專利名稱：：使用煙堿乙酰膽堿受體亞單位的新檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明得到了國立衛(wèi)生研究院5-U01-AI053873號的資助。因此，政府可享有本發(fā)明的某些權(quán)利。目前本發(fā)明應用于識別和鑒定新的殺蟲的靶位，特別是與宿主細胞相關(guān)的新的殺蟲的耙位、檢測和其抗體。
背景技術(shù)：
：由昆蟲對農(nóng)作物造成的全球經(jīng)濟損失是令人震驚的。在美國每年由于鱗翅類害蟲造成的經(jīng)濟損失估計高達600,000,000美元。因此，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中殺蟲劑是殺滅害蟲的重要物質(zhì)。一種被稱為多殺菌素的殺蟲劑是兩種天然代謝物spinosynA和spinosynD的混合物，其是由放線菌saccharapolysporaspinosa中產(chǎn)生的。多殺菌素可以有效地依次殺滅昆蟲中鱗翅目、雙翅目和纓翅目害蟲，還可以有效地抗鞘翅目和直翅目的害蟲。殺蟲劑多殺菌素通常是針對生物體特定的靶點，例如關(guān)鍵蛋白質(zhì)。迄今為止，僅僅鑒定了為數(shù)不多的殺蟲劑作用的靶位。也可能由于田間的昆蟲種群增加了對殺蟲劑的抗藥性，這些靶位點作用失效。由于多殺菌素是天然的殺蟲劑，因此有望發(fā)現(xiàn)其他作用于多殺菌素靶位的具有殺蟲效果的化學化合物。
發(fā)明內(nèi)容盡管不斷的改進技術(shù)，目前知道的具有殺蟲效果的耙位還是有限的，因此需要發(fā)現(xiàn)和研制新的、有效的、安全的殺蟲劑。本發(fā)明根據(jù)這個需要，尋找到了以類似于多殺菌素的作用方式和化學組成的新的可以有效的識別和鑒定靶位點，即多殺菌素靶位點。此外，來自于脊椎動物的煙堿乙酰膽堿受體是干涉多種疾病狀態(tài)的藥學和動物健康化合物重要靶位。因此，本發(fā)明也提供了一個研究煙堿乙酰膽堿受體亞單位相互作用和藥物學的模式系統(tǒng)。SEQUENCEIDNO:1是位于果蠅2L染色體34E位點上的編碼煙堿乙酰膽堿受體a-5亞單位的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:2是果蠅X染色體上18C位點的編碼煙堿乙酰膽堿受體a-7亞單位的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:3是位于30D位點編碼果蠅煙堿乙酰膽堿a-6受體亞單位的正向PCR引物的寡核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:4是位于30D位點編碼果蠅煙堿乙酰膽堿a-6受體亞單位的反向PCR引物的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:5是位于34E編碼果蠅煙堿乙酰膽堿a-5受體亞單位的正向PCR引物的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:6是位于34E編碼果蠅煙堿乙酰膽堿a-5受體亞單位的反向PCR引物的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:7是位于18C編碼果蠅煙堿乙酰膽堿a-7受體亞單位的正向PCR引物的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:8是位于18C編碼果蠅煙堿乙酰膽堿a-7受體亞單位的反向PCR引物的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:9是編碼線蟲ric-3正向PCR引物的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:10是編碼線蟲ric-3反向PCR引物的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:11是對應于果蠅煙堿乙酰膽堿a-6受體亞單位第367-380位氨基酸的氨基酸序列。SEQUENCEIDNO:12是加入Kozak翻譯起始信號編碼30DnAChRa6正向PCR引物的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:13是編碼30DnAChRa6反向PCR引物的核苷酸序列。SEQUENCEIDNO:14是加入Kozak翻譯起始信號編碼線蟲ric3正向PCR引物的核苷酸序列。上面列出來的序列是與參考文獻NucleicAcidsRes.l3:3021-3030(1985)和BiochemicalJ.219(No.2):345-373(1984)列出來的標準一致的核酸序列字母的單字母密碼和氨基酸單字母密碼，所述文獻通過參考并入本申請。核酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)所用的符號和格式遵守37C.RR.§1.822的要求。本發(fā)明一方面涉及宿主細胞，其包括(i)與編碼受體亞單位的NCBI接收號No.NM205953基因編碼區(qū)第79-1485位核酸有至少50%同一性的核酸；(ii)編碼離子通道亞單位的核酸，其中宿主細胞能對spinosyn響應。本發(fā)明的另一方面涉及宿主細胞，其包括(i)與編碼的受體亞單位NCBI接收號No.NM205953基因編碼區(qū)第79-1485位核酸有至少50%同一性的核酸；(ii)編碼前體蛋白質(zhì)的核酸，其中宿主細胞中能對spinosyn口向應。本發(fā)明的另外一個方面涉及檢測影響受體亞單位能力的化學化合物的方法，包括以下步驟(a)將(i)NCBI接收號為No.NM205953的編碼受體亞單位的編碼區(qū)第79-1485位核酸序列有至少50%同一性的核酸；和(ii)編碼離子通道亞單位的核酸分子體外導入宿主細胞，以表達受體亞單位和離子通道亞單位，其中該宿主細胞能對spinosyn響應；(b)將受體亞單位暴露于化學化合物；(c)評估暴露的受體亞單位來判斷化學化合物是否會影響受體亞單位。本發(fā)明的另一方面涉及用于評估化學化合物影響受體亞單位能力的方法，包括以下步驟(a)將(i)與編碼受體亞單位NCBI接收號為No.NM205953的基因第79-1485位核酸序列有至少50%同一性的核酸體外導入宿主細胞，以表達受體亞單位；其中離子通道亞單位由宿主細胞內(nèi)源性產(chǎn)生和表達，其中宿主細胞能對syinosyn響應；(b)將表達的受體亞單位暴露于化學化合物；(c)評估被暴露的受體亞單位來判斷化學化合物是否會影響受體亞單位。本發(fā)明的另一方面涉及檢測化學化合物對受體亞單位影響能力的方法，包括以下步驟(a)將(i)與編碼受體亞單位NCBI接收號為NO.NM205953的第79-1485位核酸序列有至少50%同一性的核酸在宿主細胞體外表達受體亞單位，(ii)編碼輔助蛋白的分離的核酸分子體外導入宿主細胞以表達受體亞單位好輔助蛋白，其中宿主細胞能對spinosyn響應；(b)將表達的受體亞單位暴露于化學化合物；(c)評估暴露的受體亞單位來判斷化學化合物是否會影響受體亞單位。本發(fā)明的另外一個方面涉及評估化學化合物影響受體亞單位的能力的方法，包括以下步驟(a)與編碼受體亞單位NCBI接收號No.NM205953基因編碼區(qū)第79-1485位核酸有50%同一性的核酸體外導入宿主細胞，以表達受體亞單位，其中宿主細胞內(nèi)源性產(chǎn)生和表達輔助蛋白，其中宿主細胞能對spinosyn響應；(b)將表達的受體亞單位暴露于化學化合物；(c)評估被暴露的受體亞單位來判斷化學化合物是否會影響受體亞單位。本發(fā)明的另一方面涉及可以特異性的與NCBI接受號為No.NM205953編碼區(qū)第79-1485位核酸序列有至少50%同一性的核酸序列編碼的多肽抗原表位結(jié)合的抗體，其中功能性表達由核酸編碼的的多肽的宿主細胞能對spinosyn響應。本發(fā)明的另外一方面涉及包括了基因突變的生物體，其中基因編碼區(qū)具有與NCBI接收號No.NM205953編碼區(qū)第79-1485位核酸序列有至少50%同一性，其中包括突變的生物體顯示比其來源的母系的生物體對spinosyn降低的響應性。本發(fā)明另一方面涉及載體，包括(a)與(1)與NCBI接收號No.NM205953編碼區(qū)的第79-1485位核酸序列有至少50%同一性的DNA分子的一條鏈的對應部分基本上互補的反義核酸序列；(b)與反義核酸序列可操作性連接的調(diào)節(jié)序列，以在轉(zhuǎn)化細胞中表達反義核酸序列，其中轉(zhuǎn)化細胞比未轉(zhuǎn)化細胞對spinosyn的響應性減少。本發(fā)明的再一個方面涉及用于篩選對spinosyn抗性的生物體，包括下面步驟(a)從生物體中獲得核酸；(b)檢測與NCBI接受號為NO.NM205953基因編碼區(qū)第79-1485位核酸有至少50%同一性的核酸序列；(c)比較被檢測的序列與來自于對spinosyn易感的生物體的相同基因的序列，其中被篩選的生物體與spinosyn易感的生物體來源于同一個物種的。在進一步的實施范例中，本發(fā)明涉及檢測影響受體亞單位的化學化合物的能力的方法，包括下面步驟(a)將包括(i)與NCBI接收號No.NM205953基因編碼區(qū)的第79-1485位有至少50%同一性的核酸序列；(ii)與核酸序列可操作性連接的調(diào)節(jié)序列的載體導入生物體的一個或多個細胞中，以使得核酸序列的在至少一個或者多個轉(zhuǎn)化細胞中表達，其中轉(zhuǎn)化細胞顯示了比未轉(zhuǎn)化細胞對spinosyn響應的增強；(b)將表達受體亞單位的轉(zhuǎn)化細胞暴露于化學化合物；(c)評估暴露的受體亞單位來檢測化學化合物是否影響受體亞單位。本發(fā)明的其他特性和優(yōu)點將在下面的說明書中進行解釋，其中一部分在說明書中是清楚的，或者在本項發(fā)明的應用中學到。在本文中可以從本發(fā)明的說明書和其權(quán)利要求中了解和知道其優(yōu)點。將被理解，對本發(fā)明的總的描述和后面更為的詳細的描述是示例性和說明性的，并用于對進一步解釋要求保護的本發(fā)明。為更方便的了解本發(fā)明下面是部分定義。單位、前綴和符號以其SI的接收格式表示。除非有其他的說明，核酸都是按照從左側(cè)5'端起始到右側(cè)3'端的順序；氨基酸是從左到右從氨基端到羧基端。說明書中列出的數(shù)值范圍是包括在限定的一定范圍內(nèi)的，且包括該范圍內(nèi)的每一個整數(shù)。本申請?zhí)岬降陌被崾前凑誌UPAC-IUB生物化學命名委員會推薦使用的眾所周知的三個字母的密碼子或者是一個字母的密碼子。同樣，核酸也是用該委員會命名的單字母代碼。除非另作說明，本文所涉及的軟件術(shù)語和電工、電子術(shù)語是按照新的正EE標準的電工和電子術(shù)語詞典進行使用(第五版本，1993年)。下述定義的術(shù)語被參考文獻更詳細的定義，并作為整體并入本申請。"輔助蛋白"指包括但不限于是昆蟲和無脊椎動物的輔助蛋白，例如伴侶蛋白質(zhì)，其參與膜運輸、離子通道亞單位的成熟、折疊和多肽如受體亞單位的轉(zhuǎn)運和/或裝配。"編碼輔助蛋白的核酸"或者"多核酸的輔助蛋白"指的是編碼輔助蛋白的多聚核酸。這個術(shù)語也包括任何輔助蛋白的片段、變異體、同系物、等位基因或者前體(如前導蛋白(preproteins)或前蛋白)。"抗體"指的是能夠特異結(jié)合抗原決定簇的完整分子和其片段。可以用完整的多肽或片段作為免疫抗原來制備特異性結(jié)合該多肽的抗體(如，本發(fā)明中提到的核酸編碼的多肽)。如有需要，可以使這些蛋白質(zhì)與載體蛋白連接。"反義RNA"指的是可以阻斷耙基因(美國專利號No.5，107,065通過參考并入本申請)表達的，且與該基因的初級轉(zhuǎn)錄本或mRNA的全部或部分互補的RNA轉(zhuǎn)錄本。它可以與耙基因的轉(zhuǎn)錄本的任何一段互補，如5'非編碼序列、3'非編碼序列、內(nèi)含子或者編碼序列，等等。"具有轉(zhuǎn)錄活性的RNA(功能RNA)"指的是正義RNA、反義RNA、核酶RNA、或者是那些參與細胞過程但并不能被翻譯的RNA。"結(jié)合親合力"指的是配體與受體或者其他蛋白質(zhì)相互作用的傾向(propensity)。"離子轉(zhuǎn)運"指的是在生物系統(tǒng)中鹽離子和其他電解質(zhì)以離子的形式從一個地方運動到另一個地方。"抗原表位(抗原決定簇)"指的是大分子的任何一個區(qū)域能夠或者具有識別并結(jié)合一個或者更多特異性抗體的潛能，也包括結(jié)合特異性抗體的區(qū)域。"表達"指的是來源于本發(fā)明中的核酸片段的正義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄本和穩(wěn)定累積。表達也指的是mRNA翻譯形成的多肽。"反義抑制"指的是能夠抑制靶標蛋白質(zhì)表達的反義RNA轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)物。"過表達"指的是的轉(zhuǎn)基因生物體中的某一個基因的表達產(chǎn)物明顯高于正?；蛘叻寝D(zhuǎn)基因生物體。"共抑制"指的是能夠抑制相同或基本相似的外源性或內(nèi)源性基因(美國專利號No.5,231，020通過參考并入本申請)表達的正義RNA轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)物。"功能表達"指的是宿主細胞離子通道分子的合成和任何必需的翻譯后的過程，使得在對細胞膜電位的實驗性增加改變的響應中或一旦暴露于適當?shù)乃幚砘衔锏那闆r下離子通道能夠正確的插入到細胞膜上并能夠進行離子轉(zhuǎn)運。"基因"指的是表達特異蛋白質(zhì)的核酸片段，包括前面的調(diào)節(jié)序列(5'非編碼區(qū))和編碼區(qū)后面的序列(3'非編碼區(qū))。"天然基因，，指的是在自然界中發(fā)現(xiàn)的本身具有調(diào)節(jié)序列的基因。"嵌合基因"指的是除天然基因之外的任何基因，包括未在自然界中一起存在的調(diào)節(jié)和編碼序列。因此，嵌合基因包括不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列或者是相同來源的但與自然界中的天然基因不同的方式排列的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。"內(nèi)源基因"指的是在生物體的基因組中位于原來位置的天然基因。"外源基因"指的是未在宿主生物體中發(fā)現(xiàn)的基因，可通過基因轉(zhuǎn)移將其轉(zhuǎn)入到宿主生物體中。外源基因包括能夠嵌入到非其天然生物體中的天然基因或嵌合基因。"轉(zhuǎn)基因"指的是能夠通過轉(zhuǎn)化的方法進入基因組中的基因。"基因組DNA"指的是染色體DNA并且可能包括內(nèi)含子。"內(nèi)含子"是間插序列，是一個基因中的DNA非編碼序列，該基因可以被轉(zhuǎn)錄成不均一核RNA(hnRNA)，但在核內(nèi)通過RNA剪切的形式去除內(nèi)含子，留下一個成熟的mRNA，然后在細胞質(zhì)內(nèi)翻譯。內(nèi)含子末端的區(qū)域是自身互補的，在hnRNA中形成天然的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。"宿主細胞"指的是將分離得到的核酸片段穩(wěn)定的或瞬間轉(zhuǎn)入的任何細胞或生物體。宿主細胞可以是一個大生物體的一部分、組織培養(yǎng)的個體或自由生活的生物體。這些包括但不限于脊椎動物和無脊椎動物宿主、真核宿主如哺乳動物細胞(例如SH-SY5Y細胞、COS細胞、HEK-293細胞和PC12細胞)、大鼠和小鼠、眾所周知的模式生物如斑馬魚、爪蟾卵、昆蟲細胞(昆蟲細胞系如果蠅schneider、果蠅Kc、Sf9和HighFive系)，原核宿主如細菌(包括但不限于大腸桿菌、芽胞桿菌屬、鏈霉菌屬和假單胞細菌屬)以及真菌(包括但不限于來源于克魯維酵母屬和酵母菌物種的細胞)和植物。"昆蟲"包括昆蟲綱中的任何空氣呼吸的節(jié)肢動物，包括但不限于家蠅、果蠅或醋蠅(黑腹果蠅)，也包括其他農(nóng)業(yè)昆蟲、醫(yī)學昆蟲、重要的獸醫(yī)昆蟲等如桃財(綠色桃岈)、綠棉鈴蟲(煙草螃蟲)、馬鈴薯甲蟲(科羅拉多馬鈴薯甲蟲)、德國小蠊(德國蟑螂)、蘋果蠹蛾、小菜蛾、埃及伊蚊和岡比亞按蛟。"離子通道亞單位"指的是能夠形成部分離子通道的任何蛋白質(zhì)分子，包括那些在形成離子通道的過程中能夠與其他分子結(jié)合的亞單位。"編碼離子通道亞單位的核酸"或"離子通道亞單位多聚核酸"指的是編碼離子通道亞單位的多聚核酸。這個術(shù)語也包括任何離子通道亞單位的片段、變異體、同系物、等位基因或前體(如前導蛋白或前體蛋白)。"編碼離子通道亞單位的核酸"這個術(shù)語也包括由宿主細胞如PC12細胞內(nèi)源性產(chǎn)生的核酸的實施方案。"