專利名稱：：一種新型檢測(cè)重型乙型肝炎的質(zhì)譜分析試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種非侵入性檢測(cè)、評(píng)估重型乙型肝炎病人試劑盒的新方法，其特征是采用質(zhì)譜法對(duì)樣品中已被磁珠或抗體捕獲的P2-微球蛋白進(jìn)行精確地鑒別、檢測(cè)的方法。本發(fā)明提供的方法能夠檢測(cè)重型乙型肝炎的病人，其靈敏度為100%，特異性為100%。血清變異的P2-微球蛋白水平是反映肝組織損害程度良好指標(biāo)，對(duì)了解重型肝炎病情危重程度，判斷預(yù)后有重要意義。
背景技術(shù)：
：隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施和完成，科學(xué)家們提出了后基因組(post-genome)計(jì)劃的概念，研究要點(diǎn)轉(zhuǎn)移到功能基因組學(xué)上，而生物功能主要體現(xiàn)物質(zhì)是蛋白質(zhì)。1994年，澳大利亞Macquarie大學(xué)的Wilkins和Williams首先提出蛋白質(zhì)組(proteome)的概念，指的是"一種基閑組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)"，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。對(duì)于蛋白質(zhì)組的研究是功能基因組學(xué)研究的核心，稱為蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)。蛋白質(zhì)組學(xué)被認(rèn)為是后基因組研究中最主要的部分。與基因組相比，蛋白質(zhì)組的組成更復(fù)雜，功能更活躍，應(yīng)用前景更廣泛。蛋白質(zhì)組學(xué)從細(xì)胞整體水平進(jìn)行蛋白質(zhì)屬性的研究，如表達(dá)水平、翻譯后修飾及相互作用等，并由此獲得對(duì)于疾病過(guò)程、細(xì)胞生理生化特征和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的廣泛完整的認(rèn)識(shí)。所以，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)正在逐步成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及制藥學(xué)等的重要研究手段。不論是細(xì)胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)功能。因此，鑒定人體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的區(qū)別，可用于體外疾病樣本診斷及篩查，并最終用于藥物開(kāi)發(fā)和疾病治療。而要進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和功能的差異化分析，要求能夠達(dá)到分辨細(xì)胞內(nèi)分子的復(fù)雜混合物的程度。但細(xì)胞內(nèi)許多物質(zhì)往往以微量存在，R前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)序列鑒定分析。用抗體及質(zhì)譜聯(lián)合可克服這一技術(shù)缺點(diǎn)。電噴霧電離質(zhì)譜(electrosprayionizsationmassspectrometry,ESI-MS)是在毛細(xì)管的出口處施加一髙電壓，所產(chǎn)生的高電場(chǎng)使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相。電噴霧離子化的特點(diǎn)是產(chǎn)生髙電荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷比(masstochargeratio,m/z〉降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測(cè)的范圍，因而大大擴(kuò)展了分子量的分析范圍，離子的真實(shí)分子質(zhì)量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電荷數(shù)算出。基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)的基本原理是將分析物分散在吸能分子中并形成晶體，當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，由于吸能分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使吸能分子晶體升華，致使連同分析物一起進(jìn)入氣相。MALDI-TOF-MS所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子，因而質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。MALDI-TOF-MS與蛋白芯片分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用即為表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(surfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,SEIDI-TOF-MS)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是建立一種在生物樣品中檢測(cè)正常人與重型乙型肝炎在離體血液中生物標(biāo)志的試劑盒和方法。