專利名稱：Mhc寡聚體及其制備方法
MHC寡聚體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及MHC寡聚體，其中單個的功能性MHC復(fù)合物單體們 通過其結(jié)合于所述復(fù)合物的肽結(jié)合溝中的肽發(fā)生寡聚化，本發(fā)明還涉及 制備這種MHC寡聚體的方法及各種使用所述MHC寡聚體的方法。
背景技術(shù)：
存在于組織的細(xì)胞表面上的主要相容性復(fù)合物(MHC)分子在通過與 T細(xì)胞表面上的T細(xì)胞受體(TCR)的相互作用將短的線性肽形式的細(xì)胞 抗原呈遞給T細(xì)胞方面起到了重要作用。MHC分子是由a和P鏈、以及 結(jié)合于當(dāng)這些鏈正確折疊時所述鏈所形成的溝的肽組成。
已經(jīng)知道分離或重組形式的MHC肽分子可以用于依據(jù)T細(xì)胞所識 別的特異性肽抗原來檢測、分離和加工處理這些T細(xì)胞。也已經(jīng)了解到 MHC分子和跨細(xì)胞表面的TCR之間的相互作用在本質(zhì)上都是多聚體的 相互作用，且單個MHC分子和給定TCR的親和力通常是相當(dāng)?shù)偷摹?br> 因此，盡可能開發(fā)出多聚體形式的具有增加的功能親和力的分離或 重組的MHC肽分子，以便使得這些分子在上面所述的應(yīng)用中是更有用 的。
歐洲專利申請EP 812 331描述了用于依據(jù)T細(xì)胞抗原受體特異性標(biāo) 記、檢測和分離哺乳動物T細(xì)胞的多聚體的結(jié)合復(fù)合物，所述復(fù)合物具 有結(jié)構(gòu)式(ot-(3-P)n，其中(a-P-P)是MHC肽分子，n2 2， a包含I類MHC 或II類MHC分子的a鏈，P包含MHC蛋白的p鏈，以及P是基本上同質(zhì) 的肽抗原。通過將MHC分子的a或P鏈中的其中一條鏈的C末端生物素 化并將MHC單體與四價的鏈霉抗生物素/抗生物素蛋白相結(jié)合使得 MHC肽分子發(fā)生多聚化，或者通過提供其中a或p鏈中的其中一條鏈的
c末端被修飾成包含被作為多聚化實體的相應(yīng)抗體所識別的表位的 MHC分子的嵌合蛋白使得MHC肽分子發(fā)生多聚化。該文獻(xiàn)還披露了 MHC寡聚體用于依據(jù)T細(xì)胞的TCR特異性來檢測、標(biāo)記和分離特異性 T細(xì)胞的用途。
WO 93/10220披露了嵌合MHC分子，其包含MHC的可溶性部分， 這可以是與免疫球蛋白恒定區(qū)融合的I型或II類MHC。分子的MHC部 分包含互補的a和/或p鏈以及結(jié)合于MHC分子的相應(yīng)的結(jié)合溝的肽。因 為存在二聚體的免疫球蛋白構(gòu)架，這些嵌合MHC-Ig分子可以自我組裝 成二聚體結(jié)構(gòu)。
歐洲專利申請EP 665 289披露了特異肽、結(jié)合這些肽的MHC分 子、以及通過使具有結(jié)合于其內(nèi)的特異肽的相應(yīng)的MHC分子發(fā)生交聯(lián) 而獲得的寡聚體。通過使用交聯(lián)劑或者通過提供包含被免疫球蛋白例如 IgG或IgM識別的表位的MHC嵌合蛋白可以實現(xiàn)寡聚化。MHC分子可 以包含標(biāo)記，并被用于依據(jù)T細(xì)胞的特異性受體結(jié)合來標(biāo)記、檢測和分 離T細(xì)胞，并最終可以應(yīng)用于人類治療。
在另一個實施方式中，EP 665 289描述了寡聚體的MHC復(fù)合物， 其通過使用寡聚體形式的MHC結(jié)合肽發(fā)生寡聚化。通過肽上面的化學(xué) 修飾可以連接寡聚體肽，或者寡聚體肽可能己經(jīng)形成線性的寡聚體，即 一個肽鏈具有多個MHC結(jié)合部分。
US 2002/0058787披露了肽寡聚體，其包含至少兩個經(jīng)柔性分子接 頭連接的MHC結(jié)合肽。MHC結(jié)合肽可以是I類MHC結(jié)合肽或II類 MHC結(jié)合肽。也披露了用于生產(chǎn)這種寡聚體的定向克隆方法。所闡述 的寡聚體例如可以被用于特異性激活或抑制CD4+或CD8+ T細(xì)胞的活 性的方法。這種方法提供了用于治療腫瘤、自身免疫性疾病、同種異體 移植物排斥和過敏反應(yīng)的治療手段。但是這些肽寡聚體并不是非常適合 于形成分離的MHC肽多聚體，因為通常必須在存在摩爾過量的肽的條 件下孵育可溶性MHC復(fù)合物或其鏈。這會造成復(fù)合物的非常不完全的
寡聚化以及且所形成的復(fù)合物中的MHC結(jié)合肽的多個節(jié)段沒有與MHC 肽復(fù)合物結(jié)合的情況，這反過來會造成這些復(fù)合物的特異性減低以及更 高的背景結(jié)合力。
在構(gòu)建MHC多聚體時，首先需要構(gòu)建出MHC肽單體，然后通過 將它們附著到多價實體(例如如US5，635，363所述)或者彼此附著將這些 單體多聚化。但是US 5,635,363所述的方法需要MHC肽復(fù)合物的a或p 鏈具有用于單體與多價實體特異性附著的表位或位點。事實上，提供這 種特異性附著位點的便利方法還很少。
最簡單的方法可能是提供MHC分子的C末端上的抗體結(jié)合表位， 然后通過特異于表位的一個或多個抗體將分子多聚化。這種技術(shù)的缺點 是單體的抗體表位相互作用通常不像要求的那樣強烈，且如果多聚化是 通過兩步方法實現(xiàn)的，例如首先通過結(jié)合表位特異性抗體，其次是通過 所形成的MHC抗體復(fù)合物的同種型特異性抗體，則所形成的分子可能 很大。
對通過重組蛋白表達(dá)生成的多肽的任一化學(xué)位點特異性修飾都是困 難的，因為絕大多數(shù)已知的靶向結(jié)合方法都特異于一或多種氮基酸。因 此， 一些氨基酸常常同時被修飾，包括在單體復(fù)合物形成之后結(jié)合于 MHC分子的抗原肽的那些氨基酸。這對復(fù)合物與其互補的T細(xì)胞受體 成功結(jié)合的能力具有無法控制的影響。對于任何隨機的交聯(lián)過程來說更 是如此。
作為另一種選擇方案，已經(jīng)推薦利用生物素-鏈霉抗生物素系統(tǒng)將 MHC復(fù)合物寡聚化(見例如US 5,635,363)。這個方法要求在接近所述 MHC的其中一個羧基末端上對MHC進(jìn)行酶性生物素化。大約14個氨 基酸的酶識別肽序列與一個MHC肽鏈的C末端融合，然后容許復(fù)合物 通過應(yīng)用能夠識別這個位點的生物素化酶發(fā)生生物素化。生物素化因此 包括大量的操作步驟，包括多輪蛋白純化、和造成活性MHC復(fù)合物大 量丟失的酶性生物素化反應(yīng)。此外，對單體MHC亞基的生物素化效率
以及最終多聚體產(chǎn)物的質(zhì)量的控制都是困難的。例如，在合成包含同質(zhì)
的肽的特異性MHC復(fù)合物且合成產(chǎn)率非常低的情況下，生物素化反應(yīng) 中的蛋白丟失以及低于100%的生物素化效率可以使得最終產(chǎn)物的產(chǎn)率 要低于可接受的水平。
這個方法學(xué)也將生物素化復(fù)合物的多聚化方法局限于所述復(fù)合物與 抗生物素蛋白家族蛋白或這種蛋白的交聯(lián)變體的結(jié)合，所述抗生物素蛋 白家族蛋白例如是鏈霉抗生物素，其使得所述復(fù)合物發(fā)生四聚體化。但 是，對于交聯(lián)的抗生物素蛋白家族蛋白變體而言，難以準(zhǔn)確地控制復(fù)合 物的效價。對于不想要四聚體的或不一致效價的多聚體或者不想使用鏈 霉抗生物素或鏈霉抗生物素相關(guān)分子的情況，這個方法也有嚴(yán)重的局限 性。
本發(fā)明的目的是通過提供容許發(fā)生任何所需程度的寡聚化的MHC
寡聚體實現(xiàn)對已有技術(shù)的改進(jìn)。本發(fā)明的另一個目的是提供寡聚體，所 述寡聚體可以合適的產(chǎn)率和優(yōu)越的純度進(jìn)行制備。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上面提及的和其他的已有技術(shù)的缺點，以及為了實現(xiàn)上面 的目的，本發(fā)明的第一個方面因此提供了 MHC寡聚體，其包含至少兩 個具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合物，每個MHC復(fù)合物都具有結(jié)合 于所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝中的肽，其中每個肽都具有容許所述功 能性MHC復(fù)合物通過一核心結(jié)構(gòu)發(fā)生高度特異性寡聚化的修飾。