分離"指的是如核酸或蛋白質(zhì)的物質(zhì)，其為(1)基本上或完全沒有在天然存在的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的通常與該物質(zhì)相伴或相互作用的組分；(2)如果這個物質(zhì)在其自然環(huán)境中，但被人類的故意介入而改變形成組合物和/或被放到不是該物質(zhì)的原來位置上的細胞中。"損傷"指的是核酸與來源于母系或野生型種群的核酸相比發(fā)生的任何分子變化。例如，損傷可以是核酸序列的缺失、倒置、插入、復制、轉(zhuǎn)換、顛換或重排。"配體門控離子通道亞單位"指的是形成受配體調(diào)節(jié)的任何離子通道的部分的亞單位，包括但不限于煙堿乙酰膽堿受體亞單位、GABA受體亞單位、5-羥色胺受體亞單位和谷氨酸受體亞單位。已知并可以從公用數(shù)據(jù)庫和互聯(lián)網(wǎng)可以獲得核酸序列、蛋白質(zhì)序列，以及多序列對比和系統(tǒng)進化的研究。"編碼配體門控離子通道亞單位的核酸"或"配體門控離子通道亞單位多聚核酸"指的是編碼配體門控離子通道亞單位的多聚核酸。這個術(shù)語也包括任何配體門控離子通道亞單位的片段、變異體、同系物、等位基因或前體(如前導蛋白或前體蛋白)。"核酸"指的是任何核酸，包括單鏈或多鏈脫氧核糖核酸或核糖核酸堿基的聚合物。核酸也包括片段、修飾的核酸和變異體。因此，本申請使用的術(shù)語"多聚核酸"和"核酸"是可以替換使用的。典型的"啟動子"指的是指導結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA的DNA序列。典型的啟動子位于基因上游500bp(堿基對)接近轉(zhuǎn)錄起始位點的區(qū)域。如果是一個可誘導型啟動子，在外源性或內(nèi)源性誘導因素作用下，轉(zhuǎn)錄會增加或減少。相反，對于組成型啟動子誘導因素不能調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。"受體亞單位"指的是構(gòu)成完整受體的任何蛋白質(zhì)。"煙堿乙酰膽堿受體亞單位"指的是構(gòu)成完整的煙堿乙酰膽堿受體組成的任何蛋白質(zhì)，如煙堿乙酰膽堿a-5、a-6和a-7受體亞單位。前面提到的所有引用的編碼受體亞單位的核酸指的是編碼受體亞單位的多聚核酸。這個術(shù)語也包括任何受體亞單位的片段、變異體、同系物、等位基因或前體(如前導蛋白或前體蛋白)。"抗性"指的是遺傳確定的昆蟲種群對spinosyn作用的相對響應。一般，昆蟲品系或種群在殺蟲劑試驗中(以可以殺死一個屬或種群中50%的用藥劑量作為評判標準)顯示了比適當?shù)膮⒖寄褪軇┝炕蛘弑纫赘蟹N群至少高于2倍，優(yōu)選4-8倍，更優(yōu)選至少10倍以上的抗性則被認為其具有"抗性"。"對spinosyn的響應"指的是暴露spinosyn產(chǎn)生的可以檢測到包括但不限于行為、存活力、配體結(jié)合或離子轉(zhuǎn)運的改變的效應。"Spinosyn"指的是包括由放線菌多刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)產(chǎn)生的由U.S.專利號No.5,362,634鑒定命名的A83543等發(fā)酵產(chǎn)物。這些化合物指的是因子或A、B、C、D、E、F、G、H、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W和Y組分等等(可參見公布的國際專利申請書WO93/09126和W094/20518)以及下文中會被提到的SpinosynA、B、C等等。天然產(chǎn)生的spinosyn化合物由融合到12-元大環(huán)內(nèi)酯的5,6,5-三環(huán)系統(tǒng)、中性糖(鼠李糖)和氨基糖(forosamine)纟且成(見Kirstetat,1991)。包括由Saccharopolysporapagona產(chǎn)生的21-正丁巴比妥spinosyn這些及其他的天然spinosyn化合物是由位于1815北方大學街道，皮奧里亞(Peoria,)III.61604的中西部北方區(qū)域研究中心、農(nóng)業(yè)研究服務處和美國農(nóng)業(yè)部存貯培養(yǎng)的命名為NRRL18719、18537、18538、18539、18743、18395和18823保藏培養(yǎng)物發(fā)酵產(chǎn)生的。在U.S.Pat.Nos.5,496,931、5,670,364、5,591,606、5,571,卯1、5,202,242、5,767,253、5,840,861、5,670,486和5，631，155專利中也公開了Spinosyn化合物。SpinosynA和D是spinosyn的兩個組分，其是具有特別活性殺蟲劑。由稱為多殺菌素的DowAgroSciences(Indianapolis,Ind.)生產(chǎn)的主要包含這兩種spinosyn組分(大約85%的spinosynA和15%的spinosynD)。此處使用的此術(shù)語也包括由spinosyn合成或半合成的"spinosyn衍生物"。"實質(zhì)類似"指的是核酸片段，其中一個或多個核酸堿基變化導致一個或多個氨基酸的替換，但并不影響由DNA序列編碼蛋白質(zhì)的功能特性。"實質(zhì)類似"也指的是核酸片段，其中一個或多個核酸堿基發(fā)生改變不能影響由反義或共抑制方法導致的核酸片段介導的基因表達發(fā)生改變。"實質(zhì)類似"也指的是發(fā)生缺失或插入一個或多個核酸核酸片段的修飾，沒有從實質(zhì)上影響合成的轉(zhuǎn)錄本與由反義或共抑制介導基因表達發(fā)生改變的功能特性或者獲得的蛋白質(zhì)分子的功能特性相比發(fā)生改變。因此可以理解為本發(fā)明包括更多的特定的例舉的序列。例如，本領(lǐng)域所熟知的用小于耙基因整個編碼區(qū)的核酸片段和與靶基因不是100%同一性的核酸片段可以反義抑制和共抑制基因的表達。此外，本領(lǐng)域所熟知的靶基因的改變可以導致在特定位點上化學等值的氨基酸的產(chǎn)生，但并不影響編碼蛋白質(zhì)的功能特性。因此，疏水性氨基酸丙氨酸的密碼子可以被其他具有較少疏水殘基如甘氨酸和具有較多疏水殘基如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸編碼的密碼子所替換。類似的，發(fā)生陰離子電荷殘基替換，如谷氨酸替換天冬氨酸，或陽離子電荷殘基發(fā)生替換，如精氨酸替換賴氨酸，可以產(chǎn)生一樣的功能產(chǎn)物。造成蛋白質(zhì)分子的N端和C端部分的發(fā)生改變的核酸變化并不能改變蛋白質(zhì)的活性?？梢杂帽绢I(lǐng)域常規(guī)方法預測編碼產(chǎn)物的保留生物學活性的每一個修飾。此外，實質(zhì)類似的核酸片段具有在嚴謹條件下(O.IXSSC、0.1%SDS，65。C)與本申請公開的核酸片段雜交的能力。本發(fā)明中的實質(zhì)類似的核酸片段也可以由其編碼的氨基酸序列與在本申請公開的用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的計算方法得到的氨基酸序列的百分比類似性進行比對。優(yōu)先選擇那些編碼的氨基酸與本申請報道的核酸序列編碼的氨基酸序列有80%以上相似性的核酸片段。更優(yōu)選那些核酸序列編碼的氨基酸與本申請報道的核酸序列編碼的氨基酸序列有90%以上相似性的核酸片段。最優(yōu)選那些核酸序列編碼的氨基酸與本申請報道的核酸序列編碼的氨基酸序列有95%以上相似性的核酸片段。用VactorNTiSuite(InforMax,NorthBethesda,MD)程序?qū)π蛄袑Ρ群桶俜直冉朴嬎?。用Clustalmethodofalignment(HigginsandSharp,1989)的缺省參數(shù)(GAPPENALTY-IO，GAPextensionPENALTY:O.l)(此后稱為Clustalalgorithm)對序列多重對比。用Clustalmethod進行配對對比的缺省參數(shù)是KTUPLE1、GAPPENALTY=3、WINDOW:5和DIAGONALSSAVED=5。氨基酸或核酸序列的"實質(zhì)部分"指的是用本領(lǐng)域技術(shù)人員評估的方法或應用自動化的計算機算法如BLAST(基本的局部比對搜索工具，參見Altschuletal,1993，www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行序列比較的時需要的足以推定多肽或基因的氨基酸或核酸序列。大體上，與氨基酸相鄰十個或更多或者三十個或更多的核酸的序列可以用來推定與已知蛋白質(zhì)或基因的同源的多肽或核酸序列。此外，就核酸序列而論，可以應用依賴序列的方法，利用包括20-30個相鄰的核酸的基因特異寡核苷酸探針鑒定(如Souther雜交)和分離(如細菌克隆或噬菌體的原位雜交)基因。另外，12-15個堿基的短寡核苷酸可用來作為進行PCR擴增的引物來獲得包括引物的特異的核酸片段。相應地，核酸序列的"實質(zhì)部分"指的是需要特異性鑒定和域分離包括該序列的核酸片段的足夠序列。本說明書說明了一個或更多個編碼特異的植物蛋白質(zhì)的部分或全部氨基酸和核酸序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員利用本申請報道的序列，可以將本申請公開的全部或?qū)嵸|(zhì)部分序列用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的目的。"轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)"和"調(diào)節(jié)區(qū)"指的是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。調(diào)節(jié)區(qū)包括許多順式作用元件，這些順式作用元件包括但不限于啟動子、增強子和激素反應元件。由于內(nèi)含子和5'非翻譯區(qū)可以影響轉(zhuǎn)錄，因此轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)還包括這些序列。調(diào)節(jié)區(qū)可操作地連接于核酸，以保證宿主細胞中核酸的表達。"轉(zhuǎn)基因動物"指的是通過將DNA人為插入和穩(wěn)定整合到基因組上的修飾動物。DNA可以隨機或定向插入到染色體、附加體或染色體外元件的特定位點。"轉(zhuǎn)基因細胞"指的是將DNA人為插入到染色體或附加體或染色體外元件的細胞。"變異體"指的是實質(zhì)類似的序列。一般，本發(fā)明的核酸序列變異體與天然核酸序列有至少46%、48%、50%、52%、53%、55%、60%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，其中百分比序列同一性是基于全部序列的，用缺省參數(shù)進行GAP10分析得到的。一般來說，本發(fā)明中的多肽序列變異體與天然蛋白質(zhì)有至少60%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，其中百分比序列同一性是基于全部序列的，用缺省參數(shù)進行GAP10分析得到的。GAP用的是NeedlemanandWunsch(J.Mol.Biol.48:443-453,1970)算法來尋找兩個完整序列的最大匹配數(shù)和最小缺口數(shù)的比對。"變異體"也指的是與本發(fā)明包含的和生物學功能必需的基序高度相似的氨基酸序列的實質(zhì)類似序列。通常，本發(fā)明的多肽序列的變異體與定義的基序的保守氨基酸殘基有至少85%、90%或95%的序列同一性。本發(fā)明使用的本領(lǐng)域所熟知的標準重組DNA和分子克隆技術(shù)，在SambrookandRussell(2000)中有詳細描述。本發(fā)明包括的變異體包括核酸的個別替換、缺失或加入，或改變、添加或缺失單個氨基酸，或在編碼的序列中的小部分氨基酸的多肽序列。"保守修飾變異體"通過化學類似的氨基酸替換原來的氨基酸導致改變。可以利用假定宿主的偏好的密碼子參數(shù)制備或合成改變的核酸。本發(fā)明的核酸片段可被用來分離來源于同一個或不同物種的編碼同源性蛋白質(zhì)的cDNAs和基因。用本領(lǐng)域所熟知的依賴于序列的方法分離同源基因。依賴于序列的方法的實施例包括但不限于核酸雜交方法和DNA、RNA擴增方法，例如各種使用核酸擴增技術(shù)的方法(如多聚酶鏈延伸反應、連接酶鏈反應)。例如可以本領(lǐng)域所熟知的以全部或部分核酸片段作為雜交探針篩選目標生物體，從而直接分離編碼其他煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位的cDNAs或基因組DNAs。用本領(lǐng)域所熟知的方法根據(jù)核酸序列設計并合成特異的寡核苷酸探針(SambrookandRussell,2000)。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以用全部序列來指導合成DNA探針，如隨機弓I物DNA標記、缺口平移或末端標記，或用體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成RNA探針。另外，設計可以用來擴增全部或部分序列的特異性引物。在擴增反應中或在擴增反應后，直接標記得到的擴增產(chǎn)物，將標記得到的擴增產(chǎn)物作為探針在適當?shù)膰乐敆l件下來分離全長cDNA或基因組片段。另外，核酸片段的兩個小片段可被用到多聚酶鏈反應中來擴增更長的編碼DNA或RNA的同源基因的核酸片段。多聚酶鏈反應可用來擴增核酸片段克隆形成的文庫，其中一個引物的序列來源于核酸片段，另外一個引物的序列是利用編碼基因的mRNA前體3'末端的多聚腺苷酸尾巴的序列。第二條引物的序列也可以來源于克隆載體序列。例如，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員可遵循RACE技術(shù)(Frohmanetal,1988)使用PCR方法擴增轉(zhuǎn)錄本中某一個點到3'或5'末端產(chǎn)生cDNAs。根據(jù)序列設計3，和5，方向的引物。使用商業(yè)上通用的3'RACE或5'RACE系統(tǒng)(Invitrogen,Madison，WI)分離特異性的3'或5'cDNA片段(Oharaetal.,1989;Lohetal，1989)。將3，和5'RACE得到的產(chǎn)物相連可以得到全長的cDNAs產(chǎn)物(FrohmanandMartin,1989)。得到的核酸和推測得到的氨基酸序列可用于cDNA表達文庫的免疫篩選?？梢院铣砂被嵝蛄写硇圆糠值亩嚯摹？捎眠@些肽免疫動物制備特異性的針對組成氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)的單克隆或多克隆抗體。用得到的抗體篩選cDNA文庫分離感興趣的全長cDNA克隆(Lerner,1984;SambrookandRussell,2000)。本發(fā)明包括的編碼相同氨基酸序列的許多多聚核酸。遺傳密碼子的簡并性使得"沉寂變異體"的出現(xiàn)，其例如可用于選擇性雜交、檢測本發(fā)明的多聚核酸的等位變異體。另外，本發(fā)明包括了由等位變異體組成的分離的核酸。本申請用的術(shù)語"等位基因"指的是相同基因相關(guān)的核酸。也可將變異體描述成，如，剪切、物種或多態(tài)變異體。剪切變異體是與參考分子有高度同一性，但由于它在mRNA過程中改變剪切外顯子產(chǎn)生了比參考分子多或少一定數(shù)量的多聚核酸。因此，相應的多肽會比參考分子增加或減少功能結(jié)構(gòu)域。物種變異體指的是在不同物種中不同的多聚核酸。獲得的多肽通常互相具有很高的氨基酸同一性。多態(tài)變異體是特定物種的個體的某一個特定基因的多聚核酸序列，也包括一個核酸堿基的多聚核酸序列變異產(chǎn)生的"單核酸多態(tài)性(SNP)，，。本項發(fā)明中提到的核酸變異體可以通過如下方法如寡核苷酸定點誘變、接頭分區(qū)誘變、PCR產(chǎn)生的誘變等等獲得，也可參見McPherson(1991)。因此，本發(fā)明也包括那些核酸序列與發(fā)明中的序列具有實質(zhì)相似性的序列組成的DNA分子。就某一個特定核酸序列而言，"保守修飾變異體"指的是那些編碼一致或保守修飾氨基酸序列變異體的核酸序列。由于遺傳密碼子的簡并性，大量功能上相同的核酸編碼特定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此，丙氨酸的指定密碼子中的一個發(fā)生上面描述的相應的變化都不會改變其編碼的多肽。這樣的核酸變異體叫做"沉寂變異體"，它屬于一種保守修飾的變異體。本申請的每一個核酸序列都依據(jù)遺傳密碼子編碼一個多肽，都可能描述核酸的每一個可能的沉寂變異體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以識別被修飾核酸產(chǎn)生的功能一致分子的密碼子(除了AUG是蛋氨酸的唯一密碼子，UGG是色氨酸的唯一密碼子外)。相應地，在本發(fā)明描述的多肽序列以及本發(fā)明要求保護的權(quán)利要求范圍中，本發(fā)明描述的多肽序列，包含了編碼這個多肽的核酸的每一個沉寂變異體。"