該方法為重型乙型肝炎的早期檢測(cè)提供了新的途徑，并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的變異的或修飾的生物標(biāo)志提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明涉及一種非侵入性檢測(cè)、評(píng)估重型乙型肝炎病人的新方法，其特征是采用質(zhì)譜法對(duì)樣品中己被wcx/疏水基質(zhì)或抗體捕獲的變異的e2-微球蛋白進(jìn)行精確地鑒別、檢測(cè)的方法。重型乙型肝炎血清變異的P2-微球蛋白水平顯著髙于急性乙型肝炎；重型乙型肝炎死亡者血清變異的P2-微球蛋白水平顯著髙于存活者。血清變異的P2-微球蛋白水平是反映肝組織損害程度良好指標(biāo)，對(duì)了解重型肝炎病情危重程度，判斷預(yù)后有重要意義。本發(fā)明中的變異的P2-微球蛋白生物標(biāo)志是利用一臺(tái)質(zhì)譜儀來(lái)發(fā)現(xiàn)的。該設(shè)備的質(zhì)量精確度約為+/-0.1%。02-微球蛋白生物標(biāo)志物首先能夠被具有能與生物標(biāo)志物結(jié)合的抗體或WCX/疏水吸附表面基質(zhì)捕獲，非吸附物能從基質(zhì)上洗脫，吸附到底基的生物標(biāo)志物在飛行質(zhì)譜儀中被檢測(cè)。生物標(biāo)志物通過(guò)離子發(fā)生源，如激光，被離子化，產(chǎn)生的離子被一個(gè)離:子感受集合器收集，然后質(zhì)量分析器分析那些通過(guò)的離子。之后，檢測(cè)器將檢測(cè)的離子信息轉(zhuǎn)換為質(zhì)荷比。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測(cè)試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091.IDa或6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至50%質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度的最大值。生物標(biāo)志物的檢測(cè)明顯地將與信號(hào)強(qiáng)度的檢測(cè)有關(guān)。這樣，生物標(biāo)志物的數(shù)量與質(zhì)量都可以被檢測(cè)出來(lái)。飛行質(zhì)譜對(duì)待分析物的分析生成飛行時(shí)間譜。該飛行時(shí)間譜的最終分析并不表示離子化能量攻擊一個(gè)樣本產(chǎn)生的單獨(dú)的脈沖信號(hào)，而是一系列脈沖的信號(hào)之和。這樣降低了干擾，并增加了動(dòng)態(tài)范圍。該飛行時(shí)間數(shù)據(jù)受數(shù)據(jù)處理軟件的影響。軟件中數(shù)據(jù)處理主要包括轉(zhuǎn)換飛行時(shí)間與質(zhì)荷比而產(chǎn)生質(zhì)譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過(guò)濾高頻噪音而減輕髙頻噪音。通過(guò)對(duì)生物標(biāo)志物的吸附和檢測(cè)而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可利用計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)分析程序進(jìn)行分析。該計(jì)算機(jī)程序分析這些數(shù)據(jù)以顯示檢測(cè)出的標(biāo)記物的數(shù)量，并顯示信號(hào)的強(qiáng)度和確定被檢測(cè)的每個(gè)生物標(biāo)志物的分子量。數(shù)據(jù)分析還能包括一系列的確定生物標(biāo)志物的信號(hào)強(qiáng)度和矯正數(shù)據(jù)對(duì)預(yù)定統(tǒng)計(jì)分布狀態(tài)的偏離。例如，通過(guò)計(jì)算與某些參數(shù)相關(guān)的每個(gè)峰值的高度，可規(guī)范觀測(cè)到的峰。該參數(shù)可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學(xué)成分產(chǎn)生的不重要的千擾，這可以設(shè)置調(diào)零。計(jì)算機(jī)可以將計(jì)算結(jié)果數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成各種形式來(lái)表現(xiàn)。其標(biāo)準(zhǔn)譜可以表示，但在一種形式中只有峰髙和質(zhì)量信息可以在譜帶中保留，產(chǎn)生一個(gè)較清晰的圖，并使具有幾乎相同分子量的生物標(biāo)志物更易顯現(xiàn)。在另一種形式中，兩個(gè)或更多的譜比較，便于突顯獨(dú)特的生物標(biāo)記物和那些髙于或低于校準(zhǔn)樣本的生物標(biāo)志物。分析一般包括展示從待分析物得到的信號(hào)的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過(guò)視圖進(jìn)行選擇，軟件是可用的，它可自動(dòng)檢測(cè)峰。一般情況下，該軟件通過(guò)鑒定信號(hào)具有信噪比髙于一個(gè)選擇閾值并標(biāo)記出在峰信號(hào)的質(zhì)心處的峰的質(zhì)量這樣的方式操作。在一個(gè)有效的程序中，比較許多譜線以認(rèn)定出現(xiàn)在質(zhì)譜中某一選定范圍內(nèi)同樣的一些峰。該軟件的一個(gè)版本聚集所有出現(xiàn)在確定的質(zhì)量范圍內(nèi)的各條光譜的峰，對(duì)所有在質(zhì)量(質(zhì)荷比)中值附近的峰指定一個(gè)質(zhì)量(質(zhì)荷比)簇。