專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)乙型肝炎病毒е抗原的試劑盒及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原的試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，肝病已經(jīng)越來(lái)越成為威脅人類(lèi)健康的主要疾病之一，其中病毒性肝炎中尤以乙型肝炎對(duì)人類(lèi)影響最大。乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個(gè)嚴(yán)重的全球性公共健康問(wèn)題，成為了當(dāng)前的一種世界性疾病。目前全世界HBV持續(xù)感染者達(dá)3.5億，其中75％在亞洲和西太平洋地區(qū)。我國(guó)是乙型肝炎的高流行區(qū)，HBV感染者達(dá)1.2億，平均年發(fā)病約140萬(wàn)左右，居法定傳染病第三位。隨著我國(guó)對(duì)乙型肝炎的深入了解，自我保健意識(shí)的逐步加強(qiáng)，對(duì)乙肝的預(yù)防與檢測(cè)成為了醫(yī)療界的重要課題。
由于乙肝影響范圍的廣泛性、危害的嚴(yán)重性，乙型肝炎診斷試劑作為專(zhuān)用于乙肝患者各種生理指標(biāo)的檢測(cè)、乙肝的診斷和治療過(guò)程監(jiān)測(cè)的生物學(xué)和化學(xué)試劑，具有廣泛的應(yīng)用范圍和社會(huì)需求。無(wú)論是新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)還是已有產(chǎn)品的市場(chǎng)推廣，均具有巨大潛力。
乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)是乙型肝炎病毒相關(guān)的一個(gè)分泌型的抗原，在前C區(qū)編碼，和核心抗原(C抗原)有部分同源性，但是由于在N端有了一個(gè)信號(hào)肽，所以是一個(gè)分泌型的抗原。HBeAg與HBV DNA、DNAP和前-S高度相關(guān)，共同代表病毒復(fù)制(Matsuo M.，Clinical Evaluation or HBeAg/Anti-Hbesystem in HBeAg Positive Hapatitis，Acta Hepatol Spn.，1985，26(7)819)。目前在乙型肝炎病毒的血清標(biāo)志物中HBeAg是應(yīng)用最為廣泛、最為可靠的評(píng)估乙型肝炎病毒(HBV)復(fù)制與傳染性的指標(biāo)之一。HBeAg陽(yáng)性有助于判斷急性肝炎的預(yù)后、代表血液傳染性強(qiáng)，亦可作為抗病毒藥物療效的考核指標(biāo)之一(彭文偉主編，《病毒性肝炎研究》，廣東科技出版社，1998年版，19-20；倪語(yǔ)星、洪秀華、樓昌斌主編，《現(xiàn)代病原學(xué)檢驗(yàn)與臨床實(shí)踐》，上海上海科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1999年146)。目前，在乙型肝炎的兩對(duì)半診斷中，HBeAg診斷也是其中很重要的一部分，因此HBeAg的抗體的研制具有重要的臨床使用價(jià)值。
目前，HBeAg的檢測(cè)方法有放射免疫檢測(cè)法(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法(ELISA)等。由于RIA法所需設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、價(jià)格高、易污染等缺點(diǎn)而使其使用受到很大限制，這一限制為ELISA法的使用提供了廣闊的市場(chǎng)。Imai M等人利用單克隆抗體技術(shù)制備出單克隆抗-HBeAg(a，b)兩株雜交瘤細(xì)胞后，使檢測(cè)HBeAg的方法在特異性和敏感性方面達(dá)到了一個(gè)新水平(Imai M，免疫學(xué)雜志(J.Immunol)，1982，12869)。由于單克隆抗一HBeAg雜交瘤細(xì)胞株難以獲得，也由于其分泌的抗-HBeAg單克隆抗體不配對(duì)而無(wú)法用于ELISA檢測(cè)，因此，在檢測(cè)HBeAg時(shí)，往往采用包被單抗、酶標(biāo)多抗，這會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性率高、敏感性低等技術(shù)缺陷，因此采用雙抗體夾心-ELISA法檢測(cè)HBeAg是必然趨勢(shì)。但是雙抗體夾心ELISA法需要兩個(gè)識(shí)別HBeAg不同表位的單克隆抗體，而利用傳統(tǒng)的方法制備抗-HBeAg單克隆抗體時(shí)往往只能得到識(shí)別HBeAg一個(gè)優(yōu)勢(shì)表位(命名為b表位)的抗體，這給夾心法ELISA檢測(cè)HBeAg的臨床應(yīng)用造成了很大限制。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺乏識(shí)別HBeAg不同表位的單克隆抗體這樣的技術(shù)缺陷，發(fā)明人進(jìn)行了廣泛而詳細(xì)的研究工作，包括對(duì)傳統(tǒng)的單克隆抗體技術(shù)的改進(jìn)、制備和篩選識(shí)別HBeAg不同表位的單克隆雜交瘤細(xì)胞、抗-HBeAg單克隆抗體的制備及其在檢測(cè)HBeAg中的應(yīng)用等。
基于上述研究，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供包括識(shí)別HBeAg不同表位的抗-HBeAg單克隆抗體的試劑盒。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供包括識(shí)別HBeAg不同表位的抗-HBeAg單克隆抗體的試劑盒在檢測(cè)HBeAg中的用途。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的為了在獲得識(shí)別優(yōu)勢(shì)表位抗體的同時(shí)能夠獲得不同于優(yōu)勢(shì)表位抗體的抗體，人為改變機(jī)體對(duì)抗原不同表位反應(yīng)性的相對(duì)強(qiáng)弱。在免疫前先靜脈注射識(shí)別HBeAg優(yōu)勢(shì)表位(b表位)的單抗。另外還可以在每次免疫前將抗原HBeAg和b表位的單克隆抗體反應(yīng)，然后再進(jìn)行免疫。這樣增加了獲得b表位之外的其他表位的抗體的幾率。經(jīng)分離脾臟B淋巴細(xì)胞、與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，然后篩選雜交瘤細(xì)胞并進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞克隆化最終獲得產(chǎn)生抗-HBeAg單克隆抗體的細(xì)胞株。通過(guò)體外培養(yǎng)或體內(nèi)腹水法擴(kuò)增上述細(xì)胞株，然后從細(xì)胞培養(yǎng)液或組織液體(如腹水)中分離抗-HBeAg單克隆抗體。獲得的抗體識(shí)別HBeAg不同的表位，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記其中的一個(gè)抗體，可用于雙抗體夾心法ELISA檢測(cè)HBeAg。進(jìn)一步發(fā)明人制備了包含識(shí)別不同表位的雙抗體檢測(cè)HBeAg的試劑盒。