保守修飾變異體"是由于個體替換、缺失或加入核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的改變、增加或缺失編碼序列的一個氨基酸或一小部分氨基酸序列的氨基酸序列，這個改變導致用化學類似氨基酸替代原來的氨基酸。因此，從整體中可以選擇從1到50任何數(shù)目的氨基酸殘基。例如，1、2、3、14、25、37、45或50個氨基酸殘基都可以。典型的保守修飾變異體與同一個來源的未修飾的多肽序列具有相似的生物學活性。如一般天然蛋白質(zhì)對其天然的底物有至少20%、30%、40%、50°/。、60%、70%、80%或90%的底物特異性、酶活性或配體/受體結(jié)合。保守置換表格提供了本領(lǐng)域所熟知的功能上相似的氨基酸。例如，下面六組包括的氨基酸是每一個組內(nèi)的是可以相互保守置換的l)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷胺酰胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、纈氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。也可以用其他本領(lǐng)域所熟知的保守置換模式(參見Creighton,1984)，如用比較軟件GCG包、BLAST或CLUSTAL對序列進行評分。"載體"指的是能夠運送另外一個與其相連的核酸的核酸分子。一種類型的載體就是"質(zhì)粒"，指的是連接了一個DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另外一種類型的載體是病毒載體，其中加入的DNA片段可以插入到病毒基因組中。某些載體在進入宿主細胞后可以自身復制(如具有細菌來源復制子的細菌載體和附加哺乳動物載體)。其他載體(如非附加體哺乳動物載體)當轉(zhuǎn)入宿主細胞后，可以整合到宿主細胞的基因組中，因此和宿主的基因組一起復制。此外，某些載體具有能夠指導與它相連接基因表達的能力。這樣的載體指的是本申請說的"表達載體"?？偟膩碚f，重組DNA技術(shù)使用的表達載體通常都是質(zhì)粒的形式。在本說明書中，由于質(zhì)粒是最常使用的載體形式，因此"質(zhì)粒"和"載體"這兩個術(shù)語可以交互使用。然而，本項發(fā)明也包括具有相同的功能的其它形式的表達載體，如病毒載體(復制缺陷的逆病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。"電壓門控性離子通道亞單位"指的是形成任何受電壓的變化調(diào)節(jié)離子通道的部分的亞單位，包括但不限于鈣、鈉、鉀和氯化物電壓門控性離子通道亞單位。可以從NCBI數(shù)據(jù)庫上找到已經(jīng)公布的編碼這些電壓門控性離子通道的核酸序列。"編碼電壓門控性離子通道亞單位的核酸"或"電壓門控性離子通道亞單位多聚核酸"指的是編碼電壓門控性離子通道亞單位的多聚核酸，該術(shù)語也包括任何電壓門控性離子通道亞單位的片段、變異體、同源物、等位基因或前體(如前導蛋白或前體蛋白)。2.詳細描述本發(fā)明的實施方案涉及包括特定的核酸，并在合適條件下，能夠表達某個氨基酸的宿主細胞。本發(fā)明的宿主細胞包括與NCBI接收號No.NM205953編碼的受體亞單位的基因編碼區(qū)在79-1485位有至少50%、優(yōu)選至少60%、尤其至少70%、更優(yōu)選至少80%或特別是90°%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%的同一性的核酸，優(yōu)選其長度超過至少100、特別是超過至少500個緊鄰的核酸，和特別是完全覆蓋全序列。NCBI接收號No.NM205953基因在黑腹果蠅基因組中位于染色體2L的30D。示例性的核酸序列包括但不限于果蠅或其它無脊椎動物的核酸序列，如秀麗隱桿線蟲(NCBI接收號No.NM072806)、岡比亞按蚊(NCBI接收號No.AY705401)、產(chǎn)蜜蛭蟲(NCBI接收號No.AY500239)和煙芽夜蛾(綠棉鈴蟲)(NCBI接收號No.AF143847)?？梢垣@得這些已經(jīng)公布了的示例性的核酸序列相對應的氨基酸序列。在一些實施方案中，這個核酸序列編碼煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位。在其它實施方案中，編碼受體亞單位的核酸序列是包括選自下面序列的核酸(a)NCBI接收號No.NM205953的核酸序列；(b)編碼黑腹果蠅接收號No.NM205953受體亞單位的剪切變異體的序列，如公共數(shù)據(jù)庫公布的(NCBI接收號Nos.NM164874,NM205951,NM135472,麗205952,畫205953AF321445,AF321446,AF321447,AF321448和AF321449);(c)由于遺傳密碼子簡并性，編碼與在(a)和(b)中定義的相同的氨基酸的序列。在本發(fā)明的另外一個實施方案中，宿主細胞還包括編碼離子通道亞單位的核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以明白編碼離子通道亞單位的核酸是宿主細胞內(nèi)源性產(chǎn)生或非內(nèi)源性產(chǎn)生的。在可以內(nèi)源性產(chǎn)生的離子通道亞單位的情況下，因此沒有必要將核酸轉(zhuǎn)入宿主細胞中。示例性的離子通道亞單位包括配體門控性離子通道亞單位，如煙堿乙酰膽堿受體亞單位、Y-氨基丁酸(GABA)受體亞單位、5-羥色胺受體亞單位、谷氨酸受體亞單位和它們的功能片段，以及電壓門控性離子通道亞單位如鈣、鈉、鉀、氯化物門控性離子通道亞單位和它們的功能片段。在一些實施方案中，宿主細胞包括編碼煙堿乙酰膽堿受體亞單位的離子通道亞單位的核酸。在其它實施方案，編碼煙堿乙酰膽堿受體亞單位的核酸包括選自下面的序列(a)具有SEQIDNo:1的核酸序列；(b)與SEQIDNo:1編碼煙堿乙酰膽堿受體亞單位基因編碼區(qū)925-2424位序列有至少50%、優(yōu)選至少60%、尤其優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%和特別優(yōu)選90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%的同一性的核酸序列，序列的長度優(yōu)選超過至少100、特別優(yōu)選至少超過500個緊鄰的核酸、并特別優(yōu)選覆蓋序列的全長；(c)包括已知和公共數(shù)據(jù)庫得到的(NCBI接收號Nos.NM176035，NM205986，NM205985,AF272778)編碼煙堿乙酰膽堿受體亞單位剪切變異體的核酸序列；(d)由于遺傳密碼子簡并性編碼在(a)-(c)中定義的序列，編碼相同氨基酸的序列。上面提到的SEQIDNo:1位于黑腹果蠅基因組的染色體2L的34E。在本發(fā)明的實施方案中，宿主細胞能夠?qū)pinosyn響應。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以用本申請描述的容易有效的方法進行檢測，如電壓鉗制術(shù)、離子流測定膠遷移、WesternBlots、放射標記競爭試驗、噬菌體表達克隆和色譜聯(lián)合分段分離技術(shù)。此外除了含有上面提及序列的宿主細胞，本發(fā)明的實施方案涉及還包括編碼輔助蛋白核酸的宿主細胞。在特定的實施方案是，編碼輔助蛋白的核酸是編碼無脊椎動物輔助蛋白的核酸。在進一步的實施方案中，編碼輔助蛋白的核酸選自(a)具有NCBI接收號NaNM068898的核酸；(b)與NCBI接收號No.NM068898基因編碼區(qū)的第1-1137位序列有至少36%的同一性、優(yōu)選至少40%，特別優(yōu)選至少50%、優(yōu)選至少60%、特別優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選80%和特別優(yōu)選90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%的同一性，序列的長度優(yōu)選超過至少100、特別超過至少500個緊密相連的核酸，和特別覆蓋整個序列的編碼輔助蛋白的序列；(c)NCBI接收號No.NM068898編碼秀麗隱桿線蟲ric-3輔助蛋白的剪切變異體的序列；(d)由于密碼子的簡并性，編碼與(a)-(c)定義的的氨基酸相同的氨基酸的序列。此外，本發(fā)明的實施方案涉及還包括編碼離子通道亞單位的第二個核酸的宿主細胞。特定的編碼離子通道亞單位的第二個核酸是編碼配體門控性離子通道的第二個亞單位。在一些實施方案中，宿主細胞包括編碼配體門控性離子通道亞單位的第二個核酸，這個核酸也是煙堿乙酰膽堿受體亞單位。甚至在其它一些實施方案中，編碼煙堿乙酰膽堿受體亞單位的核酸是編碼煙堿乙酰膽堿a-7受體亞單位的核酸。在進一步的實施方案是，編碼煙堿乙酰膽堿a-7受體亞單位的核酸恐怖選自下述的序列(a)與編碼煙堿乙酰膽堿a-7受體亞單位的SEQIDNo:2基因編碼區(qū)第106-1617序列有至少50%、優(yōu)選至少60%、特別優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%和特別優(yōu)選90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99°/。和100%同一性的序列，這個序列的長度優(yōu)選超過至少100、特別超過至少500個緊密連接的核苷酸，和基本覆蓋全長核酸的序列。(b)與編碼煙堿乙酰膽堿a-7受體亞單位的SEQIDNo:2序列有至少50%同一性；(c)來源于黑腹果蠅的編碼煙堿乙酰膽堿a-7受體亞單位的剪切變異體的序列，包括可以從公共數(shù)據(jù)庫中査到的序列(NCBI接收號Nos.NM206791、NM167645、麗206790、畫080340、AJ554210和AY036614);(d)由于密碼子的簡并性，編碼與(a)-(c)中定義的的氨基酸相同的氨基酸的序列。需要提到的是，包含SEQIDNo:2的基因位于黑腹果蠅基因組的X染色體的18C位置。本發(fā)明的實施方案還涉及包括與NCBI接收號No.NM205953編碼受體亞單位的基因的79-1485核酸序列有至少50%同一性的核酸；(ii)編碼輔助蛋白的核酸，其中宿主細胞能對spinosyn響應的宿主細胞。在這些特別的實施方案中，編碼離子通道亞單位的核酸不需要被轉(zhuǎn)入到宿主細胞中。本發(fā)明的另外一個方面涉及，包括前面提到的核酸序列的載體，優(yōu)選表達載體的宿主細胞。在本發(fā)明的實施方案中，提供了前面提到的載體形式，其中的核苷酸序列與在載體中存在的并且被安排在該核苷酸序列中的調(diào)控序列操作性連接，且受其調(diào)控。這些調(diào)控核酸序列與本發(fā)明中的核酸序列可以是異源的，即它們來源于不同的基因或生物體，或同源的，即與本發(fā)明的核苷酸在調(diào)控單位中是天然共同存在的。本發(fā)明的重組表達載體包括適于在宿主細胞中表達的核酸，也就是說重組表達載體包括一個或更多個基于被用來表達的宿主細胞中篩選得到的與表達核酸序列操作性連接的調(diào)節(jié)序列。在重組表達載體中，"可操作連接"指的是感興趣的核酸以表達核酸序列的方式與調(diào)控序列相連(如體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)或轉(zhuǎn)入載體的宿主細胞)。調(diào)節(jié)序列包括那些在許多類型的宿主細胞中直接組成型表達的核酸序列和那些僅僅在部分宿主細胞中直接表達的核酸序列(如組織特異性調(diào)節(jié)序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解根據(jù)要轉(zhuǎn)入的宿主細胞和想要表達的蛋白質(zhì)的表達水平等等來設計要用的表達載體。在真核或原核細胞中根據(jù)蛋白質(zhì)的表達來設計重組表達載體。例如，可以在細菌大腸桿菌細胞、昆蟲細胞(桿狀病毒表達載體)、酵母細胞或哺乳細胞中表達蛋白質(zhì)。Goeddel，1990中詳細說明了如何選擇合適的宿主細胞。本發(fā)明中證實的宿主細胞，提供了檢測化學化合物中化學試劑與受體亞單位相互作用或影響受體亞單位的能力，如作用于spinosyn類似物。因此，本發(fā)明的另外一個方面涉及檢測化學化合物影響受體亞單位的能力的方法包括下述步驟(a)將(i)與包含NCBI接收號No.NM205953編碼受體亞單位的基因的編碼區(qū)的第79-1485位核酸序列有至少50%同一性的核酸；(ii)編碼離子通道亞基的核酸分子轉(zhuǎn)入宿主細胞中，體外表達受體亞單位和離子通道亞基，其中宿主細胞能對spinosyn響應；(b)將表達的受體亞單位與化學化合物暴露；(c)評估被表達和被暴露的受體亞基來檢測是否化學化合物可以影響受體亞基。本領(lǐng)域所熟知的誘導核酸進入宿主細胞的方法很多。其中之一就是微注射，也就是直接用細的玻璃注射針將DNA注射到細胞核中(或者直接將RNA注射到細胞的細胞質(zhì)中)。也可以將DNA和惰性碳水化合物聚合物(葡聚糖)共同孵育，其中該聚合物與帶正電荷的化學基團(DEAE、溴化甲基)耦合。DNA通過其帶負電荷的磷酸基團依附到DEAE-葡聚糖)上。這些大的包含DNA的顆粒依次依附到細胞表面，通過己知的內(nèi)吞作用進入細胞。逃避被破壞的細胞質(zhì)中的一些DNA進入到細胞核，象其他基因一樣轉(zhuǎn)錄形成RNA。另外一個方法是，用磷酸鈣沉淀的方法使細胞攝入DNA。電穿孔的方法是將細胞放到含有DNA的溶液中，用電脈沖使細胞膜瞬間打開，DNA通過這些打開的孔直接進入細胞質(zhì)中，或用DEAE-葡聚糖和磷酸鈣方法形成內(nèi)吞小囊泡旁路進入細胞(這個途徑有時可以破壞囊泡或DNA)。也可以通過人工脂囊泡、脂質(zhì)體與細胞膜融合，直接將其與DNA的內(nèi)容物運送到細胞質(zhì)，從而將DNA轉(zhuǎn)入細胞。更直接的方法是，用原代培養(yǎng)的植物細胞和組織，將DNA吸入到鉤微粒的表面，鳥槍注射入細胞。這些方法中的微注射，電穿孔和脂質(zhì)體融合很適合誘導蛋白質(zhì)進入細胞。還可以參考ManninoandGould-Fogerite,1988;ShigekawaandDower,1988;Capecchi;1980禾口Kleinetal，1987。誘導核酸進入細胞的方法也包括使用病毒載體。由于病毒的生長依賴于進入細胞的病毒基因組能力，因此運用病毒載體誘導核酸進入細胞是一個很精明和有效的方法。被廣泛使用的產(chǎn)生蛋白質(zhì)的一種這樣的病毒是昆蟲病毒桿狀病毒。由于桿狀病毒在復制的過程中能夠產(chǎn)生令人矚目的水平的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(病毒外殼蛋白質(zhì))而被許多學者關(guān)注。如果外源基因置換病毒的基因，該外源基因的表達明顯增加。像牛痘苗一樣，桿狀病毒很大，因此必需將外源基因重組到病毒基因組上。為了在桿狀病毒中表達外源基因，要將感興趣的基因克隆到帶有小部分病毒基因組的載體的病毒外殼蛋白基因上。將重組質(zhì)粒和野生型的桿狀病毒DNA共同轉(zhuǎn)染昆蟲細胞。以較低的效率質(zhì)粒和病毒DNA通過同源序列重組，因此可以將外源基因插入病毒基因組中。由于缺乏外殼蛋白包含重組病毒的斑看上去與病毒的斑不同。挑選重組病毒的斑擴大培養(yǎng)。病毒原種然后用于感染新鮮培養(yǎng)的昆蟲細胞，使外源蛋白質(zhì)高效表達?？梢詤⒖糓iller(1989)的桿狀病毒載體。多種病毒載體如噬菌體、痘苗病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒可被用來轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞。需要指出的是，轉(zhuǎn)化細胞的一些方法需要使用中間質(zhì)粒載體。Cohen和Boyer的專利U.S.Pat.No.4，237,224描述了用限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒表達系統(tǒng)。利用轉(zhuǎn)化的方法將重組質(zhì)粒導入細胞，在單細胞的原核細胞生物體中復制，在組織培養(yǎng)的真核細胞中生長。用本領(lǐng)域熟知的SambrookandRussell(2000)所述標準的克隆方法將DNA序列克隆到質(zhì)粒載體上。在本發(fā)明的一些實施方案中，所用的宿主細胞能夠內(nèi)源性產(chǎn)生編碼離子通道亞單位的核酸，所以，沒有必要將編碼離子通道亞單位的核酸誘導進入宿主細胞。因此，檢測化學化合物影響受體亞單位的方法包括下述步驟(a)將(i)誘導編碼受體亞單位的核苷酸序列導入宿主細胞，體外表達受體亞單位，其中宿主細胞可以內(nèi)源性產(chǎn)生和表達離子通道亞單位，其中宿主細胞能對spinosyn響應；以及因此(b)使受體亞單位暴露于化學化合物；(c)評估受處理的受體亞單位來檢測化學化合物是否可以影響受體亞單位。