專利名稱：：一種均相熒光免疫檢測領域新型熒光物質組合技術的制作方法
技術領域：
：熒光免疫檢測技術技術背景均相熒光免疫檢測法(homogeneousfluroimmunoassay,HFIA)是基于熒光共振肯g量轉移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)原理發(fā)展的一種新的免疫檢測技術。常用的方法是用二個熒光物質分別標記同一抗原的二個抗體，其中一個熒光物質(供體)的發(fā)射光波長與另一個熒光物質(受體)的激發(fā)光波長相互重疊。當同把二個熒光標記抗體加入到反應液中，用雙抗體夾心法檢測待測抗原。如果待測樣品中含有目的抗原，會發(fā)生抗原、抗體反應，形成抗原、抗體復合物，供體熒光物質與受體熒光物質緊密接觸。這時采用熒光檢測儀或時間分辨熒光檢測儀檢測反應液熒光信號，用短波長紫外光激發(fā)供體熒光，就會發(fā)生FRET。供體發(fā)射的熒光能進一步激發(fā)受體分子發(fā)射出更長波長的熒光。這樣不僅可以增強熒光信號，并且可以降低背景熒光，減少非特異性熒光的干擾，顯著提高信噪比。這是因為，(l)供體產生熒光后，再激發(fā)受體產生熒光，有放大熒光信號的作用。(2)受體熒光一般波長較長，多為紅光或紅外光。而樣品中本底熒光物質在受到紫外光激發(fā)后波長位移沒有這么大，多為綠色光和黃色光，并會迅速衰減。因此，長波長熒光信號不受非特異性熒光的干擾，信噪比較高。此外，均相免疫檢測法是在抗原、抗體反應后，直接檢測反應液的熒光信號，省卻了酶聯免疫檢測法(ELISA)需要反復孵育和洗板等煩瑣的操作步驟，也相應地避免了許多人為操作因素和試劑、環(huán)境等外界因素的干擾，操作簡單，檢測時間短，穩(wěn)定性和重復性較好，能較真實地反映被測物質的含量。傳統的熒光染料激發(fā)光和發(fā)射光波長之間的Stokes位移較小，僅有30-SOmn,常有部分重疊，較易受到非特異性熒光干擾?，F在熒光FRET技術通常采用鑭系元素銪(Eu)、锝(Tb)等作為供體熒光材料，激發(fā)光波長和發(fā)射光波長之間Stokes位移較大，超過250nm，如Eu的激發(fā)波長為340nm,最大發(fā)射波長為615nm,二者相差290nm，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜沒有重疊，可避免非特異性熒光的干擾。鑭系離子螯合物經紫外光激發(fā)后不僅強度高，而且半衰期長(比普通的熒光物質半衰期長5-6個數量級)，穩(wěn)定性好(低溫條件可保存三年)，非常適合于抗原、抗體標記，因而成為二十一世紀最熱門的熒光材料。在均相熒光免疫檢測技術中，通常將標記抗體的熒光物質制備成納米顆粒。然后再標記相應的抗體或抗原。這樣，既可以減少熒光物質的泄漏，也可以增強熒光物質的穩(wěn)定性。當抗原、抗體發(fā)生反應形成抗原、抗體復合物時，熒光納米顆粒緊密接觸，在受到激發(fā)光刺激后，通過納米顆粒間發(fā)生的FRET,顯著增強熒光信號。這種技術目前廣泛應用于蛋白或半抗原的免疫熒光檢測或制備微型生物傳感器。目前，均相熒光免疫檢測技術常用的熒光物質配伍組合是銪(Eu)或锝(Tb)與Cy5、Cy3或藻紅蛋白等組合方式。Eu的最大激發(fā)光為3々0nm,最大發(fā)射光為615rnn,Cy5的最大激發(fā)光為643nm，最大發(fā)射光為670nm。Eu發(fā)射光與Cy5發(fā)射光之間仍有部分重疊，本底熒光還比較高，影響均相熒光免疫檢測的靈敏度和信噪比。