專利名稱：一種擴(kuò)展免疫檢測可測量范圍的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種檢測方法，能擴(kuò)展目標(biāo)分析物的可測量范圍。

背景技術(shù)：
在免疫定量檢測試驗中，可測量范圍受檢測方法、抗體(或者抗原)性質(zhì)和抗體(或者抗原)使用量的影響。如果檢測方法確定，抗體(或者抗原)原料選定，則測定范圍大至也確定，原料使用量只能在小幅度范圍內(nèi)改變測量范圍；不同的免疫檢測方法對試劑的可測量范圍都有局限性，要么靈敏度低，要么檢測范圍窄，即使采用一些先進(jìn)的技術(shù)平臺(比如ECL，F(xiàn)TIR等)也只能小幅度地提高靈敏度和小幅度地增大檢測范圍。
臨床樣本(如血清樣本)中目標(biāo)檢測物的濃度常常超出試劑盒的高值檢測范圍，比如甲胎蛋白(AFP)試劑盒的一般測量范圍是0到2000ng/ml，但人群中AFP的血清樣本值分布范圍是0到2000,000ng/ml，而且很多病人血清樣本遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于2000ng/ml，分布在10,000-100,000ng/ml之間，在此種情況下，對于采用一步法(反應(yīng)時同時加入固定有捕獲抗體或抗原的固相載體、血清樣本和二抗標(biāo)記物及信號物質(zhì)，無洗滌過程)的試劑盒常報告假陰性結(jié)果，對于采用多次洗滌的試劑盒，最終只能報告大于試劑盒檢測范圍的上限而不能給出具體的值。鑒于這種情況，現(xiàn)有試劑盒一般采用多次稀釋反復(fù)測量的辦法給出具體值，這樣為工作人員帶來大量煩瑣工作，同時還增加了檢測成本，是現(xiàn)有免疫檢測試劑盒的一個瓶頸。
因此本領(lǐng)域需要一種既采用一步法反應(yīng)(中間無洗滌過程)又能正確報告目標(biāo)檢測物具體濃度值的方法及試劑盒。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種方法，它只采用一步法反應(yīng)，便能準(zhǔn)確測定目標(biāo)檢測物的具體濃度值，無論該濃度是在線性范圍內(nèi)的，還是處于HD-Hook效應(yīng)區(qū)的。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種擴(kuò)展免疫檢測可測量范圍的方法，即在同一反應(yīng)體系中的兩種可相互區(qū)別的固相載體上，分別通過雙抗夾心法和免疫競爭法測定樣品濃度；雙抗夾心法測定處于雙抗夾心法線性范圍內(nèi)的樣品濃度，免疫競爭法測定處于雙抗夾心法的線性范圍以外的樣品濃度。
在另一優(yōu)選例中，上述的方法包括步驟 (1)將樣品、檢測載體和標(biāo)記了可檢測信號的第二抗體混合，形成一反應(yīng)體系，其中所述的檢測載體是帶有第一抗體的固相載體，并且所述的第二抗體與第一抗體可同時結(jié)合于目標(biāo)抗原的不同表位，從而形成“第二抗體-抗原-第一抗體-固相載體”四元復(fù)合物； (2)將指示載體加入到步驟(1)的體系中，其中指示載體是帶有目標(biāo)抗原的固相載體，從而在帶有可檢測信號的第二抗體存在下，形成“第二抗體-抗原-固相載體”三元復(fù)合物； (3)檢測反應(yīng)體系中所述三元復(fù)合物中微球上的可檢測信號，得到指示載體的信號值，并與無HD-HOOK效應(yīng)時的指示微球信號值(正常值)比較； 當(dāng)指示載體測量值小于指示載體正常值時，則判定目標(biāo)抗原的濃度處于HD-HOOK效應(yīng)區(qū)，并通過三元復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)值或標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，確定反應(yīng)體系中目標(biāo)抗原的存在與否和/或數(shù)量； 當(dāng)指示載體測量值大于或等于指示載體正常值時，則判定樣品中目標(biāo)抗原的濃度處于非HD-HOOK測量范圍，此時通過檢測反應(yīng)體系中所述四元復(fù)合物中載體上的可檢測信號，并與四元復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)值或標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，從而確定反應(yīng)體系中目標(biāo)抗原的存在與否和/或數(shù)量。
在另一優(yōu)選例中，所述的抗原或抗體與固相載體之間的結(jié)合方式有共價鍵或配基反應(yīng)或非特異性吸附。
在另一優(yōu)選例中，所述的固相載體是帶不同熒光或具有不同體積的物體。
在另一優(yōu)選例中，上述的方法包括步驟 (a)將樣品、檢測微球和標(biāo)記了可檢測信號的第二抗體混合，形成一反應(yīng)體系，其中所述的檢測微球是如I式所示的第一抗體-微球的二元復(fù)合物， anti1X-bead(I) 式中，“X”表示目標(biāo)抗原，“anti1X”表示針對所述目標(biāo)抗原“X”的第一抗體，“bead”表示微球，“-”表示第一抗體與微球之間的結(jié)合方式， 并且所述的第二抗體與第一抗體可同時結(jié)合于目標(biāo)抗原的不同表位， 從而形成“第二抗體-抗原-第一抗體-微球”四元復(fù)合物； (b)將指示微球加入到步驟(a)的體系中，其中指示微球是式II所示的目標(biāo)抗原-微球的二元復(fù)合物， X-bead’(II) 式中，“bead’”表示可與“bead”互相區(qū)別的不同微球，“-”表示目標(biāo)抗原X與微球之間的結(jié)合方式， 從而在帶有可檢測信號的第二抗體存在下，形成“第二抗體-抗原-微球”三元復(fù)合物； (c)檢測反應(yīng)體系中所述三元復(fù)合物中微球上的可檢測信號，得到指示微球的信號值，并與無HD-HOOK效應(yīng)時的指示微球信號值(正常值)比較； 當(dāng)指示微球測量值小于指示微球正常值時，則判定目標(biāo)抗原的濃度處于HD-HOOK效應(yīng)區(qū)，并與三元復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)值或標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，確定反應(yīng)體系中目標(biāo)抗原的存在與否和/或數(shù)量； 當(dāng)指示微球測量值大于或等于指示微球正常值時，則判定樣品中目標(biāo)抗原的濃度處于非HD-HOOK測量范圍，此時通過檢測反應(yīng)體系中所述四元復(fù)合物中微球上的可檢測信號，并與四元復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)值或標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，從而確定反應(yīng)體系中目標(biāo)抗原的存在與否和/或數(shù)量。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，目標(biāo)抗原與微球之間的結(jié)合方式有共價鍵或配基反應(yīng)或非特異性吸附。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(c)中，當(dāng)指示微球測量值≤0.9×指示微球正常值時，則判定樣品存在HD-HOOK效應(yīng)。
