專利名稱：一種檢測(cè)免疫球蛋白的裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)用診斷類物品，具體的說是一種檢測(cè)免疫球蛋白的裝置，更具體的說涉及一種可以快速準(zhǔn)確檢測(cè)樣本里是否含有特異免疫球蛋白抗體的試紙條。
背景技術(shù)：
當(dāng)哺乳動(dòng)物或者人體內(nèi)受到某種外源物質(zhì)的侵害時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一類特異抗體來防御外來物質(zhì)的危害，這類抗體又稱為免疫球蛋白，這種外源物質(zhì)常被稱為抗原，例如艾滋病毒、肝炎病毒、近年流行的登革熱病毒等等。這類免疫球蛋白又可以分為五類，即免疫球蛋白M(IgM)、G(IgG)、A(IgA)、E(IgE)和D(IgD)類。五類中的每一種蛋白在防御外來抗原物質(zhì)方面都有其特殊的功能，例如，在遭受到病毒初次感染時(shí)候，體內(nèi)的球蛋白M都會(huì)大量增加，然而隨著感染的加深，球蛋白M的量會(huì)逐漸下降到一定水平；IgM是對(duì)抗原初次免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體種類，也是新生兒最先合成的免疫球蛋白，此時(shí)球蛋白G在體內(nèi)緩慢增加。當(dāng)在第二次感染時(shí)候，體內(nèi)的球蛋白G急劇上升，IgG是機(jī)體再次免疫應(yīng)答后形成的抗體主要組成成分，在機(jī)體防御機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。
這五類免疫球蛋白在血液里的濃度也各不相同。IgG大約占整個(gè)血清免疫球蛋白的75％左右，在血清里的濃度大約8-18毫克/升；第二類是IgA，在血清里的濃度大約為0.9-4.5毫克/升；IgM在血清里的濃度大約為0.6-2.8毫克/升；IgD在血清里的濃度為0.003-0.4毫克/升，IgE在血清里的濃度最小，大約為0.02-0.05毫克/升。
在臨床上，診斷不同種類免疫球蛋白對(duì)于診斷不同疾病有很重要的臨床意義。但是，由于大量的IgG會(huì)干擾其它類型的免疫球蛋白，從而降低了檢測(cè)的靈敏度，特別是區(qū)分IgG和IgM在臨床上尤為重要。例如，當(dāng)被病毒、細(xì)菌或者真菌感染后，檢測(cè)體內(nèi)的特異IgG和IgM并區(qū)分它們，從而可以準(zhǔn)確的區(qū)分是初次感染還是二次感染，對(duì)于早期診斷和治療具有很重要的意義。另外，在檢測(cè)某種特異IgG的時(shí)候，大量非特異IgG也會(huì)對(duì)特異IgG造成影響。總之，降低檢測(cè)樣本中多余的IgG在臨床檢測(cè)中有重要的意義。
利用免疫學(xué)原理反應(yīng)的干化學(xué)試紙條技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員來說是非常清楚、顯而易見的公知技術(shù)。這類試紙條以及它們的運(yùn)用在很多專利文獻(xiàn)里都有描述，例如中國已經(jīng)被授權(quán)的發(fā)明專利01239923.X和02202021.7，以及申請(qǐng)公開專利02122907.4和02139704.X、01131834.1等等所揭示的那樣。例如，最常見利用三明治原理的一步法檢測(cè)的試紙條，在檢測(cè)試紙條上的接受樣本區(qū)域上加入所要檢測(cè)的樣本，該樣本中由于毛細(xì)層吸作用沿著試紙向前縱向流動(dòng)，經(jīng)過標(biāo)記區(qū)域，如果樣本中存在被分析物，該被分析物與標(biāo)記區(qū)域上另一物質(zhì)特異結(jié)合形成復(fù)合物；該復(fù)合物隨著液體繼續(xù)向前流動(dòng)，經(jīng)過包括有捕獲被分析物區(qū)域的檢測(cè)區(qū)域，再與捕獲被分析物區(qū)域上的捕獲物特異結(jié)合，從而復(fù)合物被捕獲；使在檢測(cè)區(qū)域累積起來。