優(yōu)選地，MHC寡聚體基本上不含未與MHC肽復(fù)合物結(jié)合的MHC 結(jié)合肽的節(jié)段。
優(yōu)選地，MHC寡聚體所含的MHC肽復(fù)合物中的所述肽的MHC結(jié) 合部分的氨基酸側(cè)鏈和/或MHC a或(3鏈的氨基酸側(cè)鏈在寡聚化的過程中 基本上都沒有被修飾。
在第一個具體實施方式
中，本發(fā)明涉及MHC寡聚體，其包含至少 兩個具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合物，每個MHC復(fù)合物都具有結(jié) 合于所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝的肽，在所述包含肽的功能性單體 MHC復(fù)合物發(fā)生組裝后，MHC復(fù)合物在其肽位置發(fā)生寡聚化。
在第二個具體實施方式
中，發(fā)明涉及MHC寡聚體，其包含至少兩 個具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合物，每個MHC復(fù)合物都具有結(jié)合 于所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝的肽，其中每個肽都包含選自由特異性 附著位點(specific attachment site)禾卩寡聚化結(jié)構(gòu)域(oligomerisation domain)組成的組中的修飾，
其中通過以下方式實現(xiàn)功能性MHC復(fù)合物的寡聚化
(i) 每個肽在每個肽上所提供的或附著于其的特異性附著位點與多價 實體結(jié)合，或者
(ii) 所述的肽通過每個肽上所提供的或附著于其的寡聚化結(jié)構(gòu)域進(jìn) 行排列，
其中寡聚體中的MHC復(fù)合物與多價實體或肽排列所提供的核心結(jié) 構(gòu)相連接。
在第二個方面，本發(fā)明提供藥物組合物或診斷組合物，其包含上面 所定義的MHC寡聚體，任選地與藥學(xué)可接受載體組合，每個肽都具有 容許發(fā)生寡聚化的修飾，所述修飾選自由附著位點或寡聚化結(jié)構(gòu)域組成 的組。
在第三個方面，本發(fā)明提供了一些依據(jù)T細(xì)胞抗原受體能夠結(jié)合功 能性MHC復(fù)合物的特異性來標(biāo)記和/或檢測和/或分離哺乳動物T細(xì)胞的 方法。
在第四個方面，本發(fā)明提供了形成MHC寡聚體的方法，所述MHC 寡聚體包含至少兩個具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合物，每個MHC 復(fù)合物都具有結(jié)合于所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝的肽，其中每個肽都
具有容許所述功能性MHC復(fù)合物通過一核心結(jié)構(gòu)發(fā)生高度特異性寡聚
化的修飾，所述方法包括步驟
(i) 提供一或多種能夠結(jié)合于每個功能性MHC復(fù)合物的肽溝的肽，
所述肽通過以下方式被修飾
(a) 提供特異性附著位點，或
(b) 提供寡聚化結(jié)構(gòu)域；
(ii) 提供包含(i)的肽的單體功能性MHC肽復(fù)合物；和
(iii) 通過以下方式使功能性MHC復(fù)合物發(fā)生寡聚化
(a) 提供多價實體且所述單體功能性MHC肽復(fù)合物在每個肽所 具有的特異性附著位點與多價實體結(jié)合，或
(b) 所述的肽通過每個肽上所提供的或附著于其的寡聚化結(jié)構(gòu)域 進(jìn)行排列。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的第四個方面的方法形成的MHC寡聚體是本 發(fā)明的其他適用方面和/或它們的相應(yīng)實施方式中之一的MHC寡聚體和/ 或如在此所述的MHC寡聚體。


圖1顯示了單體的II類MHC肽復(fù)合物，其包含適合于隨后發(fā)生多 聚化的本發(fā)明的修飾的肽。
圖2顯示了單體的I類MHC肽復(fù)合物，其包含適合于隨后發(fā)生多 聚化的本發(fā)明的修飾的肽。
圖3顯示了適合于根據(jù)本發(fā)明使得MHC復(fù)合物單體在其結(jié)合肽處 發(fā)生多聚化的分支肽；和
圖4顯示了適合于根據(jù)本發(fā)明使得MHC復(fù)合物單體在其結(jié)合肽處 發(fā)生多聚化的環(huán)狀寡核苷酸。
圖5顯示了在沒有獨立的多價實體的情況下能夠形成多聚體MHC 復(fù)合物的修飾的肽。
發(fā)明詳述
本發(fā)明的MHC寡聚體通過MHC結(jié)合肽發(fā)生寡聚化，在所述包含 肽的功能性單體MHC復(fù)合物通過所述肽上所具有的修飾發(fā)生組裝后， 所述MHC肽復(fù)合物以高度特異方式發(fā)生寡聚化。為了形成寡聚化，每 個單體MHC肽復(fù)合物所含的肽通過所述肽以高度特異方式與核心結(jié)構(gòu) 發(fā)生寡聚化。為此，肽與多價實體相附著或者肽進(jìn)行自我組裝或寡聚 化，據(jù)此生成了所形成的寡聚體的核心結(jié)構(gòu)。
術(shù)語"核心結(jié)構(gòu)"在此打算表示任何容許同時結(jié)合所述肽和MHC 單體的實體。也可通過獨立的多聚體實體提供核心結(jié)構(gòu)，肽與所述實體 相附著?；蛘撸谋旧砜梢酝ㄟ^寡聚化生成這樣的核心結(jié)構(gòu)。這包括肽 寡聚化結(jié)構(gòu)域，MHC結(jié)合部分結(jié)合并懸掛于此。換句話說，肽的修飾 容許肽進(jìn)行自我組裝或排列，據(jù)此生成能同時所有肽可與之結(jié)合的新的 核心結(jié)構(gòu)。
術(shù)語"多聚化"或"寡聚化"在此表示生成至少一種在所需時間內(nèi) 穩(wěn)定的包含至少兩個功能性MHC單體的復(fù)合物的現(xiàn)象。兩個術(shù)語是可 以相互替換的。
根據(jù)所選的多聚化的類型，本發(fā)明的MHC寡聚體可以具有很好的 可控的預(yù)定效價以及非常高的純度，因為單個的單體MHC肽復(fù)合物可 以被分別地純化和組裝，以及之后發(fā)生多聚化。另外，在一些實施方式 中，本發(fā)明所具有的優(yōu)點是利用公知的合成方法可以合成單體MHC肽 復(fù)合物，如果需要還可以對其進(jìn)行修飾。在單體合成之后就可以進(jìn)行多 聚化，不需要同時對單體進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，因此在這個階段避免了額 外的蛋白丟失。另外，只需要對結(jié)合于MHC肽結(jié)合溝的小肽進(jìn)行修飾 以用于隨后發(fā)生多聚化的目的。但是，通過使用例如固相技術(shù)可以便利 地完成修飾，這為引入定點修飾提供了極大的靈活性。因此，本發(fā)明所形成的MHC寡聚體可以被設(shè)計成具有有利的立體 構(gòu)象，因為它們可以被容易地定位為平面構(gòu)型，其中復(fù)合物中所有的 MHC肽結(jié)合面都面向于抗原特異性T細(xì)胞表面上的T細(xì)胞受體。也可 以用精確的和受很好控制的化學(xué)計量法制備出這些MHC寡聚體。另 外，所形成的寡聚體基本上不含未與MHC分子結(jié)合的肽MHC-結(jié)合部 分。
在本發(fā)明中，首先形成功能性單體MHC復(fù)合物。它們可以是通過 來自包涵體材料的相關(guān)的MHC ot和(3鏈在存在相關(guān)的修飾肽時發(fā)生重折 疊、或者是通過優(yōu)選地在存在相關(guān)的修飾肽時在真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出天 然的單體MHC肽復(fù)合物而形成的。在兩種情況中，與這種相關(guān)的修飾 肽的肽交換也可以發(fā)生于重折疊之后。
在己經(jīng)形成單體MHC肽復(fù)合物之后，通過部分地因所述肽提供的 修飾而得以進(jìn)行合適的反應(yīng)化學(xué)或機制使得MHC復(fù)合物發(fā)生寡聚化。 通常在不會破壞或更改單體MHC肽復(fù)合物的結(jié)合性能的生理緩沖液條 件下進(jìn)行寡聚化。本發(fā)明因此也提供了高產(chǎn)率的方法，其保留了寡聚化 的MHC復(fù)合物單體功能性。