對(duì)生物標(biāo)志的檢測(cè)需要將一個(gè)樣本放基質(zhì)的一個(gè)吸附點(diǎn)上，接著進(jìn)行清洗。向吸附點(diǎn)上加入SINAPINIC酸等并讓其千燥。而后，用質(zhì)譜測(cè)定法對(duì)基質(zhì)進(jìn)行分析，而一個(gè)顯示了蛋白質(zhì)分子的遺留物圖將生成，這張圖是在蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量-電荷比的基礎(chǔ)上，以彼此分開(kāi)的峰圖的形式顯示出來(lái)的。通過(guò)Marm-Whitney〃檢驗(yàn)分析幾百種血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述蛋白指紋或質(zhì)譜圖譜可以用于區(qū)分正常與肝炎病人的血清。峰值CV〉309b或者p<0.01為有顯著性差異正常與肝炎病人蛋白指紋或質(zhì)譜圖譜的顯著性差異(土15Da)2045.10加4132.675193.66。G7ftG85胡.993262.124279.065474.448764.033387.194294.945630.338900.283939.424343.055838.529409.523954.054471.6760抑.0911654.93971.幼4593.826235.7111729.94070.814960.676874.8713730,440抑.024卵9.617620加13947.74112.885061.497963.4716113.6用從中篩選出一個(gè)特征蛋白11729.9Da,雙盲測(cè)試正常人與重型乙型肝炎，發(fā)現(xiàn)下述一種分子量為11729土15Da蛋白指紋(圖1)可以用于區(qū)分正常人血清、重型乙型肝炎病人的血清、重型乙型肝炎的危重病人、急性乙型肝炎病人的血清<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>發(fā)現(xiàn)分子量為11729i15DaDa蛋白指紋的變化對(duì)于鑒別重型乙型肝炎病人具有重要意義。通過(guò)這個(gè)峰的鑒別，上述結(jié)果表明，該方法的靈敏度為1009b(45/45),特異性100%(50/50)。利用C8及C18疏水基質(zhì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。因?yàn)楸卷?xiàng)發(fā)明中的生物標(biāo)記是通過(guò)質(zhì)量和抗體來(lái)標(biāo)識(shí)的，因而它們可通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定法進(jìn)行檢測(cè)而直接知道它們特定的身份。這種方法比抗體為基礎(chǔ)的ELISA及免疫熒光法更準(zhǔn)確。目前ELISA等技術(shù)主要依靠間接的化學(xué)或放射測(cè)定法，因而無(wú)法直接鑒定抗原的變異，而用免疫-質(zhì)譜技術(shù)能測(cè)定抗原變異片段的分子量。用抗e2-微球蛋白抗體基質(zhì)與質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用發(fā)現(xiàn)被分析物是分子量與上述一致，而非巳知cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中的血液中P2-微球蛋白分子的分子量(13705.9Da)。則11729土15Da化學(xué)結(jié)構(gòu)可以推測(cè)為變異的P2-微球蛋白。發(fā)現(xiàn)下述變異的P2-微球蛋白可以用于區(qū)分正常人血清、重型乙型肝炎病人的血清、重型乙型肝炎的危重病人、急性乙型肝炎病人的血清<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>重型乙型肝炎血清變異的02-微球蛋白水平顯著髙于急性乙型肝炎重型乙型肝炎死亡者血清變異的P2-微球蛋白水平顯著髙于存活者。然而，如果有必要，這些生物標(biāo)志也可通過(guò)，比如，確定多肽的氨基酸序列來(lái)進(jìn)行鑒別。例如，一個(gè)生物標(biāo)志能用許多酶描繪出來(lái)，例如V8蛋白酶(V8protease)或胰蛋白酶，而且消化片段(digestionfragments)的分子量可被用來(lái)在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索序列，這些序列與由多種酶生成的消化片斷的分子量相吻合?；蛘?，如果此生物標(biāo)志不是己知數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)分子，在生物標(biāo)志的N極氨基酸序列(N-terminalAminoAcidSequence)的基礎(chǔ)上，可使用降解探針，而后，這些探針會(huì)被用來(lái)描繪由探測(cè)到了生物標(biāo)志的樣本所生成的基因組或cDNA庫(kù)。最后，蛋白質(zhì)生物標(biāo)志可用蛋白質(zhì)梯狀排序法(proteinladdersequencing)進(jìn)行排序。通過(guò)將分子碎成碎片并將碎片用嗨解作用或其他可按順序從碎片末端除去一個(gè)單個(gè)氨基酸分子的方法進(jìn)行處理后，可生成蛋白質(zhì)梯度(proteinladders)。然后，用質(zhì)譜對(duì)此梯度進(jìn)行分析。階梯狀碎片(ladderfragments)在質(zhì)量上的差異可鑒別出從分子末端被除去的氨基酸。將11729土15Da生物標(biāo)志用多級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白質(zhì)梯狀排序法(proteinladdersequencing)進(jìn)行排序等方法。