本發(fā)明理論根據(jù)是免疫學(xué)的兩個(gè)基本原理第一，用識(shí)別一個(gè)表位的抗體可以對(duì)這個(gè)表位進(jìn)行封閉；第二，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生抗體具有一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，即當(dāng)機(jī)體內(nèi)已經(jīng)有大量的識(shí)別一個(gè)表位的抗體存在時(shí)，再注射抗原，機(jī)體對(duì)這個(gè)表位的反應(yīng)性會(huì)被負(fù)反饋調(diào)節(jié)，從而抑制了這個(gè)表位的抗體的產(chǎn)生水平，而對(duì)其他表位的反應(yīng)水平相對(duì)提高。
在本發(fā)明中，發(fā)明人用HBeAg免疫動(dòng)物，第一次免疫前先靜脈注射大量識(shí)別HBeAg的b表位的抗體，第一次免疫用福氏完全佐劑與HBeAg混合后乳化按照本領(lǐng)域公知的方法免疫動(dòng)物，第二次、第三次免疫用福氏不完全佐劑與HBeAg混合后乳化免疫動(dòng)物，第三次免疫后再用HBeAg回憶刺激動(dòng)物，取血清檢測(cè)抗體效價(jià)。優(yōu)選地在每次免疫前將HBeAg和優(yōu)勢(shì)表位(b表位)的抗-HBeAg單抗預(yù)先反應(yīng)后再免疫動(dòng)物。免疫動(dòng)物的抗原或者是商品化的乙型肝炎病毒e蛋白(HBeAg)或者用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的基因工程技術(shù)制備的HBeAg(HBeAg的氨基酸序列是公知的，Sequence ID No.1)。免疫動(dòng)物可以是本領(lǐng)域常用的動(dòng)物如家兔、小鼠等，優(yōu)選地使用BALB/C小鼠。免疫方法、免疫劑量、免疫間隔時(shí)間等因使用不同的動(dòng)物會(huì)有所不同，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)公知的技術(shù)(如根據(jù)金伯泉主編，《細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，西安，第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2002年)方便地實(shí)施之。血清抗體效價(jià)用雙向瓊脂擴(kuò)散法或間接ELISA法檢測(cè)。
免疫小鼠前先注射0.1mg～5.0mg識(shí)別HBeAg優(yōu)勢(shì)表位的抗體、優(yōu)選地注射0.1～2.0mg識(shí)別HBeAg優(yōu)勢(shì)表位的抗體。每次免疫前使0.05mg～0.2mg HBeAg和0.1～1.0mg識(shí)別HBeAg優(yōu)勢(shì)表位的抗體混合乳化后注射免疫小鼠。
優(yōu)選地免疫小鼠前先注射0.5mg～1.0mg識(shí)別HBeAg優(yōu)勢(shì)表位的抗體，然后每次免疫前使0.1mg～0.2mg HBeAg和0.5～1.0mg識(shí)別HBeAg優(yōu)勢(shì)表位的抗體混合乳化后注射免疫小鼠。
從回憶刺激后的動(dòng)物脾臟中分離脾臟B淋巴細(xì)胞，在常規(guī)條件下用聚乙二醇(PEG)作融合劑將脾臟B淋巴細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，用含有1×HAT(次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T))和10％小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行選擇培養(yǎng)。50×HAT有商品化產(chǎn)品，其含有5mM的H、0.02mM的A和0.8mM的T。按照本領(lǐng)域常規(guī)的方法進(jìn)行細(xì)胞融合，培養(yǎng)液是RPMI1640。融合雜交瘤細(xì)胞的克隆化采用本領(lǐng)域常規(guī)的有限稀釋法，最后獲得了兩株產(chǎn)生抗-HBeAg單克隆抗體的細(xì)胞株S-29-3和S-72-3，其中細(xì)胞株S-29-3已經(jīng)于2005年9月23日提交位于中國(guó)武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC-C200516；細(xì)胞株S-72-3已經(jīng)于2005年9月23日提交位于中國(guó)武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC-C200517。
將上述雜交瘤細(xì)胞株按照常規(guī)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增或者注射小鼠腹腔制備腹水。用間接ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液或腹水中的抗體效價(jià)，用本領(lǐng)域公知的方法從培養(yǎng)液或者腹水中回收抗-HBeAg單克隆抗體，即獲得抗-HBeAg單克隆抗體，為說(shuō)明方便分別表示為抗體S-29-3和抗體S-72-3。
以HBeAg和其他蛋白質(zhì)抗原如牛血清白蛋白作為抗原、用間接ELISA法進(jìn)行抗體特異性檢測(cè)。用本領(lǐng)域公知的方法如酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體鑒定抗體的Ig類(lèi)及用標(biāo)準(zhǔn)的抗亞類(lèi)血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)散或夾心ELISA法鑒定上述抗-HBeAg單克隆抗體的亞類(lèi)，上述抗-HBeAg單克隆抗體中抗體S-29-3為IgG1，輕鏈為κ鏈；抗體S-72-3為IgG2b亞型，輕鏈為κ鏈。
用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)和/或生物傳感器(Biosensor)檢定上述抗-HBeAg單克隆抗體的識(shí)別表位。人工合成了一段18個(gè)氨基酸殘基的肽(LN18)(Sequence IDNo.2)，它是HBeAg的119-136的氨基酸序列，間接ELISA檢測(cè)表明抗體S-72-3與肽LN18的結(jié)合性很弱而商品化的識(shí)別HBeAg優(yōu)勢(shì)表位(b表位)的單克隆抗體(ewb)與LN18特異性結(jié)合，表明本發(fā)明的抗體S-72-3所結(jié)合的表位是在HBeAg的119-136之外的氨基酸序列，與ewb的表位不同。進(jìn)一步用基因工程的手段表達(dá)了另一個(gè)多肽Ec(Sequence ID No.3)，系去掉了HBeAg抗原C端31個(gè)氨基酸殘基的多肽，亦即包含HBeAg1-118的肽段。本發(fā)明的抗體S-72-3和Ec高度結(jié)合而ewb與Ec幾乎不結(jié)合，因而本發(fā)明的抗體S-72-3識(shí)別的HbeAg的表位位于HBeAg的1-118序列。