在另一優(yōu)選例中，所述指示微球正常值是用以下方法確定的 (a’)將濃度已知且處于測量范圍的目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品系列分別與所述檢測微球、所述帶有可檢測信號的第二抗體混合，形成一反應(yīng)體系，從而形成不同目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度的“第二抗體-抗原-第一抗體-微球”四元復(fù)合物； (b’)將所述的指示微球加入到步驟(a’)的體系中，從而在帶有可檢測信號的第二抗體存在下，形成不同目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度的“第二抗體-抗原-微球”三元復(fù)合物； (c’)檢測所述三元復(fù)合物中微球上的可檢測信號，以P+2SD為指示微球正常值，式中P表示不同目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度時，三元復(fù)合物中微球信號值的平均值，2SD為2倍的微球信號值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
在另一優(yōu)選例中，所述的四元復(fù)合物中微球上的可檢測信號的標(biāo)準(zhǔn)曲線由下述方法確定 (i)將濃度已知且處于測量范圍的目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品系列分別與所述檢測微球、所述帶有可檢測信號的第二抗體混合，形成一反應(yīng)體系，從而形成不同目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度的“第二抗體-抗原-第一抗體-微球”四元復(fù)合物； (ii)檢測所述四元復(fù)合物中微球上的可檢測信號，以其為Y軸，以目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸所得到的曲線為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
在另一優(yōu)選例中，所述的三元復(fù)合物中微球上的可檢測信號的標(biāo)準(zhǔn)曲線由下述方法確定 (i’)將濃度已知且超出測量范圍的目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品系列分別與所述檢測微球、所述帶有可檢測信號的第二抗體混合，形成一反應(yīng)體系，從而形成不同目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度的“第二抗體-抗原-第一抗體-微球”四元復(fù)合物； (ii’)將所述的指示微球加入到步驟(a’)的體系中，從而在帶有可檢測信號的第二抗體存在下，形成“第二抗體-抗原-微球”三元復(fù)合物； (iii’)檢測所述三元復(fù)合物中微球上的可檢測信號，以其Log值為Y軸，以目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度的Log值為X軸所得到的曲線為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
在另一優(yōu)選例中，第一抗體與相應(yīng)的第二抗體的摩爾比為1∶0.1-2；式II所示的目標(biāo)抗原-微球的二元復(fù)合物與第二抗體的摩爾比為1∶0.1-2。
在另一優(yōu)選例中，第一抗體與相應(yīng)的第二抗體的摩爾比為1∶0.8-1.5；式II所示的目標(biāo)抗原-微球的二元復(fù)合物與第二抗體的摩爾比為1∶0.8-1.5。
在另一優(yōu)選例中，所述的各種微球bead與bead’是帶不同熒光的微球。
在另一優(yōu)選例中，目標(biāo)抗原數(shù)量為1-100種。
在另一優(yōu)選例中，所述的抗原是蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測目標(biāo)抗原的試劑盒，它包括容器，說明書，以及分別裝于容器中的下列物質(zhì) (1)兩種可相互區(qū)別的固相載體； (2)第一抗體和帶有可檢測信號的第二抗體，所述的第二抗體與第一抗體可同時結(jié)合于目標(biāo)抗原的不同表位； (3)目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒包括容器，說明書，以及分別裝于容器中的下列物質(zhì) (a)檢測微球，其中所述的檢測微球是如I式所示的第一抗體-微球的二元復(fù)合物， anti1X-bead(I) 式中，“X”表示目標(biāo)抗原，“anti1X”表示針對所述目標(biāo)抗原“X”的第一抗體，“bead”表示微球，“-”表示第一抗體與微球之間的結(jié)合方式， (b)帶有可檢測信號的第二抗體，其中，所述的第二抗體與第一抗體可同時結(jié)合于目標(biāo)抗原的不同表位， (c)指示微球，所述指示微球是式II所示的目標(biāo)抗原-微球的二元復(fù)合物， X-bead’(II) 式中，“bead’”表示可與“bead”互相區(qū)別的不同微球，“-”表示目標(biāo)抗原X與微球之間的結(jié)合方式。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中含有針對1-100種目標(biāo)抗原的相應(yīng)的檢測微球?qū)蛶в锌蓹z測信號的第二抗體，其中所述的檢測微球由檢測微球和指示微球組成，并且所述的各種微球bead與bead’是帶不同熒光的微球。
據(jù)此，本發(fā)明提供了一種既采用一步法反應(yīng)(中間無洗滌過程)又能正確報告目標(biāo)檢測物具體濃度值的方法及試劑盒。



圖1顯示實施例1中的夾心法MMF(Meta-model Frameworks)曲線；曲線方程式為y＝(a*b+c*x^d)/(b+x^d)，其中a＝-155.8，b＝383.289，c＝12602.2，d＝1.06166；S＝391.65218121，r＝0.99925435。
圖2顯示實施例1中競爭法雙對數(shù)曲線；曲線方程式為y＝a+bx，其中a＝6.1919435，b＝-0.753973；S＝0.04031135，r＝0.99694446。
圖3顯示實施例2中的夾心法MMF(Meta-model Frameworks)曲線；曲線方程式為y＝a(1-exp(-bx)，其中a＝4475.262，b＝0.002951；S＝99.08877036，r＝0.99910704。
圖4顯示實施例2中競爭法雙對數(shù)曲線；曲線方程式為y＝a+bx，其中a＝5.795542，b＝-0.7543；S＝0.04040649，r＝0.99693273。

具體實施例方式 發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)在雙位點夾心免疫測定的反應(yīng)體系中加入另一指示微球，通過夾心法MMF曲線和競爭法雙對數(shù)曲線，無論該檢測物的濃度是在非HD-HOOK效應(yīng)區(qū)內(nèi)，還是處于HD-HOOK效應(yīng)區(qū)，都能有效地定量檢測目標(biāo)檢測物，從而大大擴(kuò)展了一步法反應(yīng)的有效檢測范圍。