為了清楚起見，在此對單體MHC肽復(fù)合物的引用不排除這種單體 復(fù)合物在其肽發(fā)生進(jìn)一步的寡聚化之前已經(jīng)被預(yù)先多聚化到一定程度。 例如，在被寡聚化成更高效價的MHC肽寡聚體之前，可以以MHC-Ig 融合二聚體的形式提供單體MHC肽復(fù)合物，例如WO9310220所述的那 樣。因此，單體MHC肽復(fù)合物在此只表示在所述肽發(fā)生進(jìn)一步的寡聚 化之前首先要形成包含相關(guān)肽的功能性單體亞基的事實。但是，優(yōu)選 地，通過形成第一種情況中的真正的單體MHC肽復(fù)合物生成本發(fā)明的 寡聚體的MHC復(fù)合物。
在第一個方面，本發(fā)明因此提供了 MHC寡聚體，其包含至少兩個 具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合物，每個MHC復(fù)合物都含有結(jié)合于 所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝內(nèi)的肽，每個肽都具有容許發(fā)生高度特異
性寡聚化的修飾。修飾可以優(yōu)選地選自由附著位點或寡聚化結(jié)構(gòu)域組成
的組。根據(jù)所選的修飾，功能性MHC復(fù)合物可以通過以下方式實現(xiàn)寡
聚化(i)每個肽在其所提供的或與之相連的特異性結(jié)合位點與多價實體 結(jié)合；或(ii)所述的肽通過每個肽上所提供的或附著于其的寡聚化結(jié)構(gòu) 域進(jìn)行排列。在各種情況中，寡聚體中的MHC復(fù)合物與多價實體或肽 排列所提供的核心結(jié)構(gòu)相連接。
術(shù)語"高度特異性"寡聚化在此表示形成寡聚體(通過附著或排列)
的特異性和/或選擇性優(yōu)選地高于10倍，以及更優(yōu)選地高于100倍，最 優(yōu)選地高于1000倍，優(yōu)選地是在生理條件下、以避免在寡聚化反應(yīng)中 對單體MHC肽復(fù)合物的a或j3鏈的氨基酸或MHC結(jié)合肽的MHC結(jié)合部 分的氨基酸進(jìn)行任何修飾的預(yù)定方式形成。
為了圖解說明的目的，圖1顯示了相應(yīng)的在其溝內(nèi)具有抗原肽的單 體II類MHC復(fù)合物。該圖分別顯示了 MHCa和p鏈的al、 a2和(31、 P2 區(qū)。相應(yīng)多肽鏈的氨基末端和羧基末端分別被標(biāo)記為N和C。用S-S表 示二硫鍵的位置。顯示出MHC a鏈具有一個標(biāo)簽區(qū)(E)。在肽(P)的一個 末端用接頭(未顯示)以及該接頭末端的修飾(H)合成了肽(P)的抗原或 MHC結(jié)合部分，所述修飾的形式為附著位點或寡聚化結(jié)構(gòu)域。
對于II類MHC結(jié)合肽而言，已知結(jié)合肽可以超出MHC結(jié)合溝的 范圍，可以在肽的N或C末端或其鄰近部位對其進(jìn)行修飾。
與圖1相似，圖2顯示了具有結(jié)合于其溝內(nèi)的修飾抗原肽的單體I 類MHC復(fù)合物(用圖1中的相應(yīng)命名標(biāo)記圖2)。對于I類MHC分子而 言，特異性附著位點或寡聚化結(jié)構(gòu)域形式的修飾(H)優(yōu)選地位于肽的C 末端或其鄰近部位，因為在該部位包含接頭的MHC結(jié)合肽比N末端的 結(jié)合肽具有更強的懸掛MHC結(jié)合溝的柔性。
在一個實施方式中，通過肽與多價實體的附著發(fā)生寡聚化。這種附 著可以通過多價實體提供的互補的識別位點識別肽提供的或與之相連的 特異性附著位點來實現(xiàn)。識別位點將容許分別在特異性附著位點和互補
的識別位點發(fā)生肽與多價實體的共價的或非共價的結(jié)合。多價實體的效 價取決于多價實體所提供的以及結(jié)合所能接近的互補的識別位點的數(shù)目 以及它們的單個效價。
如果附著是非共價的，就從特異性結(jié)合對中選出特異性附著位點和 識別位點。具有所必需的特異性的合適的結(jié)合對在本領(lǐng)域是已知的。這 些結(jié)合對的非限制性實例是半抗原/抗體、表位/抗體、配體/受體、底物 或底物類似物/酶、輔因子或輔因子類似物/酶、核酸/互補核酸、糖/凝集 素、生物素/抗生物素蛋白家族蛋白例如抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素、
neutravidin 、 Streptag /Streptactin 。
例如對于生物素/鏈霉抗生物素結(jié)合對而言，可以通過便利的化學(xué)合 成將生物素引入到MHC結(jié)合肽的預(yù)定的氨基酸位點上，消除了麻煩的 酶的生物素化的需要。然后通過鏈霉抗生物素的寡聚化生成四聚體的 MHC復(fù)合物。
或者，可以通過肽與多價實體的共價結(jié)合實現(xiàn)肽與多價實體的附 著。在這種情況中，附著位點和識別位點是優(yōu)選地能夠在生理條件下形 成共價鍵或彼此偶聯(lián)的互補部分。特殊的偶聯(lián)方法包括但不限于以下類 型的共價鍵(a)肟鍵、(b)腙鍵、(c)噻唑烷鍵、(d)噁唑烷鍵、(e)硫醚 鍵、(f)二硫鍵、和(g)肽鍵。用本領(lǐng)域已知的一些化學(xué)方法可以形成這些 類型的鍵。
在一個優(yōu)選的實施方式中，能夠形成共價鍵或偶聯(lián)的部分可以有(i) 天然氨基酸側(cè)鏈和域(ii)氨基酸羧基或氨基末端基團(tuán)和(iii)(i)和(ii)的組合 等不同。
在一個更優(yōu)選的實施方式中，采用了其中任何一種最近開發(fā)出的利 用巰基化學(xué)或碳?；瘜W(xué)的特異的化學(xué)選擇性連接化學(xué)。更多的細(xì)節(jié)應(yīng)當(dāng) 參照Weng C. Chan禾口 Peter D. White主編的"Fmoc solid phase peptide synthesis, A Practical Approach" (Oxford University Press)(2000)中J,R Tam 和Y.A. Lu編寫的第ll章，在此通過引用將其并入本申請?？梢詰?yīng)用于
本發(fā)明的商品化可獲得的特異的交聯(lián)工具是例如從EMD Biosciences, Inc., Darmstadt, Germany獲得的HydraLinK⑧(商標(biāo)名)。
這些化學(xué)選擇性連接特征性地(i)使用了未受保護(hù)的肽片段和(ii)在水 性條件下進(jìn)行反應(yīng)。為了實現(xiàn)這些化學(xué)反應(yīng)，在它們各自的合成過程 中，將由親核劑和親電子劑組成的反應(yīng)對放置于P肽和多價實體上。親 核劑通常是弱堿，其具有比天然氨基酸的a或s氨基明顯更低的pKa，或 者其親核性明顯強于這些a氨基，使得在pH值近似為7的水性緩沖溶液 中發(fā)生的連接是選擇性連接。當(dāng)將這些相互反應(yīng)的基團(tuán)與作為唯一親核 劑的弱堿都一起放在水溶液中與親電子劑發(fā)生反應(yīng)時，可以實現(xiàn)化學(xué)選 擇性。因此，對所涉及的肽的其他功能基團(tuán)的保護(hù)變成是不必要的。
一般優(yōu)選地使用化學(xué)選擇性連接化學(xué)，使得MHC結(jié)合肽的特異性 附著位點和多價實體的互補的識別位點作為互補部分發(fā)生反應(yīng)，可以在 環(huán)境條件下進(jìn)行彼此之間的反應(yīng)，使得沒有一個天然存在的氨基酸的氨 基酸側(cè)鏈在這個反應(yīng)中會被修飾，以及基本上不會破壞天然MHC肽復(fù) 合物的功能完整性。
在一個優(yōu)選的實施方式中，特異性結(jié)合位點或互補識別位點包含醛
基，可以如Tam和Lu (見上)所述的那樣將其引入到多肽骨架。在更優(yōu)
選的實施方式中，特異性附著位點或互補識別位點包含與醛基相互反應(yīng)
形成(a)肟鍵、(b)腙鍵、(c)噻唑烷鍵、(d)噁哇烷鍵、(e)硫醚鍵的基團(tuán)。
在最優(yōu)選的實施方式中，肽(P)所提供的特異性附著位點包含醛基。
形成上面的類型(a)到(d)的鍵的反應(yīng)化學(xué)的實例如下
(a) 月虧鍵<formula>formula see original document page 17</formula>O
(b) 腙鍵 <formula>formula see original document page 17</formula>
<formula>formula see original document page 18</formula>
(c)噻唑烷鍵 <formula>formula see original document page 18</formula>(d)噁唑垸鍵 Ri—+ H2N」
