專利名稱：抗α9整聯(lián)蛋白抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特異性識(shí)別人a9整聯(lián)蛋白(integrin)和小鼠a9整 聯(lián)蛋白的單克隆抗體；產(chǎn)生上述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；含有上述 單克隆抗體的藥物組合物；含有上述單克隆抗體的診斷劑；上述單克 隆抗體的制備方法；上述雜交瘤細(xì)胞的制備方法等。
背景技術(shù)：
細(xì)胞通過(guò)被稱為整聯(lián)蛋白的一組細(xì)胞表面受體與胞外基質(zhì) (extracellular matrix,以下簡(jiǎn)稱為ECM)結(jié)合。整聯(lián)蛋白通過(guò)形成 a鏈和p鏈l:l的異二聚體來(lái)發(fā)揮功能。目前至少鑒定了 18種a鏈、 8種p鏈和24種ap異二聚體。已知各整聯(lián)蛋白分別識(shí)別特異性的配 體。按照與配體的特異性以及功能，整聯(lián)蛋白被分類為亞家族 (subfamily),分成膠原受體、層粘連蛋白受體、識(shí)別纖連蛋白或玻 連蛋白等中含有的Arg-Gly-Asp ( RGD)序列的RGD受體、只存在 于白細(xì)胞中的白血胞特異性受體(非專利文獻(xiàn)1: Hynes RO. 2002. Integrins: Bidirectional, Allosteric Signaling Machines. Cell 110: 673-87;非專利文獻(xiàn)2: Miyasaka M. 2000. New edition of Adhesion Molecule handbook. Shujunsya)。 a4和a9整聯(lián)蛋白是不屬于上述任 何一種的亞家族，被稱為a4整聯(lián)蛋白亞家族(非專利文獻(xiàn)3: EliseL. Palmer, Curzio Rfiegg， Ronald Ferrando， Robert Pytela， Sheppard D. 1993. Sequence and Tissue Distribution of the Integrin a9 Subunit， a Novel Partner of 131 That Is Widely Distributed in Epithelia and Muscle. The Journal of Cell Biology 123: 1289-97)。而目前ECM只 被認(rèn)為是細(xì)胞間的填充物，不過(guò)，已經(jīng)搞清楚整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的ECM 與細(xì)胞的相互作用與細(xì)胞的增殖、粘附、運(yùn)動(dòng)等的調(diào)節(jié)有很大關(guān)系， 與癌的進(jìn)展或炎癥的惡化等疾病的發(fā)病相關(guān)。
作為ECM —種的骨橋蛋白(osteopontin，以下簡(jiǎn)稱為OPN)是 分子量約為41 kDa的分泌型酸性磷酸化糖蛋白，是在乳汁、尿、腎 小管、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、活化T細(xì)胞、腫瘤組織等中
可見(jiàn)廣泛表達(dá)的分子。分子中央部具有細(xì)胞粘附序列GRGDS，在人 類的OPN中具有SVVYGLR序列，在小鼠OPN中具有SLAYGLR 序列，其后緊接著具有凝血酶切斷位點(diǎn)，通過(guò)GRGDS序列與RGD 整聯(lián)蛋白粘附，通過(guò)SVVYGLR序列或SLAYGLR序列與a4 ( a4pi) 和a9 (a9pi)整聯(lián)蛋白粘附。
還發(fā)現(xiàn)a4pi和a外l有以下的方式差異a4pi與未被凝血酶切 斷的OPN (非切斷型OPN)和被凝血酶切斷的N末端片段(切斷型 OPN )兩者結(jié)合，a9pi只與切斷型OPN結(jié)合(非專利文獻(xiàn)4: Y. Yokosaki 等人，(1999) The Journal of Biological Chemistry 274， 36328-36334; 非專利文獻(xiàn)5: P. M. Green等人，(2001) FEBS Letters 503， 75-79; 非專利文獻(xiàn)6: S. T. Barry等人，(2000) Experimental Cell Research 258， 342-351 )。