如本文所用，術(shù)語“第一抗體”、“一抗”可互換使用，指可特異性結(jié)合于某一抗原(如腫瘤標(biāo)志物)的一種抗體。
如本文所用，術(shù)語“第二抗體”、“二抗”可互換使用，指可特異性結(jié)合于某一抗原(如腫瘤標(biāo)志物)的另一種抗體。例如，對于同一種抗原(如腫瘤標(biāo)志物)而言，相應(yīng)的第一抗體和第二抗體是不同的，并且可同時結(jié)合于所述的抗原的不同表位。
如本文所用，術(shù)語“抗原”指具有免疫原性的物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、多肽。代表性的抗原例子包括(但并不限于)細(xì)胞因子、腫瘤標(biāo)志物、金屬蛋白類、心血管糖尿病相關(guān)蛋白等。
如本文所用，術(shù)語“腫瘤標(biāo)志物”是指在腫瘤的發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細(xì)胞本身所產(chǎn)生的或者是由機(jī)體對腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而產(chǎn)生的，反映腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)。代表性的腫瘤標(biāo)志物包括(但并不限于)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、糖鏈抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)。
如本文所用，術(shù)語“一步法反應(yīng)”是指中間沒有洗滌過程的雙抗體夾心反應(yīng)。
基本原理 (a)雙抗夾心法的原理 雙抗夾心免疫檢測法的基本原理是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。常規(guī)的做法是將一抗固定于固相載體，然后一抗與抗原反應(yīng)，洗滌后再與帶有標(biāo)記的二抗反應(yīng)，洗滌，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光或酶聯(lián)顯色反應(yīng)檢測信號。
(b)免疫競爭法的原理 免疫競爭檢測法的基本原理是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。常規(guī)的做法是標(biāo)本中的抗原和一定量的帶有標(biāo)記的抗原競爭性地與固相抗體結(jié)合，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光或酶聯(lián)顯色反應(yīng)檢測信號。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合的標(biāo)記抗原愈少，最后的檢測信號也愈弱。
(c)流式微球免疫檢測法的原理 流式微球免疫檢測技術(shù)是一種非常靈活高效多功能的技術(shù)。目前流式微球技術(shù)平臺主要有Luminex xMAP多功能技術(shù)平臺，流式細(xì)胞儀多功能技術(shù)平臺(BD公司和貝克曼庫爾特(BeckmanCoulter)公司)。它們主要通過不同熒光編碼微球或者通過改變微球直徑大小來作為多種檢測項目的載體，同時通過熒光標(biāo)記檢測物作為被檢測物的豐度信號達(dá)到同時對多指標(biāo)進(jìn)行定量檢測。
(I)流式細(xì)胞儀技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)院廣泛應(yīng)用，其技術(shù)原理也為大家熟知。流式細(xì)胞儀應(yīng)用于流式微球免疫檢測技術(shù)的原理主要是采用多種不同直徑大小的微球作為載體，每種直徑大小的微球均可以作為一種檢測項目，而且不同項目的微球可以在同一體系中同時進(jìn)行免疫反應(yīng)，最后通過儀器識別不同大小的微球和微球上的熒光信號達(dá)到同時檢測多種項目的目的(即流式細(xì)胞儀蛋白芯片微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技術(shù)Cytometric Bead Array(CBA))。
(II)Luminex xMAP是一個非常靈活的多功能技術(shù)平臺。其原理是把微小的乳膠顆粒(Beads，簡稱為“微球”)分別染成不同的熒光色，然后再把針對不同檢測物的蛋白(如抗原抗體)以共價方式結(jié)合到特定顏色的微球上。應(yīng)用時，先把針對不同檢測物的、用不同顏色編碼的微球混合，再加入被檢測物(被測物可以是血清中的抗原、抗體、或酶等)。在懸液中的微球與被檢測物特異性地結(jié)合，并加上熒光標(biāo)記。然后，微球成單列通過兩束激光，一束判定微球的顏色從而決定被測物的特異性(定性)；另一束測定微球上的熒光標(biāo)記強(qiáng)度從而決定被測物的量(定量)，所得到的數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理后可以直接用來判斷結(jié)果。
在一個優(yōu)選例中，充分利用了一抗固定在不同流動微球(Beads)的特點，同時優(yōu)化藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的二抗的濃度，將交聯(lián)了一抗的微球溶液與血清樣本或抗原標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品液、PE標(biāo)記的二抗溶液依次或同時一并加入反應(yīng)容器中，從而發(fā)生以下反應(yīng) ①微球上的一抗與血清或標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品液中相應(yīng)的抗原(即腫瘤標(biāo)志物抗原)結(jié)合，形成“腫瘤標(biāo)志物-第一抗體-微球”三元復(fù)合物， ②二抗與血清或標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品液中相應(yīng)的抗原(即腫瘤標(biāo)志物抗原)結(jié)合，最終形成“第二抗體-腫瘤標(biāo)志物-第一抗體-微球”四元復(fù)合物(包括微球交聯(lián)的一抗-血清相應(yīng)抗原-PE標(biāo)記的復(fù)合物或微球交聯(lián)的一抗-標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品液的抗原-PE標(biāo)記的復(fù)合物)，反應(yīng)過程中不須離心洗滌，在液相中即可通過LuminexxMAP檢測復(fù)合物的熒光，達(dá)到從反應(yīng)到定性定量分析一步完成的效果，即一步法。
在Luminex檢測儀上，這些微球被微量液體傳送系統(tǒng)排成單列，通過兩束激光，一束判定微球的編碼從而決定被測腫瘤標(biāo)志物的種類；另一束測定微球上PE的熒光強(qiáng)度，經(jīng)數(shù)據(jù)處理得出被測腫瘤標(biāo)志物的含量。
關(guān)于Luminex xMAP的技術(shù)平臺詳細(xì)資料，請參見產(chǎn)品說明書或文獻(xiàn)，(1)Cancer Chemotherapy and Pharmacology，51321-327，(2)Journal ofImmunological Methods，22741-52；(3)www.luminexcorp.com。