用間接ELISA法檢測(cè)抗體S-29-3與肽段LN18及無(wú)關(guān)肽的結(jié)合性，抗體S-29-3與LN18較高結(jié)合，表明抗體S-29-3識(shí)別的表位可能就是LN18所代表的抗原表位，即HBeAg119-136氨基酸序列。該結(jié)果顯示本發(fā)明的免疫方法同樣獲得了識(shí)別與HBeAg的b表位相近似的表位的抗體。
因而，本發(fā)明公開(kāi)了產(chǎn)生抗-HBeAg單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保藏號(hào)分別為CCTCC-C200516和CCTCC-C200517。
本發(fā)明還公開(kāi)了抗-HBeAg單克隆抗體，分別由細(xì)胞株CCTCC-C200516和CCTCC-C200517產(chǎn)生，其中抗體S-72-3識(shí)別HBeAg的優(yōu)勢(shì)表位(b表位)(119-136)之外的表位，其識(shí)別表位位于HBeAg的1-118氨基酸序列；抗體S-29-3識(shí)別HBeAg的119-136表位，其為IgG1型。進(jìn)一步的研究顯示抗體S-72-3和S-29-3均識(shí)別構(gòu)型表位。因而本發(fā)明的抗體可以用于雙抗體夾心法ELISA檢測(cè)HBeAg。
制備上述抗-HBeAg單克隆抗體的方法，包括如下步驟(a)擴(kuò)增產(chǎn)生上述抗-HBeAg單克隆抗體的細(xì)胞株；(b)從擴(kuò)增產(chǎn)物中回收抗-HBeAg單克隆抗體。
擴(kuò)增細(xì)胞株的方法在本領(lǐng)域是公知的，如用體外動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)法，例如滾瓶、方瓶或者動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵罐培養(yǎng)擴(kuò)增雜交瘤細(xì)胞；或者用體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞制備腹水或血清法，例如接種雜交瘤細(xì)胞實(shí)體瘤法制備抗體血清或腹腔接種雜交瘤細(xì)胞制備腹水法。
從擴(kuò)增產(chǎn)物中回收抗-HBeAg單克隆抗的方法在本領(lǐng)域也是常用的，如硫酸銨沉淀法、陰離子交換層析法或者葡萄球菌A蛋白親和層析法。
本發(fā)明的抗體S-72-3與商品化的識(shí)別HBeAg優(yōu)勢(shì)表位的單克隆抗體(ewb)識(shí)別HBeAg的不同抗原表位，可以配合使用用于夾心法ELISA檢測(cè)HBeAg。用辣根過(guò)氧化物酶或異硫氰酸熒光素或生物素標(biāo)記本發(fā)明的抗-HBeAg單克隆抗體，與ewb配合用于檢測(cè)HBeAg。預(yù)先將ewb固定在固相載體上，然后加入待檢樣品，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，抗體-抗原結(jié)合后加入標(biāo)記的本發(fā)明的抗-HBeAg單克隆抗體，反應(yīng)、加入酶反應(yīng)底物顯色或發(fā)光檢測(cè)樣品中的HBeAg。當(dāng)然，標(biāo)記ewb而預(yù)先固定本發(fā)明的抗體也可以達(dá)到檢測(cè)目的。該方法具有很高的特異性和較高的準(zhǔn)確率。
本發(fā)明的兩個(gè)抗-HBeAg單克隆抗體具有不同的抗原識(shí)別表位，因而可以配合用于夾心法ELISA檢測(cè)HBeAg。用辣根過(guò)氧化物酶或異硫氰酸熒光素或生物素標(biāo)記本發(fā)明的抗-HBeAg單克隆抗體S-29-3，與抗體S-72-3配合用于檢測(cè)血清中的HBeAg。預(yù)先將S-72-3固定在固相載體上，然后加入待檢樣品，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，抗體-抗原結(jié)合后加入標(biāo)記的本發(fā)明的抗-HBeAg單克隆抗體S-29-3，反應(yīng)、加入酶反應(yīng)底物顯色或發(fā)光法檢測(cè)樣品中的HBeAg。或者反之標(biāo)記抗體S-72-3而預(yù)先固定抗體S-29-3也可以達(dá)到檢測(cè)目的。
因而，本發(fā)明提供了雙抗體夾心法ELISA檢測(cè)HBeAg的試劑盒，包括包裝于容器中的識(shí)別HBeAg不同表位的單克隆抗體，其中任選地一種抗體是用辣根過(guò)氧化物酶或異硫氰酸熒光素或生物素標(biāo)記的。
優(yōu)選地，雙抗體夾心法ELISA檢測(cè)HBeAg的試劑盒，包括包裝于容器中的識(shí)別HBeAg不同表位的單克隆抗體S-29-3和S-72-3，其中任選地一種抗體是用辣根過(guò)氧化物酶或異硫氰酸熒光素或生物素標(biāo)記的。優(yōu)選地，標(biāo)記抗體S-29-3。更優(yōu)選地，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體S-29-3，抗體復(fù)合物為S-29-3-HRP。
雙抗體夾心法ELISA檢測(cè)HBeAg的試劑盒，包括包裝于容器中的識(shí)別HBeAg不同表位的單克隆抗體ewb和S-72-3，其中任選的一種抗體是用辣根過(guò)氧化物酶或異硫氰酸熒光素或生物素標(biāo)記的。優(yōu)選地，標(biāo)記抗體S-72-3。更優(yōu)選地，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體S-72-3，抗體復(fù)合物為S-72-3-HRP。
抗體標(biāo)記的方法在本領(lǐng)域是公知的，例如用簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法或者戊二醛二步法進(jìn)行HRP標(biāo)記抗體。異硫氰酸熒光素或生物素標(biāo)記抗體的方法如《細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(金伯泉主編，西安第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2002年版)所記載。
另外本發(fā)明的檢測(cè)HBeAg的試劑盒還包括HBeAg標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照正常血清。優(yōu)選地該試劑盒還包括固相載體，如96孔酶標(biāo)板或酶標(biāo)排條等。
更優(yōu)選地，包被抗體可以預(yù)先固定在固相載體上。因而更加方便臨床檢測(cè)HBeAg。