標(biāo)記區(qū)域上的另一特異物質(zhì)可以被標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記；該標(biāo)記物質(zhì)可以是現(xiàn)有技術(shù)公知的非水溶解性的帶顏色顆粒，例如金顆粒膠體和乳膠顆粒，也可以是熒光標(biāo)記，還可以是水溶解性的標(biāo)記顆粒，例如由右旋糖苷聚合形成的標(biāo)記顆粒等等。當(dāng)標(biāo)記區(qū)域上含有帶顏色顆粒，則在檢測(cè)區(qū)域上出現(xiàn)一帶顏色的符號(hào)，該符號(hào)既可以直接用肉眼就可以讀出結(jié)果，也可以借助儀器更加準(zhǔn)確的定性和定量的讀出結(jié)果。這種被分析物和在捕獲被分析物區(qū)域上的捕獲物特異結(jié)合之間的配對(duì)，以及被分析物和帶有標(biāo)記的物質(zhì)之間的結(jié)合是現(xiàn)有技術(shù)公知的物質(zhì)，這些結(jié)合既可以是它們之間的直接特異結(jié)合也可以是間接的特異結(jié)合，常見的如雙抗體夾心、雙抗原夾心或其間接法，還有競(jìng)爭(zhēng)法等等。這些配對(duì)有很多方式，例如抗原和其抗體配對(duì)，抗體和抗抗體配對(duì)，抗體和半抗原配對(duì)，生物素和抗生物素的抗體之間的配對(duì)，生物素和抗體配對(duì)，以及他們之間的形成多個(gè)配對(duì)組合等等，抗體還包括抗體片段的抗體，例如抗Fc位點(diǎn)的抗體等等。
其中，利用一步法試紙條來檢測(cè)免疫球蛋白的時(shí)候，減少多余的IgG是提高檢測(cè)其它免疫球蛋白靈敏度，特別是IgM的重要方法之一。主要原因是，在血液中，由于IgG的數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于IgM的數(shù)量，所以在檢測(cè)中IgG競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IgM的特異位點(diǎn)，使IgM檢測(cè)的靈敏度下降，常常造成對(duì)特異抗原的IgM漏檢。
目前現(xiàn)有技術(shù)中解決這一問題的常用方法就是在檢測(cè)過程中，先對(duì)要檢測(cè)的血液進(jìn)行稀釋處理，然后再來檢測(cè)。通常是向血液中加入抗IgG的抗體去掉多余的IgG，從而減少對(duì)IgM的干擾。然而，此過程需要分幾步操作才能完成，耗費(fèi)時(shí)間，達(dá)不到快速檢測(cè)的目的。
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)IgM的靈敏度底等缺陷，本發(fā)明采用了一種新的技術(shù)方案來解決此問題，使IgM的靈敏度大大提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種檢測(cè)免疫球蛋白抗體的檢測(cè)裝置，和現(xiàn)有一步法檢測(cè)裝置相比較，不同之處在于，在接受樣本區(qū)域上固定有一定量的吸附免疫球蛋白G類抗體試劑。具體的說，該裝置包括可以讓檢測(cè)液體在上流動(dòng)的試紙條，在試紙條上包括接受樣本的區(qū)域、檢測(cè)區(qū)域和完成反應(yīng)必須的一個(gè)或多個(gè)試劑區(qū)域，其中檢測(cè)區(qū)域包括捕獲被分析物區(qū)域，所述的捕獲被分析物區(qū)域包括特異直接或間接捕獲免疫球蛋白抗體的捕獲物，其特征在于，在接受樣本區(qū)域固定有吸附免疫球蛋白G類抗體的吸附試劑。
一個(gè)具體方案中，接受樣本區(qū)域包括吸附層，該吸附層上固定有一定數(shù)量的免疫球蛋白G類抗體的吸附試劑。吸附層可以是尼龍膜或硝酸纖維素膜等等微孔膜；膜的孔徑可以為2-10微米，優(yōu)選為4-7微米；最優(yōu)選為5-6微米。吸附試劑選自于A蛋白、B蛋白、抗免疫球蛋白G類的抗體等，優(yōu)選為A、B蛋白；處理蛋白的濃度為1-10毫克/毫升，優(yōu)選為2.5毫克/毫升。吸附試劑的濃度可以根據(jù)不同的檢驗(yàn)要求任意調(diào)節(jié)，例如只要求精確檢測(cè)IgM，可以增加吸附試劑的濃度以至可以完全吸附樣本中的IgG，例如要同時(shí)檢測(cè)IgG和IgM，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)吸附試劑的濃度以至可以吸附掉樣本里多余的部分IgG。捕獲物可以是生物素或者抗生物素的抗體，也可以是抗免疫球蛋白的抗體，例如抗IgM、IgG、IgA、IgE、IgD的抗體或者抗體片段，還可以是抗原或者抗原片段；完成反應(yīng)必須的一個(gè)或多個(gè)試劑區(qū)域包括帶有顏色標(biāo)記物質(zhì)的標(biāo)記區(qū)域，該帶顏色顆粒為膠體金顆?；蛘呷槟z膠體顆粒；被標(biāo)記的物質(zhì)可以是抗原或抗原片段，也可以是抗體或抗體片段等等。