其中R,是(a)未受保護(hù)的肽(P)或(b)多價實體中的任意一個，112是 相應(yīng)的另一個。
在各種情況中，多價實體都可以被修飾成摻入可控數(shù)目拷貝的識別 位點?；パa結(jié)合伴侶系統(tǒng)將具有高的特異性和選擇性。具體地，識別位 點與附著位點的結(jié)合將使得在不會降低單體MHC肽復(fù)合物的穩(wěn)定性和 活性的條件下發(fā)生所述結(jié)合，這意味著通常要在水性條件和近中性pH 值下進(jìn)行所述結(jié)合。
也優(yōu)選地是，選出兩個位點使得在寡聚化的過程中不會修飾肽P的 MHC結(jié)合部位或MHC ot或(3鏈的任何殘基。
識別位點和附著位點之間的共價偶聯(lián)是優(yōu)選的，以便使得寡聚體的 MHC復(fù)合物的穩(wěn)定性最大化。為了開發(fā)這些共價偶聯(lián)化學(xué)，肽的附著 位點提供了其中一個必需的反應(yīng)部分，而多價實體的識別位點提供了另 一個必需的反應(yīng)部分。整合這種反應(yīng)部分的簡單方法是在肽合成期間或 之后用如Tam和Lu (見上)所描述的方案將合適的修飾整合到多價實體 和/或肽的氨基或羧基末端或鄰近部位。
化學(xué)選擇性的非酰胺連接對于偶聯(lián)是優(yōu)選的，因為它是位點特異 的，以及在水性條件、pH值為7或非常接近于7的條件下進(jìn)行反應(yīng)，這 不會干擾天然MHC肽復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。
在一個優(yōu)選的實施方式中，附著位點和識別位點分別是2-肼吡啶基
和苯甲醛基，它們可以在pH4.7時發(fā)生最佳反應(yīng)，形成二芳香腙。也可 以在pH值最大到7.3的條件下進(jìn)行這個反應(yīng)，這保證了 MHC肽單體的 穩(wěn)定性，不過在較高的pH值下這個反應(yīng)進(jìn)行得更為緩慢。為了兼顧結(jié) 合反應(yīng)動力學(xué)的速度和不會破壞MHC分子的綴合條件，6.5到6.8左右 的緩沖pH值是最佳的pH值。
在另一個優(yōu)選的實施方式中，用固相合成技術(shù)將附著位點和識別位 點引入到至少一個肽(P)和多價實體中。 一些用于引入合適基團(tuán)的方法是 如Tam和Lu (見上)所述的方法。
如何將上面的化學(xué)轉(zhuǎn)變成其中多價實體不是多肽而是寡核苷酸的情 況對于本領(lǐng)域熟練的實踐人員是顯而易見的。
在進(jìn)行本發(fā)明的寡聚化的第一種和第二種方法中所用的多價實體可 以是任一多價實體，只要它們不會過分地干擾T細(xì)胞受體與MHC復(fù)合 物單體的結(jié)合即可。多價實體的效價即識別位點或反應(yīng)部分的數(shù)目以及
它們的間距將決定寡聚化的程度。例如，四價實體例如鏈霉抗生物素將 形成四聚體。但是，明顯更高的效價是可能的。實體的效價優(yōu)選地是在 2到20的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地是4到10。
多價實體優(yōu)選地是天然聚合物或其衍生物例如蛋白、分支多肽(樹狀 聚合物)、多聚體蛋白、核酸、多糖例如葡聚糖、淀粉、纖維素、透明質(zhì) 酸、甲殼質(zhì)、或海藻酸或這些多糖的衍生物、寡核苷酸、環(huán)狀寡核苷 酸；合成聚合物例如聚丙二醇、聚乙二醇(PEG);磷脂膜例如小泡或脂 質(zhì)體、和無機顆粒例如聚苯乙烯或丙烯酸珠或磁珠。識別位點可以由多 價實體例如其骨架提供或者可以與其附著。
在一個優(yōu)選的實施方式中，多價實體是天然聚合物(例如蛋白或多聚 體蛋白例如鏈霉抗生物素、抗生物素蛋白、免疫球蛋白、透明質(zhì)酸、纖 維素)或合成聚合物(例如聚丙烯酸、聚苯乙烯、聚乳酸)，而識別位點由 多價實體的骨架提供或者與之相附著。
在更優(yōu)選的實施方式中，多價實體是分支多肽(所謂的樹狀聚合
物)?？梢愿鶕?jù)Tam和Lu (見上)所述的方案制備出這些樹狀聚合物。一 些用于合成分支多肽的其他方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。
優(yōu)選地，分支多肽在其兩個或多個分支的預(yù)定位點上摻入特異性識 別位點或特異性結(jié)合對的成員。肽的每個分支都可以具有所需的長度。 每個分支的長度優(yōu)選地小于24個氨基酸。通過在肽合成期間用已知的 方法在Lys殘基上使肽分支可以實現(xiàn)肽的分支化。通過這種方式，肽在 第一個賴氨酸殘基上被分支成兩個分支，之后在更多的賴氨酸殘基上被 進(jìn)一步分支形成四價實體。通過包括更多的或更少的分支步驟可以實現(xiàn) 其他的效價例如八聚體。通過僅僅部分地分支合成肽也可以得到奇數(shù)效 價。
作為多價實體的樹狀聚合物的化學(xué)合成將容許非常精確地控制寡聚 體的性質(zhì)和化學(xué)計量。這反過來造成了在寡聚體的各種用途例如T細(xì)胞 標(biāo)記或檢測中的更高的精確度。
圖3顯示了適用于使得本發(fā)明的MHC復(fù)合物單體在其肽位置發(fā)生 多聚化的分支肽或樹狀聚合物。該圖舉例說明了多肽骨架，其分支兩 次，生成了四聚體結(jié)構(gòu)。合成了在其每個末端分支上都摻入互補識別位 點(H')的樹狀聚合物，所述識別位點可以在不影響MHC穩(wěn)定性的條件 下與特異性附著位點(H)結(jié)合，據(jù)此生成四價實體。該圖還顯示了熒光 標(biāo)記部分(F),其被整合于樹狀聚合物的非分支部分。
在另一個實施方式中，多價實體是寡核苷酸或環(huán)狀寡核苷酸。寡核 苷酸的長度通常是50到150個核苷酸，但是也可以短到3個核苷酸。多 價實體優(yōu)選地是環(huán)狀寡核苷酸，甚至更優(yōu)選地其周長小于150個堿基。 圖4顯示了這個實施方式，其顯示了這種環(huán)狀寡核苷酸的骨架。與圖3 相類似，在其合成期間或之后，寡核苷酸在此已經(jīng)被修飾成包含6個不 同核苷酸位置上的互補識別位點(H，)，因此形成了六價實體。另外，環(huán) 狀寡核苷酸也包括兩個熒光標(biāo)記的部分(F)。
根據(jù)第二種寡聚化方案，MHC寡聚體通過肽在其寡聚化結(jié)構(gòu)域的 排列發(fā)生寡聚化。排列最廣義地表示(大)分子之間的任何自我組織的結(jié) 合現(xiàn)象，這至少形成了兩個或多個這種(大)分子的暫時連接。這種類型 排列的實例是核酸雜交、兩種或多種蛋白(或蛋白區(qū))例如免疫球蛋白Fc 區(qū)、巻曲螺旋區(qū)的自我組裝、角蛋白纖維和類似物的自我組裝以及化學(xué) 部分的共價結(jié)合。寡聚化結(jié)構(gòu)域事實上可以形成肽骨架的一部分或者與 之相附著。它們在性質(zhì)上可以是肽或核酸。因此，在第一個實施方式 中，每個肽都包含肽寡聚化結(jié)構(gòu)域，其優(yōu)選地與肽骨架融合。在另一個 實施方式中，每個肽都與寡聚化結(jié)構(gòu)域相附著。在這種情況中，寡聚化 結(jié)構(gòu)域可以選自由肽寡聚化結(jié)構(gòu)域和核酸組成的組。
肽寡聚化結(jié)構(gòu)域可以選自由抗體恒定區(qū)、酶單體和形成寡聚體的巻 曲螺旋蛋白的寡聚化結(jié)構(gòu)域組成的組。優(yōu)選地，這是形成寡聚體的巻曲 螺旋蛋白的寡聚化結(jié)構(gòu)域，所述蛋白選自由膠原蛋白家族、C型凝集素 和血小板反應(yīng)蛋白家族蛋白組成的組。
形成寡聚體的巻曲螺旋蛋白的實例包括各種類型的膠原、C型凝集 素例如甘露糖結(jié)合蛋白(MBP)的三巻曲螺旋區(qū)、Clq、肌球蛋白、亮氨 酸拉鏈例如存在于p53、 GCN4、噬菌體P22Mnt抑制子中的亮氨酸拉 鏈、和血小板反應(yīng)蛋白家族蛋白例如COMP。寡聚化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地源自 軟骨寡聚體基質(zhì)蛋白(COMP)。更優(yōu)選地，寡聚化結(jié)構(gòu)域是人類的 COMP。
對于巻曲螺旋蛋白而言，本發(fā)明的MHC寡聚體所包含的MHC復(fù) 合物的數(shù)目(m)通常依賴于肽寡聚化結(jié)構(gòu)域所來源的類型， 一般是2個 或更多，優(yōu)選地m=2到10，最優(yōu)選地m=3或5。如果被寡聚化的肽的 修飾例如源自COMP的五聚體化區(qū)，該數(shù)目通常是5，使得該寡聚體是 五聚體(m-5)，而當(dāng)這些寡聚化結(jié)構(gòu)域源自膠原時，該數(shù)目是3(m-3)。