a4和a9整聯(lián)蛋白除OPN之外還有很多共通的配體.已知有纖 連蛋白的EDA位點(diǎn)、前肽-血管性血友病因子(pp-vWF)、組織型轉(zhuǎn) 谷氨酰胺酶(tTG )、第XIII凝血因子以及血管細(xì)胞粘附分子-l( vascular cell adhesion molecule-l， VCAM-1)等.已知a4整聯(lián)蛋白特異性識(shí) 別的配體有纖連蛋白的CS-1結(jié)構(gòu)域、MadCAM-1 (a4卩7)等.已知 a9整聯(lián)蛋白特異性識(shí)別的配體有腱生蛋白C、血纖蛋白溶酶等。
a9、 a4和pi的整聯(lián)蛋白亞單位的氨基酸序列是公知的。例如， 在GenBank中，人a9登記為NM_002207 、小鼠a9登記為 醒一133721、人a4登記為NM一000885、小鼠a4登記為NM一010576、 人PI登記為X07979、小鼠pi登記為NM_010578。還已知這些整聯(lián) 蛋白種間的氨基酸序列間類似性高。
WO02/081522 (專利文獻(xiàn)1)中公開(kāi)了使用OPN缺損小鼠或OPN 中和抗體的OPN功能性抑制對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或肝炎的治愈效果。 該公報(bào)中公開(kāi)了在炎癥性疾病發(fā)病中，a9整聯(lián)蛋白、a4整聯(lián)蛋白 識(shí)別序列SVVYGLR序列是重要的，OPN的受體在免疫活性細(xì)胞等 中表達(dá)，與炎癥性疾病相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
目前，已知關(guān)于癌、炎癥性疾病、自身免疫性疾病的治療藥有多 種多樣，但是人們?nèi)韵Ｍ_(kāi)發(fā)出具有更好的治療效果的癌、炎癥性疾
病、自身免疫性疾病的預(yù)防藥和/或治療藥等。
本發(fā)明人著眼于整聯(lián)蛋白，進(jìn)行了各種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)a9整聯(lián) 蛋白的特異性抑制抗體具有癌抑制效果、抗炎癥效果，從而完成了本 發(fā)明。即，具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供以下單克隆抗體、雜交瘤細(xì)胞、藥 物組合物等。
(1) 單克隆抗體，該單克隆抗體特異性識(shí)別人a9整聯(lián)蛋白和小鼠 a9整聯(lián)蛋白。
(2) 上述(l)的單克隆抗體，該單克隆抗體抑制人和/或小鼠a9整 聯(lián)蛋白與a9整聯(lián)蛋白的配體的結(jié)合。
(3) 上述(2)的單克隆抗體，其中，a9整聯(lián)蛋白的配體是骨橋蛋白。
(4) 上述(1)~(3)中任一項(xiàng)的單克隆抗體，所述單克隆抗體由保藏 編號(hào)FERM ABP-10195、 FERM ABP-10196、 FERM ABP-10197或 FERM ABP-10198標(biāo)示的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
(5) 雜交瘤細(xì)胞，該雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生上述(1)~(4)中任一項(xiàng)的單克 隆抗體。
(6) 藥物組合物，該藥物組合物含有上述(1)~(4)中任一項(xiàng)的單克 隆抗體。
(7) 藥物組合物，該藥物組合物含有權(quán)利要求(1)~(4)中任一項(xiàng)的 單克隆抗體和抗a4整聯(lián)蛋白抗體兩者。
(8) 上述(6)或(7)的藥物組合物，該藥物組合物是炎癥性疾病的預(yù) 防和/或治療劑。
(9) 炎癥性疾病的診斷劑，該診斷劑含有上述(1)~(4)中任一項(xiàng)的 單克隆抗體。
(10) 上述(1) (4)中任一項(xiàng)的單克隆抗體的制備方法，其特征在 于使用過(guò)量表達(dá)a9整聯(lián)蛋白的細(xì)胞作為抗原。
(11) 上述(5)的雜交瘤細(xì)胞的制備方法，其特征在于，使用與作為 過(guò)量表達(dá)a9整聯(lián)蛋白的抗原使用的細(xì)胞不同種類的細(xì)胞。
(12) 細(xì)胞和/或組織的重塑(y乇fy^y)的抑制和/或促進(jìn)劑，該
抑制和/或促進(jìn)劑含有a9整聯(lián)蛋白結(jié)合性功能分子(例如OPN、 VCAM-1、腱生蛋白C、纖連蛋白、pp-vWF、 tTG等)作為有效成 分。
(13) 細(xì)胞和/或組織重塑的抑制和/或促進(jìn)方法，其特征在于，使
a9整聯(lián)蛋白表達(dá)細(xì)胞和/或組織(例如腫瘤細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、平 滑肌等)與a9整聯(lián)蛋白結(jié)合性功能分子(例如OPN、 VCAM-1、腱 生蛋白C、纖連蛋白、pp-vWF、 tTG等)接觸。