本發(fā)明的另外一個實施方案涉及檢測化學化合物影響受體亞單位的相關(guān)方法包括下述步驟(a)將(i)與編碼受體亞單位的NCBI接收號No.NM205953基因編碼區(qū)第79-1485位核苷酸序列至少50%同一性的核酸；(ii)編碼輔助蛋白的核酸分子導入宿主細胞，體外表達受體亞單位和輔助蛋白，其中宿主細胞能對spinosyn響應；(b)使受體亞單位暴露于化學化合物；(c)評價被表達的和被暴露的的受體亞單位來檢測化學化合物是否能夠影響受體亞單位。在本發(fā)明的一些實施方案是，所用的宿主細胞能夠內(nèi)源性表達輔助蛋白，所以，沒有必要將編碼輔助蛋白的核酸誘導進入宿主細胞。因此，檢測化學化合物影響受體亞基的方法包括下述步驟(a)將(i)編碼受體亞單位的核酸序列進入宿主細胞，并使其體外表達受體亞單位，其中宿主細胞能夠產(chǎn)生和表達內(nèi)源性的輔助蛋白，其中宿主細胞能對spinosyn響應；以及因此(b)使受體亞單位暴露于化學化合物；(c)評估被暴露的受體亞單位來檢測化學化合物是否可以影響受體亞基。無論如何，本發(fā)明所用的宿主細胞是可以暴露于各種化學化合物如可能的殺蟲劑和殺蟲劑(pesticides),并通過評估細胞和化合物的相互作用，發(fā)現(xiàn)和鑒定新的控制昆蟲的化合物。本發(fā)明的實施方案中，所用的化學化合物是化學化合物的混合物。篩選化學化合物的示例方法在Eldefrawi改al.(1987)和Rauhetal.(1990)中公開。本領(lǐng)域熟知的有許多種通過評估被暴露的宿主細胞來檢測化學化合物是否可以影響受體亞單位的方法。在一個實施方案中，評估包括監(jiān)測離子轉(zhuǎn)運，例如通過離子通道，如對非洲爪蟾的卵母細胞功能性表達的通道用電壓鉗制術(shù)進行分析(參見Taglialatelaetal,1992和Stuhmer,1992總體討論的用電壓鉗制術(shù)分析在爪蟾表達的受體和離子通道)。用包含一種或多種化合物的培養(yǎng)基預培養(yǎng)細胞，向培養(yǎng)基中加入含放射性指示劑如發(fā)射性鈣("Ca2,或放射性鈉("Na+)的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細胞，過濾分離細胞來監(jiān)測離子轉(zhuǎn)運。用液體閃爍計數(shù)或其它放射性技術(shù)(BloomquistandSoderlund，1988)測量細胞中的放射性指示劑來監(jiān)測離子轉(zhuǎn)運。在另外一個實施方案中，用鈣或鈉選擇性熒光螯合劑平衡預處理細胞，洗漆細胞，用化學試劑處理細胞，通過測量熒光來監(jiān)測細胞內(nèi)鈣或鈉的增加，來評估化學化合物對受體的影響(DeriandAdam-Vizi，1993;Lin，etal，1999;PCTIntAppl.WO2004033647;PCTApplication:WO20031009;Wilcox,1999)。在進一步的實施方案中，通過測量化合物對受體亞單位的結(jié)合親和力來評估化學化合物對受體亞單位的影響。檢測結(jié)合的結(jié)合試驗使是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括但不限于凝膠遷移檢測、westernblots、放射標記的競爭檢測、基于噬菌體的表達克隆、色譜分段分離、共沉淀、交聯(lián)、相互作用捕獲或雙雜交試驗、Southwestern分析、ELISA等等，其在例如CurrentProtocolsinMolecularBiology(1999,JohnWiley&80113,:^)中描述，通過參考全文并入本申請。篩選的化合物包括任何化合物，但不限于細胞外、細胞內(nèi)、生物或化學起源的化合物。本發(fā)明的方法也包含配體，特別是帶有指示劑如放射標記、熒光標記、化學熒光標記、酶標記和免疫原標記的可能的殺蟲劑。試驗中用的核酸包括在溶液中游離的、附著到固體支持物上的、細胞表面的或位于細胞內(nèi)或與細胞部分結(jié)合的核酸。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以測量受體亞單位和被試驗的化合物形成的復合物。也可以檢測被試驗的化合物減少受體亞單位和其底物形成的復合物。另外，這項試驗特別適用于使用CCD照相機、發(fā)光計或其它合適的光亮檢測系統(tǒng)進行高通量篩選的檢測。通過這種方式，向培養(yǎng)在多孔盤中的細胞加入試驗必需的試驗底物和試劑，來檢測進入細胞內(nèi)的鈣。此外，可以使用商業(yè)儀器如"FLIPR-fluorimetricimagingbasedplatereader"(MolecularDevicesCorp,Sunnyvale,Calif"USA;Woodetal,2000)禾口"VIPR"voltageionprobereader(Aurora,BioscienceCorp.CA,USA)。"FLIPR"可以高通量精確測量整個細胞內(nèi)的熒光。電壓敏感的熒光染料FLIPR技術(shù)被大量的用來測量哺乳動物細胞的膜電位和細胞的熒光現(xiàn)象。這個設備使用的是低角度激光掃描光照，從而在接近標準的96孔板的孔底部大約200微米的處的掩膜(mask)以選擇性激發(fā)熒光。低角度激光通過選擇性將光只想單層細胞而減少產(chǎn)生的背景，也消除了周圍培養(yǎng)基產(chǎn)生的熒光背景。然后使用CCD照相機對平板底部的所有視野照相，來測量每一個孔的底部產(chǎn)生的熒光。根據(jù)孔的面積均化測量得到的信號，然后測量所有細胞的平均響應。這個系統(tǒng)具有同時測量每一個孔熒光的優(yōu)點，也避免了通過一個孔接一個孔的測量方法中連續(xù)測量的不精確性。這個系統(tǒng)可以以每秒兩次的速度讀出96孔或384孔板每一個孔的熒光信號。這個特性使得FLIPR系統(tǒng)可以平行的快速測量熒光，該特性可以檢測細胞的許多生理性能變化。細胞的這些生理性能變化可以作為藥物發(fā)現(xiàn)功能試驗的代理標志物。FLIPR也被設計為具有本領(lǐng)域的已有的靈敏度。此靈敏度使得它可以精確測量非常小的變化。被稱為"chamdeons"的不編碼輔助因子的新的鈣熒光指示劑在細胞內(nèi)有明確的定位。這些所謂的"chameleons"包括綠色熒光蛋白(GFP)的藍或青紫發(fā)射突變、鈣調(diào)節(jié)蛋白、鈣調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合多肽M13和增強綠色或黃色發(fā)射的GFP的銜接融合。結(jié)合鈣的鈣調(diào)節(jié)蛋白包裹M13功能區(qū)，增力口(Miyawakietal,1997)或減少(Romoseretal,1997)GFP蛋白兩側(cè)的熒光共振能的轉(zhuǎn)移。本發(fā)明鑒定了不同宿主細胞以及方法，也提供了產(chǎn)生的抗體，即與NCBI接收號No.NM205953基因編碼區(qū)第79-1485位核酸序列有至少50%、優(yōu)選至少60%、特別優(yōu)選至少70%的同一性、更優(yōu)選至少80%的同一性、特別是90%、91%、92°/。、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%的同一性的核酸序列編碼的多肽的抗原表位特異性結(jié)合的抗體，其中這個多肽在宿主細胞表達、優(yōu)選功能表達由能對spinosyn響應的核酸編碼的多肽。優(yōu)選與NCBI接收號No.NM205953核酸序列以及才第367-380位氨基酸的多肽特異性結(jié)合的抗體。本發(fā)明的抗體包括能夠與已經(jīng)鑒定的抗原表位結(jié)合的多克隆和單克隆抗體、抗體的片段和人源化的抗體。本發(fā)明的人源化的抗體可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的嵌合體的方法產(chǎn)生。本發(fā)明的抗體片段包括但不限于Fab、Fab2和Fd片段。本發(fā)明也提供了能夠產(chǎn)生上面描述抗體的雜交瘤。雜交瘤是能夠分泌特異性單克隆抗體的永生化細胞系。一般而言，本領(lǐng)域所熟知的制備多克隆、單克隆抗體以及能夠產(chǎn)生理想抗體的雜交瘤技術(shù)參見Campbell,1984和St.Grothetal，1980。用煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位蛋白質(zhì)(或其抗原片段)作為抗原免疫任何已知能夠產(chǎn)生抗體的動物(小鼠、兔子等等)可以產(chǎn)生抗體。免疫方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些方法包括皮下或腹腔注射蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)免疫不同的動物、蛋白質(zhì)抗原性和免疫注射的位置知道用于免疫接種的煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位蛋白質(zhì)的量是不同的。對作為免疫原的蛋白質(zhì)修飾或給予佐劑給藥來增加蛋白質(zhì)抗原性。增加蛋白質(zhì)抗原性的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于將抗原與異種蛋白質(zhì)偶聯(lián)(如球蛋白或P-半乳糖苷酶)或在免疫過程中加入佐劑。對于單克隆抗體，將從被免疫動物中分離的脾細胞與骨髓瘤細胞融合(如SP2/OAg15骨髓瘤細胞)形成產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞。可以使用本領(lǐng)域所熟知的鑒定產(chǎn)生具有理想特征的抗體雜交瘤細胞的任何方法之一。這些方法包括ELISA試驗篩選雜交瘤、Westernblot分析或放射性免疫法(Lutzetal,1988)?？寺∨囵B(yǎng)分泌理想抗體的雜交瘤，而后用本領(lǐng)域所熟知的方法(Campbell,1984)測定抗體的類和亞類。從被免疫的動物分離含抗體的抗血清的多克隆抗體，而后用上面描述的一個方法篩選得到具有理想特異性的抗體。本申請進一步提供了上面描述的以可檢測標記形式存在的抗體。抗體可以通過使用放射性同位素、親和標記(如生物素、卵白素等)、酶標記(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)、熒光標記(如FITC或若丹明等)、順磁原子、納米顆粒而被可檢測地標記。用本來領(lǐng)域所熟知的方法對抗體進行標記，例如參見Sternbergeretal,1970、Bayeretal,1979、Engvaletal,1972、Godingl976和Yeetal，2005。本發(fā)明標記的抗體或其片段可用于進行體外、體內(nèi)和原位檢測鑒定表達具有該被鑒定的抗原表位的受體亞單位的細胞或組織、鑒定包含具有該被鑒定的抗原表位的受體亞單位的樣品或鑒定樣品中的存在的具有該被鑒定的抗原表位的受體亞單位。更特別地，抗體或其片段通過與樣品孵育可用于檢測樣品中的具有該被鑒定的抗原表位的受體亞單位。與樣品中具有理想抗原表位的任何受體亞單位結(jié)合的抗體或其片段形成復合物。然后檢測復合物，籍此檢測樣品中的受體亞單位。本發(fā)明的另外一個方面涉及包含基因的生物體，其中基因的編碼區(qū)與包含NCBI接收號No.NM205953基因編碼區(qū)的第79-1485位核酸序列有至少50%同一性，其中包含了突變的生物體顯示相對母系來源的生物體對spinosyn的響應的降低。感興趣基因的突變可導致生物體中的受體亞單位蛋白質(zhì)不表達，或可以表達受體亞單位蛋白質(zhì)但包含改變的配體結(jié)合位點。本領(lǐng)域所熟知的任何遺傳誘變的方法都可以產(chǎn)生基因的突變(Ashbumer,1989和Wood,1988)。在基因或基因組中產(chǎn)生突變的技術(shù)包括輻射(如X射線、紫外或y射線)、化學試齊W如EMS、MMS、ENU、甲醛等)和由轉(zhuǎn)位子插入誘導的包括發(fā)育不全的可動因子導致的插入誘變或轉(zhuǎn)位子介導的缺失，如前面所述的男性重組。改變基因表達的其它方法包括使用轉(zhuǎn)位子(如P元件、EP-類型"過表達阱"元件、水手元件、piggyBac轉(zhuǎn)位子、hermes、minos、sleepingbeauty等)反義雙鏈RNA干擾、肽和RNA適體、直接缺失、同源重組、顯性負性等位基因和細胞內(nèi)抗體使基因不表達。許多誘變劑可以造成遺傳突變。誘變劑的示例是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括但不限于化學誘變劑(如影響(增加或減少)活性的DNA嵌入或DNA結(jié)合化學試劑、化學試劑與DNA分子結(jié)合編碼可能或表達基因的蛋白質(zhì))、物理誘變劑(如紫外光、電離輻射(Y、P、a輻射、X射線))、生物化學誘變劑(如限制性內(nèi)切酶、DNA修復誘變劑、DNA修復抑制劑、易錯DNA多聚酶和復制蛋白質(zhì))等等。誘變劑和DNA相互作用造成DNA序列的誘變改變。在損傷作用下加入誘變劑造成突變可啟動替代的DNA修復機制可以參與完成突變。在某一個實施方案中，化學誘變可誘導靶細胞或生物體一個或多個基因的突變。化學誘變劑通常的實施例是N-乙基-N-亞硝基脲(ENU)突變細胞和生物體。在本發(fā)明中使用的化學誘變劑的其它實施例包括但不限于ethylmethanesulphonate(EMS)和ICR191。許多其他的化學誘變劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的，也可以用于本發(fā)明，參見Friedbergetal,1995，通過參考，其指導化學誘變劑和在不同細胞和生物體中誘導基因突變的突變，而并入本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以明白突變包括缺失突變、插入突變、移碼突變、無義突變、錯義突變或剪切突變。本申請示范了本領(lǐng)域所熟知的破裂和失活基因的轉(zhuǎn)位子插入突變技術(shù)。許多技術(shù)應用P元件轉(zhuǎn)位子誘導果蠅的插入誘變，產(chǎn)生誘導隱性致死突變的P元件轉(zhuǎn)位子的技術(shù)(P-致死)特別適用于快速鑒定新的果蠅的必需基因(Cooleyetal,1988;Spraldingetal,1995;Ohetal，2003)。由于P元件和果蠅基因組的序列是已知的，所以快速鑒定轉(zhuǎn)錄單位是可能的，即由插入到插入序列的兩側(cè)的P元件一端或兩端序列造成的斷裂P元件。本發(fā)明中，斷裂感興趣的果蠅基因如果是同源的則不能導致致死效應，但可以對抗spinosyn或其衍生物的致死效應。這個基因的突變顯示影響編碼蛋白質(zhì)的化合物是有效的殺蟲劑化合物，這類蛋白質(zhì)是篩選和發(fā)現(xiàn)的有效殺蟲劑的極好的靶標。此外，影響這類蛋白質(zhì)的化合物具有治療的效果。用共抑制的方法(Bingham,1997;Smyth，1997;QueandJorgensen,1998)可產(chǎn)生spinosyn抗性表型(包括apinosyn衍生物抗性表型)。共抑制是由于表達或注射與感興趣基因的部分片段一致的反義RNA鏈造成的基因表達降低的表型。共抑制效應被有效延伸到植物和線蟲以產(chǎn)生功能缺失表型。在果蠅中只有一篇關(guān)于共抑制的報道，即用共抑制方法從白色Adh轉(zhuǎn)基因誘導Adh基因降低的表達(Pal-Bhadraetal，1997)。用雙鏈RNA干擾技術(shù)(dsRNAi)可以產(chǎn)生spinosyn抗性表型。這個方法是根據(jù)來源于基因編碼區(qū)的雙鏈RNA的干擾特性，在線蟲的遺傳研究中廣泛使用(Fireetal,1998)，在果蠅中可產(chǎn)生功能缺失的表型(KennerdellandCarthew,1998;MisquittaandPatterson,1999)。這個方法的一個實施例是，在體外合成來源于感興趣基因(例如主題基因)的重要部分的互補的正義和反義RNAs。在注射緩沖液中退火正義和反義RNAs，將雙鏈RNA注射或其他方法誘導進入動物(如在它們的食物中或浸漬在包含RNA的緩沖液中)。然后檢査注射動物的后代的感興趣表型(PCT公布no.W099/32619)。產(chǎn)生功能丟失如spinosyn抗性表型的其它方法包括使用肽適配體作為蛋白質(zhì)功能的顯性抑制子(KoloninandFinley,1998;Xuetal,1997;Hoogenboometal，1998)、RNA適配體(Goodeta/.,1997;Ellingtonetat1995;Belletal，1998;Shietal,1999)和細胞內(nèi)抗體(Chenetal，1994;Hassanzadehetal,1998aand1998b)。細胞內(nèi)表達的抗體或細胞內(nèi)抗體都是單鏈抗體分子，與細胞內(nèi)的靶分子特異性結(jié)合并使其失活。細胞內(nèi)抗體可用于細胞試驗和整個生物體如果蠅(Chenetal，1994;Hassanzadehetal，1998aand1998b)。