在另一方案中，所述的接受樣本區(qū)域還包括樣本接受層，該樣本接受層和吸附層組合形成接受樣本區(qū)域；組合的方式可以是樣本接受層在吸附層之上、樣本接受層在吸附層之下、吸附層在兩層樣本接受層之間之一。
在另一方案中，檢測(cè)裝置還包括帶有加樣孔和結(jié)果讀取窗口的上板和下板，試紙條位于上板和下板之間，加樣孔和接受樣本區(qū)域?qū)?yīng)，結(jié)果讀取窗口和檢測(cè)區(qū)域?qū)?yīng)。在檢測(cè)時(shí)，樣本通過加樣孔流到接受樣本區(qū)域，通過結(jié)果讀取窗口讀取檢測(cè)區(qū)域上的檢測(cè)結(jié)果。
在另一具體方案中，檢測(cè)裝置中的吸附層為尼龍膜，檢測(cè)區(qū)域由硝酸纖維素膜構(gòu)成，在硝酸纖維素膜上固定結(jié)合被分析物的兩種捕獲物質(zhì)，一帶顏色標(biāo)記物的區(qū)域位于接受樣本區(qū)域和檢測(cè)區(qū)域之間。其中，捕獲物分別為鼠抗人IgG和連球菌生物素蛋白(Streptavidin)；在標(biāo)記區(qū)域上處理有與乳膠膠體相連的登革熱病毒抗原以及乳膠膠體與帶有生物素(Biotin)鼠抗人IgG單克隆抗體相連；在尼龍膜上處理有一定量的A蛋白。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的檢測(cè)裝置剖面結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例2的檢測(cè)裝置剖面結(jié)構(gòu)示意圖；
圖3是本發(fā)明實(shí)施例2的檢測(cè)裝置平面俯視結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例2的檢測(cè)IgM裝置平面俯視結(jié)構(gòu)示意圖；圖5A-5B是本發(fā)明實(shí)施例1在檢測(cè)加樣后吸附反應(yīng)過程模擬示意圖；圖6A是本發(fā)明實(shí)施例3的檢測(cè)裝置平面俯視結(jié)構(gòu)示意圖；圖6B是本發(fā)明實(shí)施例3的檢測(cè)裝置IgM為陽性和IgG為陰性結(jié)果示意圖；圖6C是本發(fā)明實(shí)施例3的檢測(cè)裝置IgM為陰性和IgG為陽性結(jié)果示意圖；圖7是本發(fā)明實(shí)施例4的檢測(cè)裝置平面俯視結(jié)構(gòu)示意圖；圖8是本發(fā)明實(shí)施例5的檢測(cè)裝置平面俯視結(jié)構(gòu)示意圖；圖9是本發(fā)明實(shí)施例6的檢測(cè)裝置平面俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
圖中主要標(biāo)號(hào)說明上板1，結(jié)果讀取窗3，加樣孔4，試紙條5，吸水區(qū)域6，檢測(cè)區(qū)域7，標(biāo)記區(qū)域8，接受樣本區(qū)域9，樣本接受層10，吸附層39，支撐墊板11，檢測(cè)裝置12，下板13，控制區(qū)域15，捕獲被分析物區(qū)域27，IgM捕獲物17，IgG捕獲物2，IgA捕獲物30，被檢測(cè)樣本20，免疫球蛋白G類抗體21，免疫球蛋白M類抗體22，免疫球蛋白非G類和M類其它類抗體23，微孔18。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步介紹實(shí)施例1如圖1所示的試紙條5，有一支撐墊板11，在支撐墊板11上有檢測(cè)區(qū)域7，在支撐墊板11的一端由吸附層39和加樣層10疊加形成的接受樣本區(qū)域9，另一端為吸水區(qū)域6，在接受樣本區(qū)域9和檢測(cè)區(qū)域7之間有一標(biāo)記區(qū)域8。接受樣本區(qū)域9、標(biāo)記區(qū)域8、檢測(cè)區(qū)域7和吸水區(qū)域6相連，能夠讓來自于接受樣本區(qū)域9的被檢測(cè)液體樣本沿液體流動(dòng)方向(箭頭所示)流動(dòng)并依次經(jīng)過標(biāo)記區(qū)域8、檢測(cè)區(qū)域7，最后到達(dá)吸水區(qū)域6。