本發(fā)明的抗a9整聯(lián)蛋白抗體通過(guò)抑制a9整聯(lián)蛋白功能，可對(duì)癌 例如癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移；炎癥性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (y々7于関節(jié)炎)、變形性關(guān)節(jié)癥(変形性関節(jié)癥)、肝炎、支氣管哞喘、 纖維變性(線維癥)、糖尿病、動(dòng)脈硬化、多發(fā)性硬化癥、肉芽腫、炎 癥性腸病(潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病(夕口一y病))以及自身免疫性 疾病等發(fā)揮治療效果。
含有本發(fā)明的抗a9整聯(lián)蛋白抗體和抗a4整聯(lián)蛋白抗體兩者的藥 物組合物發(fā)揮更好的炎癥性疾病治療效果。本發(fā)明制備了小鼠a9整 聯(lián)蛋白、人a9整聯(lián)蛋白各自的單克隆抗體?？剐∈骯9整聯(lián)蛋白抗體 可在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中使用，抗人a9整聯(lián)蛋白抗體可作為治療藥使用。


圖1是表示整聯(lián)蛋白基因?qū)爰?xì)胞中mRNA表達(dá)量的分析結(jié)果圖。
圖2是表示抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體的FACS分析結(jié)果圖。
圖3是通過(guò)抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體對(duì)正常組織進(jìn)行染色的圖像.
圖4是免疫染色結(jié)果一覽圖。
圖5是表示四個(gè)克隆的抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體的細(xì)胞粘附抑制 效果圖。
圖6是抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體克隆的細(xì)胞粘附抑制效果的比較圖。
圖7是表示通過(guò)竟?fàn)幰种茖?shí)驗(yàn)對(duì)抗體的表位分析結(jié)果圖。
圖8是a4和a9整聯(lián)蛋白在小鼠黑素瘤細(xì)胞林中的表達(dá)分析結(jié)果圖。
圖9是a9整聯(lián)蛋白在單核細(xì)胞系細(xì)胞林中的表達(dá)的分析結(jié)果圖。 圖IO是表示小鼠嗜中性粒細(xì)胞的FACS分析結(jié)果圖。 圖11是表示小鼠肝臟浸潤(rùn)白細(xì)胞的FACS分析結(jié)果圖。 圖12是表示抗a4整聯(lián)蛋白抗體和a9整聯(lián)蛋白抗體的B16-BL6 細(xì)胞粘附抑制效果圖。
圖13是表示抗a4整聯(lián)蛋白抗體和抗a9整聯(lián)蛋白抗體對(duì)肝炎的 治療效果圖。
圖14是表示腱成纖維細(xì)胞的a9整聯(lián)蛋白表達(dá)的圖。
圖15是表示通過(guò)凝血酶切斷型OPN增加腱成纖維細(xì)胞的MMP-13 mRNA轉(zhuǎn)錄的圖。
圖16是表示通過(guò)抗a9整聯(lián)蛋白抗體抑制來(lái)自腱成纖維細(xì)胞的 MMP-13 mRNA的轉(zhuǎn)錄的圖。
圖17是表示通過(guò)抗a9整聯(lián)蛋白抗體抑制B16-BL6細(xì)胞的增殖的圖。
圖18是表示通過(guò)并用抗a9整聯(lián)蛋白抗體和抗a4整聯(lián)蛋白抗體 抑制VCAM-1的刺激導(dǎo)致的B16-BL6細(xì)胞的增殖的圖。
圖19是表示抗人a9整聯(lián)蛋白抗體的FACS分析結(jié)果圖。 圖20是抗人a9整聯(lián)蛋白抗體四個(gè)克隆和Y9A2的細(xì)胞粘附抑制 效果圖。
具體實(shí)施例方式
作為抗整聯(lián)蛋白抗體，a4整聯(lián)蛋白的中和抗體已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn) 階段。例如2004年7月，美國(guó)食品藥品管理局(FDA)受理了 Biogen Idec Inc (美國(guó)麻薩諸塞州)和Elan Corporation (愛(ài)爾蘭)的多發(fā)性 硬化癥治療藥Tysabri (注冊(cè)商標(biāo))(那他珠單抗(natalizumab ))的 認(rèn)證申請(qǐng)，Tysabri (注冊(cè)商標(biāo))被指定為優(yōu)先審查對(duì)象。Tysabri (注 冊(cè)商標(biāo))還以克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病為對(duì)象。另外，被稱 作P4C2的抗人a4pi整聯(lián)蛋白單克隆抗體已在實(shí)驗(yàn)室水平使用.