檢測(cè)HBeAg的試劑盒的制備方法，包括如下步驟(a)體外培養(yǎng)相應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞或體內(nèi)接種相應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞制備腹水或血清的方法擴(kuò)增雜交瘤細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)液或動(dòng)物組織液體腹水或血清中回收單克隆抗體；(c)標(biāo)記所述的抗體；(d)將抗體和標(biāo)記的抗體分裝于容器中，保存。
所述的“將抗體分裝于容器中”應(yīng)作最廣義的理解，尤其是用于包被的抗體，其“分裝于容器中”包括以液體的形式分裝于包裝容器中，也包括和固相載體相結(jié)合預(yù)先制成固相包被抗體，所說(shuō)的固相載體如本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的96孔酶標(biāo)板等。
本發(fā)明的試劑盒在臨床上用于檢測(cè)乙型肝炎病毒，特異性高，靈敏度可達(dá)ng級(jí)，HBeAg的濃度在3ng/mL-95ng/mL范圍內(nèi)具有很好的線性關(guān)系。
應(yīng)當(dāng)明確，在本發(fā)明中單克隆抗體和單抗系同義語(yǔ)，可以互換使用。本發(fā)明的抗-HBeAg單克隆抗體有時(shí)也以抗體S-72-3和抗體S-29-3表示，但抗體S-72-3指稱(chēng)雜交瘤細(xì)胞株S-72-3(保藏號(hào)CCTCC-C200517)產(chǎn)生的抗-HBeAg單克隆抗體；抗體S-29-3指稱(chēng)雜交瘤細(xì)胞株S-29-3(保藏號(hào)CCTCC-C200516)產(chǎn)生的抗-HBeAg單克隆抗體，因而抗體S-72-3和抗體S-29-3不能與抗-HBeAg單克隆抗體互換使用。


圖1是BALB/C小鼠免疫后血清抗體效價(jià)的測(cè)定，方法為間接ELISA法，◆為HBeAg免疫的小鼠血清、■為正常小鼠血清。
圖2是間接ELISA法檢測(cè)單克隆抗體腹水效價(jià)，◆系雜交瘤細(xì)胞株S-72-3腹水，■系雜交瘤細(xì)胞株S-29-3腹水。
圖3是間接ELISA法檢測(cè)單克隆抗體腹水和HBeAg結(jié)合的特異性，□為重組HBeAg抗原(5μg/mL)，■為對(duì)照蛋白(牛血清白蛋白，BSA，10μg/mL)。
圖4是間接ELISA法檢測(cè)抗體S-29-3與肽LN18的結(jié)合，□代表LN18和抗體S-29-3結(jié)合，■代表無(wú)關(guān)肽和抗體S-29-3。
圖5是間接ELISA法檢測(cè)抗體S-72-3與肽LN18的結(jié)合，LN18+S-72代表LN18和抗體S-72-3，LN18+ewb代表肽LN18和商品化抗體ewb結(jié)合。
圖6是間接ELISA法檢測(cè)抗體S-72-3和ewb與Ec的結(jié)合，其中S-72表示抗體S-72-3與Ec結(jié)合，ewb表示抗體ewb與Ec結(jié)合。
圖7夾心法ELISA鑒定抗體識(shí)別表位，其中□為重組HBeAg抗原(5μg/mL)，■為對(duì)照蛋白(牛血清白蛋白，BSA，10μg/mL)，左側(cè)兩條框?yàn)槊笜?biāo)單抗S-72-3，右側(cè)兩條框?yàn)槊笜?biāo)單抗S-29-3。
圖8是Biacore檢測(cè)抗體S-29-3的親和常數(shù)。
圖9是Biacore檢測(cè)抗體S-72-3的親和常數(shù)。
圖10是夾心ELISA檢測(cè)HBeAg，其中◆為2.5μg/mL、■為1.25μg/mL、▲為0.625μg/mL、×為0.3125μg/mL，包被抗體均為抗體S-72-3。
圖11是夾心ELISA檢測(cè)HBeAg。
以下結(jié)合具體的實(shí)施方式詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。除有特殊說(shuō)明外，具體操作均按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)(金冬雁、黎孟楓等譯，J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，北京科學(xué)出版社，1998年)和《細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(金伯泉主編，西安第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2002年版)進(jìn)行。在詳細(xì)描述了這些具體實(shí)施方式
后，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)充分知曉如何設(shè)計(jì)其他可靠方法，從而通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的成果來(lái)獲得同樣的信息。因此無(wú)論這些具體實(shí)施方法的描述如何詳細(xì)具體，均不意味著對(duì)發(fā)明總體范圍的任何限制，本發(fā)明的范圍僅以權(quán)利要求的范圍為準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 抗-HBeAg雜交瘤細(xì)胞株的建立及其單克隆抗體的制備(一)免疫動(dòng)物用基因重組的HBeAg蛋白三次免疫BALB/C小鼠。第一次免疫的前一天，先靜脈注射0.5mg的識(shí)別HBeAg的b表位的抗體ewb(上海科華有限公司產(chǎn)品)。第一次免疫用福氏完全佐劑與HBeAg蛋白等量混勻后乳化，靜脈注射，0.1mg/只，注射體積0.2～0.3mL。第二次、第三次免疫用福氏不完全佐劑與HBeAg蛋白等量混勻后乳化，免疫方法與用量同第一次免疫。每次免疫小鼠前均使0.1mgHBeAg和0.5mg抗體ewb混合、與等量佐劑混勻乳化。每次免疫間隔一個(gè)月。第三次免疫一個(gè)月后，腹腔注射0.1mg的HBeAg蛋白回憶刺激BALB/C小鼠。間接ELISA方法檢測(cè)免疫后的血清效價(jià)，圖1。從圖1中可以看出，經(jīng)過(guò)三次免疫之后，對(duì)重組HBeAg抗原的間接ELISA法檢測(cè)抗血清的效價(jià)64000，而正常小鼠血清對(duì)重組HBeAg抗原沒(méi)有反應(yīng)。間接ELISA法檢測(cè)中包被的HBeAg抗原濃度是1.5μg/ml。
福氏不完全佐劑和福氏完全佐劑均使用商品化產(chǎn)品。
(二)雜交瘤細(xì)胞株的制備和篩選取回憶刺激3天后的小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法用50％PEG-4000進(jìn)行融合。用含1×HAT和10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)。融合后三天開(kāi)始出現(xiàn)融合細(xì)胞，512個(gè)孔中335個(gè)為融合孔，融合率為65.4％。用ELISA法檢測(cè)抗-HBeAg單克隆抗體，檢測(cè)281個(gè)孔，其中陽(yáng)性孔為12個(gè)，陽(yáng)性率為4.2％。經(jīng)過(guò)三次有限稀釋克隆化，最后獲得兩株穩(wěn)定分泌抗-HBeAg單克隆抗體的細(xì)胞株，標(biāo)記為S-29-3和S-72-3。