參考文獻1.LeenaKokko,etal.Europium(III)chelate-dyednanoparticlesasdonorsinahomogeneousproximity—basedimmunoassayforestradiol.AnalyticaChimicaActa(2004),503:155-1622.KimuraH,etal.Rapidandsimplequantitationofmethamphetaminebyusingahomogeneoustime—resolvedfluoroimmunoassaybasedonfluorescenceresonanceenergytransferfromEuropiumtoCy5.J.ofAnalyticalToxicology.2005;29:799-8043.LovgrenT,etal.One—stepall-in-onedryreagentimmunoassayswithfluorenscenterupiumchelatelabelandtime-resolvedfluorometry.ClinicalChemistry,1996,42(8):1196-12014.HuhtinenP,etal.Quantitative,rapidEuropium(III)nanoparticle-label-basedall-in-onedry-reagentimmunoassayforthyroid-stimulatinghormone.ClinicalChemistry,2004,50(10):1135-365.KogaK，etal.Expressionofangiopoietin-2inhumangliomacellsanditsroleforangiogenesis.CancerResearch.2001;61:6248—62546.SumnerJPandKopelmanR.Alexa488asanironsensingmolecularanditsapplicationinPEBBLEnanosensors.Analyst.2005;130:528—5337.ArttamangkulS.etal.Bindingandinternalizationoffluorescentopioidpeptideconjugatesinlivingcells.MolecularPharmocology.2000;58:1570-15808.SoukkaT，etal.Utilizationofkineticallyenhancedmonovalentbindingaffinitybyimmunoassaysbasedonmultivalentnanoparticle-antibodybioconjugates.Anal.Chem.2001;73:2254-2260
發(fā)明內容本發(fā)明專利涉及一種均相熒光免疫檢測領域熒光物質新型組合技術。主要技術特點是，分別制備銪(Eu)和阿萊克薩紅(Alexa680)熒光納米微球，并分別標記同一抗原的兩株單克隆抗體。Alexa680的最大激發(fā)波長為680nm,最大發(fā)射波長為730nm。兩種熒光納米微球標記抗體同時加入到檢測反應液中，用時間分辨熒光檢測儀或熒光分光光度計在激發(fā)光為340rim,發(fā)射光730nm處檢測反應液的熒光強度。如果反應液中存在待測抗原，將形成抗原、抗體復合物，使得Eu熒光納米微球和Alexa680熒光納米微球緊密接觸，Eu熒光納米微球受到340nra紫外光激發(fā)后，發(fā)射出的550-700nm熒光可以進一步激發(fā)Alexa680發(fā)射出710-750nm熒光。以梯度稀釋的已知抗原作標準曲線，可計算出待測樣品中目的抗原的濃度。以銪(Eu)和阿萊克薩紅Ulexa680)兩種熒光物質組合分別標記抗體，釆用均相免疫檢測法來檢測待測抗原的濃度，Eu發(fā)射光(550-700nm)與Alexa680發(fā)射光(710-750nm)之間沒有重疊，可避免目的熒光信號與本底熒光之間重疊和干擾問題，顯著提髙730nm熒光信號的信噪比。這種新型熒光物質組合方式比采用Eu與Cy5或Cy3等熒光染料組合特異性更好、信噪比更高。