在一個實施方式中，每個肽依次包含兩個非重疊的寡聚化結(jié)構(gòu)域。 寡聚體中的第n個肽的第二個寡聚化結(jié)構(gòu)域與寡聚體中的第(n+l)個肽的
第一個寡聚化結(jié)構(gòu)域形成二聚體或排列。然后，寡聚體中的第(n+l)個肽 的第二個寡聚化結(jié)構(gòu)域與寡聚體中的第(n+2)個肽的第一個寡聚化結(jié)構(gòu)域 形成二聚體或排列等等。在這種情況中，最優(yōu)選地是，寡聚體中的最后
一個肽的第二個寡聚化結(jié)構(gòu)域與寡聚體中的第一個肽的第一個寡聚化結(jié) 構(gòu)域形成二聚體，以便提供環(huán)狀結(jié)構(gòu)。盡管對于本實施方式而言，理論
上可以使用任何形式的能夠發(fā)生二聚體化的寡聚化結(jié)構(gòu)域，但是第一個 和第二個寡聚化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地是核酸，通過它們的雜交發(fā)生寡聚化。
待寡聚化的功能性單體MHC復(fù)合物常常是可溶性的分離的或重組 的MHC復(fù)合物，其可以源自I型或II類MHC復(fù)合物，優(yōu)選地分別是如 圖1或圖2所示的I類MHC復(fù)合物的胞外部分或者II類MHC復(fù)合物的 胞外部分。這些復(fù)合物中的每個復(fù)合物都由a鏈和P鏈組成。功能性復(fù)合 物還包含結(jié)合于相應(yīng)的由其a和(3鏈形成的溝的修飾肽。
MHC蛋白可以來自任何脊椎動物物種，例如靈長類物種(特別是 人)、嚙齒類動物包括小鼠、大鼠、倉鼠和兔、馬、牛、犬、貓等。特別 相關(guān)的是人HLA蛋白和小鼠H-2蛋白。HLA蛋白包含II型亞基HLA-DPa、 HLA-DP(3、 HLA曙DQa、 HLA畫DQJ3、 HLA-DRa和HLA-DR(3，以 及I型蛋白HLA-A、 HLA-B、 HLA-C、和{32-微球蛋白。小鼠H-2蛋白 亞基包含I型亞基H-2K、 H-2D、 H-2L，和II型亞基I-Aa、 I-AP、 I-Ea 和I-E(3，以及(32-微球蛋白。 一些代表性MHC蛋白的氨基酸序列參照 EP 812 331 。非經(jīng)典的實例例如HLA-E、 HLA-F、 HLA-G、 Qal、和 CD1也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。CD1單體可以在其溝內(nèi)結(jié)合有脂質(zhì)而非 肽。本發(fā)明也適用于其中脂質(zhì)代替肽被結(jié)合的情況，本領(lǐng)域技術(shù)人員能 夠?qū)⑸厦娴墓丫刍桨皋D(zhuǎn)換到這個情況中。
在一個優(yōu)選的實施方式中，MHC肽鏈對應(yīng)于可溶性形式的正常膜 結(jié)合蛋白。對于I型亞基而言，通過缺失天然形式的跨膜區(qū)和胞漿區(qū)形 成可溶性形式。對于I型蛋白而言，可溶性形式包括a鏈的al、 oc2和cx3
區(qū)區(qū)。對于II型蛋白而言，可溶性形式分別包含oc鏈或l3鏈的al和cx2或 Pl和P2區(qū)區(qū)。
包含的跨膜區(qū)氨基酸不超過約10個、通常不超過約5個、優(yōu)選地 不包含跨膜區(qū)的氨基酸。缺失可以延伸約10個氨基酸到達(dá)oc3區(qū)內(nèi)。優(yōu) 選地，不缺失a3區(qū)的氨基酸。缺失要使得其不會干擾ot3區(qū)折疊成功能 性二硫鍵結(jié)構(gòu)的能力。I型(3鏈、P2m的天然形式都缺少跨膜區(qū)，因此不 必被截短。II型亞基一般都不與I型亞基綴合。
上述缺失同樣適用于II型亞基。所述缺失可以延伸約10個氨基酸 到達(dá)a2或p2區(qū)內(nèi)。優(yōu)選地，不缺失a2或p2區(qū)的氨基酸。缺失要使得其 不會干擾a2或p2區(qū)折疊成功能性二硫鍵結(jié)構(gòu)的能力。
可以在多肽末端引入少數(shù)氨基酸，通常不超過25個氨基酸，更通 常地不超過20個氨基酸。氨基酸的缺失或插入通常是克隆需要的結(jié) 果，例如提供便利的限制性位點等的結(jié)果，以便解決分子組裝過程中可 能的空間問題。另外，基于同樣的原因，可以用不同的氨基酸取代一個 或多個氨基酸，通常不取代任一區(qū)內(nèi)的5個以上的氨基酸。
一般而言，因此，除了在此所含的一個或多個蛋白或蛋白鏈，寡聚 體還包含一個或多個附加區(qū)例如一個或多個接頭、標(biāo)簽區(qū)和純化區(qū)。附 加區(qū)例如不僅可以由多價實體或肽提供，還可以存在于MHC的a和/或(3 鏈中。
出于說明的目的，圖1和圖2中的復(fù)合物是融合多肽，額外具有與 其蛋白鏈之一融合的蛋白標(biāo)簽(E)，所述標(biāo)簽可以進(jìn)一步地容許標(biāo)記、純 化或附著這些蛋白。標(biāo)簽E可以是表位標(biāo)簽或者經(jīng)修飾的蛋白序列。多 肽接頭可以將這個標(biāo)簽與MHC a或p鏈的多肽分開。這個接頭和其他任 何接頭一般都包含不超過25個氨基酸，優(yōu)選地不超過20個氨基酸。
在所述復(fù)合物中任選包含的蛋白標(biāo)簽(E)可以是任何容許標(biāo)記蛋白的 區(qū)域。優(yōu)選地，標(biāo)簽區(qū)包括標(biāo)記。這個標(biāo)記本身可以包含于標(biāo)簽區(qū)內(nèi)， 例如被抗體所識別的表位或光可檢測或放射性標(biāo)記。優(yōu)選地，標(biāo)記選自
由熒光標(biāo)記物例如FITC、藻膽蛋白例如R-或B-藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋 白、Cy3、 Cy5、 Cy7、發(fā)光標(biāo)記物、放射性標(biāo)記例如1251或3卞、酶例如 辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶例如蝦堿性磷酸酶、表位、凝集素、生物 素或鏈霉抗生物素。
當(dāng)標(biāo)記本身是蛋白時，用作標(biāo)記的蛋白的多肽鏈可以與肽融合，形 成嵌合蛋白，優(yōu)選地在其C末端。例如，該嵌合蛋白可以使用熒光蛋白 例如綠熒光蛋白(GFP)或藻膽蛋白的亞基。GFP嵌合蛋白技術(shù)在本領(lǐng)域 是公知的。例如在WO 01/46395中描述了包含源自藻膽蛋白的合適區(qū)域 的嵌合蛋白。
或者，可以通過經(jīng)合適標(biāo)記的抗體、或抗體片段例如經(jīng)標(biāo)記的F(ab) 片段與標(biāo)簽(E)的合適表位結(jié)合實現(xiàn)標(biāo)記。
在本發(fā)明的寡聚體中任選包含的純化區(qū)可以是有助于純化本發(fā)明的 蛋白的任何區(qū)域，例如通過提供特異性結(jié)合表征。適當(dāng)?shù)男蛄袑τ诒绢I(lǐng) 域技術(shù)人員是已知的，只要它們不會干擾復(fù)合物的功能部分就可以釆 用。優(yōu)選地，純化區(qū)是六組氨酸序列。
被寡聚化的功能性單體MHC復(fù)合物包含結(jié)合于它們的肽結(jié)合溝內(nèi) 的肽。該肽至少包含MHC結(jié)合部分以及形成或攜帶附著位點或寡聚化 結(jié)構(gòu)域形式的修飾的獨立部分。除了任何接頭和修飾之外，對于具有I 類MHC蛋白的復(fù)合物而言，MHC結(jié)合部分的長度是從約6個到14個 氨基酸，通常是從約8個到ll個氨基酸。具有II類MHC蛋白的復(fù)合物 的長度是從約6個到35個氨基酸，通常是從約10個到20個氨基酸。
肽的MHC結(jié)合部分可以具有源自多種蛋白的序列。在多種情況 中，都需要使用作為T細(xì)胞表位的肽。多種抗原的表位序列在本領(lǐng)域是 已知的?；蛘撸梢酝ㄟ^分離和測序結(jié)合于天然MHC蛋白的肽、從靶 序列合成一系列推測的抗原肽、然后測定不同肽的T細(xì)胞反應(yīng)性，或者 通過用這些肽生成一系列MHC肽復(fù)合物并定量出T細(xì)胞結(jié)合力可以經(jīng) 驗地確定出表位序列。肽的制備包括合成肽的合成、鑒定序列以及鑒定
相關(guān)的最小抗原序列在本領(lǐng)域都是已知的。在各種情況中，寡聚體的
MHC復(fù)合物中所含的肽優(yōu)選地是基本上均一的，意思是所述肽在它們 的MHC結(jié)合部分優(yōu)選地具有至少80%、更優(yōu)選地具有至少90%以及最 優(yōu)選地具有至少95%的相同性。