通過(guò)將分子碎成碎片，可生成蛋白質(zhì)梯度(proteinladders)-然后，用質(zhì)譜對(duì)此梯度進(jìn)行分析。査已知cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中的血P2-微球蛋白分子的分子量(分子量為13705.9Da,pi:6.1)。鑒別出11729土15Da生物標(biāo)志為變異的02-微球蛋白。其化學(xué)結(jié)構(gòu)為(從N端至C端排列的氨基酸)11729土15Da生物標(biāo)志的化學(xué)結(jié)構(gòu)N端IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGF51HPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYAC101RVNHVTLSQPKIVKWDRDMC端。將變異的P2-微球蛋白制備抗體。特異性是指某一物質(zhì)或某種疾病的專一屬性，它是代表某種物質(zhì)或某種疾病的特征。通過(guò)某些特征可以識(shí)別某種物質(zhì)或某種疾病，從而把它和其他物質(zhì)或疾病區(qū)分開(kāi)來(lái)。對(duì)專有特征的識(shí)別往往依賴于特殊的檢測(cè)方法，例如要了解某種疾病是否存在有特異性抗原就要用有關(guān)特異性抗體來(lái)檢測(cè)。自蛋白質(zhì)組學(xué)研究有新發(fā)展以來(lái)，這種傳統(tǒng)意義上特異性檢測(cè)和界定方法有了很大的突破。如一個(gè)蛋白質(zhì)不同片段變異是不同類型腫瘤的標(biāo)志。根據(jù)基因到蛋白質(zhì)表達(dá)的復(fù)雜過(guò)程，一種特異性基因的產(chǎn)物一蛋白質(zhì)必定有相關(guān)多組分蛋白質(zhì)的表達(dá)。通過(guò)對(duì)這些不同組分的檢測(cè)形成一個(gè)綜合模式圖(蛋白指紋圖譜)，將這種圖譜(如某種腫瘤)與其他圖譜(如正常人或其他疾病)相比較，進(jìn)而識(shí)別這種特異蛋白(如腫瘤抗原或其片段)，從而將正常人與患某種疾病病人血液區(qū)分開(kāi)來(lái)。具體操作步驟以下是用本發(fā)明提供的一個(gè)操作方案實(shí)例。1.樣品處理及標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清制備將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中，視需要離心澄清樣品。質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清制備定義符合如下標(biāo)準(zhǔn)供血者10人，5男5女，血型為0型；年齡為18-30歲；民族漢。生化指標(biāo)正常，包括總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功檢査、腎功檢查無(wú)遺傳病家族史無(wú)重大傳染病史。女性不能懷孕，男性為不吸煙者。2.樣品上樣將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清及樣品點(diǎn)樣在支持物的基質(zhì)上[a.可用WCX或疏水基質(zhì)的磁珠，陰離子表面(WCX,WeakCationicExchanger,—羧酸基西)基質(zhì)磁珠(實(shí)施例1)及C8及C18疏水表面磁珠；或用b.已標(biāo)記上抗e2-微球蛋白抗體基質(zhì)的磁珠(實(shí)施例2)]?？梢詫①|(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清用于質(zhì)譜的定量方法?；|(zhì)的支持物可以是金屬片、陶瓷珠、磁性珠、多聚體或毛細(xì)管電泳柱子。3.洗滌用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點(diǎn)。洗滌溶液在位點(diǎn)上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。以下可有不同步驟(1)用水徹底洗滌整個(gè)陣列點(diǎn)，自然千燥基質(zhì)及滯留的生物標(biāo)志，加0.5^L吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的制備的飽和標(biāo)準(zhǔn)溶液)(2)或用0.05%1%三氟乙酸徹底洗滌整個(gè)陣列點(diǎn)(當(dāng)用陶瓷珠、磁性珠、多聚體為支持物時(shí))，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3ram圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5nL吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸制備的飽和標(biāo)準(zhǔn)溶液)(3)或用電噴霧電離質(zhì)譜(液相色譜柱子或毛細(xì)管電泳柱子為支持物時(shí))。3.質(zhì)譜的定量控制及測(cè)試用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337咖)和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離己洗脫的生物標(biāo)志后用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)標(biāo)準(zhǔn)方法去分析滯留于各位點(diǎn)的生物標(biāo)志或蛋白質(zhì)。