在吸附層39上處理有可以結(jié)合樣本里IgG抗體的吸附試劑，該類吸附物質(zhì)可以是一些蛋白和外源凝集素(Lectins)之一或者它們的混合物，例如A蛋白、B蛋白、G蛋白、伴刀豆球蛋白A(Concanavalin A)、抗IgG的抗體、小扁豆凝集素(Lentil lectin)、金黃球菌凝集素(Wheat germ lectin)、花生凝集素(Peanut lectin)等等。在一個(gè)優(yōu)選的方案中，吸附層還可以具有一定大小的孔徑，可以讓沒有被吸附的IgG、IgM或者需要檢測(cè)的其它類免疫球蛋白抗體通過該吸附層的微孔，然后隨著檢測(cè)液體到達(dá)檢測(cè)區(qū)域7上。多余IgG被減少的過程如圖5A和圖5B所示，在檢測(cè)時(shí)，向含有吸附層39的接受樣本區(qū)域9上加入檢測(cè)樣本20后，樣本20中的大部分IgG 21被吸附層39上的吸附試劑19結(jié)合并固定在吸附層39上，剩下的沒有被結(jié)合的其他類抗體23或部分IgG抗體通過吸附層的微孔18流向檢測(cè)區(qū)域7。吸附試劑的處理濃度可以根據(jù)不同吸附層材料、吸附層數(shù)量的多少和檢測(cè)目的來任意調(diào)節(jié)；吸附層微孔的大小沒有特別的限制，只要可以讓沒有被吸附的抗體蛋白通過就可以。構(gòu)成吸附層的材料如常用的尼龍膜，孔徑為3-10微米都可以，還可以是硝酸纖維素膜或者其他現(xiàn)有技術(shù)公知的常用微孔膜，只要可以在上面固定住一定量吸附試劑即可。
實(shí)施例2如圖2和圖3所示，與實(shí)施例1所不同之處在于，試紙條5被安裝在檢測(cè)裝置12的上板1和下板13之間，其中上板1的加樣孔4和試紙條5上接受樣本區(qū)域9對(duì)應(yīng)，結(jié)果讀取窗口3和試紙條5上的檢測(cè)區(qū)域7對(duì)應(yīng)。試紙條5上的檢測(cè)區(qū)域7包括捕獲被分析物區(qū)域27和控制區(qū)域15。在區(qū)域27上包括一種特異捕獲物(虛線所示)，當(dāng)樣本中存在被分析物的時(shí)候，該捕獲物可以特異直接結(jié)合或間接結(jié)合樣本中的被分析物，使被分析物在區(qū)域27上累積起來，如果不存在被分析物的時(shí)候，該區(qū)域27上不能累積被分析物。控制區(qū)域15也可以包括一種捕獲物(虛線所示)來捕獲標(biāo)記物質(zhì)來顯示檢驗(yàn)該結(jié)果是否有效，無論區(qū)域27上是否有被分析物累積，該控制區(qū)域總會(huì)出現(xiàn)顏色線條來顯示結(jié)果的有效性，否則還要重新檢測(cè)一次。
如圖4所示，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，捕獲被分析物區(qū)域27上的特異捕獲物為IgM捕獲物17，它可以是抗IgM的抗體，如鼠抗人IgM、羊抗人IgM、兔抗人IgM的抗體。在標(biāo)記區(qū)域8上可以是帶有標(biāo)記物的抗原，該抗原可以是病毒抗原，例如登革熱病毒抗原、肝炎病毒抗原等等(未顯示)。標(biāo)記物可以是帶有顏色的標(biāo)記物，例如膠體金顆粒、乳膠顆粒等等。在檢測(cè)時(shí)候，如果樣本中存在特異抗原的IgM，大量的IgG被吸附層39上的吸附試劑19固定吸附后，由于減少了IgG競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗原上的位點(diǎn)，所以使IgM就很容易和帶有標(biāo)記物的抗原形成復(fù)合物，IgM捕獲物17能夠捕獲更多的帶有標(biāo)記物的IgM復(fù)合物，從而大大提高檢測(cè)IgM的靈敏度，這樣就很好地提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