接頭多肽序列通常被插入于肽(P)的MHC結(jié)合部分序列和修飾位點 (H)之間。為了其靈活性和可溶性，這種接頭可以是例如插入于脯氨酸 或絲氨酸之間的甘氨酸殘基重復(fù)，(GGPGG)n或(GGSGG)n，其中n的范 圍通常是1到6之間。要明白其他的柔性的、具有足夠可溶性并且不會 形成顯著的二級結(jié)構(gòu)的接頭也適用于這個目的。 一般可以使用長度為1 到30個、優(yōu)選的3到20個和最優(yōu)選的3到IO個氨基酸的多肽。對于非 肽接頭，可以相應(yīng)地調(diào)整它們的長度。非肽接頭還可包括PEG或聚環(huán)氧 乙垸(PEO)重復(fù)。
優(yōu)選地選擇接頭的長度，使得寡聚化結(jié)構(gòu)域或附著位點至少要遠(yuǎn)離 MHC肽復(fù)合物與T細(xì)胞受體(TCR)和CD4、 CD8或其他輔助受體的結(jié)合 部位，這樣它就基本上不會干擾相應(yīng)的MHC肽復(fù)合物與TCR的相互作 用。為了實現(xiàn)前述目的，接頭長度也要盡可能短，因為這會有助于降低 肽合成的費用。
本發(fā)明的MHC寡聚體也可以包含標(biāo)記。這種標(biāo)記例如可以選自由 光可檢測標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶、表位、凝集素或生物素組成的組。上 面已經(jīng)列出了針對標(biāo)簽區(qū)的其他標(biāo)記。同樣可以使用這些標(biāo)記。如果存 在這樣的實體，標(biāo)記在一個實施方式中優(yōu)選地是由多價實體或寡聚化結(jié) 構(gòu)域排列形成的結(jié)構(gòu)提供的。在組裝寡聚體期間或之后或者甚至在應(yīng)用 或使用所述寡聚體期間可以整合標(biāo)記。當(dāng)多價實體本身是通過化學(xué)合成 形成時，可以在多價實體的預(yù)定位置上化學(xué)地引入標(biāo)記，其容許標(biāo)記具 有精確化學(xué)計量的寡聚體的MHC復(fù)合物。當(dāng)標(biāo)記是熒光標(biāo)記時，這容 許獲得具有高度均一的亮度和最大信號噪音比的復(fù)合物。本發(fā)明也涉及藥物組合物或診斷組合物，其包含如上定義的MHC 寡聚體，任選地與藥學(xué)可接受載體組合。
包含本發(fā)明的寡聚體的藥物組合物可以用于例如腸外給藥即皮下、 肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。另外，開發(fā)出了大量新的藥物轉(zhuǎn)運方法。本發(fā)明 的藥物組合物同樣適用于利用這些新方法給藥。
用于腸外給藥的組合物常常包含溶解于可用載體的寡聚體溶液，優(yōu)
選地是水性載體?？梢允褂酶鞣N水性載體，例如緩沖水、0.4%鹽水、 0.3%甘氨酸等。這些溶液是無菌的， 一般都不含顆粒物質(zhì)?？梢杂脗鹘y(tǒng) 的、公知的滅菌技術(shù)將這些組合物滅菌。組合物可以包含近似生理條件 所需的藥學(xué)可接受的輔助物，例如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等、 例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。根據(jù)所選的具體給 藥模式，這些劑型中的寡聚體濃度可以有著極大的不同，即從小于約 lpg/ml，通常至少約0.1mg/ml至U 10-100mg/ml，主要根據(jù)液體體積、粘 度等選擇寡聚體濃度。
用于肌肉內(nèi)注射的常用藥物組合物通常被制劑成包含lml無菌的緩 沖水和O.lmg寡聚體蛋白。用于靜脈內(nèi)輸注的常用組合物可以被制劑成 包含250ml無菌林格液和10mg寡聚體復(fù)合物蛋白。用于制備可腸外給 藥的組合物的實際方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的或顯而易見的。
本發(fā)明的MHC寡聚體可以被凍干儲存，并在使用前用合適的載體 重構(gòu)。這個技術(shù)已經(jīng)顯示出是有效的，可以采用常用的凍干和重構(gòu)技 術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員要明白凍干和重構(gòu)可以造成不同程度的活性丟失， 需要調(diào)整施用水平進(jìn)行補償。
本發(fā)明也涉及依據(jù)T細(xì)胞抗原受體的特異性來標(biāo)記和/或檢測哺乳動 物T細(xì)胞的方法，方法包括
(i) 組合本發(fā)明的MHC寡聚體和包含T細(xì)胞的懸浮液或生物學(xué)樣 品，禾口
(ii) 檢測是否存在所述復(fù)合物和T細(xì)胞的特異性結(jié)合。
本發(fā)明也涉及依據(jù)T細(xì)胞抗原受體的特異性來分離哺乳動物T細(xì)胞 的方法，方法包括
(i) 組合本發(fā)明的MHC寡聚體和包含T細(xì)胞的懸浮液或生物學(xué)樣
品，禾口
(ii) 將與所述復(fù)合物結(jié)合的T細(xì)胞與未結(jié)合的細(xì)胞分離。 本發(fā)明還涉及用于如上所述標(biāo)記和/或檢測和/或分離細(xì)胞的方法，
其中依據(jù)與MHC分子特異性結(jié)合的特殊類型的細(xì)胞表面分子來標(biāo)記、 檢測或分離一種非T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞類型。例如，已知人非經(jīng)典MHC 分子HLA-E可以通過與NK表面受體CD94/NKG2的特異性結(jié)合與自然 殺傷(NK)細(xì)胞結(jié)合(D.S丄Allan W "/., J. Immunol. Meth. 268 (2002) 43-50)。同樣，HLA-G和HLA-F顯示出能染色CD14+細(xì)胞上的ILT2和 ILT4受體，以及HLA-F也顯示出能染色CD19+亞群(Allan a/.,見 上)。技術(shù)人員能夠?qū)⑸厦嫠龅姆椒ǚg到這種情況。
本發(fā)明最后涉及一種生成MHC寡聚體的方法，所述寡聚體包含至 少兩個具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合物，每個復(fù)合物都具有結(jié)合于 所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝內(nèi)的肽，其中每個肽都包含容許發(fā)生高度 特異性寡聚化的修飾，所述方法包括步驟
(i) 提供一種或多種能夠結(jié)合于每個功能性MHC復(fù)合物的肽溝的 肽，所述肽可以通過以下方式進(jìn)行修飾
(a) 提供特異性附著位點，或
(b) 提供寡聚化結(jié)構(gòu)域；
(ii) 提供包含(i)的肽的單體功能性MHC肽復(fù)合物，和
(iii) 可以通過以下方式使功能性MHC復(fù)合物發(fā)生寡聚化 (a)提供多價實體以及所述單體功能性MHC肽復(fù)合物在每個肽
上所提供的或附著于其的特異性結(jié)合位點與多價實體的結(jié) 合，或
(b)所述的肽通過每個肽上所提供的或附著于其的寡聚化結(jié)構(gòu)域
進(jìn)行排列。
優(yōu)選地，在存在如步驟(i)所修飾的肽時，通過重折疊MHC a和卩鏈 提供步驟(ii)中的單體功能性MHC復(fù)合物。
例如可以從真核或原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得MHC a和p鏈，任選地可以 在重折疊之前將其純化?；蛘撸梢詮钠渌麃碓粗蟹蛛x出a和p鏈或折疊 復(fù)合物。在需要或者合適的時候，該方法也可以包含重折疊的功能性 MHC復(fù)合物的肽交換步驟。通過如上所述的固相合成通?？梢蕴峁┎?驟(i)中的肽?？梢栽谒龊铣善陂g或之后修飾所述肽。合成期間的修飾 是例如通過向骨架中添加肽區(qū)或者整合經(jīng)修飾(例如硫代-)的氨基酸。合 成后的修飾例如可以是連接核酸寡聚化結(jié)構(gòu)域。
在圖5中，經(jīng)修飾的肽(P)顯示出在沒有獨立的多價實體時能夠形成 多聚體MHC肽復(fù)合物。抗原肽通常具有10個氨基酸甘氨酸絲氨酸接 頭，以便為寡聚體提供足夠多的空間。在5個變體P(l)到P(5)中合成了 包含5種不同寡核苷酸的肽。優(yōu)選地，P(1)到P(5泡含相同的MHC結(jié)合 部分。