(三)腹水的制備及其效價(jià)和抗體亞型的鑒定將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株S-29-3和S-72-3分別以1×106個(gè)/只的量腹腔注射預(yù)先致敏8-10周齡的BABL/C雌性小鼠，7-10天后，采集小鼠腹水，用間接ELISA方法檢測(cè)單抗的效價(jià)，包被的HBeAg抗原濃度是1.5μg/mL。
結(jié)果如圖2，單克隆抗體S-29-3的效價(jià)為1.28×106，S-72-3的效價(jià)為2.56×106。進(jìn)而用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類(lèi)血清系統(tǒng)作雙夾心ELISA確定細(xì)胞株S-29-3分泌的抗體亞型為IgG1，輕鏈為κ鏈，S-72-3分泌的抗體亞型為IgG2b，輕鏈為κ鏈。
實(shí)施例2 抗-HBeAg單克隆抗體S-29-3的制備將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株S-29-3以1×106個(gè)/只的量腹腔注射預(yù)先致敏8-10周齡的BABL/C雌性小鼠，7-10天后，采集小鼠腹水，用間接ELISA方法檢測(cè)S-29-3單抗的效價(jià)。腹水4℃、12000rpm離心15min，取1份(體積)腹水與2份(體積)0.06MpH4.8的醋酸緩沖液混合，室溫?cái)嚢柘轮鸬渭尤胝了?3μL/mL腹水，室溫混合30min。4℃靜置2小時(shí)以上使其充分沉淀，然后4℃、12000rpm離心30min，棄去沉淀，上清經(jīng)砂芯漏斗過(guò)濾后加入1/10體積的0.1MpH7.4的PBS，用2M NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4。冰浴下于30min內(nèi)加入0.277g/mL的硫酸銨使飽和度達(dá)到45％，4℃靜置1小時(shí)以上，然后4℃、10000rpm離心30min，棄去上清。沉淀用含有137mM NaCl、2.6mM KCl、0.2mM EDTA的pH7.4PBS溶解，并于50-100倍體積的上述PBS中4℃透析過(guò)夜。然后用Q Sepharose Fast Flow交換柱層析技術(shù)進(jìn)一步純化。平衡緩沖液為20mM pH7.5的Tris-HCl緩沖液、洗脫緩沖液為含1.0M NaCl的20mM pH7.5的Tris-HCl緩沖液，層析柱XK 16/20、Pharmacia AKTA FPLC層析系統(tǒng)。按照廠商提供的說(shuō)明書(shū)裝柱，平衡緩沖液平衡層析柱、流速5mL/min。上樣完畢后用3倍柱體積的平衡緩沖液洗去未結(jié)合蛋白，以NaCl遞增的線性梯度洗脫結(jié)合的抗體蛋白，線性梯度為0-1.0MNaCl/10倍柱體。檢測(cè)A280，收集洗脫的抗體蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)純度，用本領(lǐng)域常用的紫外分光光度法測(cè)定抗體含量，用間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)。
實(shí)施例3 抗-HBeAg單克隆抗體S-72-3的制備將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株S-72-3以1×106個(gè)/只的量腹腔注射預(yù)先致敏8-10周齡的BABL/C雌性小鼠，7-10天后，采集小鼠腹水，其余步驟同實(shí)施例2制得抗體S-72-3。
實(shí)施例4 抗-HBeAg單克隆抗體的特異性用間接ELISA方法檢測(cè)抗-HBeAg單克隆抗體的特異性。包被的抗原是重組HBeAg抗原(5μg/ml)，對(duì)照為牛血清白蛋白(10μg/ml)。實(shí)施例2和3的抗體S-29-3及S-72-3的濃度是5μg/ml。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。
從圖3可以看出抗體S-29-3和S-72-3與重組蛋白HBeAg都有著很強(qiáng)的反應(yīng)性，而與對(duì)照蛋白的反應(yīng)性很低。表明抗體S-29-3和S-72-3具有很好的抗原特異性。
實(shí)施例5 抗體S-29-3的結(jié)合表位的鑒定及性質(zhì)分析為了研究所制備的單克隆抗體所識(shí)別的表位，設(shè)計(jì)合成了多肽，命名為L(zhǎng)N18(見(jiàn)序列表Sequence ID No.2)。LN18肽的序列是根據(jù)文獻(xiàn)資料和計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)的，它所代表的是HBeAg抗原119-136的氨基酸序列所組成的一個(gè)表位。間接ELISA法檢測(cè)抗體S-29-3與LN18的結(jié)合性，對(duì)照為一段無(wú)關(guān)的肽段，結(jié)果如圖4。抗體S-29-3和LN18具有較好的結(jié)合性，表明抗體S-29-3所結(jié)合的表位很有可能是LN18所在的HBeAg的這段序列上。
為了進(jìn)一步分析抗體S-29-3的結(jié)合表位，發(fā)明人對(duì)它們所結(jié)合的抗原表位進(jìn)行了初步的定性分析，確定它們所識(shí)別的是線性表位還是構(gòu)型表位。如果識(shí)別的是構(gòu)型表位，那么在抗原變性之后，反應(yīng)活性將大大下降，一般來(lái)說(shuō)＞50％；如果識(shí)別的是線性表位，那么活性下降幅度會(huì)比較小，一般來(lái)說(shuō)＜50％。
首先將重組的HBeAg變性，用間接ELISA法檢測(cè)抗體S-29-3和ewb對(duì)HBeAg變性前后的結(jié)合性，結(jié)果如表1。
表1單克隆抗體對(duì)抗原變性前后反應(yīng)結(jié)果

從表中結(jié)果看出，抗體S-29-3對(duì)變性前后的HBeAg的反應(yīng)活性分別下降了80％，這表明抗體S-29-3所識(shí)別的表位可能是構(gòu)型表位；而ewb只下降了43％，這表明它所識(shí)別的表位可能是線性表位。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)抗體ewb對(duì)LN18具有一定的結(jié)合性，表明抗體S-29-3識(shí)別的表位為L(zhǎng)N18代表的序列的構(gòu)型表位。