實(shí)施例3如圖6A所示，與實(shí)施例2不同之處在于，在捕獲被分析物區(qū)域27上還包括IgG捕獲物2，捕獲物2位于IgM捕獲物17和控制區(qū)域15之間。圖6B是檢測(cè)樣本中不存在特異抗原IgG的陰性結(jié)果，而存在特異抗原的IgM的陽性檢測(cè)結(jié)果；圖6C是檢測(cè)樣本中不存在特異抗原IgM的陰性結(jié)果，而存在特異抗原的IgG的陽性檢測(cè)結(jié)果。
實(shí)施例4如圖7所示，與實(shí)施例3不同之處在于，IgM捕獲物17位于IgG捕獲物2和控制區(qū)域15之間。
實(shí)施例5如圖8所示，與實(shí)施例4不同之處在于，在捕獲被分析物區(qū)域27上還包括IgA捕獲物30，捕獲物30位于IgG捕獲物和控制區(qū)域15之間。
實(shí)施例6如圖9所示，與實(shí)施例3不同之處在于，在捕獲被分析物區(qū)域27上還包括IgA捕獲物30，區(qū)域30位于區(qū)域17和控制區(qū)域15之間。
實(shí)驗(yàn)為了更好的說明本發(fā)明的有益效果，現(xiàn)予以實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步地說明。
實(shí)驗(yàn)1尼龍膜蛋白承載能力實(shí)驗(yàn)材料吸水紙、硝酸纖維素膜、聚酯膜、玻璃纖維，孔徑為5微米的尼龍膜66，單克隆抗體1，單克隆抗體2，A蛋白，膠體金顆粒。
材料處理硝酸纖維素膜片材的處理將硝酸纖維素膜粘貼于塑料襯墊，用噴膜機(jī)器在上面分別噴灑兩條線條，依次為單克隆抗體1的線條和控制線。把處理好的硝酸纖維素膜在37℃的烘箱里烘干。
標(biāo)記墊的處理將單克隆抗體2與膠體金顆粒偶聯(lián)，用機(jī)器噴灑在聚酯膜上。
尼龍網(wǎng)膜作為吸附層的處理用磷酸緩沖液體(PH，7.2)配置A蛋白溶液，使A蛋白的濃度為2.5毫克/毫升。然后處理尼龍網(wǎng)膜，使每平方厘米上有大約40微克的A蛋白。最后把處理好的尼龍網(wǎng)膜在37下烘2個(gè)小時(shí)，所選用的尼龍網(wǎng)膜的孔徑為5微米。
樣品墊的處理在玻璃纖維上處理紅細(xì)胞抗體，緩沖液和一些常用的表面活性試劑。
含試紙條測(cè)試裝置的準(zhǔn)備在硝酸纖維素膜的片材上靠近控制線的一端帖上吸水墊，讓吸水墊和硝酸纖維素膜大約有2-5毫米的疊加；然后在硝酸纖維素膜的片材上靠近檢測(cè)線的一端貼上標(biāo)記墊和樣品墊，然后在切割機(jī)器上切成4毫米寬的試紙條。最后把試紙條裝配在塑料板子中，讓該板子上板的樣本加樣孔和樣本墊對(duì)應(yīng)，上板讀取結(jié)果窗和纖維素膜對(duì)應(yīng)，制作若干個(gè)如此測(cè)試裝置。
實(shí)驗(yàn)過程將A蛋白溶液分別用磷酸緩沖液體稀釋至25.6ug/ml、17.1ug/ml、12.8ug/ml、10.24ug/ml、8.53ug/ml，分別取100ul稀釋好的溶液，加至制作好的測(cè)試裝置的加樣孔，10分鐘記錄結(jié)果。
重復(fù)以上測(cè)試并記錄結(jié)果。
根據(jù)結(jié)果制作A蛋白濃度和測(cè)試結(jié)果相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
在測(cè)試裝置的樣本墊上分別覆上一層，兩層和三層處理好的尼龍網(wǎng)膜。吸取100ul磷酸緩沖液體加入到測(cè)試裝置的加樣孔中。記錄10分鐘后的結(jié)果。重復(fù)以上測(cè)試并記錄結(jié)果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和制作好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別換算出一層，兩層和三層尼龍網(wǎng)膜的A蛋白濃度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果原先處理的尼龍網(wǎng)膜每片約含A蛋白7.2ug，以最大值1ug作為尼龍網(wǎng)膜未能結(jié)合的蛋白量計(jì)算，即每片能承載蛋白6.2ug表1、尼龍網(wǎng)膜不同層數(shù)和蛋白承載能力