每個附著的寡核苷酸都具有兩個區(qū)(1,2')、 (2,3')、 (3，4')、 (4，5')、和 (5,1')，其中每個區(qū)與另一個寡核苷酸上的一個且僅僅一個其他區(qū)互補。 第5個寡核苷酸具有與第一個寡核苷酸的第一個區(qū)1互補的第二個區(qū) 1，。每個區(qū)對可以具有約為20。C的退火溫度。通過已知的寡核苷酸設(shè)計 技術(shù)將非互補區(qū)之間的交叉反應(yīng)性最小化。每個寡核苷酸上的兩個區(qū)可 以直接連接或者具有非退火的寡核苷酸接頭，以便增加區(qū)之間的空間。 接頭可以包含合成標(biāo)記，例如在前所述的標(biāo)記?？梢栽谝粋€單一過程中 合成偶聯(lián)的多肽-寡核苷酸，或者可以分別合成，之后進(jìn)行偶聯(lián)，其中通 過如上所述的修飾肽與寡核苷酸的化學(xué)選擇性連接可以實現(xiàn)肽與寡核苷 酸的連接。用HPLC將5種寡核苷酸/肽產(chǎn)物都純化到足夠高的純度。
寡核苷酸/肽在被加熱到30°C 5分鐘后，在20。C退火。然后重新純 化出寡核苷酸/肽五聚體。然后根據(jù)已知的方案，用變性的MHCoc和(3鏈 重折疊成寡核苷酸/肽五聚體。這將生成具有所形成的不均一效價的異多 聚體，因為MHC分子的重折疊是不完整的，所給定的合理的過量的肽 將主要生成具有經(jīng)寡核苷酸偶聯(lián)附著的4個附加肽的MHC肽單體 (MHC-Ps)。然后用凝膠過濾色譜法濃縮并純化所形成的產(chǎn)物，以便主要 地選擇出MHC-P5單體。然后通過將單體加熱到30°C 5分鐘，消除P5 相互作用，生成MHC-P，單體和游離肽。然后在30°C、 PD10柱 (Amersham Biosciences, Chalfont St. Giles, UK)中快速地純化出肽。然后 從柱中洗脫出所形成的MHC-P單體。當(dāng)在純化產(chǎn)物中存在粗等量摩爾 比的單體P(l)到P(5)肽時，單個的MHC-P單體可以被重新退火形成 MHC五聚體。在第二次凝膠過濾步驟中，純化去除不正確退火的產(chǎn) 物，使得純化產(chǎn)物基本上只包含MHC五聚體。
實施例
實施例l:形成摻入流感血凝素A肽HA(306-318): PKYVKQNTLKLAT 的經(jīng)標(biāo)記的II類MHC肽八聚體HLA-DRB"OIOI
HA'-肽被合成為HA-(GGGSG)2-K"，其中K"是被修飾包含苯甲醛 的賴氨酸，其純度>95%。
一般可以如下合成肽P'-K"-P"，其中P'、 P"是兩個多肽亞片段。引 入Fmoc-Lys(Mtt)-OH或Fmoc-Lys(ivDde)-OH作為需要被修飾的位置， 其中Fmoc是9-芴甲氧羰基，Mtt是4-甲基三苯甲基，以及ivDde是1-(4,4-二甲基-2，6-二氧環(huán)己-1 -亞基)-3-甲丁基。然后用丁氧羰基(Boc)封閉 肽的N末端，使得可以選擇性地去除Mtt或ivDde。然后可以用丙酮5-(琥珀酰亞胺基氧羰基)-吡啶-2-基腙(SANH)或琥珀酰亞胺基-4-甲?；?甲酸酯(SFB)修飾暴露的氨基，以便引入2-肼基吡啶基或苯甲醛基。 按照Cameron et al., J. Immunol. Meth. 268: (2002) 51-69所述的方案 從可溶性oc鏈HLA-DRA1*0101禾叩鏈HLA-DRB1*0101和HA'肽的包涵 體材料中重折疊出單體的HLA-DRB1*0101 HA'復(fù)合物，有所不同的是 每個蛋白鏈都不需要生物素化的融合標(biāo)簽。按照該相同方案中所述的那 樣實現(xiàn)單體復(fù)合物的純化。用Bradford法測定出復(fù)合物的蛋白濃度。
合成下面的八價肽(F)MV8。
(F)MV8.1: (KmGGSGGGGSGG)8(K'G)4(K'G)2K'GKFGA
這個肽的分支出現(xiàn)在各個賴氨酸K'處，數(shù)字說明了每個階段的肽的 分支的數(shù)目。KF是經(jīng)異硫氰酸熒光素FITC修飾的賴氨酸殘基，以提供 熒光標(biāo)記物。K"'是經(jīng)2-hydrazinopyridyl修飾的賴氨酸殘基，提供了分 支肽上的8個能與HA'肽上的醛基反應(yīng)形成穩(wěn)定的二芳香腙的2-hydrazinopyridyl基團(tuán)。
將單體HLA-DRB1*0101 HA'與(F)MV8.1按8:1摩爾比混合于PBS (pH 6.8)中，形成FITC標(biāo)記的HLA-DRB1*0101 HA'八聚體。
用凝膠過濾色譜法在Sephadex S 300柱(Amersham Biosciences, Chalfont St.Giles, UK)上純化所形成的產(chǎn)物，以主要回收八聚體。
實施例2:形成摻入CMV pp65肽(495-503): NLVPMVATV的標(biāo)記的I類 MHC肽八聚體HLA-A*0201
合成純度>95%的肽NLV':NLVPMVATV-(GGGSG)rK"，其中K"如
上所述。
按照Garboci & a/., PNAS 89 (1992), 3429-3433所述的方案從可溶性 a鏈HLA-A*0201和P2微球蛋白和NLV'肽的包涵體材料中重折疊出單 體的HLA-AW201/NLV'復(fù)合物。按照該相同方案中所述的那樣實現(xiàn)單體 復(fù)合物的純化。用Bradford法測定出復(fù)合物的蛋白濃度。
根據(jù)在此前所述的優(yōu)選方法合成(F)MV8.2， 一種96個堿基的環(huán)狀 寡核苷酸，其中依照標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸合成方法，每第12個堿基都被2-
hydrazinopyridyl修飾，且各個位于兩個2-hydrazinopyridyl部分之間中心 處的堿基都被修飾成包含(FITC)。選擇堿基以便于修飾并使得二級結(jié)構(gòu) 最小化。
將單體HLA-A8180201 NLV'與(F)MV8,2按8:1摩爾比混合于反應(yīng)緩沖 液(pH 6.8)中，形成FITC標(biāo)記的HLA-A*0201 NLV'八聚體。
用凝膠過濾色譜法例如在Sephadex S 300柱(Amersham Biosciences, Chalfont St.Giles, UK)上純化所形成的產(chǎn)物，以主要回收八聚體。
在上面的每個實施例中，都用凝膠過濾色譜法在Sephacryl S-300柱 (Amersham Biosciences, Chalfont St.Giles, UK)上純化所得產(chǎn)物，以主要 回收八聚體?？梢詽饪s所純化的產(chǎn)物，或者直接使用，例如用于流式細(xì) 胞術(shù)。
要知道多價實體(F)MV8.1或(F)MV8.2可以互換地分別用于I型和II 類MHC復(fù)合物的多聚化。
權(quán)利要求
1.MHC寡聚體，包含至少兩個具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合物，每個MHC復(fù)合物都具有結(jié)合于所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝的肽，其中每個肽都具有容許所述功能性MHC復(fù)合物通過一核心結(jié)構(gòu)發(fā)生高度特異性寡聚化的修飾。
2. MHC寡聚體，包含至少兩個具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合 物，每個MHC復(fù)合物都具有結(jié)合于所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝的 肽，在所述包含肽的功能性單體MHC復(fù)合物發(fā)生組裝后，所述MHC 復(fù)合物通過它們的肽發(fā)生寡聚化。
3. MHC寡聚體，包含至少兩個具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合 物，每個MHC復(fù)合物都具有結(jié)合于所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝的 肽，其中每個肽都包含選自由特異性附著位點和寡聚化結(jié)構(gòu)域組成的組 的修飾，其中功能性MHC復(fù)合物通過以下方式發(fā)生寡聚化，(i) 每個肽在每個肽上所提供的或附著于其的特異性附著位點與多價 實體結(jié)合，或者(ii) 所述的肽通過每個肽上所提供的或附著于其的寡聚化結(jié)構(gòu)域進(jìn) 行排列，其中寡聚體中的MHC復(fù)合物與由多價實體或肽排列所提供的核心 結(jié)構(gòu)相連接。
4. 權(quán)利要求3的MHC寡聚體，其中寡聚化通過肽與多價實體的 結(jié)合而發(fā)生。
5. 權(quán)利要求4的MHC寡聚體，其中結(jié)合通過多價實體所提供的 識別位點識別所述肽所具有的特異性附著位點而發(fā)生。