但是，作為a9整聯(lián)蛋白抗體，以人a9整聯(lián)蛋白為抗原、對(duì)人和 豚鼠的a9整聯(lián)蛋白顯示特異性的被稱為Y9A2的中和抗體(A. Wang 等人，(1996) Am. J. Respir" Cell. Mol. Biol. 15， 664-672)雖然在 實(shí)驗(yàn)室水平使用，但并未在臨床中應(yīng)用。
另一方面，在將抗人a9整聯(lián)蛋白抗體作為對(duì)人使用的藥物時(shí)， 在開(kāi)發(fā)階段不能直接施與人，不能確認(rèn)其結(jié)果。即，為了確認(rèn)效果， 必須進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，如果該效果得到確認(rèn)，才可以制作成人源化抗體 (匕卜化抗體)等。小鼠有很多是遺傳背景明確的系統(tǒng)，還具有世代間 隔短的特征。并且已知小鼠可以觀察到與人的疾病大致相同的疾病， 因此適合作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。但是與小鼠a9整聯(lián)蛋白顯示交叉反應(yīng)的中 和抗體目前尚未有報(bào)告。
本發(fā)明中，通過(guò)小心地進(jìn)行以下四個(gè)步驟，可以獲得分別與人、 小鼠的a9整聯(lián)蛋白特異性反應(yīng)的抑制抗體。
(1) a9整聯(lián)蛋白過(guò)量表達(dá)林的制備
基因表達(dá)細(xì)胞的篩選通常是在蛋白質(zhì)水平或基因水平進(jìn)行，但這 里是通過(guò)利用作為a9整聯(lián)蛋白的功能的細(xì)胞粘附功能進(jìn)行篩選，由 此建立分別在細(xì)胞膜上過(guò)量表達(dá)人或小鼠a9整聯(lián)蛋白的細(xì)胞林。
人或小鼠a9整聯(lián)蛋白表達(dá)細(xì)胞可應(yīng)用于分別對(duì)小鼠或倉(cāng)鼠進(jìn)行
的免疫.
(2) 細(xì)胞的選擇
為了制備小鼠a9整聯(lián)蛋白的抗體，考慮對(duì)金黃倉(cāng)鼠進(jìn)行免疫。 為此，向來(lái)自倉(cāng)鼠卵巢的細(xì)胞CHO-K1細(xì)胞導(dǎo)入小鼠a9整聯(lián)蛋白基 因，在倉(cāng)鼠內(nèi)構(gòu)建只使主要抗小鼠a9整聯(lián)蛋白的抗體的抗體效價(jià) (抗體価:)增加的實(shí)驗(yàn)體系。
人a9整聯(lián)蛋白的抗體是向CHO-K1細(xì)胞中導(dǎo)入人a9整聯(lián)蛋白 的基因，在小鼠內(nèi)構(gòu)建使人a9整聯(lián)蛋白抗體增加的實(shí)驗(yàn)體系。
(3) 產(chǎn)生抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體的雜交瘤的篩選 為了有效地從各種雜交瘤中獲得只與小鼠a9整聯(lián)蛋白反應(yīng)的克
隆，篩選中使用在與免疫的細(xì)胞的母細(xì)胞(CHO-K1)不同的細(xì)胞 (NIH3T3)中表達(dá)a9整聯(lián)蛋白的細(xì)胞'進(jìn)一步使用在NIBL3T3細(xì)胞 中表達(dá)與a9整聯(lián)蛋白同樣屬于整聯(lián)蛋白家族的小鼠a4整聯(lián)蛋白的細(xì) 胞，通過(guò)選擇與a9整聯(lián)蛋白以外的整聯(lián)蛋白不顯示交叉反應(yīng)性的克 隆，有效地得到了與小鼠a9整聯(lián)蛋白特異性反應(yīng)的抗體。
(4) 產(chǎn)生抗人a9整聯(lián)蛋白抗體的雜交瘤的篩選 為了從各種雜交瘤中有效地獲得只與人a9整聯(lián)蛋白反應(yīng)的克隆，
選擇與基因?qū)隒HO-K1反應(yīng)、不與CHO-K1細(xì)胞反應(yīng)的克隆.另 外，通過(guò)確認(rèn)不與導(dǎo)入人a4整聯(lián)蛋白基因的CHO-K1細(xì)胞反應(yīng)，得 到了與人a9整聯(lián)蛋白特異性反應(yīng)的抑制抗體。等。油性液 例如可使用芝麻油、大豆油等，可以并用苯甲酸芐酯、芐醇等作為溶 解助劑。所制備的注射液通常填充在適當(dāng)?shù)陌碴称恐?。在直腸給藥的 栓劑中，可通過(guò)將上述抗體或其鹽與通常的栓劑用基質(zhì)混合而制備。