結(jié)論從以上結(jié)果可以看出，實(shí)驗(yàn)1中測(cè)試裝置所用的尼龍網(wǎng)膜至少牢靠固定了86％的A蛋白，同時(shí)也證明了尼龍網(wǎng)膜作用的有效性。
實(shí)驗(yàn)2利用本發(fā)明所述的技術(shù)方案來一步檢測(cè)登革熱病毒IgG和IgM實(shí)驗(yàn)材料硝酸纖維素膜；鼠抗人登革熱病毒免疫球蛋白G類抗體的單克隆抗體，并且該單克隆抗體與抗生物素鏈球菌蛋白相連；登革熱病毒抗原；乳膠膠體；鼠抗人登革熱病毒免疫球蛋白M類抗體單克隆抗體，并且該單克隆抗體與生物素相連；孔徑分別為3微米、4微米、5微米、6微米、8微米的尼龍膜66；A蛋白；吸水紙；聚酯膜；玻璃纖維素膜；噴膜和乳膠的機(jī)器；烘箱；25份用PanBion公司的酶標(biāo)試劑盒確定為登革熱IgM和IgG為陽性血清樣本和100份陰性血清；PanBion公司檢測(cè)登革熱病毒免疫球蛋白M和G類抗體的快速測(cè)試裝置。
材料處理硝酸纖維素膜片材的處理先把寬25毫米的硝酸纖維素膜粘貼在塑料底板上，用噴膜機(jī)器在硝酸纖維素膜上分別噴灑三條線條，依次為檢測(cè)IgM的線條、IgG線條和控制線。在檢測(cè)IgM的線條上噴灑的濃度為20ug/cm的抗生物素鏈球菌蛋白；在IgG線條上噴灑的濃度為20ug/cm的鼠抗人登革熱病毒免疫球蛋白G類抗體的單克隆抗體，控制線為標(biāo)記蛋白的藍(lán)色乳膠與曙紅混合溶液，當(dāng)發(fā)生層析時(shí)，曙紅將會(huì)隨著層析向上方移動(dòng)，在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)控制線將變成藍(lán)色，以示檢測(cè)試劑流過檢測(cè)線。然后把處理好的硝酸纖維素膜在37℃的烘箱里烘干。
標(biāo)記墊1的處理把登革熱病毒抗原和乳膠膠體溶液按重量比為1∶4混合。然后用稀釋緩沖液體稀釋該混合液體，使被標(biāo)記的登革熱病毒抗原達(dá)到一定濃度，稀釋緩沖液體組成成分為5％BSA，0.02％疊氮鈉，25％的蔗糖。
標(biāo)記墊2的處理抗生物素鏈球菌蛋白相連的鼠抗人登革熱病毒免疫球蛋白M類抗體單克隆抗體，然后把該溶液稀釋終濃度為10ug/ml，最后把該溶液噴灑在聚脂膜上，在37℃的烘箱里烘10h。稀釋緩沖液由Tris鹽、50毫克/毫升BSA、5毫克/毫升的PVP組成，PH值為8.0。
尼龍網(wǎng)膜66的處理用磷酸緩沖液體(pH，7.2)配置A蛋白溶液，使A蛋白的濃度為2.25毫克/毫升。然后處理尼龍網(wǎng)膜，使每平方厘米上有大約40微克的A蛋白。最后把處理好的尼龍網(wǎng)膜在37℃下烘2個(gè)小時(shí)，所選用的尼龍網(wǎng)膜的孔徑為5微米。用同樣的方法處理孔徑為3微米、4微米、6微米、8微米的尼龍膜。
樣品墊的處理在玻璃纖維素膜上處理紅細(xì)胞抗體、BSA、Tirs鹽、PVP和一些常用的表面活性試劑。
測(cè)試裝置的準(zhǔn)備如圖1所示，在硝酸纖維素膜的片材上靠近控制線的一端帖上吸水墊，讓吸水墊和硝酸纖維素膜大約有2-5毫米的疊加；然后在硝酸纖維素膜的片材上靠近IgM檢測(cè)線的一端依次縱向貼上標(biāo)記墊1和標(biāo)記墊2，和樣品墊，然后在樣品墊上疊加一層處理好的尼龍膜，最后在切割機(jī)器上切成4毫米寬的試紙條。最后把試紙條裝配在塑料板子中，讓該板子上板的樣本加樣孔和樣本墊上的尼龍膜對(duì)應(yīng)，上板讀取結(jié)果窗和纖維素膜對(duì)應(yīng)，制作150個(gè)如此測(cè)試裝置。對(duì)照測(cè)試裝置的準(zhǔn)備。除了沒有尼龍網(wǎng)膜外，該試紙條的結(jié)構(gòu)和處理過程和上面所述的一樣，數(shù)量也是150個(gè)。