6. 權(quán)利要求3到5中任一項的MHC寡聚體，其中肽包含MHC 結(jié)合部分和一攜帶或形成所述修飾的獨立部分。
7. 權(quán)利要求6的MHC寡聚體，其中肽還包含其MHC結(jié)合部分 和所述獨立部分之間的多肽接頭，所述接頭的長度優(yōu)選地是3到10個 氨基酸。
8. 權(quán)利要求5的MHC寡聚體，其中特異性附著位點和識別位點 選自特異性結(jié)合對的成員。
9. 權(quán)利要求8的MHC寡聚體，其中特異性結(jié)合對選自由半抗原/ 抗體、表位/抗體、配體/受體、底物或底物類似物/酶、輔因子或輔因子 類似物/酶、核酸/互補核酸、糖/凝集素、生物素/抗生物素蛋白家族蛋白 例如抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素、neutravidin 、和 Streptag⑧/Streptactin⑧組成的組。
10. 權(quán)利要求4到7中任一項的MHC寡聚體，其中附著通過肽與 多價實體的共價結(jié)合而發(fā)生，所述附著位點和識別位點是能夠彼此形成 共價鍵的部分。
11. 權(quán)利要求IO的MHC寡聚體，其中所形成的共價鍵是選自由躬 鍵、腙鍵、噻唑烷鍵、噁唑烷鍵、硫醚鍵、二硫鍵、和肽鍵組成的組中 的類型。
12. 權(quán)利要求4至U 11中任一項的寡聚體，其中多價實體選自由天 然聚合物或其衍生物例如蛋白質(zhì)、分支多肽(樹狀聚合物)、多聚體蛋 白、核酸、多糖例如葡聚糖、淀粉、纖維素、透明質(zhì)酸、甲殼素、或海 藻酸或這些多糖的衍生物、寡核苷酸、環(huán)狀寡核苷酸；合成聚合物；磷 脂膜例如小泡或脂質(zhì)體；和無機顆粒組成的組。
13. 權(quán)利要求12的MHC寡聚體，其中多價實體是天然的或合成的 聚合物，所述識別位點是由多價實體的骨架提供的或者是與所述多價實 體相連的。
14. 權(quán)利要求11的MHC寡聚體，其中多價實體是分支多肽(樹狀 聚合物)，優(yōu)選地在其兩個或多個分支的預(yù)定位點上摻入識別位點。
15. 權(quán)利要求14的MHC寡聚體，其中肽的每個分支的長度都小于 24個氨基酸。
16. 權(quán)利要求IO的MHC寡聚體，其中多價實體是寡核苷酸或環(huán)狀 寡核苷酸，環(huán)狀寡核苷酸的周長優(yōu)選地小于150個堿基。
17. 權(quán)利要求3的MHC寡聚體，其中寡聚化通過肽的排列而發(fā)生。
18. 權(quán)利要求17的寡聚體，其中每個肽都附著有寡聚化結(jié)構(gòu)域， 所述寡聚化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地選自由肽寡聚化結(jié)構(gòu)域和核酸組成的組。
19. 權(quán)利要求18的MHC寡聚體，其中寡聚化結(jié)構(gòu)域是肽寡聚化結(jié) 構(gòu)域，所述寡聚化結(jié)構(gòu)域選自由抗體恒定區(qū)、角蛋白和形成寡聚體的巻 曲螺旋蛋白的寡聚化結(jié)構(gòu)域組成的組。
20. 權(quán)利要求18的MHC寡聚體，其中每個肽都依次包含兩個非重 疊的寡聚化結(jié)構(gòu)域，其中所述寡聚體中的第n個肽的第二個寡聚化結(jié)構(gòu) 域與所述寡聚體中的第(n+l)個肽的第一個寡聚化結(jié)構(gòu)域發(fā)生二聚體化。
21. 權(quán)利要求20的MHC寡聚體，其中進(jìn)一步地，所述寡聚體中的 最后一個肽的第二個寡聚化結(jié)構(gòu)域與所述寡聚體中的第一個肽的第一個 寡聚化結(jié)構(gòu)域發(fā)生二聚體化，以提供環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
22. 權(quán)利要求20或21的MHC寡聚體，其中第一個和第二個寡聚 化結(jié)構(gòu)域是核酸。
23，前述權(quán)利要求中任一項的MHC寡聚體，其中MHC寡聚體基 本上不包含未結(jié)合于MHC肽復(fù)合物的MHC結(jié)合肽區(qū)段。
24. 前述權(quán)利要求中任一項的MHC寡聚體，其中MHC復(fù)合物源 自I類MHC復(fù)合物的胞外部分。
25. 前述權(quán)利要求中任一項的MHC寡聚體，其中MHC復(fù)合物源 自II類MHC復(fù)合物的胞外部分。
26. 前述權(quán)利要求中任一項的MHC寡聚體，其中所述肽的MHC 結(jié)合部分基本上是均一的。
27. 前述權(quán)利要求中任一項的MHC寡聚體，其中至少一個單體功 能性MHC復(fù)合物是CD1，以及相應(yīng)的肽是脂質(zhì)。
28. 前述權(quán)利要求中任一項的MHC寡聚體，其中寡聚體所包含的 MHC-肽復(fù)合物中的所述肽的MHC結(jié)合部分的氨基酸側(cè)鏈和/或MHC a 或(3鏈的氨基酸側(cè)鏈在寡聚化過程中基本上都沒有被修飾。
29. 藥物或診斷組合物，包含前述權(quán)利要求中任一項的MHC寡聚 體，任選地與藥學(xué)可接受載體組合。
30. 依據(jù)T細(xì)胞抗原受體的特異性來標(biāo)記和/或檢測哺乳動物T細(xì) 胞的方法，方法包括(i) 組合權(quán)利要求1到28中任一項的MHC寡聚體和包含T細(xì)胞的 懸浮液或生物學(xué)樣品，和(ii) 檢測是否存在所述復(fù)合物和T細(xì)胞的特異性結(jié)合。
31. 依據(jù)T細(xì)胞抗原受體的特異性來分離哺乳動物T細(xì)胞的方法， 方法包括(i) 組合權(quán)利要求1到28中任一項的MHC寡聚體和包含T細(xì)胞的懸浮液或生物學(xué)樣品，和(ii) 將結(jié)合于所述復(fù)合物的T細(xì)胞與未結(jié)合的細(xì)胞分離。
32. 權(quán)利要求30或31的方法，其中依據(jù)特異結(jié)合MHC分子的特 殊類型的細(xì)胞表面分子來標(biāo)記、檢測或分離出非T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞類 型。
33. 形成如權(quán)利要求1到28中任一項所定義的MHC寡聚體的方 法，所述MHC寡聚體包含至少兩個具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合 物，每個復(fù)合物都具有結(jié)合于所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝的肽，其中 每個肽都具有容許功能性MHC復(fù)合物通過一核心結(jié)構(gòu)發(fā)生高度特異性 寡聚化的修飾，所述方法包括步驟(i)提供一種或多種能夠結(jié)合于每個功能性MHC復(fù)合物的肽溝的 肽，所述肽通過以下方式被修飾 (a) 提供特異性附著位點，或(b) 提供寡聚化結(jié)構(gòu)域；(ii)提供包含在(i)中被修飾的肽的單體功能性MHC肽復(fù)合物，禾口 (m)通過以下方式使功能性MHC復(fù)合物發(fā)生寡聚化(a) 提供多價實體并將所述單體功能性MHC肽復(fù)合物在每個 肽上所提供的或附著于其的特異性附著位點與多價實體結(jié)合，或(b) 通過每個肽上所提供的或附著于其的寡聚化結(jié)構(gòu)域?qū)λ?的肽進(jìn)行排列。
34. 權(quán)利要求33的方法，其中在存在在步驟(i)中被修飾的肽的情 況下，通過重折疊MHC a和P鏈來提供步驟(ii)中的單體功能性MHC-肽 復(fù)合物。
35. 權(quán)利要求33的方法，其中在存在在步驟(i)中被修飾的肽的情 況下，通過被重折疊的功能性MHC復(fù)合物的肽交換提供步驟(ii)中的單 體功能性MHC-肽復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了MHC寡聚體及其制備方法，所述MHC寡聚體包含至少兩個具有肽結(jié)合溝的功能性MHC復(fù)合物，每個MHC復(fù)合物都具有結(jié)合于所述MHC復(fù)合物的肽結(jié)合溝內(nèi)的肽，其中每個肽都具有容許所述功能性MHC復(fù)合物通過一核心結(jié)構(gòu)發(fā)生高度特異性寡聚化的修飾。
文檔編號G01N33/569GK101111520SQ200680003922
公開日2008年1月23日 申請日期2006年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月4日
發(fā)明者N·F·G·施瓦貝 申請人:普羅伊繆因有限公司