實現方式本發(fā)明技術可以通過分別制備銪(Eu)和阿萊克薩紅(Alexa680)熒光納米微球，熒光納米微球分別標記同一抗原的兩株單克隆抗體，組合形成檢測試劑盒，采用均相熒光免疫檢測法來實現對待測樣品目的抗原含量的檢測。具體的熒光納米微球制備方法、標記抗體方法及均相熒光免疫檢測方法(以標記促血管生成素2(angiopoietin-2，Ang-2)抗體，檢測血清Ang-2含量為例)如下1.材料與試劑l.l核心微球單體丙稀酰胺UG);交聯劑二甲基丙稀酰胺(bis);氣溶膠琥珀酸二辛酯磺酸鈉(AOT)和乳化劑Brij30;催化劑過硫酸銨(AP)、加速劑四甲基乙二胺(TEMED);有機溶液正己烷；磷酸緩沖液(PBS),PH7.4;熒光材料Eu螯合物TEKES-Eu;阿萊克薩紅(AlexaFluor680)1.2外殼單體:苯乙烯(Styrene,St)、氨基官能團單體(Aminoethylmethacrylatehydrochloride,AEMH)、乳化劑(Hexadecyltrimethylammoniumbromide,HDTAB)、引發(fā)劑(2,2'-azobisisobutyramidinedihydrochloride,AIBA或2,2'-azobisdimethylenisobutyramidinedihydrochloride,ADIBA)、終止劑(對苯二酴Hydroquinone)。2.氨基化核殼熒光納米微球制備配方見下表表1-1聚丙烯酰胺核心微球(core)合成配方<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表1-2聚丙烯酰胺核心微球(core)合成配方<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2氨基化聚苯乙烯外殼合成配方<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>3.具體制備方法和操作步驟:3.1銪(Eu)熒光納米核心微球的制備。釆用反相微乳液聚合法合成熒光納米核心微球。在PH7.4的磷酸緩沖液中，按照表1-1的配方和比例加入Eu螯合物TEKES-Eu、丙稀酰胺，交聯劑雙叉丙稀酰胺。溶解后加入20ml正己烷，再加入氣溶膠琥祐酸二辛酯磺酸鈉AOT和乳化劑Brij30，在通氮氣條件下慢慢噴入催化劑過硫酸銨、加速劑四甲基乙二胺(TEMED),室溫反應2小時。反應完成后，旋轉蒸發(fā)除去正己烷，產物用乙醇洗滌，最后可在30%乙醇中長期保存。3.2阿萊克薩紅(AlexaFluor680)熒光納米核心微球的制備。制備方法與上述Eu熒光納米微球制備方法相似。也是釆用反相微乳液聚合法合成熒光納米核心微球。不同的是在PH7.4的磷酸緩沖液中，按照表1-2的配方和比例加入熒光染料阿萊克薩紅(AlexaFluor680)，然后再加入丙稀酰胺，交聯劑雙叉丙稀酰胺等試劑。在通氮氣條件下慢慢噴入催化劑過硫酸銨、加速劑四甲基乙二胺(TEMED),室溫反應2小時。反應完成后，旋轉蒸發(fā)除去正己烷，產物用乙醇洗滌，最后可在30%乙醇中長期保存。3.3Eu、Alexa680納米微球的氨基化包覆。按照表2的配方和比例，以ADIBA為引發(fā)劑、以HDTAB為乳化劑，與氨基化單體AEMH交聯，制備成氨基化熒光納米微球。制備出的納米微球直徑在20-lOOmn之間，大部分為Mnm左右。(注在包覆聚苯乙烯的過程中不加入氨基化單體AEMH，可制備成非氨基化納米微球)3.4掃描電子顯微鏡測量熒光納米微球的直徑。純化的納米微球用正己烷稀釋至0.1%的濃度，移到銅網上噴涂電子染料，掃描電子顯微鏡觀測熒光納米微球直徑及大小，計算納米微球平均直徑及標準差。4.Eu、Alexa680納米微球組合在均相熒光免疫檢測中的應用。以Eu、Alexa680納米微球分別標記促血管生成素Ung-2)兩株抗體，并用于定量檢測血清Ang-2含量為例介紹檢測方法4.1熒光微球標記抗體。