實(shí)驗(yàn)過程首先，分別向?qū)φ蘸蜏y(cè)試的裝置滴加5微升同一陽性血清，然后在10-30分鐘內(nèi)讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并對(duì)所有25份陽性血清進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，按照此方法檢測(cè)100份陰性血清，并在10-30分鐘內(nèi)讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果(實(shí)驗(yàn)結(jié)果略)。本發(fā)明的檢測(cè)裝置和目前市場(chǎng)上銷售的PanBion公司同類產(chǎn)品作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表2、有尼龍網(wǎng)膜和沒有尼龍網(wǎng)膜對(duì)IgM and IgG靈敏度的影響(尼龍膜孔徑5微米)

表3、有尼龍網(wǎng)膜和沒有尼龍網(wǎng)膜對(duì)IgM and IgG靈敏度的影響(尼龍膜孔徑3微米)

表4、有尼龍網(wǎng)膜和沒有尼龍網(wǎng)膜對(duì)IgM and IgG靈敏度的影響(尼龍膜孔徑4微米)

表5、有尼龍網(wǎng)膜和沒有尼龍網(wǎng)膜對(duì)IgM and IgG靈敏度的影響(尼龍膜孔徑6微米)

表6、有尼龍網(wǎng)膜和沒有尼龍網(wǎng)膜對(duì)IgM and IgG靈敏度的影響(尼龍膜孔徑8微米)

表7、有尼龍膜的檢測(cè)裝置和Panbio公司的檢測(cè)裝置比較實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果由上表2-6可以知道，沒有尼龍網(wǎng)膜的時(shí)候，IgM檢測(cè)的靈敏度只有72％，而在試紙條上加入了尼龍網(wǎng)膜后，使IgM的靈敏度提高了28％。同時(shí)對(duì)檢測(cè)IgG的靈敏度沒有大的影響。對(duì)100份陰性血清測(cè)試的結(jié)果來看(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)略)，IgG和IgM的檢測(cè)都是陰性結(jié)果，說明對(duì)二者的特異性沒有太大的影響；另外網(wǎng)膜孔徑對(duì)靈敏度和特異性都沒有太大的影響，同時(shí)在實(shí)際反應(yīng)中，網(wǎng)膜的孔徑越小，檢測(cè)液體樣本到達(dá)檢測(cè)區(qū)域的時(shí)間相對(duì)要長一些，但是對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有什么影響(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9)。
由表7可以看出，本發(fā)明對(duì)IgM的測(cè)試的靈敏度大大高于目前市場(chǎng)上所銷售Panbio公司的產(chǎn)品。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還做了全血樣本的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和血清樣本一樣(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)略)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)免疫球蛋白的裝置，包括；可以讓液體樣本在上流動(dòng)的試紙條，在試紙條上有接受液體樣本區(qū)域、檢測(cè)區(qū)域和完成檢測(cè)所必須的反應(yīng)試劑區(qū)域，其中，試紙條上的檢測(cè)區(qū)域包括捕獲被分析物區(qū)域，所述捕獲被分析物區(qū)域包括捕獲免疫球蛋白的捕獲物；其特征在于，在接受樣本區(qū)域上固定有吸附樣本中G類免疫球蛋白的吸附試劑。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述試紙條是硝酸纖維素膜試紙條，所述的接受液體樣本區(qū)域包括吸附層和樣本接受層，吸附試劑被固定在吸附層上，所述的反應(yīng)試劑區(qū)域包括標(biāo)記區(qū)域。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述吸附層為孔徑為3-10微米的尼龍膜，吸附試劑為A蛋白、B蛋白、抗IgG的抗體、外源凝集素之一或它們的混合物。