(d)擴(kuò)展檢測范圍的原理 本發(fā)明基于免疫雙抗體夾心方法和免疫競爭法的原理，在同一實驗中同時采用雙抗體夾心法和免疫競爭法，雙抗體夾心法測量低范圍的血清樣本，這樣可以保證檢測的靈敏度和正確測量在臨床參考值附近的樣本。免疫競爭法測量超出雙抗夾心測量范圍的高值樣本。
在一個優(yōu)選例中，發(fā)明人在1種熒光編碼的Beads(在此命名為1號Beads)上以共價鍵方式交聯(lián)針對某種抗原的一抗；加入血清樣本或標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品液、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的對應(yīng)于該種抗原的二抗溶液(正常檢測這種抗原濃度，與常規(guī)雙抗夾心試劑方法相同)，同時發(fā)生以下反應(yīng)①1號Beads上的一抗與血清或標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品液中相應(yīng)的抗原結(jié)合，②二抗與血清或標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品液中相應(yīng)的抗原結(jié)合，最終形成四元復(fù)合物1號Beads-一抗-血清相應(yīng)抗原-PE標(biāo)記的二抗的或1號Beads-一抗-標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品液的抗原-PE標(biāo)記的二抗。
在Luminex檢測儀上，熒光編碼的Beads被微量液體傳送系統(tǒng)排成單列，通過兩束激光，一束判定Beads的編碼從而決定被測抗原的種類；另一束激發(fā)Beads上PE，熒光強(qiáng)度經(jīng)數(shù)據(jù)處理得出被測抗原的含量。
在2號熒光編碼的Beads(在此命名為2號Beads)上以共價鍵方式交聯(lián)被檢測抗原純品；在1號beads和樣本、二抗-PE反應(yīng)結(jié)束后加入2號Beads于反應(yīng)系統(tǒng)中，發(fā)生以下反應(yīng)2號Beads上的抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中剩余的抗原共同競爭系統(tǒng)中加入的二抗-PE，最終形成三元復(fù)合物2號Beads-抗原-PE標(biāo)記的二抗。
在Luminex檢測儀上，熒光編碼的2號與1號beads同時進(jìn)行處理，Beads被微量液體傳送系統(tǒng)排成單列，通過兩束激光，一束判定Beads的編碼從而決定為2號beads；另一束測定Beads上PE的熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光信號強(qiáng)度，經(jīng)數(shù)據(jù)處理得出被測抗原的含量。
(e)指示HD-HOOK方法的原理 HD-HOOK效應(yīng)是指在雙位點夾心免疫實驗中，其劑量反應(yīng)曲線的高劑量(HIGH DOSE，HD)區(qū)段，線性走向不是呈平臺狀無限后延，而是向下彎曲狀，似一只鉤子或一把鐮刀(HOOK)，根據(jù)此現(xiàn)象寫實性地稱之為″HD-HOOK″效應(yīng)(Miles LEM，Lipschitz DA，Bieber CP and Cook JDMeasurement of serumferritin by a 2-site immunoradiometric assay.Analyt Biochem 61209-224，1974.) 產(chǎn)生HD-HOOK效應(yīng)的分子機(jī)理有″分子變構(gòu)說″和″濃度效應(yīng)″等推論(《臨床免疫學(xué)檢驗的進(jìn)展》南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍醫(yī)學(xué)檢驗中心，武建國；《ELISA的質(zhì)量管理》江蘇省臨床檢驗中心，許斌；《腫瘤標(biāo)志物檢測的影響因素和應(yīng)用原則》華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，吳健民)。
在本發(fā)明提供的方法中，如果樣品中待檢測抗原的濃度處于非HD-HOOK區(qū)(即樣品中含有待檢測抗原的數(shù)量并不明顯大于檢測體系中二抗的數(shù)量，因此有一部分或較多的二抗呈未結(jié)合狀態(tài))，那么會發(fā)生以下反應(yīng)2號beads上的抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中剩余的游離的二抗-PE結(jié)合，最終形成“2號beads-抗原-PE標(biāo)記的二抗”的三元復(fù)合物。這導(dǎo)致后續(xù)檢測中，可檢測到一定數(shù)量的所述三元復(fù)合物。
與此相反，如果樣品中待檢測抗原的濃度超過檢測的線性區(qū)域而處于HD-HOOK區(qū)(即樣品中含有目標(biāo)抗原的數(shù)量明顯大于檢測體系中二抗的數(shù)量，則幾乎所有的二抗都結(jié)合于樣品中的目標(biāo)抗原，故體系中沒有或基本上沒有未結(jié)合狀態(tài)的二抗)，那么2號beads上的抗原將很難遇到與反應(yīng)系統(tǒng)中剩余的游離的二抗-PE結(jié)合，因此難以形成“2號beads-抗原-PE標(biāo)記的二抗”構(gòu)成的三元復(fù)合物。這導(dǎo)致后續(xù)檢測中，檢測不到“2號beads-抗原-PE標(biāo)記的二抗”構(gòu)成的三元復(fù)合物或讀數(shù)很低。
在Luminex檢測儀上，熒光編碼的2號與1號beads同時進(jìn)行處理，微球被微量液體傳送系統(tǒng)排成單列，通過兩束激光，一束判定微球的編碼從而決定為2號beads；另一束測定微球上PE的熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光信號強(qiáng)弱判斷該血清樣本是否為HD-HOOK血清樣本。如果來自2號beads的熒光強(qiáng)度較低(如低于無HD-HOOK效應(yīng)時的指示微球熒光信號值(正常值)的90％，較佳地低于50％，更佳地低于30％，最佳地低于10％)，則可判定樣品中待測抗原的濃度處于HD-HOOK區(qū)，即樣品是HD-HOOK樣品。
下面進(jìn)一步說明本發(fā)明的相關(guān)操作細(xì)節(jié)。
第一抗體-微球的二元復(fù)合物(檢測微球) 在本發(fā)明中，第一抗體-微球的二元復(fù)合物具有式(I)結(jié)構(gòu) anti1X-bead(I) 式中，X表示腫瘤標(biāo)志物，anti1X表示抗腫瘤標(biāo)志物X的第一抗體，bead表示微球，-表示第一抗體與微球之間的共價鍵； 一抗與微球的交聯(lián) 針對某種被檢測抗原的一抗(anti1X，X代表腫瘤標(biāo)志物抗原)與微球共價交聯(lián)的詳細(xì)操作程序可用常規(guī)方法，例如按照Luminex公司的產(chǎn)品說明書或網(wǎng)站www.luminexcorp.com中所述的方法進(jìn)行偶連，從而得到不同微球與相應(yīng)一抗形成偶連物anti1X-Beads。