上述口服或非口服用藥物組合物優(yōu)選制備成適合活性成分給藥量 的給藥單位的劑型。作為這種給藥單位的劑型，可列舉片劑、丸劑、 膠嚢劑、注射劑(安瓿瓶)、栓劑等，每個(gè)給藥單位劑型通常分別含 有5-500 mg、注射劑為5-100 mg、其它劑型中優(yōu)選10-250 mg的上述抗體。
上述各組合物只要不因與上述抗體配合而發(fā)生不希望的相互作用 即可含有其它活性成分。
本發(fā)明涉及含有a9整聯(lián)蛋白結(jié)合性功能分子(例如OPN、 VCAM-1、腱生蛋白C、纖連蛋白、pp-vWF、 tTG等)作為有效成 分的細(xì)胞和/或組織重塑的抑制和/或促進(jìn)劑；以及以使a9整聯(lián)蛋白表 達(dá)細(xì)胞和/或組織(例如腫瘤細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、平滑肌等)與a9 整聯(lián)蛋白結(jié)合性功能分子接觸為特征的細(xì)胞和/或組織重塑的抑制和/ 或促進(jìn)方法。上述治療劑有效成分的施與量、施與方法、制劑等可參 照上述含有抗體的藥物中的記載適當(dāng)確定，
為了調(diào)查所構(gòu)建的四種抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體是否具有細(xì)胞粘 附抑制活性，使用GRGDS、腱生蛋白C、 SVVYGLR肽和小鼠 a9/NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞粘附抑制實(shí)驗(yàn)。GRGDS肽中所含的RGD 序列是在很多ECM中共同存在的細(xì)胞粘附部位。腱生蛋白C的細(xì)胞 粘附部位AEIDGIEL肽可以與a9整聯(lián)蛋白粘附，但是不能與a4整
聯(lián)蛋白粘附。人OPN的SVVYGLR肽可以與a4、 a9整聯(lián)蛋白粘附。 研究各抗a9整聯(lián)蛋白抗體在這三種肽固相與小鼠a9/NIH3T3細(xì)胞的 細(xì)胞粘附中的抑制粘附的能力。
將OPN細(xì)胞粘附區(qū)SVVYGLR序列(SEQ ID NO: 15 )、 GRGDS 序列(SEQ ID NO: 16 )、腱生蛋白C的AEIDGIEL序列(SEQ ID NO: 17)固定(10 ng/ml、 50 fiL/孔)，在用封閉液(0.5% BSA/PBS )封 閉的ELISA板中添加在DMEM/0.25% BSA培養(yǎng)基中預(yù)先與抗體反 應(yīng)的a9/NIH3T3細(xì)胞(1.0x10s個(gè)/ml)。在37TC培養(yǎng)1小時(shí)，用PBS 洗滌未粘附細(xì)胞，粘附細(xì)胞用0.5%結(jié)晶紫/20%甲醇固定并染色，在 室溫下放置30分鐘，添加20%乙酸溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)溶解，粘附活性通過(guò) 測(cè)定波長(zhǎng)590 mn的OD來(lái)定量。
其結(jié)果如圖5所示，對(duì)于GRGDS肽的固相，a9整聯(lián)蛋白的粘附 是RGD非依賴性的，因此所有的抗a9整聯(lián)蛋白抗體均未能抑制。將 腱生蛋白-C功能部位AEIDGIEL肽和OPN功能部位SVVYGLR肽 固定在固相時(shí)，在11L2B、 12C4，58、 55A2C三種中可見(jiàn)顯著的細(xì)胞 粘附抑制。18R18D幾乎不顯示抑制能力。
下面，對(duì)在圖5中見(jiàn)到抑制效果的11L2B、 12C4，58、 55A2C這 三種的抑制效果進(jìn)行比較。以5 jig/ml將AEIDGIEL肽和SVVYGLR 肽的固相進(jìn)行固定，通過(guò)細(xì)胞粘附抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)抑制抗體的濃度進(jìn)行比 較研究。如圖6所示，55A2C的抑制能力最高。50%抑制濃度(IC50) 也示于圖6。
實(shí)施例通過(guò)竟?fàn)幰种茖?shí)驗(yàn)進(jìn)行表位分析
通過(guò)實(shí)施例5的細(xì)胞粘附抑制實(shí)驗(yàn)，可以得到各抗a9整聯(lián)蛋白 抗體的抑制活性有差異的結(jié)論。這顯示，這些抗體識(shí)別a9整聯(lián)蛋白 上各不相同的表位。因此，進(jìn)行抗體的生物素化，通過(guò)竟?fàn)幰种茖?shí)驗(yàn) 進(jìn)行表位分析。作為生物素化抗體，使用12C4，58和18R18D，研究 該兩個(gè)克隆與全部克隆的表位的差異。如圖7所示，兩種抗體在利用 同一克隆的竟?fàn)幹?，生物素化抗體的結(jié)合完全受到抑制。使用生物素 化18R18D時(shí)，所有克隆都不能抑制。而對(duì)于12C4，58，被55A2C部 分抑制，這顯示12C4，58和55A2C中部分表位重疊。