4.如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述尼龍膜的孔徑為4-7微米，吸附試劑為A蛋白。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述捕獲免疫球蛋白的捕獲物包括抗人免疫球蛋白M類的抗體，所述反應(yīng)試劑區(qū)域包括位于接受樣本區(qū)域和檢測(cè)區(qū)域之間的標(biāo)記區(qū)域，該標(biāo)記區(qū)域上包括帶有顏色的標(biāo)記物和抗原。
6.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述捕獲免疫球蛋白的捕獲物還包括抗人G類免疫球蛋白的抗體，所述吸附層包括孔徑為4-8微米的尼龍膜，所述吸附試劑是A蛋白。
7.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述標(biāo)記區(qū)域上包括帶有顏色膠體顆粒標(biāo)記的登革熱病毒抗原和帶有抗生素的鼠抗人登革熱病毒M類免疫球蛋白的單克隆抗體，所述捕獲物包括抗抗生素的抗體和鼠抗人登革熱病毒G類免疫球蛋白的單克隆抗體。
8.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE或IgD；所述捕獲物包括抗IgG、IgM、IgA、IgE和IgD之一的抗體、生物素或者抗生物素的抗體。
9.一種檢測(cè)免疫球蛋白抗體的裝置，包括可以讓液體樣本在上流動(dòng)的硝酸纖維素膜試紙條，在試紙條上沿液體流動(dòng)方向依次為接受液體樣本區(qū)域、帶顏色顆粒的標(biāo)記區(qū)域、檢測(cè)區(qū)域和吸水區(qū)域，其中，檢測(cè)區(qū)域包括捕獲被分析物區(qū)域和控制區(qū)域，所述捕獲被分析物的區(qū)域固定有特異捕獲免疫球蛋白的捕獲物；其特征在于，在接受樣本區(qū)域上固定有吸附樣本里G類免疫球蛋白的吸附試劑。
10.一種檢測(cè)特異G或M類免疫球蛋白的裝置，包括可以讓液體樣本在上流動(dòng)的硝酸纖維素膜試紙條，在試紙條上沿液體流動(dòng)方向依次為接受液體樣本區(qū)域、帶顏色顆粒的標(biāo)記區(qū)域、檢測(cè)區(qū)域和吸水區(qū)域，其中，檢測(cè)區(qū)域包括直接或間接捕獲G或M類特異免疫球蛋白的捕獲物和控制區(qū)域，其特征在于，所述接受樣本區(qū)域包括吸附層，所述吸附層上固定有吸附樣本里G類免疫球蛋白的吸附試劑。
11.如權(quán)利要求1-10之一所述的檢測(cè)裝置，其特征在于，所述檢測(cè)裝置還包括含有加樣孔和結(jié)果讀取窗的上板和下板，所述試紙條位于上板和下板之間，上板的加樣孔和試紙條上的接受樣本區(qū)域?qū)?yīng)，結(jié)果讀取窗和試紙條上的檢測(cè)區(qū)域?qū)?yīng)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測(cè)免疫球蛋白的裝置，該裝置包括可以讓檢測(cè)液體在上流動(dòng)的試紙條，在試紙條上包括接受樣本區(qū)域、檢測(cè)區(qū)域和完成反應(yīng)必須的一個(gè)或多個(gè)試劑區(qū)域，其中檢測(cè)區(qū)域包括捕獲被分析物區(qū)域，所述的捕獲被分析物區(qū)域包括特異直接或間接捕獲免疫球蛋白的捕獲物，接受樣本區(qū)域固定有吸附G類免疫球蛋白的吸附試劑。使用該裝置可以大大提高檢測(cè)樣本中的IgM的靈敏度而對(duì)其特異性沒有影響，同時(shí)還提供了高靈敏度和高特異性同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分IgG和IgM抗體的檢測(cè)裝置。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101078726SQ200610151809
公開日2007年11月28日 申請(qǐng)日期2006年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月5日
發(fā)明者孫少民, 劉杰, 徐立 申請(qǐng)人:因韋爾尼斯醫(yī)藥瑞士股份有限公司