用與主題(subject)蛋白質(zhì)特異性反應的細胞內(nèi)抗體構(gòu)建誘導表達載體，這些載體被誘導進入模式生物體，用上面描述的研究適配體的相同方式迸行研究。突變的生物體可用于篩選理想表型如spinosyn抗性，選擇、鑒定和分類產(chǎn)生理想表型的基因如克隆、測序、序列圖等，鑒定生物體如根據(jù)本發(fā)明的這一方面的突變生物體。本研究的另一個方面是載體包括(a)反義核苷酸序列基本上與(1)與包含NCBI接收號No.NM205953編碼受體亞單位的編碼區(qū)的第79-1458位置的核酸序列有至少50%的同一性、優(yōu)選至少60%的同一性、特別優(yōu)選至少70%的同一性、更優(yōu)選至少80%的同一性、特別是90%、91%、92%、93%、94°/。、95%、96%、97%、98%、99%和100%的同一性的DNA分子一條鏈的相應部分區(qū)域互補；(b)與反義核酸連接的調(diào)節(jié)序列，以至于反義核酸序列在轉(zhuǎn)入的細胞中表達，其中轉(zhuǎn)化細胞公開了比未轉(zhuǎn)化細胞對spinosyn的響應降低。反義分子與編碼受體亞單位的整個DNA互補，如與整個分子的核酸長度相同。然而，較理想的是更短的分子。在一些范例中，可以用整個反義分子的片段。合適的片段優(yōu)選含有至少20個核酸，可以與編碼整個分子的mRNA雜交。導入與受體亞單位基因產(chǎn)物mRNA(如導入反義分子)互補的RNA或單鏈DNA分子進入細胞可減少黑腹果蠅的受體亞單位基因產(chǎn)物的表達水平。反義分子與受體亞單位基因產(chǎn)物mRNA配對，阻滯mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。因此，黑腹果蠅的受體亞單位反義分子能夠阻斷編碼受體亞單位的mRNA翻譯成功能受體。與編碼受體亞單位或其片段的mRNA互補的反義分子可用來顯著降低黑腹果蠅功能受體亞單位的表達。先選擇表達功能受體亞單位第一水平的細胞，然后導入反義分子(或其片段)進入細胞。反義分子(或其片段)阻斷黑腹果蠅受體亞單位的表達導致細胞中黑腹果蠅功能受體亞單位的第二水平表達。第二表達水平少于起始的第一次表達水平。傳統(tǒng)地，目標基因編碼區(qū)(來自于基因組DNA或cDNA)或編碼反義RNAs的基因、共抑制RNAs、干擾dsRNA、RNA適配體、肽適配體或細胞內(nèi)抗體與特異啟動子和具有已經(jīng)很好了解其調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄增強子、優(yōu)選異源啟動子/增強子(啟動子/增強子對基因表達的主要途徑是非天然的)結(jié)合產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。用本領(lǐng)域所熟知的方法將外源性核酸序列轉(zhuǎn)入動物或培養(yǎng)細胞的基因組中可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物或重組細胞系。對于無脊椎動物模型，最常見的方法是使用轉(zhuǎn)位因子。有幾個合適的轉(zhuǎn)位因子可用來導入核酸序列進入模式生物體的基因組中。轉(zhuǎn)位因子特別適合向感興趣的基因中插入序列，以至于不能正確表達編碼蛋白質(zhì)，產(chǎn)生功能缺失表型的基因敲除動物。在果蠅中用P元件(RubinandSpmdling，1982;U.S.Pat.No.4，670,388)、在線蟲用Tel(Zwaaletal，1993;EpsteinandShakes,1995)可以很好的建立這項技術(shù)。也可以使用其它Tel樣轉(zhuǎn)位因子如minos、mariner和sleepingbeauty。此外，已經(jīng)鑒定了在不同物種中發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)位因子，如PiggyBac(Thibaultetal"1999)、hobo和hermes。除了產(chǎn)生功能缺失表型外，轉(zhuǎn)位因子也可用來將感興趣的基因或其突變或變異體作為附加基因插入到動物基因組的任何功能區(qū)，導致基因的錯誤表達(包括過表達)。優(yōu)化的從pGMR衍生的載體可以特異性的使轉(zhuǎn)基因果蠅的基因錯誤表達的(Hayetal.，1994)，載體長度為9Kb，包含大腸桿菌的復制起始區(qū)、氨芐青霉素耐藥基因、活動插入序列的P元件轉(zhuǎn)位子的3'和5'末端、White標志基因、包括hsp70增強子的TATA區(qū)表達單位和a-tubulin基因3'非翻譯區(qū)的。表達亞單位包括插入增強子的第一個多克隆位點和位于500個堿基下游的插入感興趣基因的第二個多克隆位點。作為轉(zhuǎn)位因子的替代，利用同源重組或基因打耙技術(shù)置換動物同源基因中感興趣基因的一個或兩個拷貝。外源或內(nèi)源啟動子元件可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因，轉(zhuǎn)基因可以是一個小的基因或是一個大的基因組片段。在一個應用中，例如使用果蠅(Brandetal,1994)或線蟲(MeUoandFire,1995)中異位表達基因分析基因的功能。己經(jīng)很好表征的可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的異源啟動子的實施例是包括熱休克啟動子/增強子，即在溫度誘導下錯誤表達。在果蠅中，包括hsp70和hsp83基因，在線蟲中包括hsp16-2和hsp16-41基因。也使用果蠅中組織特異性啟動子/增強子包括在眼睛中表達的eyeless(MozerandBenzer,1994)、sevenless(Bowtelletal，1991)禾口glass-responsive啟動子/增強子(Quiringetal.,1994)和在翅膀中表達的dpp或vestigal基因起源的啟動子/增強子(Stachling-Hamptonetal,1994;Kimetal，1996)。最后，用內(nèi)源性啟動子如主要蛋白質(zhì)通路基因限制顯性激活或顯性負性轉(zhuǎn)基因的正常激活通路是必需的。在線蟲中，有用的組織特異性啟動子/增強子的示例包括咽肌肉特異性表達的myo-2基因啟動子、用于身體-肌肉特異性表達的hlh-1基因啟動子、神經(jīng)元接觸特異性基因表達的mec-7基因啟動子。優(yōu)選的實施方案中，將基因插入轉(zhuǎn)化載體，然后和包含顯性可選標記如，rol-6的質(zhì)粒注射入線蟲，由于基因融合直接造成主要通路基因的錯誤表達。通過表型和主要通路基因錯誤表達造成的表型來鑒定轉(zhuǎn)基因動物。在果蠅中，用外源DNA的二元控制系統(tǒng)檢測發(fā)育特異性階段和組織特異性模式的錯誤表達(mis-expression)基因。二元外源調(diào)節(jié)系統(tǒng)的兩個實施例包括源自酵母的UAS/GAL4系統(tǒng)(Hayetal，1997;Ellisetal，1993;BrandandPerrimon，1993)和源自大腸桿菌的Tet系統(tǒng)(Belloetal，1998)。用已知的方法可以產(chǎn)生顯性負性突變，該突變引起蛋白質(zhì)干擾野生型蛋白質(zhì)拷貝的正常功能，并且其導致在正?；蚩截惔嬖谙碌墓δ軄G失或降低功能的表型(Hershkowitz，1987)。本發(fā)明的一個方面，提供了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因魚。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因魚的基因組中含有被導入與啟動子操作性連接的受體亞單位基因，其被穩(wěn)定整合或插入到基因組中。優(yōu)選的啟動子包括器官或組織特異性啟動子(包括細胞特異性的啟動子)或可以被特異性組織調(diào)節(jié)的啟動子。典型的，來自于除魚之外的動物的受體亞單位基因有利于構(gòu)建到在本申請詳細描述的重組載體上。優(yōu)選的受體亞單位基因是無脊椎動物受體亞單位。這樣的魚可以形成穩(wěn)定魚系，其能夠復制，并把與受體亞單位相關(guān)的遺傳信息傳遞給它們后代的。本發(fā)明中用了許多種的魚。魚的實施例包括硬骨魚如斑馬魚。與其它動物模型相比，與其他動物相比較，選用斑馬魚有特別的好處。如，斑馬魚適于遺傳篩選、修飾篩選和化學篩選，可快速的發(fā)育成ex-utero，有明顯的生活周期，每周可產(chǎn)生非常多的后代。用相對很小的設施(在9升的池子中可以生存54個成年斑馬魚)可以喂養(yǎng)斑馬魚，且很容易產(chǎn)生為數(shù)眾多的后代，每一個成熟的雌性一般每周可以產(chǎn)100-300個卵。這些卵是體外受精產(chǎn)生的，胚胎是透明的，因此可以用解剖顯微鏡觀察早期的造血組織和其它器官和組織系統(tǒng)的發(fā)育。胚胎的大部分器官的發(fā)育是非常快的，在受精后5天血細胞可以完全發(fā)育成熟，3個月時達到生殖成熟。載體包括編碼受體亞單位的基因操作性與啟動子相連接。優(yōu)選器官或組織特異性的啟動子。由于大部分哺乳動物的啟動子在魚中不能很好的發(fā)揮作用，因此本領(lǐng)域的技術(shù)人員用所熟知的方法將斑馬魚、fogu或其它物種的魚的基因組調(diào)節(jié)序列特異性的克隆到感興趣的編碼序列的上游、中間和下游。類似的程序也可以用來構(gòu)建其其如斑馬魚的器官或組織特異性啟動子，這也是本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的。轉(zhuǎn)運載體中包括轉(zhuǎn)基因。本申請用的本領(lǐng)域所熟知的載體指的是包括設計用來直接轉(zhuǎn)化(如通過將外源性的DNA插入到其基因組可以改變細胞遺傳物質(zhì)的過程)目標細胞遺傳物質(zhì)的核酸序列構(gòu)建。載體可能包括多個位置和序列定向的(oriented)遺傳性元件，即與其它必需或理想元件操作性連接，以便在盒(cassette)中核酸的可以被轉(zhuǎn)錄，并且如果需要在微注射的單細胞受精胚胎中翻譯核酸。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的和許多文獻中描述的方法將上面引用的核酸序列插入載體從而構(gòu)建重組表達載體。本發(fā)明用了許多已知的載體。合適的載體包括質(zhì)粒載體、病毒載體包括逆病毒載體(參見Milleretal，1993)、腺病毒載體(參見Erzurum,etal，1993;Zabner,etal，1994;andDavidson,etal,1993)、腺相關(guān)病毒載體(參見Flotte，etal，1993)、皰疹病毒載體(參見Anderson,etal，1993)和慢病毒載體(參見Lever,2000)。這些載體包括其它已知的在特異宿主細胞中有效表達的必需或理想的遺傳元件，包括調(diào)節(jié)元件，如本申請描述的轉(zhuǎn)基因魚宿主細胞。例如，載體包括啟動子，例如本申請描述的具有器官或組織特異性的啟動子，和與啟動子共同作用以達到轉(zhuǎn)錄基因的任何必需的增強子序列。"增強子"指能夠在細胞中刺激啟動子活性的核酸序列元件，如本申請描述的轉(zhuǎn)基因魚宿主細胞。載體也可以例如是線性的。核酸序列與編碼報告基因產(chǎn)物的核酸序列融合，以便形成融合蛋白質(zhì)，能夠可視化觀察或其他方式鑒定存在的融合蛋白質(zhì)或其位置。術(shù)語"編碼"指的是通過轉(zhuǎn)錄和翻譯的機制，轉(zhuǎn)錄和翻譯核酸序列的過程，這使細胞具有將一系列的氨基酸聚集到氨基酸序列上產(chǎn)生多肽的信息的特性。這樣的核苷酸序列的一個示例是，本發(fā)明用的編碼GFP的核苷酸序列，以便在發(fā)育的胚胎的區(qū)域和/或hatched或者成熟魚融合蛋白一旦表達時產(chǎn)生熒光。作為替代，可以使用其它報告基因產(chǎn)物包括熒光素酶、(3-半乳糖苷酶、氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶、P-葡萄糖苷酶和堿性磷酸酶。檢測本申請描述的報告基因產(chǎn)物存在，包括檢測其活性或量的試驗是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，以及也在定期更新的CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubeletal，eds.，JohnWiley&Sons)中有描述。本申請可以發(fā)現(xiàn)對報告基因試驗的更詳細的描述，例如下面的文章熒光素酶參見Nguyen,V.T.etal.(1988)、|3-半乳糖苷酶參見Martin,C.S.，etal，1997;JainandMagrath,1991);卩-葡萄糖苷酶，卩-葡萄糖苷酶和堿性磷酸酶參見Bronstein,etal(1994);氯霉素?；D(zhuǎn)移酶參見Cullen(1987);Go腿n,C.etal,(1982);Mineretal.(1988);Sleigh(1986);小時ubyandWilsonC1992)。本發(fā)明的另外一個方面，基因位于報告基因之前，所述報告基因如熒光蛋白質(zhì)基因(例如GFP、RFP、BFP、YFP或dsRED2)或熒光素酶蛋白質(zhì)基因，包含位于特異性重組酶識別位點(如Flox、Lox或FRT位點)兩側(cè)的一個強的轉(zhuǎn)錄終止位點。一個普遍存在的啟動子(如EFI-a或(3-actin)可以啟動"Loxed"、"Floxed"或"FRPed"報告基因的表達。由于位于報告基因內(nèi)的強轉(zhuǎn)錄終止位點，在重組蛋白質(zhì)不存在的情況下，報告基因的鄰近的第二個基因產(chǎn)物(如受體亞單位基因)不表達。然而，當在細胞中激活重組蛋白質(zhì)表達時，就會切斷Loxed,Floxed，orFRPed的報告基因產(chǎn)物，第二個基因與普遍表達的基因啟動子并排排列。此外，組織特異性重組通過使用激光激活熱休克可導入位點特異性重組酶轉(zhuǎn)基因。在胚胎發(fā)育過程中激光可激活單個細胞。這些發(fā)明的另外一個方面是本申請?zhí)峁┝酥苽滢D(zhuǎn)基因魚的方法。在一個實施方案中，方法包括導入受精魚卵(包含魚的胚胎)或沒有受精的魚卵的核酸，該核酸包括無脊椎動物受體亞單位與啟動子操作性連接。本申請描述的核酸可以是載體的一部分。當用受精的魚卵時方法包括從魚的胚胎發(fā)育成轉(zhuǎn)基因魚。當編碼煙堿受體亞單位的基因?qū)霙]有受精的卵時的方法包括受精魚卵和從魚的胚胎發(fā)育成轉(zhuǎn)基因魚。有許多本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可將核酸導入到卵中，包括機械的方法、化學方法、親脂的方法、逆病毒感染的方法和電穿孔。例如，示例性的機械方法包括例如微注射。示例性的化學方法包括例如磷酸鈣法或DEAE-葡聚糖法。示例性的親脂的方法包括使用脂質(zhì)體和其它脂質(zhì)介導轉(zhuǎn)染的陽離子試劑。這些方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，伊J鄉(xiāng)口也在GeneTransferMethods:IntroducingDNAintoLivingCellsandOrganisms,(NortonandSteel，2000)和定期更新的CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubeletal.,)中有描述。例如，涉及魚的微注射的方法在例如ChenandPowers(1990)和FletcherandDavis(1991)有更進一步的詳細描述。涉及魚的電穿孔的方法在例如Powersetal.(1992)和Luetal.(1992)中有更進一步的詳細描述。用逆病毒載體，如泛嗜性逆病毒載體感染的方法導入DNA進入魚卵或胚胎的技術(shù)在Bums，J.C,etal(1993)中有描述。包括轉(zhuǎn)基因的載體或其它核酸可以在發(fā)育的理想階段導入沒有受精的卵或受精的卵中。本申請描述了可以使用的多個編碼不同轉(zhuǎn)基因的載體。當使用受體卵或胚胎時，優(yōu)選將核酸導入胚胎(即在發(fā)育的一個細胞階段)。然而，在發(fā)育的后期包括兩細胞期、四細胞期等等的階段可以通過給藥的方式把核酸導入。因此核酸可以被導入桑椹胚、囊胚等等中。用上面描述的轉(zhuǎn)基因的方法可以將分離的至少一個核酸分子導入進入受精卵。此外，在發(fā)育的后期當核酸進入受精卵，用上面描述的轉(zhuǎn)基因的方法，分離的至少一個核酸分子整合到上述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建中，并進入至少一個細胞中如桑椹胚、囊胚中。用標準的方法可以從合適的魚得到其卵。許多魚可以通過商業(yè)購買的方式得到，如寵物商店。用本領(lǐng)域已知的方法可得到受精卵。例如，將相應年齡的魚，如3-12個月的魚，按照雌性和雄性的理想比率如(2:1)放到一個相應大小的容器如池子中。在交配后的一定時間如10-60分鐘，將魚放在池子中的交配室中，收集受精卵。例如在Gulpetal.