實(shí)施例7
為了研究培養(yǎng)細(xì)胞上a9整聯(lián)蛋白的表達(dá)，采用小鼠黑素瘤培養(yǎng) 細(xì)胞B16-F1和B16-F10、 B16-BL6進(jìn)行FACS分析。結(jié)果如圖8所 示，在B16-F1、 B16-F10、 B16-BL6全部細(xì)胞中均可以確認(rèn)a9整聯(lián) 蛋白的表達(dá)。
另外，在人外周血單核細(xì)胞中可見(jiàn)低水平的表達(dá)，因此對(duì)小鼠骨 髄單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞WEHI-3B細(xì)胞和類巨噬細(xì)胞 (7夕口77—^様細(xì)胞')RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行FACS分析。如圖9所示， 在WEHI-3B細(xì)胞中未檢測(cè)出表達(dá)，但在RAW264.7細(xì)胞中可見(jiàn)強(qiáng)表 達(dá).
實(shí)施例8
已有報(bào)告指出a9整聯(lián)蛋白在人嗜中性粒細(xì)胞中高表達(dá).因此， 為了分析小鼠嗜中性粒細(xì)胞中的a9整聯(lián)蛋白的表達(dá)，回收巰基乙酸 (于才y于3k—卜)誘導(dǎo)腹腔細(xì)胞，將其用于小鼠嗜中性粒細(xì)胞的表達(dá) 分析。以Mac-l+Gr-l+細(xì)胞作為嗜中性粒細(xì)胞，對(duì)該細(xì)胞群的a9整聯(lián) 蛋白的表達(dá)進(jìn)行FACS分析。如圖IO所示，在C57BL/6、 BALB/c、 CBA、 C3H整個(gè)系統(tǒng)的小鼠中均未見(jiàn)到a9整聯(lián)蛋白的表達(dá)。由該結(jié) 果可知，在小鼠嗜中性粒細(xì)胞上通常a9整聯(lián)蛋白不表達(dá)。
實(shí)施例9
使用人a9/CHO-Kl細(xì)胞、CHO-K1細(xì)胞、內(nèi)源性表達(dá)a9整聯(lián)蛋 白的人嗜中性粒細(xì)胞研究抗人a9整聯(lián)蛋白抗體是否可用于FACS。對(duì)
于人嗜中性粒細(xì)胞，F(xiàn)ACS方法按照與圖2同樣的方法進(jìn)行，與Fc受 體非特異性反應(yīng)的阻斷使用50%山羊血清進(jìn)行。第二抗體使用經(jīng)FITC 標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體。結(jié)果如圖19所示，所有的抗人a9整聯(lián)蛋白 抗體均可以檢測(cè)出人a9/CHO-Kl細(xì)胞和人嗜中性粒細(xì)胞上的a9整聯(lián) 蛋白。并且所有的抗體均不與人a4/CHO-Kl細(xì)胞反應(yīng)。由這些結(jié)果 可知，所有的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體均可以通過(guò)FACS檢測(cè)出在細(xì)胞 上表達(dá)的人a9整聯(lián)蛋白蛋白質(zhì)。
實(shí)施例15
使用作為a9整聯(lián)蛋白的配體的OPN和腱生蛋白-C功能肽進(jìn)行 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞使用人a9/CHO-Kl細(xì)胞，對(duì)各種抗a9整聯(lián)蛋白 抗體的抑制能力進(jìn)行研究.將肽以5嗎/ml固定于固相，用5 jig/ml 抗體進(jìn)行抑制。如圖20所示，在抑制對(duì)于OPN的粘附實(shí)驗(yàn)中，克隆 21C5顯示了最有效的抑制活性。1K11、 24111的抑制效果低。而關(guān)于 抑制對(duì)于腱生蛋白-C粘附的能力，Y9A2顯示最有效的抑制活性.而 本次制備的抗a9整聯(lián)蛋白抗體四個(gè)克隆對(duì)腱生蛋白-C未怎么顯示抑 制活性。
