的一種新穎酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(E-LAMP)。l.l.如
發(fā)明內(nèi)容1.所述的一種新頼雜聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(E-LAMP)，其特征在于，將普通的酶聯(lián)免疫技術(shù)與RT-LAMP有機(jī)結(jié)合，也一并引入了固相載體技術(shù)。1.2.如
發(fā)明內(nèi)容1.1所述的新穎鷹聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(E-LAMP)將普通的酶聯(lián)免疫技術(shù)與RT-LAMP有機(jī)結(jié)合，其特征在于，將RT-LAMP的中產(chǎn)物固相到包被有鏈霉親和素的微孔板上，再通過嗨標(biāo)二抗而最終呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。1.3.如
發(fā)明內(nèi)容1.2所述的通過酶標(biāo)二抗呈現(xiàn)顏色反應(yīng)，是指通過辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗地髙辛(Digoxb)抗體與標(biāo)記在引物上的地高辛特異性結(jié)合而呈現(xiàn)顏色反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了在單管中完成從擴(kuò)增到結(jié)果呈現(xiàn)的全部檢測(cè)過程。2、引物設(shè)計(jì)通過Bkst、AlignX和Prim汰5.0程序、選擇丙型肝炎病毒HCV的5'UTR區(qū)，對(duì)保守區(qū)分別設(shè)計(jì)了六條引物，其中包括兩條外引物(F3、B3)、兩條內(nèi)引物(FIP、BIP)和兩條環(huán)結(jié)合引物(Loopl、Loop2)。所有引物的具體序列見表2。表2.E-LAMP檢測(cè)HCV的引物序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>2.1.如
發(fā)明內(nèi)容2.所述的引物，其特征在于反應(yīng)中使用了三對(duì)特異性引物，只有在三對(duì)引物均與特異的靶序列結(jié)合時(shí)擴(kuò)増反應(yīng)才能進(jìn)行，因此這種檢測(cè)方法的特異性很高。2.2.如
發(fā)明內(nèi)容2.所述的引物，其特征在于其中一對(duì)引物的5'端含有一段與下游擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的序列，因此，這對(duì)引物的單鏈產(chǎn)物就可形成一個(gè)類似啞鈴狀回文結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)正好為下一步等溫置換擴(kuò)增反應(yīng)提供了一個(gè)可被周而復(fù)始利用的模板，從而保證了擴(kuò)增的持續(xù)進(jìn)行。2.3.如
發(fā)明內(nèi)容2.所述的引物，其特征還在于對(duì)其中一條內(nèi)引物(FIP)在5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記。2.4.如
發(fā)明內(nèi)容2.所述的引物，其特征還在于對(duì)其中另一條內(nèi)引物(BIP)在5'端進(jìn)行地高辛標(biāo)記。3、建立了如下的檢J8過程3.1.合成探針使用大連寶生物生物技術(shù)公司合成儀合成。3.2.將待測(cè)標(biāo)本按Qiagen公司的病毒RNA提取試劑盒步驟處理，獲得樣本的RNA。3.3.進(jìn)行酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(E-LAMP)反應(yīng)。3.4.酶標(biāo)儀中讀值。本發(fā)明特點(diǎn)這種新穎酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(E-LAMP)將檢測(cè)時(shí)間縮短到兩小時(shí)以內(nèi)，靈敏度可達(dá)到檢測(cè)十個(gè)拷貝以上的病毒核酸分子，除了應(yīng)用一些常用聚合酶外，對(duì)硬件設(shè)備基本無特殊要求，在普通的生物實(shí)驗(yàn)室就可完成這項(xiàng)檢測(cè)工作。在試驗(yàn)實(shí)施中只需一步就可完成實(shí)驗(yàn)操作，減少了污染楓會(huì)并方便了實(shí)驗(yàn)過程中的質(zhì)控工作。這種改進(jìn)后的LAMP檢測(cè)技術(shù)可以自酸檢測(cè)樣品進(jìn)行半定量。本發(fā)明是目前對(duì)RNA病毒檢測(cè)技術(shù)手段的改進(jìn)和補(bǔ)充，它具有安全、特異、靈敏、便捷的優(yōu)勢(shì)，這主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面第-，擴(kuò)增反應(yīng)只有在六條引物完全與識(shí)別的靶序列中八個(gè)結(jié)合區(qū)匹配的情況下才能順利進(jìn)行，從而使檢測(cè)特異性得到改善。