分別取針對某種抗原的anti1X-Beads，按一定比例混合就可得到第一抗體溶液(簡稱為A液)。
抗原-微球的二元復(fù)合物(指示微球) 按上述類似方法，將被檢測抗原純品與另一種號碼的微球共價交聯(lián)，形成抗原-微球的二元復(fù)合物，相應(yīng)的溶液簡稱為H液。
二抗的標(biāo)記 雖然二抗可用各種本領(lǐng)域已知的可檢測信號進(jìn)行標(biāo)記。然而，優(yōu)選的是用熒光信號進(jìn)行標(biāo)記，尤其是通過生物素-親和素連接方式標(biāo)記PE。
在一優(yōu)選例中，二抗的生物素(Biotin)標(biāo)記方法如下分別取針對不同腫瘤標(biāo)志物抗原的二抗(anti2X，X代表腫瘤標(biāo)志物抗原)透析純化后加入生物素二甲基亞砜(DMSO)溶液，避光反應(yīng)，透析去除未反應(yīng)的生物素，保存?zhèn)溆谩?br> 分別取針對不同腫瘤標(biāo)志物抗原的生物素標(biāo)記的anti2X，按比例混合，加入親和素(Streptavidin)標(biāo)記的PE，使生物素與Streptavidin結(jié)合，生成帶熒光素標(biāo)記的第二抗體(即PE-anti2X，其中PE表示藻紅蛋白)，得到第二抗體溶液(簡稱為C液)。
標(biāo)準(zhǔn) 用某種抗原的標(biāo)準(zhǔn)品配制一定濃度范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，為B液。
將上述的第一抗體溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液和第二抗體溶液(即A、B和C液)依次或同時混勻，然后加入H液混勻，充分反應(yīng)(如在37±50C反應(yīng)10-100min)，隨后在luminex100上讀數(shù)，得到針對某種抗原的不同濃度與對應(yīng)的熒光信號的1號和2號標(biāo)準(zhǔn)曲線，1號標(biāo)準(zhǔn)曲線是MMF曲線，2號標(biāo)準(zhǔn)曲線是雙對數(shù)曲線。
如果需要測定樣品中的多種抗原，可以根據(jù)以上方法得到不同抗原的標(biāo)準(zhǔn)曲線對。
樣品的檢測 可用本發(fā)明方法檢測的樣品沒有特別限制，可以是任何含有抗原的樣品，代表性的例子包括血清樣本、尿液樣本、唾液樣本等。優(yōu)選的樣品是血清樣品。
將A、人血清樣本和C液，H液，混勻370C反應(yīng)30min，然后在luminex100上讀數(shù)。如果是非hook樣品，則根據(jù)1號beads上的熒光信號及MMF曲線換算出低濃度范圍的抗原濃度。如果是hook樣品，則根據(jù)2號beads上的熒光信號及雙對數(shù)曲線計算出高濃度范圍的抗原濃度。
如果同時檢測樣品中的多種抗原，可以相應(yīng)地使用多對檢測、指示微球，即對每一種抗原可以使用一對檢測、指示微球，并且各對檢測、指示微球具有不同的編碼熒光，從而可以相互區(qū)分。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于 1、極大地擴(kuò)展了雙位點夾心免疫測定的測量范圍； 2、一步法反應(yīng)，無需洗滌，操作簡單； 3、非常適用于同時定量檢測樣品中的多種抗原。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 人血清中甲胎蛋白(AFP)的定量檢測 實驗材料 針對AFP的一抗和二抗購自上海第二軍醫(yī)大學(xué)， AFP抗原純品購自Biodesign， Beads購自Luminex公司， 常規(guī)試劑為市售品。
實驗方法 1.準(zhǔn)備 1.1一抗和AFP抗原預(yù)先去除含氨基小分子和雜蛋白(透析或過層析柱)，測量其濃度。
1.2在1.5ml聚丙烯離心管中，精確稱取5mg左右N-hydroxys μ Lfosuccini-mide(NHSS)，備用(防潮)。
1.3在1.5ml聚丙烯離心管中，精確稱取5mg左右N-ethyl-N’(3-dimethylainopropyl)-carbodiimide(EDC)，備用(防潮)。
2.beads活化 2.1分別取33號和51號beads原液旋渦混旋儀混懸20秒，移取200L beads(相當(dāng)于2.5×106beads)于兩個1.5ml聚丙烯離心管中。
2.215000rpm離心2分鐘(設(shè)置3分鐘)，移去上清液。
2.3加入100μL蒸餾水，旋渦混旋儀混懸20秒，15000rpm離心2分鐘，移去上清液。
2.4重復(fù)2.3。
2.5在兩管中分別加入80μL 0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)，pH 6.2，旋渦混旋儀混懸20秒。
2.6用蒸餾水將(NHS)稀釋至50mg/ml。(現(xiàn)配現(xiàn)用) 2.7分別取10μL 50mg/ml(NHSS)加到兩種beads溶液中，旋渦混旋儀混懸20秒。
2.8用蒸餾水將EDC稀釋至50mg/ml。(現(xiàn)配現(xiàn)用) 2.9分別取10μL 50mg/ml EDC加到兩種beads溶液中，旋渦混旋儀混懸20秒。
2.10避光、37℃孵育20分鐘。
2.1115000rpm離心2分鐘，移去上清液。
2.12分別加入250μL 50mmol/L 2-(N-morpholino)ethanesμLfonicacid(MES)pH5.0。
2.1315000rpm離心2分鐘，移去上清液。
2.14重復(fù)2.12，2.13，馬上進(jìn)行下步實驗。
3.交聯(lián)、封閉和儲存 3.1取20μg已處理好的AFP一抗加入到已活化的33號beads中；取20μg已處理好的AFP抗原加入到已活化的51號beads中。旋渦混旋儀混懸20秒。
3.2避光、37℃反應(yīng)2小時，每十五分鐘混勻一次。
3.3分別加入1ml PBS-TBN，旋渦混旋儀混懸20秒，15000rpm離心2分鐘。移去上清液(PBS-TBN的組成為10mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液、0.02％吐溫20、1mg/ml的小牛血清白蛋白和0.05％疊氮鈉)。
3.4分別加入500μL PBS-TBN，旋渦混旋儀混懸20秒，15000rpm離心2分鐘。移去上清液。
3.5分別加入500μL PBS-TBN，旋渦混旋儀混懸20秒。
3.6用顯微鏡計數(shù)兩種beads的濃度分別是 33號1×106個/ml，51號1×106個/ml。
3.72-8℃避光保存。
4.二抗的Biotin標(biāo)記 4.1二抗預(yù)處理 4.2生物素標(biāo)記反應(yīng) 取上述預(yù)處理的AFP二抗10μL，加入25μL的1mg/ml NHS-Biotin DMSO溶液，混勻，4℃冰箱避光反應(yīng)2小時。透析過夜備用。
5.抗原標(biāo)準(zhǔn)品(B液)的配制 用pH7.4的磷酸鹽緩沖液配制濃度為10ng/ml、50ng/ml、250ng/ml、1250ng/ml，2500ng/ml，12500ng/ml，50000ng/ml的AFP標(biāo)準(zhǔn)品液。
6.A液的配制 取適量標(biāo)記了一抗的33號beads加入到1ml pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，使溶液中約含10000個beads。