已經(jīng)報(bào)道了人a9整聯(lián)蛋白的中和抗體Y9A2， Chemicon公司將 其制成產(chǎn)品，Y9A2是采用通常的免疫法(腹腔內(nèi)施與)，由導(dǎo)入人a9 整聯(lián)蛋白基因的小鼠成纖維細(xì)胞林L細(xì)胞(L cell)制備的。本發(fā)明 的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體通過(guò)消減免疫法制備，免疫方法不同.并且 如圖19所示，克隆21C5的人a9/CHO-Kl細(xì)胞的FACS圖的檢測(cè)圖 諳不同，另外如圖20所示，細(xì)胞粘附試驗(yàn)的抑制效果樣式也不同， 因此本次制備的抗a9整聯(lián)蛋白抗體四個(gè)克隆與Y9A2的表位不同。
總結(jié)
為了制備抑制小鼠a9整聯(lián)蛋白功能的抗體、以及了解疾病、病 態(tài)中a9整聯(lián)蛋白的功能，制備了四種小鼠a9整聯(lián)蛋白的單克隆抗體 和四種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體。使用這些抗體進(jìn)行的研究中了解到以 下內(nèi)容。
(1)所制備的四種抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體全部可以用于FACS分 析，具有分別不同的抑制細(xì)胞粘附的能力。
(2) 抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體克隆12C4，58可用于免疫染色。
(3) 在類巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞B16-F1、 B16-F10、 B16-BL6細(xì)胞中表達(dá)a9整聯(lián)蛋白。在小鼠嗜中性粒細(xì)胞中未觀察到 a9整聯(lián)蛋白的表達(dá)，但在人中可見(jiàn)其表達(dá)，這顯示嗜中性粒細(xì)胞上的 a9整聯(lián)蛋白的表達(dá)存在種間差異。脾細(xì)胞的B220-CD3-細(xì)胞群、 B220+CD3+細(xì)胞群中存在一部分表達(dá)a9整聯(lián)蛋白的細(xì)胞群。另外，肝 臟浸潤(rùn)白細(xì)胞的a9整聯(lián)蛋白表達(dá)在a4整聯(lián)蛋白表達(dá)細(xì)胞上多見(jiàn)。
(4) 同時(shí)存在a9和a4整聯(lián)蛋白、并且存在識(shí)別兩者的配體時(shí)， 其粘附能力是互補(bǔ)的。
(5) 發(fā)現(xiàn)抗小鼠a9整聯(lián)蛋白抗體具有肝炎治療效果，其效果因抗 小鼠a4整聯(lián)蛋白抗體而亢進(jìn)。
(6) 可知在腱成纖維細(xì)胞上表達(dá)a9整聯(lián)蛋白，如用凝血酶切斷型 OPN刺激腱成纖維細(xì)胞，則MMP-13的表達(dá)亢進(jìn)?？芍揗MP-13 亢進(jìn)被抗a9整聯(lián)蛋白抗體抑制。
(7) 可知抗a9整聯(lián)蛋白抗體可抑制B16-BL6細(xì)胞的增殖。另外， 由于VCAM-1刺激導(dǎo)致的細(xì)胞增殖通過(guò)同時(shí)并用施與抗a9整聯(lián)蛋白 抗體和抗a4整聯(lián)蛋白抗體，與單獨(dú)施與相比，增殖抑制效果亢進(jìn)。
(8) 制備的四種抗人a9整聯(lián)蛋白抗體全部可用于FACS分析，分 別具有不同的抑制細(xì)胞粘附的能力.另外，通過(guò)FACS、粘附抑制實(shí) 驗(yàn)，顯示與現(xiàn)有的抗人a9整聯(lián)蛋白抗體Y9A2不同的反應(yīng)性，因此 可認(rèn)為其表位不同。
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性
本發(fā)明的單克隆抗體通過(guò)抑制a9整聯(lián)蛋白功能，對(duì)癌例如癌細(xì) 胞的增殖、轉(zhuǎn)移，炎癥性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、變形性關(guān)節(jié)炎， 肝炎、支氣管哮喘、纖維變性、糖尿病、癌轉(zhuǎn)移、動(dòng)脈硬化、多發(fā)性 硬化癥、肉芽腫、炎癥性腸疾病(潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病)、自身 免疫性疾病等發(fā)揮治療效果。另外，含有本發(fā)明的抗a9整聯(lián)蛋白抗 體和抗a4整聯(lián)蛋白抗體兩者的藥物組合物可發(fā)揮更為改善的癌、炎 癥性疾病的治療效果。本發(fā)明的單克隆抗體也識(shí)別小鼠a9整聯(lián)蛋白， 因此也可以利用于使用小鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中。