第二，該技術(shù)省略了單獨(dú)的逆轉(zhuǎn)錄和巢式PCR的二次擴(kuò)增步驟，只需一步就可完成實(shí)驗(yàn)操作，沒有核酸的變復(fù)性過程，減少了RNA酶和擴(kuò)增核酸的污染機(jī)會(huì)，提髙了檢測(cè)的敏感性和安全性。第三，所有的擴(kuò)增過程都可在65"同溫下完成，無需PCR儀，降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)硬件的要求。第四，通過酶標(biāo)技術(shù)可將檢溯的陽(yáng)性結(jié)果用顏色反應(yīng)呈現(xiàn)出來。第五，在結(jié)果判斷方面，借鑒酶聯(lián)免疫技術(shù)的結(jié)果判斷方法，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并建立了可靠的結(jié)果判斷系統(tǒng)。第六，通過普通酶標(biāo)儀對(duì)反應(yīng)顏色的檢測(cè)可以對(duì)樣品進(jìn)行半定量的測(cè)定。第七，較RT-PCR縮短了檢測(cè)所需的時(shí)間。具體實(shí)施例方式實(shí)施方案1:丙型肝炎病毒基因(HCV)的E-LAMP檢測(cè)(1)以5ng/ml的包被濃度在酶標(biāo)板或微孔反應(yīng)板上包被鏈酶親和素，每孔加入lOOfil，4"過夜，拍干酶標(biāo)板，待用。(2)以PBS洗板，再用lW的BSA37"C封閉lh,洗板，-20匸貯存?zhèn)溆谩?3)加入帶有標(biāo)記引物的E"LAMP反應(yīng)體系，63r擴(kuò)增1.5h。E-LAMP的反應(yīng)體系如下F3與B3，5pmol:BIP與FIP,40pmol:Loop-l與Loop-2，20pmol;其它反應(yīng)組分終濃度為1.0mMdNTP，lmMbetaine，6mMMgS04，2.5ullOXBst-DNAPolymeraseBuffer,8UBst-DNApolymerase，lUAMV反轉(zhuǎn)錄酶，5ulHCVRNA樣品，補(bǔ)水至25ul，混勻，63"C，水浴1.5h。(4)移去孔中反應(yīng)液，洗板。(5)加入HRP標(biāo)記抗Digoxin抗體(1:10000),37X:繼續(xù)放置40min。(6)移去孔中反應(yīng)液，用洗液洗3-5次。(7)加入顯色液A+B，37X:避光放置2-3min，顯色。(8)顯色完成后加入終止液(1N硫酸)終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀中讀值(雙波長(zhǎng)405nm，630nm)。實(shí)施方案2:對(duì)E-LAMP方案進(jìn)行靈敏度試為了驗(yàn)證E-LAMP的半定量效果和作為常規(guī)基因檢測(cè)的可行性，對(duì)一份定量后的HCVRNA樣品進(jìn)行10倍系列稀釋，利用稀釋的樣品測(cè)試E-LAMP方案的靈敏度，具體操作程序按HCV-E-LAMP的檢測(cè)步驟進(jìn)行。測(cè)試結(jié)果表明該方法的靈敏度理論上可達(dá)到檢測(cè)10個(gè)拷貝的HCVcDNA分子，此靈敏度水平與普通RT-LAMP相同，證明該技術(shù)經(jīng)過改造后，其靈敏度并沒受到影響。實(shí)施方案3:E-LAMP檢潿HCV病毒的特異性方法與丙型肝炎病毒基因(HCV)的E-LAMP檢測(cè)相同，使用的RNA樣品改為HIV、HBV。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HIV和HBV的OD值均趨于陰性，證明這種檢測(cè)方法的特異性較高。實(shí)施方案4:用HCV臨床血淸樣品進(jìn)行E-LAMP檢測(cè)方法的驗(yàn)證對(duì)收集于甘肅省臨床檢驗(yàn)中心和湖北省干細(xì)胞研究中心的60份丙型肝炎病人的血清進(jìn)行檢測(cè),E-LAMP檢測(cè)HCV病毒的陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)RT-PCR方法或Realtime-PCR方法完全一致，說明檢測(cè)的特異性和靈敏度是滿意的。權(quán)利要求1、一種用于RNA病毒檢測(cè)的酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(E-LAMP)，其特征是將普通的酶聯(lián)免疫技術(shù)與RT-LAMP有機(jī)結(jié)合，通過標(biāo)記引物、包被微孔板和RT-LAMP中產(chǎn)物三者之間的特異性結(jié)合而最終呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。2、權(quán)利要求1所述的RNA病毒檢測(cè)的酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(E-LAMP)的標(biāo)記引物包括對(duì)其中一條內(nèi)引物(FIP)進(jìn)行生物素標(biāo)記，對(duì)另一條內(nèi)引物進(jìn)(BIP)行地高辛標(biāo)記。