實(shí)施例6 抗體S-72-3的結(jié)合表位的鑒定及性質(zhì)分析間接ELISA法檢測(cè)抗體S-72-3和ewb與LN18的結(jié)合性，結(jié)果如圖5。ewb和LN18具有較好的結(jié)合性，而抗體S-72-3和LN18的結(jié)合是幾乎沒(méi)有的，表明，ewb所結(jié)合的表位很有可能是LN18所在的HBeAg的這段序列上，而抗體S-72-3結(jié)合的表位是119-136之外的區(qū)域。同時(shí)結(jié)果也可以很清晰的說(shuō)明這兩個(gè)抗體所結(jié)合的位置是不同的，位于HBeAg的不同區(qū)域上。
為了進(jìn)一步研究抗體S-72-3所結(jié)合的具體位置，表達(dá)了一個(gè)新的抗原，一個(gè)HBeAg的肽段，標(biāo)記為Ec(Sequence ID No.3)，這個(gè)抗原和HBeAg最大的不同是把HBeAg C端的氨基酸殘基去掉，去掉的這段區(qū)域包含了LN18所在的序列，也就是Ec系HBeAg1-118氨基酸的序列。間接ELISA方法檢測(cè)抗體S-72-3和ewb與Ec的結(jié)合，抗體濃度均為5μg/mL，結(jié)果見(jiàn)圖6?？梢钥闯?，S-72-3與Ec有較好的結(jié)合，而ewb與Ec的結(jié)合是幾乎沒(méi)有的。前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)表明ewb的結(jié)合表位很可能是LN18所在的序列，所以去掉了LN18所在的序列之后的蛋白Ec與ewb的不反應(yīng)也進(jìn)一步驗(yàn)證了前面實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，而S-72-3與Ec的反應(yīng)表明S-72-3所結(jié)合的表位是Ec所在的區(qū)域，不同于ewb。
進(jìn)一步分析抗體結(jié)合表位首先將重組的HBeAg變性，用間接ELISA法檢測(cè)抗體S-72-3和ewb對(duì)HBeAg變性前后的結(jié)合性，結(jié)果如表2。
從表2中的結(jié)果看出，抗體S-72-3對(duì)變性前后的HBeAg的反應(yīng)活性分別下降了89％，這表明抗體S-72-3所識(shí)別的表位可能是構(gòu)型表位；而ewb只下降了43％，這表明它所識(shí)別的表位可能是線性表位。結(jié)合前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以初步判斷抗體S-72-3所識(shí)別的是HBeAg的1-118氨基酸所組成的一個(gè)構(gòu)型表位，這個(gè)表位可能跨越了整個(gè)的Ec。
表2單克隆抗體對(duì)抗原變性前后反應(yīng)結(jié)果

實(shí)施例7 夾心法ELISA鑒定抗體識(shí)別表位用夾心ELISA法鑒定抗體的識(shí)別表位。將抗體ewb包被在酶標(biāo)板上，用過(guò)碘酸鈉法將實(shí)施例2和3的抗體用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記即S-29-3-HRP和S-72-3-HRP，檢測(cè)的抗原是重組HBeAg，對(duì)照為BSA。結(jié)果見(jiàn)圖7。結(jié)果表明，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體S-72-3可以和ewb進(jìn)行配對(duì)特異檢測(cè)重組E蛋白，進(jìn)一步表明它和ewb識(shí)別的抗原表位是不同的。而酶標(biāo)抗體S-29-3-HRP和ewb配合反應(yīng)性很低，表明S-29-3的識(shí)別表位與ewb可能相近似。
實(shí)施例8 單克隆抗體S-29-3親和常數(shù)的測(cè)定選擇目前廣泛采用的biacore技術(shù)測(cè)定親和常數(shù)。
系統(tǒng)信息BIAcore 3000(上海生命科學(xué)研究院藥物研究所)
CM5 sensorchipAmine coupling(Directly immobilization)系統(tǒng)緩沖液20mM HEPEs150mM NaCl5mM EDTA0.1％ P20實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。其中抗體濃度梯度如下4，2，1，0.5，0.25，0.125，0μM。根據(jù)二價(jià)結(jié)合模型，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)結(jié)果如下ka1＝1.24±0.187×104l/Ms kd1＝7.78±1.68×10-5l/ska2＝2.34±0.334×10-3l/Mskd2＝0.0836±0.001l/s親和常數(shù)K＝Ka/Kd＝1.59×109M其中Ka結(jié)合常數(shù)；Kd解離常數(shù)?？梢?jiàn)抗體S-29-3對(duì)HBeAg具有高度的親和力。
實(shí)施例9 單克隆抗體S-72-3親和常數(shù)的測(cè)定測(cè)定方法與參數(shù)條件同實(shí)施例7，結(jié)果見(jiàn)圖9。計(jì)算結(jié)果如下ka1＝1.14±0.129×103l/Ms kd1＝2.49±0.168×10-5l/ska2＝1.46±0.187×10-3l/Mskd2＝0.0651±0.002l/s親和常數(shù)K＝ka/kd＝4.57×1010M其中Ka結(jié)合常數(shù)；Kd解離常數(shù)?？梢?jiàn)抗體S-72-3對(duì)HBeAg具有高度的親和力。
實(shí)施例10 辣根過(guò)氧化物標(biāo)記抗體稱(chēng)取5mg辣根過(guò)氧化物酶(HRP)溶解于1mL蒸餾水中，加入0.2mL新鮮配制的0.1M過(guò)碘酸鈉溶液，室溫下避光攪拌20min。將上述溶液裝入透析袋中對(duì)1mM pH4.4的醋酸鈉緩沖液于4℃透析過(guò)夜。加入20μL0.2M、pH9.5的碳酸鹽緩沖液，使pH升高到9.0-9.5，立即加入10mg抗體S-29-3，室溫避光輕輕攪拌2h。加0.1mL新鮮配制的硼氫化鈉溶液(4mg/mL)，混勻放置4℃2小時(shí)，然后對(duì)0.15M、pH7.4PBS于4℃透析過(guò)夜。攪拌條件下逐滴加入等體積飽和硫酸銨溶液、4℃靜置1小時(shí)，然后3000rpm、4℃離心30min，棄去上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗2次，最后沉淀物溶于少量0.15M、pH7.4的PBS中。透析除去銨離子，10000rpm離心30min，上清即為酶標(biāo)抗體，分裝后冰凍保存。酶標(biāo)抗體的濃度測(cè)定采用紫外吸光光度法，按公式IgG(g/L)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62計(jì)算。65％的HRP和抗體結(jié)合、超過(guò)99％的抗體與HRP結(jié)合，酶HRP和抗體S-29-3的活性無(wú)損失。
用同樣的方法制備S-72-3-HRP。