(1991)中描述了這個方法。或者，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法是用人工授精的方法得到魚的受精卵。還可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的其它方法得到受精的魚卵。在把構(gòu)建的核酸導入進入魚卵或胚胎后，形成的魚卵或胚胎在具有一個適宜的環(huán)境中發(fā)育成成年的魚。例如，這個適宜的環(huán)境包括在28.5°C的E3卵水中生活15天，而后在16天注入循環(huán)系統(tǒng)的水(Westerfield，2000)?？梢酝ㄟ^包括基因組DNA的點雜交和Southernblot雜交的本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法鑒定本申請描述的產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因魚。簡言之，這個方法包括從魚的組織中分離基因組DNA、用限制性內(nèi)切酶消化DNA和Southernblot雜交消化的DNA產(chǎn)物，如在Chen，T.T.etal(1996)中有描述。通過從鰭組織中分離基因組DNA、聚合酶鏈反應擴增轉(zhuǎn)基因序列和Southernblot分析擴增的產(chǎn)物進行初步篩選，這個方法在Luetal.(1992)和Chenetal(1993)有描述。此外，如果被導入的核酸編碼包括受體亞單位GFP融合蛋白質(zhì)的煙堿受體亞單位熒光融合蛋白質(zhì)，可以用可見的熒光進行初步篩選。優(yōu)選的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因魚的轉(zhuǎn)基因可以穩(wěn)定整合到其基因組中。這意味著轉(zhuǎn)基因被整合到魚的基因組中而不是染色體外。在轉(zhuǎn)基因魚孵化后的一個合適的時間，加入試驗的藥物或試劑。在本發(fā)明的其它形式中，在魚的胚胎和魚卵中加入試驗試劑。用標準的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以將編碼受體亞單位的DNA片段整合到轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組中。本領(lǐng)域已知的多種方法可以用于將轉(zhuǎn)基因?qū)雱游镆陨山⑵饋淼霓D(zhuǎn)基因動物系，例如可參見Hoganetal.1986and1994;U.S.Pat.Nos.5,602,299;5,175,384;6,066,778和6,037,521。這些技術(shù)包括但不限于原核微注射(U.S.Pat.No.4,873,191)、逆病毒介導基因轉(zhuǎn)入生殖種系(VanderPuttenetal.1985)、胚胎干細胞基因打靶(Thompsonetal,1989)、胚胎電穿孔(Lo,1983);和精子介導的基因轉(zhuǎn)移(Lavitranoetal.1989))。例如，用在不同發(fā)育階段的胚胎細胞導入轉(zhuǎn)基因生成轉(zhuǎn)基因動物。根據(jù)胚胎細胞的發(fā)育不同的階段用不同的方法。受精卵是微注射一個很好的靶標，微注射受精卵的方法是本領(lǐng)域已知的，參見U.S.Pat.No.4,873,191中的描述。在小鼠中，如果雄性前核的直徑大小達到大約20微米時，可以重復注射l-2皮升(pi)的DNA溶液。用受精卵作為靶標進行基因轉(zhuǎn)移具有主要的優(yōu)點，即在大多數(shù)情況下，注射的DNA可以在第一次分裂前整合到宿主基因組中(Brinster,etal.1985)，作為結(jié)果，非人類的轉(zhuǎn)基因動物的所有細胞都帶有了轉(zhuǎn)基因。由于50%的生殖細胞都帶有轉(zhuǎn)基因，這通常也可以反映轉(zhuǎn)基因從建立者(founder)傳給后代的傳遞效率。將受體亞單位核酸片段微注射到前核可以生成轉(zhuǎn)基因小鼠。導入目標載體進入胚胎干細胞(ES)可以生成本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物。在適合的條件下體外培養(yǎng)植入前胚胎可以獲得胚胎干細胞(Evansetal.1981;Bradleyetal.1984;Gossleretal1986;andRobertsonetal.1986)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的包括電穿孔、磷酸鈣共沉淀、原生質(zhì)體或原生質(zhì)球融合、脂質(zhì)體和DEAE-葡聚糖介導的DNA轉(zhuǎn)染的方法可以將DNA有效轉(zhuǎn)入到胚胎干細胞生成轉(zhuǎn)基因。通過逆病毒介導的導入或微注射技術(shù)可以將轉(zhuǎn)基因?qū)脒M入胚胎干細胞。轉(zhuǎn)染的胚胎干細胞在進入胚泡期胚胎的囊胚腔后，可以擴增胚胎，生成嵌合體動物(reviewedinJaenisch,1988)。轉(zhuǎn)染的胚胎千細胞進入囊胚腔前，如果轉(zhuǎn)基因帶有篩選標記，可用各種篩選的方法富集整合了轉(zhuǎn)基因的胚胎干細胞。也可以用PCR的方法篩選整合到轉(zhuǎn)基因中的胚胎干細胞。在胚胎干細胞進入囊胚腔前，這個方法不需要在合適的篩選條件培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的胚胎干細胞。此外，可以用逆病毒感染的方法將轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨说膭游镏小０l(fā)育的非人的胚胎可以在體外培養(yǎng)到胚泡期。期間，卵裂球可作為逆病毒感染的靶標(Janenich,1976)。酶切消化透明帶可以有效感染卵裂球(Hoganetal，1986)。典型的導入轉(zhuǎn)基因的病毒載體系統(tǒng)是帶有轉(zhuǎn)基因的復制缺陷逆病毒(Jahneretal.，1985);VanderPutten,etal，1985)。在單層病毒包裝細胞中培養(yǎng)卵裂球可以非常容易和有效的轉(zhuǎn)染(VanderPuttenetal,1985;Stewartetal,1987)，或者，可以在后面的階段進行病毒感染，將病毒和病毒包裝細胞注射入囊胚腔(Jahneretal，1982)。大部分的第一代是轉(zhuǎn)基因的嵌入體，因為整合僅僅發(fā)生在一部分的細胞，其之后形成轉(zhuǎn)基因動物。另外，逆病毒載體介導的第一代轉(zhuǎn)基因動物的轉(zhuǎn)基因插入到基因組的不同位置，一般其后代就會分離。此外，小型的胚胎可通過子宮內(nèi)的逆病毒感染導入轉(zhuǎn)基因進入種系(Jahneretal.，1982)。其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的利用逆病毒或逆病毒載體生成轉(zhuǎn)基因動物的方法包括逆病毒顆?；虍a(chǎn)生逆病毒的絲裂霉素C處理的細胞微注射到受精卵或早期胚胎的卵黃周隙(WO90/08832;HaskellandBowen,1995)。將編碼受體亞單位多肽的cDNA的DNA片段微注射到非人哺乳動物如小鼠的單細胞胚胎前核，將注射的胚胎移植到假孕雌性動物的輸卵管或子宮，生成轉(zhuǎn)基因動物。培養(yǎng)生成的第一代動物可以交配、近親交配、遠親交配或交叉交配生成特定動物的后代。這些交配策略的示例包括但不限于多于一個整合位點的遠親交配可產(chǎn)生不同的種系，不同種系的近親交配產(chǎn)生高表達轉(zhuǎn)基因的化合物轉(zhuǎn)基因(由于每一個轉(zhuǎn)基因的加成表達效應)，異源轉(zhuǎn)基因小鼠的交配產(chǎn)生DNA分析中增加表達而不需要篩選的在某一個整合位點的純合子小鼠，不同的純合子種系的交配可產(chǎn)生化合物雜合子或純合子的種系，培養(yǎng)不同近親交配遺傳背景的動物來檢査表達修飾轉(zhuǎn)基因動物和表達的生理效應。本發(fā)明得到了在所有細胞均攜帶轉(zhuǎn)基因的非人的轉(zhuǎn)基因哺乳動物，和部分細胞中帶有轉(zhuǎn)基因的非人的轉(zhuǎn)基因哺乳動物，即嵌合體動物。轉(zhuǎn)基因可以以單轉(zhuǎn)基因或串聯(lián)體如頭頭串聯(lián)或頭尾串聯(lián)整合。篩選轉(zhuǎn)基因動物，檢測以篩選表達受體亞單位表型的動物?？梢韵扔萌鏢outhernblot分析或PCR技術(shù)進行第一步篩選分析動物細胞來證實轉(zhuǎn)基因的整合?？梢杂玫幌抻趤碜詣游锝M織樣品的Northernblot分析、原位雜交和逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(rt-PCR)的方法評估轉(zhuǎn)基因動物細胞中的轉(zhuǎn)基因mRNA的表達?？梢赃M一步表征非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的特性，以鑒定具有本發(fā)明的方法中有用的表型的那些動物。本發(fā)明的篩選方法中，對有機體如果蠅給予大量的候選試劑。給藥后，通過與對照(如沒有給予候選試劑的轉(zhuǎn)基因或野生型的果蠅)比對檢測生物體，確定對有機體例如果蠅有效的候選試劑。一般，通過將候選試劑混合到果蠅的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，并放在有果蠅(幼蟲或成蟲，一般是成蟲)的培養(yǎng)基中，以便該果蠅以此培養(yǎng)基為食而口服給藥，所述的培養(yǎng)基例如水和含有添加的營養(yǎng)試劑。用本領(lǐng)域所熟知的方法對其它生物體給藥。一般分析多數(shù)混合物的試驗是平行進行的，不同濃度的試劑試驗來得到對候選試劑不同濃度的不同反應。一般，濃度試驗中要有一個不加復合物的陰性對照。優(yōu)選的實施方案是，用高通量篩選的方法對大量的生物體平行的篩選大量候選化合物。"大量"也是多數(shù)的意思，也就是指至少10-50，通常至少100和更通常至少IOOO，其中數(shù)目可以是10，000或50,000或更多，但是在許多試驗中將不超過5000。本發(fā)明的方法用于篩選大量不同的可能殺蟲劑的候選化合物。候選的復合物包括許多化學類型，盡管通常是有機分子，優(yōu)選分子量大于50并小于2,500Da的小分子有機化合物。候選的化合物包括與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相互作用所必須的功能集團，特別是氫鍵結(jié)合，以及特別包括至少氨基、羧基、羥基或羧基基團，優(yōu)選至少兩個功能基團。候選的化合物通常包括含有上面提到的一個或更多個功能基團取代的環(huán)狀的碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳香或多芳香結(jié)構(gòu)。候選化合物也發(fā)現(xiàn)于活性分子中，包括但不限于肽、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶和其衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或其組合。候選化合物的來源很豐富包括合成的文庫或天然的化合物。例如，有許多方法可以隨機和直接合成大量的有機化合物和活性分子包括隨機表達寡聚核苷酸和寡肽的方法。在細菌、真菌、植物和動物抽提物中可產(chǎn)生天然化合物文庫。此外，天然或合成的文庫和化合物可以通過傳統(tǒng)化學、物理和生物化學方法修飾，可用于生成組合文庫。直接或隨機化學修飾，如?；?、烷化、酯化、酰化(amidification)等等可以被產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。用藥物設計或計算機模式的方法可以創(chuàng)造新的可能殺蟲劑或治療化合物。上述篩選的方法是評估用作殺蟲劑的候選化合物效果和安全性的多步篩選過程的部分。本發(fā)明的多步篩選過程候選化合物或化合物文庫可用于在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物體中篩選。此外，在篩選候選化合物作為殺蟲劑的體外篩選試驗前要先做一個體內(nèi)篩選?？梢允褂萌魏纬Ｒ?guī)的體外篩選的試驗，其中許多合適的體外篩選試驗是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。本發(fā)明也提供了用于本發(fā)明的篩選方法的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括本發(fā)明生物體或生成這樣生物體的方式，例如本發(fā)明的雄性和雌性有機體，攜帶需要的基因，例如轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)座酶基因、GAL4等等的載體。把果蠅放在相應的容器中如管形瓶中培養(yǎng)。本發(fā)明的試劑盒也包括動物的營養(yǎng)培養(yǎng)基，如果蠅的培養(yǎng)基。用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的基于PCR檢測的直接對比的方法，篩選果蠅種群中具有抗性殺蟲劑的生物活性。如Aronstein，K.etal.(1993)。具體實施例方式實施例克隆果蠅煙堿乙酰膽堿a-6亞單位使用FasrTack2.0mRNA分離試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)從冰凍的果蠅頭部分離PolyA+mRNA。將果蠅頭(0.326g)和15ml裂解液加入到Dounce勻漿器中，從10倍的儲存液中得到裂解液。然后，按照說明書操作，用25pl的洗脫緩沖液懸浮最后得到的mRNA沉淀。用溶解在200jxl的洗脫緩沖液中的5|ilmRNA測定A260/A280的讀數(shù)。mRNA的濃度是0.139pg/W，總量是3.475jig。使用InvitrogencDNAcycle試劑盒(Invitrogen,Carlsbad，CA)合成第一條鏈cDNA，2(Vl反應體系中，加入3.5ji1mRNA(0.4865嗎mRNA)，按照說明書進行操作。然后用FailSafePCR試劑盒(Epicentre,Madison，WI)進行PCR，25^1反應體系依次加入1^1cDNA、2.5^1的lOpM/pl的SEQUENCEIDNOS.3和4引物、0.5^1FailSafe酶、12.5^12xFailSafePCR混合物(A-L)和5|alH20。在PerkinElmerCetusDNAthermalcycler儀器上進行PCR反應，條件如下95。C30秒，55。C30秒，72°C2分鐘，共30個循環(huán)。取5)al反應產(chǎn)物P/。的瓊脂糖/TBE凝膠電泳。用預混合物A、D和G可以分別產(chǎn)生預期的1497bp長度的反應產(chǎn)物。將剩下的20^1PCR反應產(chǎn)物上樣到1%的瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶，用QiaexII(Qiagen，Valencia,CA)純化回收條帶。將純化回收得到的PCR產(chǎn)物連接到pCR2.1-TOPO載體上，然后按照Invitrogen,Carlsbad，CA的說明書操作將其轉(zhuǎn)化到TOP10細胞。用WizardPlusSV小量抽提試劑盒(Promega，Madison,WI)提取從每一個PCR產(chǎn)物中得到的18個克隆的質(zhì)粒DNA。用EcoRI酶切分析質(zhì)粒DNA，可以產(chǎn)生三種形式的片段包括932bp和565bp的兩個片段、只有一個的H97bp片段或者是稍微大一些的單一條帶。對這些克隆測序結(jié)果公開來源于外顯子3和8(Grausoetal，2002)的不同剪切可以產(chǎn)生剪切變異體。由于RNAi編輯(Grausoetal.2002)導致內(nèi)部EcoRI酶切位點消失，因此EcoRI酶切消化只能產(chǎn)生單一的酶切片段。用標準的分子技術(shù)從pCR2.1-TOPO載體上切下果蠅30D基因作為BamHI片段，并亞克隆到pAcP(+)IEl-3(Novagen,Madison,WI)和pGH19(Limanet.al，1992)載體上?？寺」墴焿A乙酰膽堿(X-5亞單位以果蠅的胚胎mRNA作為模板(Clontech,PaloAlto，CA)，用SuperscriptIIfirststrandsynthesisi式齊廿盒(Invitrogen，Carlsbad,CA)合成第一條鏈cDNA。以序列ID號5和6為引物，用FailSafePCRkit(Epicntre,Madison,WI)試劑盒的2X反應混合物A-F迸行PCR反應，條件如下95°C3分鐘變性，而后進行30個循環(huán)的95。C30秒、55°C30秒、72。C2.5分鐘，最后72。C延伸10min。反應A和D可以擴增得到預期片段為2440bp的PCR產(chǎn)物，將其連接到pCRBluntll-TOPO載體上，對得到的一些克隆測序。