權(quán)利要求
1.單克隆抗體，該單克隆抗體特異性識(shí)別人α9整聯(lián)蛋白和小鼠α9整聯(lián)蛋白。
2. 權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，該單克隆抗體抑制a9整聯(lián)蛋 白與a9整聯(lián)蛋白的配體的結(jié)合。
3. 權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，其中，a9整聯(lián)蛋白的配體是 骨橋蛋白。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，所述單克隆抗體 由保藏編號(hào)FERM ABP-10195、 FERM ABP畫(huà)10196、 FERM ABP-10197 或FERM ABP-10198標(biāo)示的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生.
5. 雜交瘤細(xì)胞，該雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述 的單克隆抗體。
6. 藥物組合物，該藥物組合物含有權(quán)利要求1 ~ 4中任一項(xiàng)所述 的單克隆抗體。
7. 藥物組合物，該藥物組合物含有權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述 的單克隆抗體和抗a4整聯(lián)蛋白抗體。
8. 權(quán)利要求6或7所述的藥物組合物，其是癌、炎癥性疾病、 自身免疫性疾病的預(yù)防和/或治療劑.
9. 癌、炎癥性疾病、自身免疫性疾病的診斷劑，其含有權(quán)利要 求1-4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
10. 權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體的制備方法，其特 征在于，使用過(guò)量表達(dá)a9整聯(lián)蛋白的細(xì)胞作為抗原。
11. 權(quán)利要求5所述的雜交瘤細(xì)胞的制備方法，其特征在于，使 用與作為過(guò)量表達(dá)a9整聯(lián)蛋白的抗原使用的細(xì)胞不同種類的細(xì)胞。
12. 細(xì)胞和/或組織重塑的抑制和/或促進(jìn)劑，該抑制和/或促進(jìn)劑 含有a9整聯(lián)蛋白結(jié)合性功能分子作為有效成分。
13. 細(xì)胞和/或組織重塑的抑制和/或促進(jìn)方法，其特征在于，使a9 整聯(lián)蛋白表達(dá)細(xì)胞和/或組織與a9整聯(lián)蛋白結(jié)合性功能分子接觸。
全文摘要
本發(fā)明提供抗小鼠α9整聯(lián)蛋白抗體、抗人α9整聯(lián)蛋白抗體、產(chǎn)生上述抗體的雜交瘤細(xì)胞、上述抗體和雜交瘤細(xì)胞的制備方法、含有上述抗體的藥物組合物等。本發(fā)明的抗α9整聯(lián)蛋白抗體通過(guò)抑制α9整聯(lián)蛋白功能，對(duì)于癌例如癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、炎癥性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、變形性關(guān)節(jié)炎、肝炎、支氣管哮喘、纖維變性、糖尿病、動(dòng)脈硬化、多發(fā)性硬化癥、肉芽腫、炎癥性腸疾病(潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病)、以及自身免疫性疾病等發(fā)揮治療效果。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101103044SQ20068000225
公開(kāi)日2008年1月9日 申請(qǐng)日期2006年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月13日
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