實(shí)施例11 夾心法ELISA檢測(cè)HBeAg(1)用50mM、pH9.6碳酸鹽緩沖液將抗體S-72-3分別稀釋至2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL和0.3125μg/mL加至96孔板，100μL/孔，4℃包被過(guò)夜。
(2)用含1％BSA-PBS封閉，200μL/孔，37℃保溫2h。
(3)用0.1％Tween 20-PBS洗板3次。
(4)用0.1％BSA-0.1％Tween 20-PBS將HBeAg稀釋至1.5μg/mL、0.75μg/mL、0.375μg/mL、0.1875μg/mL、0.09375μg/mL、0.04685μg/mL、0.0234375μg/mL、0.01171875μg/mL、0.00585938μg/mL和0.00292969μg/mL，每一稀釋度加樣，100μL/孔，37℃保溫2hr。
(5)用0.1％Tween 20-PBS洗板3次。
(6)用0.1％BSA-0.1％Tween 20-PBS稀釋酶標(biāo)抗體S-29-3-HRP，100μL/孔，37℃保溫1.5hr。
(7)用0.1％Tween 20-PBS洗板3次，加入配好的ABTS顯色液，100μL/孔，37℃保溫30min。
(8)各反應(yīng)孔加50μL2MH2SO4終止反應(yīng)，ELISA酶標(biāo)儀讀取OD450nm。OD450nm對(duì)HBeAg作圖，結(jié)果見(jiàn)圖10。
當(dāng)包被抗體S-72-3濃度為2.5μg/mL時(shí)，對(duì)重組HBeAg有一個(gè)很好的反應(yīng)性，而且隨著抗原濃度的降低，相應(yīng)的OD450的值也隨之下降，說(shuō)明兩者之間有著很好的濃度依賴(lài)關(guān)系。
為了更清晰的表明這兩者之間的關(guān)系，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了進(jìn)一步的分析和處理，結(jié)果如圖11。從圖中可以看出，在一定的范圍內(nèi)，OD450和Log(E抗原濃度/ng/mL)之間有著很好的線性關(guān)系，即OD450＝0.49×Log(E抗原濃度/ng/mL)-0.0977，線性相關(guān)系數(shù)R2＝0.9688，這個(gè)范圍的重組E抗原(HBeAg)的濃度是3ng/ml-94ng/ml。兩個(gè)抗體組成的試劑盒檢測(cè)抗原的靈敏度可以到納克級(jí)水平。
實(shí)施例12 試劑盒的制備將實(shí)施例3所獲得的抗體S-72-3分裝于1.0mL的塑料離心管中，每管100μL。將實(shí)施例10獲得的S-29-3-HRP分裝于1.0mL的塑料離心管中，每管100μL。-20℃保存。
實(shí)施例13 試劑盒的制備將實(shí)施例2所獲得的抗體S-29-3分裝于1.0mL的塑料離心管中，每管100μL。將實(shí)施例10獲得的S-72-3-HRP分裝于1.0mL的塑料離心管中，每管100μL。-20℃保存。
實(shí)施例14 試劑盒的制備制備預(yù)先固定包被抗體的固相載體1、包被用單克隆抗體S-29-3作包被用抗體，用50mM、pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋至2.5μg/mL加至96孔板，100μL/孔，4℃包被過(guò)夜。
2、用蒸餾水洗3次蒸餾水加滿(mǎn)96孔板，靜置10-15S，棄去，甩干。
3、封閉1％BSA-PBS，200μL/孔，37℃，2小時(shí)。
4、洗滌用0.1％Tween 20-PBS洗板3次，甩干。
5、干燥保存存于加干燥劑的密封袋中，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 將實(shí)施例10獲得的標(biāo)記抗體S-72-3-HRP分裝于1.0mL的塑料離心管中，每管100μL。-20℃保存。
實(shí)施例15 用上述試劑盒檢測(cè)臨床血清HBeAg用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)采集臨床血清，肘靜脈取血，血液置于室溫下1h，凝固后，置4℃，過(guò)夜(切勿冰凍)析出血清，離心，4000rpm，10min。在無(wú)菌條件，吸出血清，分裝(0.05～0.2ml)，貯于低溫冰箱。使用時(shí)，血清及各種試劑要恢復(fù)室溫。乙型肝炎患者陽(yáng)性血清作為待檢樣品(5份)、同時(shí)采用臨床乙肝病毒陰性患者的血清作為陰性對(duì)照，以牛血清白蛋白作為空白對(duì)照、另外同時(shí)檢測(cè)重組HBeAg。用實(shí)施例14的試劑盒，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的雙抗體夾心ELISA法，以抗體S-29-3作包被抗體、以抗體S-72-3-HRP作檢測(cè)抗體。樣品是陽(yáng)性血清、陰性血清、空白對(duì)照和重組的HBeAg，加入實(shí)施例14的預(yù)先固定了包被抗體的96孔板中，具體操作參見(jiàn)實(shí)施例11，用ELISA酶標(biāo)儀讀取OD450nm。重復(fù)試驗(yàn)兩次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表3。
用本發(fā)明的兩株單克隆抗體，配對(duì)夾心檢測(cè)臨床血清，5份陽(yáng)性血清，4份檢測(cè)陽(yáng)性(A、B、D和H)，1份弱陽(yáng)性(C)，一份陰性血清檢測(cè)呈陰性，無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果。說(shuō)明本發(fā)明的HBeAg ELISA試劑盒可以檢測(cè)臨床血清。
表3 用實(shí)施例14的試劑盒檢測(cè)血清HBeAg

陽(yáng)性界值定義為陰性值×2.1。
序列表<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原的試劑盒及用途<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>-10<211>149<212>PRT<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<220>