串聯(lián)四極桿質(zhì)譜或線性離子阱質(zhì)譜來(lái)鑒定修飾的與變異的的生物標(biāo)志及多肽denovo的測(cè)序。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。定量性質(zhì)譜調(diào)控每次測(cè)試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清在WCX磁珠中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091.1Da或6634.0Da等強(qiáng)度調(diào)至50%信號(hào)強(qiáng)度的最大值。本發(fā)明與其他非侵入性的體外檢測(cè)方法比較，具有以下的特點(diǎn)(1)準(zhǔn)確及精確用抗體及質(zhì)譜聯(lián)合精確檢測(cè)多種生物標(biāo)志方法的一個(gè)特點(diǎn)是能夠從復(fù)雜的樣品混合物中準(zhǔn)確地分辨出分析物?？贵w與抗原結(jié)合的準(zhǔn)確率超過(guò)95先。這是ELISA及免疫熒光試劑盒等的基楚。質(zhì)譜直接分析有很強(qiáng)的精確性，一般誤差率只有0.1Da。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是由氨基酸組成的，而氨基酸的平均厲量是己知的，如果知道了抗原或生物標(biāo)志的總分子量，那么抗原的變異(指氨基酸變化)就很容易被推測(cè)出來(lái)。但ELISA及免疫熒光試劑盒無(wú)法知道抗原的變異。所以，用抗體及質(zhì)譜聯(lián)合精確檢測(cè)生物標(biāo)志方法可提供被分析物(抗原或生物標(biāo)志)化學(xué)或結(jié)構(gòu)特征的直接信息。舉例己知纖維蛋白肽A分子的分子量為1536Da,化學(xué)結(jié)構(gòu)為16個(gè)氨基酸(N端Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端)。纖維蛋白肽A的抗體與質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用發(fā)現(xiàn)分子量為1536Da的纖維蛋白肽A。則100%可確定被分析物是纖維蛋白肽A,即最精確鑒別(金標(biāo)準(zhǔn))。用纖維蛋白肽A的抗體與質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用發(fā)現(xiàn)被分析物是分子量為1465i1Da變異的纖維蛋白肽A。則化學(xué)結(jié)構(gòu)可以(從N端至C端)推測(cè)為15個(gè)氨基酸N端A印-Ser-Gly-Glu-Gly-A印-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端。(2)方便本方法將蛋白質(zhì)分成了陰離子、疏水、抗體作用的蛋白質(zhì)。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)被鑒定以后可以用數(shù)碼格式(條碼帶)永遠(yuǎn)地保留下來(lái)。這樣可以節(jié)省標(biāo)本庫(kù)的面積。(3)快捷用本發(fā)明提供的已知抗體及質(zhì)譜聯(lián)合精確檢測(cè)生物標(biāo)志方法進(jìn)行疾病血清檢測(cè)時(shí)，無(wú)需對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)序即可知"變異的或修飾的生物標(biāo)志"。不像免疫熒光法試劑盒，無(wú)法知道"變異的或修飾的生物標(biāo)志"。修飾的生物標(biāo)志指甲基化、乙?；?、羥基化、磷酸化修飾等的高表達(dá)或低表達(dá)變化。用本發(fā)明提供的蛋白指紋法進(jìn)行疾病血清診斷時(shí)，無(wú)需對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)序。目前ELISA等技術(shù)主要依靠間接的化學(xué)或放射測(cè)定法，因而無(wú)法直接鑒定抗原的變異，而用免疫-質(zhì)譜技術(shù)能測(cè)定抗原變異片段的分子量。圖1正常人、重型乙型肝炎病人、急性乙型肝炎病人血清中11729土15Da蛋白指紋峰值具體實(shí)施例方式本發(fā)明將結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1一種新型檢測(cè)重型乙型肝炎的質(zhì)譜分析試劑盒和方法(1)實(shí)驗(yàn)方法一、材料1.標(biāo)本來(lái)源A.50例正常人對(duì)照組的血清；B.25例重型乙型肝炎的病人的血清；C.IO例重型乙型肝炎的危重病人(患者死亡前兩個(gè)天內(nèi))的血清；E.IO例急性乙型肝炎病人的血清。2.質(zhì)量控制A.人標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清B.質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測(cè)試前，用上述標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清。二、方法1.樣品的收集全血采集后吸取血清，置于一801C保存-301C冰箱中取出血清樣品，置冰盒上融解以10，000轉(zhuǎn)/分，4匸離心2分鐘取上清液。2.樣品的準(zhǔn)備每個(gè)吸附劑基質(zhì)支持物點(diǎn)需要血清2.5W。取血清5jxl，用1(HUU9緩沖液(9MUrea，2%CHAPS,50mMTris-HCL，pH9.0)稀釋，而后，將以上標(biāo)本冰浴振蕩30min。將15nl上述變性后標(biāo)本加入185jil相應(yīng)的結(jié)合緩沖液，待用。