其中得到的一個克隆與NCBI接收號No.AF272778僅僅有3個堿基的改變。這些核苷酸的變化導致2個氨基酸的置換，在603位置處I-V的變化(相對于M起始)和795處I-M的變化，這兩個置換都是保守氨基酸。用標準的分子技術(shù)從pCRBluntll-TOPO載體中酶切該基因，命名為XbaI片段，將其亞克隆到pAcP(+)IEl-3和pGH19載體上?？寺」墴焿A乙酰膽堿ot-7亞單位以果蠅的幼蟲mRNA作為模板(Clontech,PaloAlto，CA)，用SuperscriptIIfirststrandsynthesis試齊U盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)合成第一條鏈cDNA。以序列ID號7和8為引物，用ThermalAcePCRkit(Invitrogen,Carlsbad,CA)試劑盒進行PCR，使用梯度段(gradientblock)的循環(huán)條件，如下95。C預變性3分鐘，而后95。C30秒，45°C、53.3°C或者60。C30秒，74。C2分鐘，共30個循環(huán)，最后74°C延伸10分鐘。每個反應產(chǎn)生預期大小的產(chǎn)物1633bp。將60。C退火得到的產(chǎn)物連接到pCRBluntll-TOPO載體上，然后測序和鑒定得到的大小正確的克隆。結(jié)果得到了從ATG起始密碼子開始1378處單個堿基C到T的變化，這個改變導致形成了翻譯提前終止密碼子。用QuickChangeIIsitedirectedmutagenesiskit(Stratagene，LaJolla，CA)試劑盒將T還原成C。最后得到的序列與NCBI接收號No.AJ554210匹配發(fā)現(xiàn)，除了在311位的賴氨酸為蘇氨酸和C端的FP氨基酸序列替代了VSGVRG。用標準的分子技術(shù)從pCRBluntll-TOPO酶切片段，命名為XbaI耙基因，亞克隆到pAcP(+)IEl-3和pGH19載體上。克隆線蟲ric-3將得到的線蟲ric3基因PCR產(chǎn)物連接到pCR2.1-TOPO載體上，證實包含1137bp大小插入片段的正確的克隆。以加入了BamHI酶切位點的序列ID號9禾n10為引物，用FailSafePCRkit試劑盒進行PCR擴增。將得到的PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1-TOPO載體上，對大小正確的克隆進行測序。得到的克隆與NCBI接收號NM068898序列完全一致。用標準的分子技術(shù)，從p2.1-TOPO重組載體中將基因切下，作為Bamffl片段，并亞克隆到pAcP(+)正l-3和pGH19載體上。功能分析制備宿主細胞通過水浴(bathing)用2g/l的三卡因甲基磺酸鹽麻醉非洲爪蟾(Xenopus1，AnnArbor,ML;Nasco，F(xiàn)ortAtkinson,WI)，外禾斗手術(shù)取出卵母細胞，將其放到包含96mMNaCl、2mMKCl、1.8mMCaCl2、1mMMgCl2、5mMHEPES5、2.5mM丙酮酸鈉、100units/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素pH7.6的培養(yǎng)溶液中。卵母細胞在通常不含(^2+的蛋白酶溶液中分散，以defoUiculate卵母細胞，該蛋白酶溶液包含88mMNaCl、2.5mMKCl、lmMMgCl2、5mMHEPES、2.5mM丙酮酸鈉、100units/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素pH7.6和1.5mg/ml膠原酶IA(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)。分離之后，徹底沖洗卵母細胞，然后將其放回到含有C^+的培養(yǎng)溶液中，18。C保存。合成用于爪蟾卵母細胞注射的cRNA按照下面的方法合成cRNA:用NotI、XhoI或NheI其中的一個限制性內(nèi)切酶酶切線性化質(zhì)粒DNA。用T7mMessagemMachinekit(Ambion，Austin,TX)試劑盒按照說明書操作，以線性化的DNA為模板合成cRNA。導入核酸分子用于將cRNA注射入爪蟾卵母細胞的，微量移液器在DMZ-UniversalPuller(Zeitz-Instruments,Mlinchen，Germany)上做成。用負壓將注射用的cRNA吸入到微量移液器中。用NanojectII卵母細胞注射器(DrummondScientificCo"Broomall,PA)，以正壓將接近10-50ng的cRNA注射到卵母細胞中。下面這些核酸被注射到卵母細胞(1)煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位亞單位(30D);(2)煙堿a-7受體亞單位(34E);(3)煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位和線蟲ric-3(30D和ric-3);(4)煙堿a-7受體亞單位和線蟲(34E和ric-3);(5)煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位和煙堿a-7受體亞單位(30D和34E);(6)煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位、煙堿a-7受體亞單位和線蟲ric-3(30D、34E和ric-3)。電壓鉗制術(shù)分析電壓鉗制術(shù)記錄的對照外部溶液包括88mMNaC1、1mMKCl、0.41mMCaCl2、2.4mMNaHC03、0.3mMCa(N03)2、0.82mMMgS04.7H20和15mMHEPESpH7.6。用重力灌注系統(tǒng)連續(xù)灌注記錄室。向外部溶液中加入lmM的煙堿，然后將其加入到灌注液，持續(xù)30秒。而后，以不少于10分鐘從外部溶液中洗脫煙堿。此后，用DMSO(二甲基亞砜)溶解spinosynA，以終濃度10將其溶解到外部溶液中，然后將其加入到灌注液中，持續(xù)60秒。而后從外部溶液中洗脫spinosynA，使得DMSO的終濃度不超過0.1%(v/v)。注射后用電壓鉗制術(shù)記錄1-5天，用OC-725C卵母細胞夾子(WarnerInstruments,Hamden，CT)進行手工記錄，大部分的結(jié)果要用Roboocyte自動卵母細胞記錄系統(tǒng)(RoboocyteAutomatedOocyteRecordingSystem)(MultichannelSystems,Reutlingen，Germany)記錄。對于手工記錄，裝酉己至ljDMZ-UniversalPuller(Zeitz-Instruments,Mi3nchen,Germany)上的記錄的微電極填充了3mMKC1，具有1-5的電阻。標準的電壓鉗制術(shù)的兩個電極是用來記錄加入煙堿或spinosynA后電流的變化的。加入煙堿或spinosynA后卵母細胞的電壓鉗位到-60mV，電流在峰值檢測。用上面描述的放大器放大得到的數(shù)據(jù)，用AcqKnowledge硬件/軟件(BIOPACSystems,Inc.,SantaBarbara,CA)或Roboocyte自動卵母細胞記錄系統(tǒng)軟件(MultichannelSystems,Reutlingen,Germany)在計算機上記錄數(shù)據(jù)。結(jié)果和討論下面的表格l公開了結(jié)果。表1.<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>"-"表示的是誘導的可以忽略不計的電流。"+"表示電流幅度小。"++"表示中等幅度電流。"++++"表示高幅度電流。本申請所出現(xiàn)的對數(shù)據(jù)的"可忽略不計"、"小"、"中等"和"高"描述性的術(shù)語都是相對的。從上面的表1可以看到，用30D(位于染色體2L的30D位置的煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位)的cRNA單獨注射卵母細胞，卵母細胞顯示對煙堿和spinosynA都沒有反應。用34E(位于染色體2L的34E位置的煙堿乙酰膽堿受體a-5亞單位)的cRNA單獨或是34E和ric-3cRNAs聯(lián)合注射卵母細胞顯示對煙堿小幅度的反應，但對spinosynA沒有可檢測到的反應。將30D和ric-3cRNAs聯(lián)合注射卵母細胞，顯示細胞對煙堿和spinosynA的小幅度的反應。這個結(jié)果顯示煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位亞單位與伴隨蛋白質(zhì)共同表達，即輔助蛋白能檢測具有影響a-6受體能力的化學試劑。將34E和30DcRNAs聯(lián)合注射卵母細胞顯示了對煙堿和spinosynA中等幅度的響應。這更進一步證明煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位與伴隨蛋白質(zhì)共同表達，即離子通道亞單位能夠檢測具有影響a-6受體能力的化學試劑。將34E、30D和ric-3cRNAs共同注射入卵母細胞顯示了對煙堿或spinosynA的高幅度響應。這更證明煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位與多個伴隨蛋白質(zhì)共同表達，能檢測具有影響a-6受體能力的化學試劑。結(jié)合試驗在昆蟲細胞中表達煙堿乙酰膽堿受體亞單位用標準的分子克隆技術(shù)將位于染色體2L30D的煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位的基因克隆到桿狀病毒載體pAcP(+)IEl-3(Novagen,Madison,WI)，用桿狀病毒介導其表達，產(chǎn)生重組病毒，將Sf9細胞稀釋到2mlSf90011SFM(Invitrogen,Carlsbad,CA)培養(yǎng)基中，按照8x105細胞/孔的密度，接種到6孔板上，27°C貼壁培養(yǎng)l小時。在12x75mm的聚苯乙烯的管中混合DNA/lipid的混合物，包括86pl無菌水、5^1濃度為0.1嗎4d載體、5^1BacPAK6Bsu361線性DNA(Clontech,PaloAlto,CA)禾卩4(ilBacfectin(Clontech,PaloAlto，CA)，室溫培養(yǎng)混合物15分鐘。在培養(yǎng)DNA/lipid混合物的過程中，棄掉貼壁培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基，加入新鮮的1.5ml培養(yǎng)基。然后將DNA/lipid混合物逐滴滴入到細胞上，同時要不斷的搖晃，27。C培養(yǎng)5小時。然后，再加入1.5ml的Sf900HSFM，27°C培養(yǎng)4-5days。用臺式離心機1000rpm5分鐘離心細胞混合物，棄去細胞碎片。將包含重組病毒(轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基)的上清收集到一個干凈的tube管中，4。C儲存。為了擴增重組病毒，以1x106細胞/ml的密度將50ml的SfP細胞加入到125ml的一次性錐形瓶中。向細胞中加入1ml的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，27。C140rpm培養(yǎng)48hours。48小時后，收集轉(zhuǎn)染混合物1000rpm離心5分鐘。將上清轉(zhuǎn)移到千凈的指定存放Pi病毒儲存的燒瓶中。為表達煙堿乙酰膽堿受體亞單位，50ml的SfP細胞按照2x106細胞/ml的密度接種到125ml的錐形瓶中。向細胞中加入lml的PiVh-US儲存液，27°C140rpm培養(yǎng)24hours。取100^1的樣品做Westernblot證明煙堿乙酰膽堿受體亞單位的表達，剩下的樣品用來作結(jié)合試驗。在D.Mel-2細胞中表達克隆的30DnAC小時a-6前面克隆得到的果蠅nAC小時a-6基因是用PCR方法，以在seqID.12和13引物的5'和3'末端加入Spel位點的擴增得到的。在s叫ID.12的5'端加入了Kozak翻譯起始序列增加30DnAC小時a-6在D.Mel-2細胞中的表達。將得到的PCR產(chǎn)物連接到pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad,CA)載體上并測序。除了引物處的引入的變化，與前面確定得到的nAC小時30D—致。用SpeI酶從pCR2.1-TOPO載體上切下目標基因，然后分別連接到Spel酶切和堿性磷酸酶處理的線性化pMT/V5-HisA和pIB/V5-HisA載體上。用限制性酶切和測序鑒定正確的克隆。用QiagenEndoFreeMaxikit(Qiagen，Valencia,CA)試劑盒大量提取質(zhì)粒。在D.Mel-2細胞中表達克隆的線蟲ric3用加入了Kozak翻譯起始信號的SeqID14和SeqID10引物PCR擴增前面得到了克隆的線蟲ric3基因。將得到的PCR產(chǎn)物連接到pCR2.1-TOPO載體上，并測序。此序列除了加入的Kozak序列與前述的序列一致。作為BamHI片段分離這個基因，將其分別連接到己經(jīng)用Bamffl酶切和堿性磷酸酶處理的pIB/V5-HisA和pMT/V5-HisA載體上。用限制性酶切和測序鑒定正確的克隆。用QiagenEndoFreeMaxikit試劑盒大量提取質(zhì)粒。在D.Mel-2細胞中瞬間表達果蠅nAC小時a-6基因?qū)⒃诤股?抗微生物劑的果蠅SFM中培養(yǎng)的D.Md-2細胞按照1.9x107細胞/燒瓶密度接種到75cm2燒瓶s上，27。C過夜培養(yǎng)。用12x75mm的聚苯乙烯管混合轉(zhuǎn)染混合物，包括1630pl無菌水、40嗎pIB/V5-HisA/ric3、40jigpIB/V5-HisA/30D和250^1CellFectin。輕微混合試劑，然后室溫培養(yǎng)15分鐘。在培養(yǎng)混合物的過程中，用10ml的新鮮的不含抗生素的果蠅SFM培養(yǎng)基洗滌細胞，然后棄掉這個培養(yǎng)基，加入不含抗生素的6ml新鮮的果蠅SFM培養(yǎng)基。向轉(zhuǎn)染混合物中加入4ml不含抗生素的果蠅SFM培養(yǎng)基，然后將這個混合物轉(zhuǎn)移到燒瓶中。上下吹打輕微混勻，27。C過夜培養(yǎng)。在D.Mel-2細胞中穩(wěn)定表達果蠅nAC小時a-6基因D.Mel-2細胞購于Invitrogen(Carlsbad,CA)，在125ml搖瓶中培養(yǎng)，需要50ml的體積。在包含5ml/L抗生素-抗維生物劑(100X)(Gibco,Carlsbad，CA)的果蠅SFM培養(yǎng)基，按照3x105細胞/ml的密度每周兩次傳代。將D.Md-2細胞按照5x105細胞/孔的密度接種到12孔板中，27°C過夜培養(yǎng)。在12x75mm的聚苯乙烯管中加入6嗎pIB/V5-HisA/ric3、82|_d無菌H20和12(ilCellFectin(Invitrogen，Carlsbad,CA)。輕微混合混合物，室溫培養(yǎng)15分鐘。在培養(yǎng)轉(zhuǎn)染混合物的過程中，棄掉細胞中的培養(yǎng)基，加入不含抗生素的lml新鮮的培養(yǎng)基。15分鐘后，棄去細胞培養(yǎng)基。向轉(zhuǎn)染混合物中加入0.5ml不含抗生素的培養(yǎng)基，然后將這個溶液加入到細胞中?；旌衔?7。C培養(yǎng)48小時。48小時后，用細胞刮從盤上刮下細胞，分到包含抗生素的2ml果蠅SFM培養(yǎng)基的6孔板的四個孔中。27°C貼壁培養(yǎng)1小時，棄去培養(yǎng)基，加入包含25(ig/ml殺稻瘟菌素S(BlasticidinS)(Invitrogen，Carisbad，CA)的新鮮培養(yǎng)基。27°C培養(yǎng)5天。5天后，刮掉細胞集中轉(zhuǎn)移到一個管中，臺式離心機中600rpm離心，棄去上清，用含25pg/ml殺稻瘟菌素S的50ml新鮮的果蠅SFM懸浮細胞，27。C/140rpm震蕩培養(yǎng)。細胞以3xlO、dls/ml的密度每周傳代兩次。篩選4周后，降低殺稻瘟菌素S的濃度到10|ig/ml。在篩選劑量下培養(yǎng)3個月，接種5x105細胞/孔到12孔板中，27。C過夜培養(yǎng)。三個12x75mm的聚苯乙烯管中都加入下面的試劑2嗎pMT/V5-HisA/30D、0.15嗎pCoHygro(Invitrogen,Carlsbad,CA)(表達質(zhì)粒和篩選質(zhì)粒的比例是40:1)、89pl無菌H20和12|ilCellFectin。輕微混合樣品，室溫培養(yǎng)15分鐘，然后按照上面所描述的方法轉(zhuǎn)染細胞。24小時后，棄去包含轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基，加入包含抗生素的1ml新鮮培養(yǎng)基，27°C培養(yǎng)另外24小時。從12孔板的三個孔中刮散細胞，平均分到兩個6孔板中。