<221>SIGNAL<222>(-10)..(-1)<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(149)<400>1Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile Asp Pro Tyr-10 -5 -1 5Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp10 15 20Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr25 30 35Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala40 45 50Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr55 60 65 70Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp Leu Val Val75 80 85Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp90 95 100Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr105 110 115Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro120 125 130Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val135 140 145<210>2<211>18<212>PRT<213>人工序列(Artificial)<400>2Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro1 5 10 15Pro Asn<210>3<211>118<212>PRT<213>人工序列(Artificial)<400>3Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr11權(quán)利要求
1.檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原的試劑盒，其特征在于包括包裝于容器中的識(shí)別乙型肝炎病毒e抗原不同表位的單克隆抗體，任選地其中一種抗體是用辣根過(guò)氧化物酶或異硫氰酸熒光素或生物素標(biāo)記的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原的試劑盒，其特征在于包括包裝于容器中的抗體ewb和保藏號(hào)CCTCC-C200517雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體，任選地其中一種抗體是用辣根過(guò)氧化物酶或異硫氰酸熒光素或生物素標(biāo)記的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原的試劑盒，其特征在于保藏號(hào)CCTCC-C200517雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體是用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原的試劑盒，其特征在于包括包裝于容器中的保藏號(hào)CCTCC-C200516和保藏號(hào)CCTCC-C200517雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體，任選地其中一種抗體是用辣根過(guò)氧化物酶或異硫氰酸熒光素或生物素標(biāo)記的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原的試劑盒，其特征在于保藏號(hào)CCTCC-C200516雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體是用辣根過(guò)氧化物酶或異硫氰酸熒光素或生物素標(biāo)記的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原的試劑盒，其特征在于保藏號(hào)CCTCC-C200516雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體是用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原的試劑盒，其特征在于保藏號(hào)CCTCC-C200517雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體是用辣根過(guò)氧化物酶或異硫氰酸熒光素或生物素標(biāo)記的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原的試劑盒，其特征在于保藏號(hào)CCTCC-C200517雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體是用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一的檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原的試劑盒在檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一的檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原的試劑盒的制備方法，包括如下步驟(a)體外培養(yǎng)相應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株或體內(nèi)接種相應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株制備腹水或血清的方法擴(kuò)增雜交瘤細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)液或動(dòng)物組織液體腹水或血清中回收單克隆抗體；(c)標(biāo)記所述的抗體；和(d)將抗體和標(biāo)記的抗體分裝于容器中，保存。
全文摘要
本發(fā)明檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原的試劑盒及用途涉及病毒免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原的試劑盒及用途以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的包被單抗、酶標(biāo)多抗ELISA檢測(cè)HBeAg的假陽(yáng)性率高、敏感性低等技術(shù)缺陷并公開(kāi)其在檢測(cè)HBeAg中的應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原的試劑盒，其特征在于包括包裝于容器中的識(shí)別乙型肝炎病毒e抗原不同表位的單克隆抗體，任選地其中一種抗體是用辣根過(guò)氧化物酶或異硫氰酸熒光素或生物素標(biāo)記的。本發(fā)明的試劑盒在臨床上用于檢測(cè)乙型肝炎病毒，特異性高，靈敏度可達(dá)ng級(jí)，HBeAg的濃度在3ng/ml－95ng/ml范圍內(nèi)具有很好的線性關(guān)系。
文檔編號(hào)G01N33/576GK1945335SQ20061014342
公開(kāi)日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2006年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月28日
發(fā)明者孫兵, 靖彩英, 顏凌晨 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院