3.樣品檢測(cè)上樣，將上述標(biāo)本100nl加至己裝好WCX(WeakCationicExchanger,陰離子表面，羧酸基團(tuán))磁珠的PCR管(北京賽爾迪公司)中，置磁性處理器上孵育30分鐘，除去液體。加100pl結(jié)合緩沖液(50mMNaAC,pH4.0-4.5)至已裝好WCX磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育2分鐘，除去液體，重復(fù)上述操作兩次。加10WElutionBuffer2分鐘，洗脫標(biāo)本至上清液。取5Jil上清液移至另一個(gè)PCR管中，加入5HiSPA飽和溶液充分混勻，取lW混合溶液加樣至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5pL吸能分子SINAPINIC酸(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液)。所有樣本均進(jìn)行雙份檢測(cè)以減少實(shí)驗(yàn)誤差。4.將上述樣品加入質(zhì)譜中，就會(huì)生成飛行時(shí)間質(zhì)譜。外部使用多肽分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)校正質(zhì)量精確性。(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果本發(fā)明將蛋白質(zhì)分成了幾大類，即WCX陰離子、C8/C18疏水作用等蛋白。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析及定量。通過(guò)Mann-Whitney"檢驗(yàn)分析幾百種血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述蛋白指紋或質(zhì)譜圖譜可以用于區(qū)分正常與肝炎病人的血清。峰值CV〉309b或者p<0.01為有顯著性差異正常與肝炎病人蛋白指紋或質(zhì)譜圖譜的顯著性差異(±15Da)2045.104132,675193.66肪58.的2815鄰4155.885297.89鄉(xiāng)5.473262.124279.065474,448764.033387.194294.94胡30.33的00.283939.424343.05幼38.529409.523954.054471.67抑抑.0911654.93971.幼4593.826235.7111729.94070.814卿.676874.8713730.440腹024989.617620.6013947.74112.885061.497963.4716113.6用從中篩選出一個(gè)特征蛋白11729.9Da,雙盲測(cè)試正常人與重型乙型肝炎，發(fā)現(xiàn)下述—種分子量為11729i15Da蛋白指紋(圖1)可以用于區(qū)分正常人血清、重型乙型肝炎病人的血清、重型乙型肝炎的危重病人、急性乙型肝炎病人的血清<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>發(fā)現(xiàn)分子量為11729土15DaDa蛋白指紋的變化對(duì)于鑒別重型乙型肝炎病人具有重要意義。通過(guò)這個(gè)峰的鑒別，上述結(jié)果表明，該方法的靈敏度為100%(45/45),特異性100%(50/50)。利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。實(shí)施例2血液中e2-微球蛋白分子鑒定用Carbodiiraide方法(CarbodiimideMethod)將帶有羧酸基團(tuán)標(biāo)記的磁性珠上基質(zhì)與抗02-微球蛋白抗體的氨基基團(tuán)結(jié)合(GunnDL，etal.Pr印arationofsensitiveandstableerythrocytesbythecarbodiimidemethodforthedetectionofprimaryandsecondaryIgMandIgGantibody.JImmunolMethods.1972;1(4):381-389.)。將樣品點(diǎn)樣在一個(gè)抗e2-微球蛋白抗體基質(zhì)的位點(diǎn)上。用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全千燥前將第一份洗滌溶液加到該位點(diǎn)。洗滌溶液在位點(diǎn)上至少停留io秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。用1%三氟乙酸徹底洗滌整個(gè)陣列點(diǎn)，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3咖圓孔)上，自然T'燥金屬片，加0.5Sinapinicacid吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液)。用質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列去分析各位點(diǎn)的生物標(biāo)志或蛋白質(zhì)。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用抗P2-微球蛋白抗體基質(zhì)與質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用發(fā)現(xiàn)被分析物是分子量與實(shí)施例1一致，而非已知cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中的血液中P2-微球蛋白分子的分子量(13705.9Da)。