7.二抗-PE(C液)的配制 取標(biāo)記好biotin AFP二抗，加入pH7.4磷酸鹽緩沖液中，二抗終濃度為20μg/ml，同時加入Streptavidin標(biāo)記的PE總濃度為60μg/ml，二抗-PE總體積為5ml，4℃避光保存?zhèn)溆谩?br> 8.H液的配制 取適量標(biāo)記了AFP抗原的51號beads加入到1ml pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，使溶液中約含10000個beads。
9.人AFP高值血清的檢測 9.1收集AFP檢測高值＞2萬ng/ml的人血清樣本5份和AFP檢測高值＜1000ng/ml的人血清樣本5份，2ml/份，5000rpm×5min，取上清，備用。
9.2在96孔反應(yīng)板的8個反應(yīng)孔內(nèi)依次加入8個不同濃度的B液各5μL，每孔再分別加入25μL A液及25μL C液，混勻；另選10孔分別加入10種上述人血清樣本5μL/孔和25μL/孔A液及25μL/孔C液，混勻；然后加入5μL/孔的H液，混勻；于37℃避光孵箱反應(yīng)30mins。
9.3孵育完成后于旋渦混旋儀上充分混勻，在Luminex100上讀數(shù)。
9.4檢測結(jié)果 9.4.1得到結(jié)合于19號beads和51號beads的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的熒光值，見表1。
表1抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的熒光值

9.4.2由表1中結(jié)合于19號beads和51號beads的標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值與所對應(yīng)的濃度得到MMF曲線和雙對數(shù)曲線，見圖1、2和表2、3、4。
表2結(jié)合于19號beads的標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值 表3結(jié)合于51號beads的標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值 表451號beads的標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值與所對應(yīng)的濃度得到雙對數(shù)值 9.4.3用curxpt曲線計算方法，得到各樣品中AFP對應(yīng)于MMF曲線和雙對數(shù)曲線的濃度值，見表5。并將所得到的值與雅培公司(Abott)試劑盒所測得的結(jié)果進(jìn)行比較，見表5。
Abott試劑盒購自雅培公司，該項產(chǎn)品使用傳統(tǒng)的微粒子酶免法(Micropaticle Enzyme Immunoassay，MEIA)進(jìn)行檢測(產(chǎn)品名稱AFP ReagentPack；產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號YZB/ABBOTT-IA-014-2004)。
表5curxpt曲線計算結(jié)果及與傳統(tǒng)產(chǎn)品的比較 9.5結(jié)果判定 首先判斷樣本的HOOK情況，如果樣本為HOOK則采用競爭法雙對數(shù)曲線計算如樣本ys060524-15，ys060524-16等；如果樣本為非HOOK樣本則采用MMF曲線計算如樣本ys060524-11，ys060524-12等。實驗結(jié)果通過統(tǒng)計學(xué)計算與對照比較CV＜15％(P＜0.5)。
結(jié)果表明，本發(fā)明提供的方法是一種很有效的擴(kuò)展免疫檢測可測量范圍的方法。
實施例2 人血清中甲胎蛋白(AFP)的定量檢測(微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技術(shù)Cytometric Bead Array(CBA)) 實驗材料 針對AFP的一抗和二抗購自上海第二軍醫(yī)大學(xué)， AFP抗原純品購自Biodesign， Beads購自BD公司 BD FACSCalibur， 常規(guī)試劑為市售品。
實驗方法 1.準(zhǔn)備 1.1一抗和AFP抗原預(yù)先去除含氨基小分子和雜蛋白(透析或過層析柱)，測量其濃度。
1.2在1.5ml聚丙烯離心管中，精確稱取5mg左右N-hydroxysμLfosuccini-mide(NHSS)，備用(防潮)。
1.3在1.5ml聚丙烯離心管中，精確稱取5mg左右N-ethyl-N’(3-dimethylainopropyl)-carbodiimide(EDC)，備用(防潮)。
2.beads活化 2.1分別取5um和8um直徑的beads原液旋渦混旋儀混懸20秒，移取200μL beads(相當(dāng)于2.5×106beads)于兩個1.5ml聚丙烯離心管中。
2.215000rpm離心2分鐘(設(shè)置3分鐘)，移去上清液。
2.3加入100μL蒸餾水，旋渦混旋儀混懸20秒，15000rpm離心2分鐘，移去上清液。
2.4重復(fù)2.3。
2.5在兩管中分別加入80μL 0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)，pH 6.2，旋渦混旋儀混懸20秒。
2.6用蒸餾水將(NHS)稀釋至50mg/ml。(現(xiàn)配現(xiàn)用) 2.7分別取10μL 50mg/ml(NHSS)加到兩種beads溶液中，旋渦混旋儀混懸20秒。
2.8用蒸餾水將EDC稀釋至50mg/ml。(現(xiàn)配現(xiàn)用) 2.9分別取10μL 50mg/ml EDC加到兩種beads溶液中，旋渦混旋儀混懸20秒。
2.10避光、37℃孵育20分鐘。
2.1115000rpm離心2分鐘，移去上清液。
2.12分別加入250μL 50mmol/L 2-(N-morpholino)ethanesμLfonicacid(MES)pH5.0。
2.1315000rpm離心2分鐘，移去上清液。
2.14重復(fù)2.12，2.13，馬上進(jìn)行下步實驗。
3.交聯(lián)、封閉和儲存 3.1取20μg已處理好的AFP一抗加入到已活化的5um beads中；取20μg已處理好的AFP抗原加入到已活化的8um beads中。旋渦混旋儀混懸20秒。
3.2避光、37℃反應(yīng)2小時，每十五分鐘混勻一次。
3.3分別加入1ml PBS-TBN，旋渦混旋儀混懸20秒，15000rpm離心2分鐘。移去上清液(PBS-TBN的組成為10mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液、0.02％吐溫20、1mg/ml的小牛血清白蛋白和0.05％疊氮鈉)。
3.4分別加入500μL PBS-TBN，旋渦混旋儀混懸20秒，15000rpm離心2分鐘。移去上清液。
3.5分別加入500μL PBS-TBN，旋渦混旋儀混懸20秒。
3.6用顯微鏡計數(shù)兩種beads的濃度分別是 5um Beads1×106個/ml，8um Beads1×106個/ml。
3.72-8℃避光保存。
4.二抗的Biotin標(biāo)記 4.1二抗預(yù)處理 4.2生物素標(biāo)記反應(yīng) 取上述預(yù)處理的AFP二抗10μL，加入25μL的1mg/ml NHS-Biotin DMSO溶液，混勻，4℃冰箱避光反應(yīng)2小時。透析過夜備用。