Ang-2單克隆抗體用磷酸緩沖液(PBS,PH7.0)稀釋成2mg/ml，分別與濃度為1%的熒光納米微球混合，在終濃度為1.25%的戊二瞎的幫助下進行微球與抗體的交聯，交聯完成后，用液相層析分離標記抗體。4.2標記抗體的純化。采用液相層析法純化標記抗體。在內徑為1.5-2.0cm的層析管內先填充Sepharose6B40ml,然后填充SephadexG5020ml形成混裝柱，加入標記好的熒光納米微球，以磷酸緩沖液為流動相，分離純化標記抗體。4.3測定標記抗體的比活度。用反應液對熒光標記抗體進行遞度稀釋，與相應標準熒光作對照，熒光檢測儀測定標記熒光的熒光信號強度，推算出抗體懸液中的熒光物質含量。然后在280nm處測定純化標記抗體的吸光度值(OD值)，計算出抗體的濃度IgGmg/ml=OD280-(0.008x熒光pmol/L)+1.34,標記抗體的比活度為熒光,1/L與IgGmg/ml的比值。4.4血清Ang-2含量均相免疫熒光檢測實驗。常規(guī)方法抽取外周血2ml，室溫靜置30分鐘使血液凝固，2500轉/分鐘(rpm)離心，吸取清亮血清，-18'C凍存?zhèn)溆谩Ｈ?5pl緩沖液(Rl)(5%聚乙二醇6000,20mMTris-HCl緩沖液，PH6.0)和15P1處理液U2)(600mM甘氨酸、0.2%Towen-20,PH2.5)加入到酶標板的微孔中，30秒鐘內立即測定340nm激發(fā)光，615nm熒光強度值Al。然后37。C再反應20min,30秒鐘內在730nm處測定反應液的熒光亮度值A2。熒光強度值△A=A2-A1。以遞度稀釋的已知濃度的Ang-2蛋白溶液作為定量標準品繪制標準曲線，并計算目的蛋白含量。權利要求1.一種均相熒光免疫檢測領域熒光物質新型組合技術。其特征是采用銪(Eu)和阿萊克薩紅(Alexa680)熒光物質組合，分別標記同一抗原的兩株單克隆抗體，應用于均相熒光免疫檢測法對細胞因子、激素和疾病標志蛋白進行定量檢測。2.權利要求1中所述的Eu和Alexa680熒光物質組合其特征是兩種熒光材料先制備成核殼型納米微球，核心為聚丙烯酰胺(PAG)嵌合熒光物質，核心微球外面包覆氨基化聚苯乙烯，富含氨基基團。3.權利要求1中所述的熒光物質組合其特征是可以與富含氨基的抗原、抗體等各種多肽蛋白質、半抗原及其他化學分子交聯，制備成檢測試劑，應用于均相熒光免疫法對各種體液蛋白、激素、細胞因子、標志蛋白和半抗原進行定量檢測。4.權利要求1中所述的熒光物質組合其特征是即使不制備成熒光納米微球，也可以用于標記各種多肽蛋白質、半抗原及其他化學分子，應用于均相熒光免疫法對各種體液蛋白、激素、細胞因子、標志蛋白和半抗原進行定量檢測。全文摘要本發(fā)明涉及一種均相熒光免疫檢測領域熒光物質新型組合技術。技術方案是分別制備銪(Eu)和阿萊克薩紅(Alexa680)熒光納米微球，并分別標記同一抗原的兩株單克隆抗體。兩種熒光納米微球標記抗體同時加入到檢測反應液中，用時間分辨熒光檢測儀或熒光分光光度計在激發(fā)光為340nm，發(fā)射光730nm處檢測反應液的熒光強度。如果反應液中存在待測抗原，將形成抗原、抗體復合物，使Eu熒光納米微球和Alexa680熒光納米微球緊密接觸，Eu熒光納米微球受到340nm紫外光激發(fā)后，發(fā)射出的550-700nm熒光可以進一步激發(fā)Alexa680發(fā)射出710-750nm熒光。以梯度稀釋的已知抗原作標準曲線，可計算出待測樣品中目的抗原的濃度。以銪(Eu)和阿萊克薩紅(Alexa680)兩種熒光物質組合，采用均相免疫檢測法來檢測待測抗原的濃度，Eu發(fā)射光與Alexa680發(fā)射光之間沒有重疊，可避免目前Eu與Cy5或Cy3等熒光染料組合目的熒光信號與本底熒光之間重疊和干擾問題，顯著提高730nm熒光信號的信噪比，可廣泛用于細胞因子、激素和疾病標志蛋白的定量檢測。文檔編號G01N33/577GK101191798SQ200610162640公開日2008年6月4日申請日期2006年12月1日優(yōu)先權日2006年12月1日發(fā)明者王珊珊申請人:王珊珊