則11729土15Da化學(xué)結(jié)構(gòu)可以推測(cè)為變異的P2-微球蛋白。目前ELISA等技術(shù)主要依靠間接的化學(xué)或放射測(cè)定法，因而無(wú)法直接鑒定抗原的變異，而用免疫-質(zhì)譜技術(shù)能測(cè)定抗原變異片段的分子量。發(fā)現(xiàn)下述變異的P2-微球蛋白可以用于區(qū)分正常人血清、重型乙型ffl^炎病人的血清、重型乙型肝炎的危重病人、急性乙型肝炎病人的血清<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>重型乙型肝炎血清變異的P2-微球蛋白水平顯著髙于急性乙型肝炎重型乙型肝炎死亡者血清變異的02-微球蛋白水平顯著高于存活者。實(shí)施例3重型乙型肝炎蛋白指紋圖譜一特征峰的排序鑒定將11729土15Da生物標(biāo)志用多級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白質(zhì)梯狀排序法(proteinladdersequencing)進(jìn)行排序等方法。通過(guò)將分子碎成碎片，可生成蛋白質(zhì)梯度(proteinladders)。然后，用質(zhì)譜對(duì)此梯度進(jìn)行分析。查已知cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中的血02-微球蛋白分子的分子量(分子量為13705.9Da,pi:6.1)。鑒別出U729土15Da生物標(biāo)志為變異的P2-微球蛋白。其化學(xué)結(jié)構(gòu)為(從N端至C端排列的氨基酸)11729土15Da生物標(biāo)志的化學(xué)結(jié)構(gòu)N端IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGF51HPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYAC101RVNHVTLSQPKIVKWDRDMC端。實(shí)施例4變異的e2-微球蛋白抗體的制備變異的e2-微球蛋白的合成及序列N端IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGF51HPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYAC101RVNHVTLSQPKIVKWDRDMC端。將合成的變異的P2-微球蛋白免疫小鼠，待免疫反應(yīng)出現(xiàn)后，從外周血中分離B細(xì)胞。用溶血噬菌斑分析法選擇并分離出能分泌所需抗體的單個(gè)淋巴細(xì)胞。將單個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增至1X10'個(gè)以上,用QuickmRNAPurificationKit提取mRNA。以提取的mRNA為模板，合成cDNA鏈。以此cDNA為模板，加入鼠抗體重鏈可變區(qū)(V,,)通用引物，輕鏈可變區(qū)(V,.)通用引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，獲得擴(kuò)增的V,'基閑片段和V,.基因片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物在15g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定和分離。用glassmilk回收擴(kuò)增的^,基因片段和V,.基因片段。與等摩爾嘗試的LirnkerPrimerMix混合，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，連接Vn和V,.。擴(kuò)增產(chǎn)物分離純化后，獲得特異性單鏈抗體(ScFV)。此ScFV可用于制備檢測(cè)所需DNA片。將此擴(kuò)增產(chǎn)物兩端加限制性嗨切位點(diǎn)，純化定量后，連接到P^s載體上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感染大腸桿菌T0P10。經(jīng)藍(lán)白斑篩選及酶切鑒定，篩選出重組質(zhì)粒。在96孔板形成單克隆抗體。用ELISA法篩選出效價(jià)最髙的單克隆抗體株，大量制備，并從培養(yǎng)上清中提取所需抗體。此抗體可用于制備檢測(cè)所需試劑盒。結(jié)論將來(lái)自具有統(tǒng)計(jì)意義重型乙型肝炎的樣品與對(duì)照組(正常樣品)比較，用WCX磁珠所捕獲的11729±15Da組或抗P2-微球蛋白抗體吸附表面所捕獲的02-微球蛋白生物標(biāo)志是一致的?？?2-微球蛋白抗體吸附表面所捕獲的新型變異e2-微球蛋白或用WCX磁珠所捕獲的11729土15Da組的試劑盒可檢測(cè)、評(píng)估重型乙型肝炎病人。重型乙型肝炎血淸變異的e2-微球蛋白水平顯著高于急性乙型肝炎；重型乙型肝炎死亡者血清變異的02-微球蛋白水平顯著髙于存活者。本發(fā)明提供方法能夠檢測(cè)重型乙型肝炎，其靈敏度為100%，特異性為100%。利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本方法用wcx基質(zhì)、e2-微球蛋白抗體吸附表面基質(zhì)及質(zhì)譜法進(jìn)行鑒別檢測(cè)發(fā)現(xiàn)一種新型變異的P2-微球蛋白。變異的P2-微球蛋白可用于重型乙型肝炎的檢測(cè)及評(píng)估。變異的P2-微球蛋白升高者提示預(yù)后差。通過(guò)WCX基質(zhì)及被抗體吸附表面基質(zhì)上捕獲的變異的e2-微球蛋白，用標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清控制下的定量性質(zhì)譜分析來(lái)檢測(cè)，可以應(yīng)用到己經(jīng)脫離人體的體液中的生物標(biāo)志組合的檢測(cè)方法或試劑盒開(kāi)發(fā)。