5.抗原標(biāo)準(zhǔn)品(B液)的配制 用pH7.4的磷酸鹽緩沖液配制濃度為10ng/ml、50ng/ml、250ng/ml、1250ng/ml，2500ng/ml，12500ng/ml，50000ng/ml的AFP標(biāo)準(zhǔn)品液。
6.A液的配制 取適量標(biāo)記了一抗的5um Beads加入到1ml pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，使溶液中約含10000個beads。
7.二抗-PE(C液)的配制 取標(biāo)記好biotin AFP二抗，加入pH7.4磷酸鹽緩沖液中，二抗終濃度為20μg/ml，同時加入Streptavidin標(biāo)記的PE總濃度為60μg/ml，二抗-PE總體積為5ml，4℃避光保存?zhèn)溆谩?br> 8.H液的配制 取適量標(biāo)記了AFP抗原的8um beads加入到1ml pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，使溶液中約含10000個beads。
9.人AFP高值血清的檢測 9.1收集AFP檢測高值＞2萬ng/ml的人血清樣本5份和AFP檢測高值＜1000ng/ml的人血清樣本5份，2ml/份，5000rpm×5min，取上清，備用。
9.2在96孔反應(yīng)板的8個反應(yīng)孔內(nèi)依次加入8個不同濃度的B液各5μL，每孔再分別加入25μL A液及25μL C液，混勻；另選10孔分別加入10種上述人血清樣本5μL/孔和25μL/孔A液及25μL/孔C液，混勻；然后加入5μL/孔的H液，混勻；于37℃避光孵箱反應(yīng)30mins。
9.3孵育完成后于旋渦混旋儀上充分混勻，在流式細(xì)胞儀上讀數(shù)。
9.4檢測結(jié)果 9.4.1得到結(jié)合于5μm beads和8μm beads的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的熒光值，見表3。
表3抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的熒光值

9.4.2由表3中結(jié)合于5μm beads和8μm beads的標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值與所對應(yīng)的濃度得到MMF曲線和雙對數(shù)曲線，見圖3、4和表4-6。
表4結(jié)合于5μm beads的標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值 表5結(jié)合于8μm beads的標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值 表6 51號beads的標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值與所對應(yīng)的濃度得到雙對數(shù)值 9.4.3用curxpt曲線計算方法，得到各樣品中AFP對應(yīng)于MMF曲線和雙對數(shù)曲線的濃度值，見表7。并將所得到的值與雅培公司(Abott)試劑盒所測得的結(jié)果進(jìn)行比較，見表7。
Abott試劑盒購自雅培公司，該項產(chǎn)品使用傳統(tǒng)的微粒子酶免法(Micropaticle Enzyme Immunoassay，MEIA)方法進(jìn)行檢測(產(chǎn)品名稱AFPReagent Pack；產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號YZB/ABBOTT-IA-014-2004)。
表7curxpt曲線計算結(jié)果及與傳統(tǒng)產(chǎn)品的比較 9.5結(jié)果判定 首先判斷樣本的HOOK情況，如果樣本為HOOK則采用競爭法雙對數(shù)曲線計算如樣本ys060524-15，ys060524-16等；如果樣本為非HOOK樣本則采用MMF曲線計算如樣本ys060524-11，ys060524-12等。實驗結(jié)果通過統(tǒng)計學(xué)計算與對照比較CV＜15％(P＜0.5)。
結(jié)果表明，本發(fā)明提供的方法是一種很有效的擴(kuò)展免疫檢測可測量范圍的方法。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種擴(kuò)展免疫檢測可測量范圍的方法，其特征在于，在同一反應(yīng)體系中的兩種可相互區(qū)別的固相載體上，分別通過雙抗夾心法和免疫競爭法測定樣品濃度；雙抗夾心法測定處于雙抗夾心法線性范圍內(nèi)的樣品濃度，免疫競爭法測定處于雙抗夾心法的線性范圍以外的樣品濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，它包括步驟
(1)將樣品、檢測載體和標(biāo)記了可檢測信號的第二抗體混合，形成一反應(yīng)體系，其中所述的檢測載體是帶有第一抗體的固相載體，并且所述的第二抗體與第一抗體可同時結(jié)合于目標(biāo)抗原的不同表位，從而形成“第二抗體-抗原-第一抗體-固相載體”四元復(fù)合物；
(2)將指示載體加入到步驟(1)的體系中，其中指示載體是帶有目標(biāo)抗原的固相載體，從而在帶有可檢測信號的第二抗體存在下，形成“第二抗體-抗原-固相載體”三元復(fù)合物；
(3)檢測反應(yīng)體系中所述三元復(fù)合物中微球上的可檢測信號，得到指示載體的信號值，并與無HD-HOOK效應(yīng)時的指示微球信號值(正常值)比較；
當(dāng)指示載體測量值小于指示載體正常值時，則判定目標(biāo)抗原的濃度處于HD-HOOK效應(yīng)區(qū)，并通過三元復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)值或標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，確定反應(yīng)體系中目標(biāo)抗原的存在與否和/或數(shù)量；
當(dāng)指示載體測量值大于或等于指示載體正常值時，則判定樣品中目標(biāo)抗原的濃度處于非HD-HOOK測量范圍，此時通過檢測反應(yīng)體系中所述四元復(fù)合物中載體上的可檢測信號，并與四元復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)值或標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，從而確定反應(yīng)體系中目標(biāo)抗原的存在與否和/或數(shù)量。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，它包括步驟
(a)將樣品、檢測微球和標(biāo)記了可檢測信號的第二抗體混合，形成一反應(yīng)體系，其中所述的檢測微球是如I式所示的第一抗體-微球的二元復(fù)合物，
anti1X-bead(I)
式中，“X”表示目標(biāo)抗原，“anti1X”表示針對所述目標(biāo)抗原“X”的第一抗體，“bead”表示微球，“-”表示第一抗體與微球之間的結(jié)合方式，
并且所述的第二抗體與第一抗體可同時結(jié)合于目標(biāo)抗原的不同表位，