3、權(quán)利要求1所述的RNA病毒檢測(cè)的酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(E-LAMP)，其包被微孔板是指以5jig/ml的包被濃度在酶標(biāo)板或微孔反應(yīng)板上包被鏈酶親和素。4、權(quán)利要求1所述的RNA病毒檢測(cè)的酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(E-LAMP)的最終顏色反應(yīng)是通過預(yù)包被于固相載體上的鏈霉親和素與生物素之間的連接將反應(yīng)產(chǎn)物固化到載體上，再使用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗地高辛抗體使固相載體中的擴(kuò)增結(jié)果呈現(xiàn)出顏色反應(yīng)。5、權(quán)力要求1所述的KNA病毒檢測(cè)的酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(E-LAMP)的引物包括表2所列的基因序列及其每種序列的互補(bǔ)序列或變體。6、權(quán)力要求1所述的RNA病毒檢測(cè)的酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(E-LAMP)的檢測(cè)程序，包括合成引物探針、提取樣本的RNA、包被酶標(biāo)板、酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(E-LAMP)反應(yīng)、顯色、酶標(biāo)儀讀值。7、權(quán)力要求1所述的RNA病毒檢測(cè)的酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(E-LAMP)的反應(yīng)體系如下F3與B3，5pmol;BIP與FIP,40pmol;Loop-l與Loop-2，20pmol;其它反應(yīng)組分終濃度為l.OmMdNTP,lmMbetaine，6mMMgS04，2.5y110XBst-DNAPolymeraseBuffer,8UBst-DNApolymerase,1UAMV反轉(zhuǎn)錄酶，5u1HCVRNA樣品，補(bǔ)水至25n1。8、權(quán)利要求1所述的RNA病毒檢測(cè)的酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(E-LAMP)的反應(yīng)溫度為63X:。9、權(quán)利要求1所述的RNA病毒檢測(cè)的酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(E-LAMP)的反應(yīng)時(shí)間為1.5h。10、權(quán)力要求1所述的RNA病毒檢測(cè)的酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(E-LAMP)包括如下病毒及其變異株丙型肝炎病毒(H印atitisCvirus,HCV)。11、權(quán)力要求l所述的RNA病毒檢測(cè)的酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(E-LAMP)應(yīng)用范圍包括HCV和其它RNA病毒。12、權(quán)力要求ll所述的本發(fā)明的應(yīng)用范圍包括人用，獸用及其它生物防御用。全文摘要本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及人類醫(yī)學(xué)及獸醫(yī)，包括RNA病毒在各種生物制品、獻(xiàn)血員、病人血液標(biāo)本等的檢測(cè)。具體是應(yīng)用酶聯(lián)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(E-LAMP)，通過計(jì)算機(jī)軟件分析HCVRNA病毒保守和病毒特異性基因序列，設(shè)計(jì)出六條引物完全與識(shí)別的靶序列中八個(gè)結(jié)合區(qū)匹配，只需一步就可完成在等溫環(huán)境中的循環(huán)置換擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)將普通的酶聯(lián)免疫技術(shù)與RT-LAMP有機(jī)結(jié)合，通過對(duì)不同引物進(jìn)行生物素標(biāo)記將RT-LAMP的中產(chǎn)物固相到包被有鏈酶親和素的微孔反應(yīng)板上，再通過HRP酶標(biāo)抗Digoxin抗體與標(biāo)記在另一條引物上的Digoxin特異性結(jié)合而最終呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。實(shí)現(xiàn)了在單管中完成從擴(kuò)增到結(jié)果呈現(xiàn)的全部檢測(cè)過程。與傳統(tǒng)的RT-PCR方法比較，它具有更安全、特異、靈敏、便捷的優(yōu)勢(shì)。文檔編號(hào)G01N21/78GK101178362SQ20061013834公開日2008年5月14日申請(qǐng)日期2006年11月8日優(yōu)先權(quán)日2006年11月8日發(fā)明者侯云德,孫梅生,李啟明,馬學(xué)軍,高寒春申請(qǐng)人:北京金迪克生物技術(shù)研究所