本方法準(zhǔn)確、方便且快捷。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。權(quán)利要求1.本發(fā)明涉及一種檢測(cè)、評(píng)估重型乙型肝炎病人的試劑盒和新方法，其特征是采用質(zhì)譜法對(duì)樣品中已被基質(zhì)捕獲的變異的β2-微球蛋白生物標(biāo)志進(jìn)行精確地鑒別、檢測(cè)的方法。該方法通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)樣品處理及質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清制備；(2)樣品上樣至基質(zhì)上；(3)洗滌；(4)質(zhì)譜的定量控制及質(zhì)譜測(cè)試；其中所述步驟(1)將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中。用O型血，男女相等，混合制備質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清；所述步驟(2)將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清及樣品點(diǎn)樣在基質(zhì)上。所述步驟(3)用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點(diǎn)。洗滌溶液在位點(diǎn)上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。用0.5～2％三氟乙酸徹底洗滌磁珠，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用的金屬片上，自然干燥金屬片，加0.5μL以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制備的吸能分子標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸能分子可用Sinapinicacid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamicacid等；所述步驟(4)用質(zhì)譜儀去分析變異的β2-微球蛋白。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)為11729±15Da峰值。定量性質(zhì)譜調(diào)控每次測(cè)試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091.1Da或6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至50％信號(hào)強(qiáng)度的最大值。2.權(quán)利要求l所述的β2-微球蛋白試劑盒和分析方法，所捕獲的變異的β2-微球蛋白來(lái)源于已經(jīng)脫離人體的全血、血清和血漿。3.權(quán)利要求1所述的基質(zhì)包含陰離子表面基質(zhì)、疏水表面基質(zhì)、抗β2-微球蛋白抗體基質(zhì)?；|(zhì)的支持物包含陶瓷珠、磁性珠、多聚體或毛細(xì)管電泳柱子。4.權(quán)利要求1所述的分子量為11729±15Da或變異的β2-微球蛋白的變化對(duì)于鑒別正常人、重型乙型肝炎、急性乙型肝炎及預(yù)后試劑盒的用途。5.權(quán)利要求4所述的11729土15Da蛋白為變異的P2-微球蛋白，從N端至C端排列的氨基酸為IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM。6.—種權(quán)利要求5所述的檢測(cè)變異β2-微球蛋白的試劑盒，其特征在于，它包括:一容器以及裝于容器中的權(quán)利要求4所述的檢測(cè)變異的β2-微球蛋白的抗體(組)。7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征于，所述的抗體(組)為單克隆抗體(組)或多克隆抗體(組)。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測(cè)、評(píng)估重型乙型肝炎病人的試劑盒和新方法，為一種非侵入性的體外檢測(cè)方法。本方法用質(zhì)譜法進(jìn)行鑒別檢測(cè)發(fā)現(xiàn)一種新型變異的β2-微球蛋白。變異的β2-微球蛋白或11729±15Da峰值可用于重型乙型肝炎的檢測(cè)及評(píng)估。變異的β2-微球蛋白或11729±15Da峰值升高者提示預(yù)后差。重型乙型肝炎中血清變異的β2-微球蛋白水平顯著高于急性乙型肝炎；重型乙型肝炎死亡者血清變異的β2-微球蛋白水平顯著高于存活者。本發(fā)明提供方法能夠檢測(cè)重型乙型肝炎的危重病人，其靈敏度為100％，特異性為100％。通過(guò)11729±15Da峰值或被抗體吸附表面基質(zhì)上捕獲的變異的β2-微球蛋白，用標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清控制下的定量性質(zhì)譜分析來(lái)檢測(cè)，可以應(yīng)用到已經(jīng)脫離人體的體液中的生物標(biāo)志組合的檢測(cè)方法或試劑盒開(kāi)發(fā)。本方法準(zhǔn)確、方便且快捷。文檔編號(hào)G01N33/68GK101201360SQ20061016811公開(kāi)日2008年6月18日申請(qǐng)日期2006年12月15日優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日發(fā)明者洋許申請(qǐng)人:洋許