從而形成“第二抗體-抗原-第一抗體-微球”四元復(fù)合物；
(b)將指示微球加入到步驟(a)的體系中，其中指示微球是式II所示的目標(biāo)抗原-微球的二元復(fù)合物，
X-bead’(II)
式中，“bead’”表示可與“bead”互相區(qū)別的不同微球，“-”表示目標(biāo)抗原X與微球之間的結(jié)合方式，
從而在帶有可檢測信號的第二抗體存在下，形成“第二抗體-抗原-微球”三元復(fù)合物；
(c)檢測反應(yīng)體系中所述三元復(fù)合物中微球上的可檢測信號，得到指示微球的信號值，并與無HD-HOOK效應(yīng)時的指示微球信號值(正常值)比較；
當(dāng)指示微球測量值小于指示微球正常值時，則判定目標(biāo)抗原的濃度處于HD-HOOK效應(yīng)區(qū)，并與三元復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)值或標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，確定反應(yīng)體系中目標(biāo)抗原的存在與否和/或數(shù)量；
當(dāng)指示微球測量值大于或等于指示微球正常值時，則判定樣品中目標(biāo)抗原的濃度處于非HD-HOOK測量范圍，此時通過檢測反應(yīng)體系中所述四元復(fù)合物中微球上的可檢測信號，并與四元復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)值或標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，從而確定反應(yīng)體系中目標(biāo)抗原的存在與否和/或數(shù)量。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟(c)中，當(dāng)指示微球測量值≤0.9×指示微球正常值時，則判定樣品存在HD-HOOK效應(yīng)。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述指示微球正常值是用以下方法確定的
(a’)將濃度已知且處于測量范圍的目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品系列分別與所述檢測微球、所述帶有可檢測信號的第二抗體混合，形成一反應(yīng)體系，從而形成不同目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度的“第二抗體-抗原-第一抗體-微球”四元復(fù)合物；
(b’)將所述的指示微球加入到步驟(a’)的體系中，從而在帶有可檢測信號的第二抗體存在下，形成不同目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度的“第二抗體-抗原-微球”三元復(fù)合物；
(c’)檢測所述三元復(fù)合物中微球上的可檢測信號，以P+2SD為指示微球正常值，式中P表示不同目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度時，三元復(fù)合物中微球信號值的平均值，2SD為2倍的微球信號值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的四元復(fù)合物中微球上的可檢測信號的標(biāo)準(zhǔn)曲線由下述方法確定
(i)將濃度已知且處于測量范圍的目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品系列分別與所述檢測微球、所述帶有可檢測信號的第二抗體混合，形成一反應(yīng)體系，從而形成不同目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度的“第二抗體-抗原-第一抗體-微球”四元復(fù)合物；
(ii)檢測所述四元復(fù)合物中微球上的可檢測信號，以其為Y軸，以目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸所得到的曲線為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的三元復(fù)合物中微球上的可檢測信號的標(biāo)準(zhǔn)曲線由下述方法確定
(i’)將濃度已知且超出測量范圍的目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品系列分別與所述檢測微球、所述帶有可檢測信號的第二抗體混合，形成一反應(yīng)體系，從而形成不同目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度的“第二抗體-抗原-第一抗體-微球”四元復(fù)合物；
(ii’)將所述的指示微球加入到步驟(a’)的體系中，從而在帶有可檢測信號的第二抗體存在下，形成“第二抗體-抗原-微球”三元復(fù)合物；
(iii’)檢測所述三元復(fù)合物中微球上的可檢測信號，以其Log值為Y軸，以目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度的Log值為X軸所得到的曲線為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，第一抗體與相應(yīng)的第二抗體的摩爾比為1∶0.1-2；式II所示的目標(biāo)抗原-微球的二元復(fù)合物與第二抗體的摩爾比為1∶0.1-2。
9.一種用于檢測目標(biāo)抗原的試劑盒，其特征在于，它包括容器，說明書，以及分別裝于容器中的下列物質(zhì)
(1)兩種可相互區(qū)別的固相載體；
(2)第一抗體和帶有可檢測信號的第二抗體，所述的第二抗體與第一抗體可同時結(jié)合于目標(biāo)抗原的不同表位；
(3)目標(biāo)抗原標(biāo)準(zhǔn)品。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，它包括容器，說明書，以及分別裝于容器中的下列物質(zhì)
(a)檢測微球，其中所述的檢測微球是如I式所示的第一抗體-微球的二元復(fù)合物，
anti1X-bead(I)
式中，“X”表示目標(biāo)抗原，“anti1X”表示針對所述目標(biāo)抗原“X”的第一抗體，“bead”表示微球，“-”表示第一抗體與微球之間的結(jié)合方式，
(b)帶有可檢測信號的第二抗體，其中，所述的第二抗體與第一抗體可同時結(jié)合于目標(biāo)抗原的不同表位，
(c)指示微球，所述指示微球是式II所示的目標(biāo)抗原-微球的二元復(fù)合物，
X-bead’(II)
式中，“bead’”表示可與“bead”互相區(qū)別的不同微球，“-”表示目標(biāo)抗原X與微球之間的結(jié)合方式。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在免疫分析中擴(kuò)展被測物可檢測范圍的方法和相應(yīng)的試劑盒。
文檔編號G01N33/543GK101201353SQ20061014724
公開日2008年6月18日 申請日期2006年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月14日
發(fā)明者姚見兒, 羅朝領(lǐng) 申請人:上海透景生命科技有限公司