貼壁培養(yǎng)6小時后，向培養(yǎng)基中分別加入含有200、150、100或5(Hig/mlhygromycinB(潮霉素B)的2ml/孔的新鮮培養(yǎng)基。27°C繼續(xù)培養(yǎng)，每4-5天換含潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基。篩選培養(yǎng)兩周后，刮散200ng/ml潮霉素B篩選的細胞，輕微沉淀，用包含20(Hig/ml潮霉素B的25ml新鮮培養(yǎng)基懸浮，然后轉(zhuǎn)到125ml的搖瓶中。27。C140rpm繼續(xù)培養(yǎng)，在篩選劑量下擴增細胞。為了誘導30DnAChR的表達，臺式離心機630rptn5分鐘離心收集細胞。用不含潮霉素B，終濃度為600nM硫酸銅的新鮮培養(yǎng)基按照2x106細胞/ml密度懸浮細胞，27。C/140rpm培養(yǎng)24小時。制備轉(zhuǎn)化細胞為進行結(jié)合試驗，如下方法制備昆蟲細胞和cRNA注射的爪蟾卵母細胞在室溫下輕微離心昆蟲細胞。棄去上清，用冰冷的包含200mM蔗糖、10mM磷酸鹽緩沖液、1mMEDTA和1mMPMSF在pH7.2-7.4條件下洗滌兩次。用冰冷的儲存緩沖液稀釋最后得到的細胞沉淀，然后分裝，這些分裝的樣品在-8(TC儲存，準備做結(jié)合試驗。按照前面描述的用電生理學的方法注射爪蟾卵母細胞，完整細胞用于結(jié)合試驗。放射性配體置換結(jié)合試驗在結(jié)合試驗中用兩個主要的放射性配體傳統(tǒng)的(X7放射性配體、[3H]methyllycaconitine(MLA，甲基牛扁亭堿)和[3H]dihydrospinosynA(DHSA)。針對這兩個放射性配體要用包含10mM磷酸鈉(7.2-7.4)的結(jié)合緩沖液。用D.Mel-2細胞，所有試驗需要50nl細胞懸浮液。用爪蟾卵母細胞進行結(jié)合試驗，集合卵母細胞(2-5卵母細胞)，轉(zhuǎn)入lml的結(jié)合緩沖液中，輕微吹打結(jié)合緩沖液，換兩次新的結(jié)合緩沖液，洗去殘存的卵母細胞培養(yǎng)基。向每一個卵母細胞聚集中加入終體積為50-100^緩沖液。沒有標記的煙堿和spinosynA分別用100%的DMSO和100。/。的乙醇配制成終濃度為40mM，如果有需要可以室溫下超聲，而后可以用結(jié)合緩沖液再稀釋。溶劑的終濃度要維持在每孔小于0.1%。25^沒有標記的競爭性化合物加入到細胞懸浮液或卵母細胞中。用化合物對細胞或細胞抽提物在平的搖床輕微搖晃預處理15-30分鐘，如果是pH]DHSA則l(TC處理，如果是["H]MLA則室溫處理。在總體積為100ul的結(jié)合緩沖液中，向混合物中加入25^的l-10nM[3H]MLA或[3H]DHSA。分別在三個反應96孔微孔滴定板中重復進行試驗，用平的搖床輕微搖晃30-90分鐘，如果是[SH]DHSA則l(TC進行，如果是[3H]MLA則室溫下進行。用TomTec(CT)96-孑L細胞收集器，通過GF/C玻璃纖維濾器色片(fiberfiltermats)輕微真空分離結(jié)合放射性和游離放射性的細胞抽提物。對于用pH]DHSA進行的試驗，用0.5%的PEI(w/v，用去離子水稀釋)預浸濾器色片1-2小時，以減少非特異性結(jié)合。然而，對于用卩H]MLA進行的試驗，只要簡單的用包含2mg/mlBSA(pH7.2-7.4)的10mM的磷酸鈉緩沖液預浸濾器色片就可以了。用冰冷的結(jié)合緩沖液快速洗滌樣品三次，用60。C烤箱烘干濾器色片，用Meltilexsolid國scintillant(PerkinElmer，F(xiàn)inland)的WallacMicroBeta計數(shù)器(Counter)(Wallac，CT)計算三分鐘的樣品放射活性。在檢測整個卵母細胞的結(jié)合試驗的情況下，加入冰冷的結(jié)合緩沖液終止反應，然后兩次抽吸步驟，中間用結(jié)合緩沖液洗滌。將卵母細胞轉(zhuǎn)到包含7ml閃爍液雞尾酒溶液(scintillationcocktail)(UlitmaGoldMV，PackardBiosciences,CT)的閃爍瓶中漩渦，用液體閃爍計數(shù)器(liquidscintillationcounter)(Tri-carb2900TR,PackardBiosciences,CT)計數(shù)3分鐘0結(jié)果和討論表2用Dma6注射完整爪蟾卵母細胞后三天進行的^H]MLA結(jié)合<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>表2的結(jié)果顯示在煙堿存在下，[3H]MLA能夠置換(72°/。)Da6-煙堿受體的煙堿。與卵母細胞的功能相關(guān)的數(shù)據(jù)(如誘導)提供了spinosyn對爪蟾卵母細胞表達Da6煙堿受體的效果。此外，這些數(shù)據(jù)第一次公開了，spinosynA可以與在爪蟾卵母細胞表達的Da6煙堿受體中的卩H]MLA結(jié)合。在瞬間表達Da6煙堿受體的Sf9和S2細胞中觀察到[SH]MLA劑量依賴的置換試驗，表明這個試驗可以被用來進行高通量篩選和證實與Da6煙堿受體相互作用的化學試劑。如下面的Figure3所看到的，與D.Mel-2細胞中表達的Da6和線蟲的ric3的fH]DHSA結(jié)合可以促進卩H]MLA的整個結(jié)合(improvedovertheoverallbindingseenwith[3H]MLA)。Figure3.[3H]DHSA置換<formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>此外，使用^H]DHSA對D.Mel-2細胞進行藥理學觀察發(fā)現(xiàn)，天然的煙堿(nicotinicinnature)可被煙堿置換(nicotinicinnatureasdemonstratedbydisplacementbynicotine),而不旨g被毒蕈堿的試齊U如毒蕈堿和阿托品置換。盡管置換^H]DHSA結(jié)合，通過使用傳統(tǒng)的如MLA和ot-金環(huán)蛇毒的煙堿對抗物，可以在較高濃度表明，且這些配體和受體化合物的親和力相對很低。其它煙堿配體如吡蟲啉、地棘蛙素、噻蟲嗪、甲酰膽堿和山梗菜鹼不能明顯置換卩H]DHSA的結(jié)合。這個結(jié)合的進一步表征通過評估在^H]DHSA結(jié)合試驗中許多已知spinosym類似物的效果而進行。鼠李糖或呋塞米中沒有觀察到顯著的置換。spinosynA的pseudoagylcone也不能顯著置換。SpinosynA、dihydrospinosynA和spinosynA的許多生物學活性衍生物在I^H]DHSA結(jié)合試驗中可以顯著置換卩H]DHSA。這些數(shù)據(jù)進一步支持[SH]DHSA結(jié)合試驗可以用來預測配體和spinosynA的結(jié)合位點之間的相互作用，因此可以用于檢測結(jié)構(gòu)活性關(guān)系。此外，這些數(shù)據(jù)表明這個試驗/受體結(jié)合可以被用來發(fā)現(xiàn)新的與spinosyn靶點相互作用的試劑。制備果蠅30D-特異性(煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位)多克隆抗邇對所有已經(jīng)公布的昆蟲煙堿乙酰膽堿受體a亞單位序列利用VectorNTi程序的比對特性進行比對。證實了一個與30D編碼區(qū)367-380位氨基酸相符的15個氨基酸肽，其對于30D是唯一的。將SEQENCEIDNO:11的肽序列提交到ZymedLaboratoriesInc.(SanFrancisco,CA)可以獲得肽特定的多克隆抗體。用30D特異的抗體作為一抗，westernblot檢測確認宿主細胞中表達的煙堿乙酰膽堿a-6受體亞單位。這個30D特異抗體不能與表達的煙堿乙酰膽堿a-5受體亞單位或雞的(x-7受體亞單位的宿主細胞中分離的蛋白發(fā)生反應。發(fā)明的有機體用兩種方法對抗spinosynA的黑腹果蠅進行篩選。其中一個方法是，收集純合子遺傳型enbwdp的雄性果蠅，并在沒有雌性的情況下培養(yǎng)到2-5天(aged2-5)。雄性果蠅饑餓2-3小時，然后給予在1%蔗糖(w/v)中的40-50mM誘變劑的甲基磺酸乙酯(mutagenethyhnethanesulfonate)(EMS)溶液接近16小時。EMS處理后存活下來的雄性分別與能夠?qū)箂pinosynA的有無效等位基因煙堿乙酰膽堿ot-6受體亞單位(其賦予spinosynA抗性)的純合子雌性交配或者與基因型為C>(9//wG/"(CX)賦予spinosynA抗性)的雌性交配。交配后產(chǎn)的卵發(fā)育成成蟲。2-5天后，通過給果蠅喂食spinosynA，和同時在管形瓶中，其事先用溶解在5%蔗糖溶液中的lOOppmspinosynA溶液浸漬的濾紙覆蓋標準黑腹果蠅的培養(yǎng)液培養(yǎng)。在化合物處理36-96小時后，如果spinosynA對成蟲沒有顯示或者有很小的毒性，則對spinosynA有抗性的成蟲個體打分。被認定對spinosynA有抗藥性的成蟲與CyO/InGla遺傳型的果蠅雜交(cross),以用于同源第二個染色體。這些雜交的第二個染色體的后代如果還是純合子則繼續(xù)用spinosynA抗性進行篩選。第二種方法是，攜帶賦予spinosynA抗性的無效等位基因(foranullallelethatconfersspinosynAresistance)、禾口在Y染色體上帶有(熱休克頭(heat-shock-head)進化缺陷)轉(zhuǎn)基因的純合子的雄性黑腹果蠅(D.melanogaster)與攜帶賦予spinosynA抗性的無效等位基因純合子雌性交配。收集交配后產(chǎn)生的卵，使其發(fā)育，在5-6天后，將發(fā)育的幼蟲放到37t:培養(yǎng)2小時。這個熱休克處理使得產(chǎn)生的/2^基因異位和致死性表達。由于fe-W"結(jié)構(gòu)位于Y染色體上，所以只在雄性幼蟲發(fā)生熱休克后的死亡。因此，只有雌性幼蟲可以發(fā)育為成蟲。用這個方式收集的接近13,000未經(jīng)改變(virgin)雌性果蠅成蟲，其與大約4,000cmZw4純合子雄性交配，如前面所描述的這些雄性成蟲用EMS發(fā)生突變。收集交配后產(chǎn)生的篩選后的具有抗性的幼蟲，并把它們放到含有O.lppmspinosynA的培養(yǎng)基中。3天后對具有抗spinosynA的發(fā)育幼蟲打分，將這些打分的具有抗性的幼蟲移到新鮮培養(yǎng)基的管形瓶中，在無spinosynA處理下繼續(xù)培養(yǎng)。新出現(xiàn)的成蟲與CyO//"G/a遺傳型的果蠅雜交以同源產(chǎn)生(isogenizing)第二個染色體。這些雜交的第二個染色體的純合子后代繼續(xù)用spinosynA抗性進行篩選。用上面描述的兩種方法分離的編碼黑腹果蠅煙堿乙酰膽堿(x-6受體亞單位的大約10個突變的等位基因具有spinosynA抗性。分析這些等位基因揭示了幾種不同類型的突變。這些突變包括引入了一個提前終止密碼子、在基因序列編碼的多肽發(fā)生單個氨基酸的置換導致的突變，和影響mRNA剪切的突變。導入提前終止密碼子的例子是NCBI接收號No.NM205953的煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位，其編碼26位的谷胺酰胺CAA密碼子突變?yōu)榻K止密碼子TAA，引入了一個提前終止密碼子，從而對抗spinosynA。氨基酸置換的示例是NCBI接收號No.NM205953的煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位的168位半胱氮酸TGC密碼子變?yōu)榻z氨酸TCC密碼子，從而對抗spinosynA。mRNA剪切位點突變的示例是NCBI接收號No.NM205953的煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位在第四個內(nèi)含子的末端剪切受體位點發(fā)生突變，從TAGCGC變?yōu)門AACGC，從而對抗spinosynA。用突變的果蠅進行21-正巴比妥-spinosvn篩選分別預處理10個俄勒岡野生種的成年黑腹果蠅(5個雄性和5個雌性)和10個spinosyn抗性株的兩組成年果蠅。建立兩組(每組10個果蠅)進行預處理。用2:1的丙酮和水配制spinosynA和21-正巴比妥-spinosyn類似物的儲存液，濃度1000ppm，而后用10%蔗糖稀釋到所需要的濃度。從棉花心(接近1/4英寸)加入500ul的處理物處理管行瓶(或?qū)φ沼萌軇?，然后把果蠅放到每一個管形瓶中，用棉花心蓋上。處理后72小時監(jiān)測果蠅，期間在室溫下培養(yǎng)，要求12:12的白天和黑夜循環(huán)。結(jié)果處理后72小時所有的果蠅都死亡了。100ppm的spinosynA或21-正巴比妥spinosyn都足夠致死所有野生型的果蠅。在相同濃度下，卻沒有顯著致死具有spinosyn抗性的果蠅。劑量響應數(shù)據(jù)(即LD^)表明具有spinosynA抗性的果蠅對spinosynA的抗性比野生型果蠅至少高100倍。此外，spinosynA抗性果蠅比新分類的spinosyns如21-正巴比妥spinosyns的抗性大于100倍(基于LDs。)。這些數(shù)據(jù)顯示可以將spinosynA抗性的果蠅(即靶位點突變)用于篩選發(fā)現(xiàn)新的與spinosynAa-6煙堿性受體亞單位相互作用的新的化合物。盡管優(yōu)選的實施方案已經(jīng)解釋和描述的非常具體，對于相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以清楚的發(fā)現(xiàn)各種修飾、加入、減少等等的變化將不超出本發(fā)明的精神，并且這些也被認為是在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。LISTOFREFERENCESCITEDAltschuletal，JMolBiol215:403-410(1993).Andersonetal,CelMolNeurobiol13:503-515(1993).Aronsteinetal,PesticBiochem.Physiol48(3):229-233(1993).Ashburner，InFlyPushing:TheTheoryandPracticeofDrosophilamelanogastergenetics(1997)ColdSpringHarborPress,Plainview，N.Y.Ashburner,InDrosophilamelanogaster.ALaboratoryManual(1989),ColdSpringHarbor,N.Y"ColdSpringHarborLaboratoryPress:pp.299-418Ausubleet.al，InShortProtocolsinMolecularBiology,ThirdEdition's),Bayeretal,MethEnzym62:308(1979).Belletal,JBiolChem273:14309-14314(1998).Belloetal,Development125:2193-2202(1998).Bingham,Cell90(3):385國387(1997).BloomquistandSoderlund，MolPharmacol33:543-550(1988).Bowtelletal,PNASUSA88(15):6853-6857(1991).Bradleyetal，Nature309:255-258(1984).BrandandPerrimon,Development118:401-415(1993).Brandetal，MethodsCellBiol44:635-654(1994).Brinsteretal，PNAS82:4438-4442(1985).Bronsteinetal,inBioluminescenceandChemiluminescence:FundamentalsandAppliedAspects,pp.20-23,(A.K.Campbell,etal,eds.,JohnWiley&Sons,1994)Bumsetal，PNAS90:8033-8037(1993).Campbell,MonoclonalAntibodyTechnology:LaboratoryTec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cacaaccagcaactcacaacactgcaaccaa161ggagcttaagtacaaaacaccacagcaacattgcaagcga201gcagcacaatagccagcaacaggagccagcatcgaaggac241gaggatgtagccaaccacggtagaagcaatgaccagcaga281cgcatctgcs3C3gcteg3cagcagc肌cstgttgtcgcc321aaagacagccgcagcagcaactgctgccggcgatgaagca361acaacccaacaaccaacaaacataagactgtgtgcacgca401agcgacaacgattgcgtcgccgacgaaaaagaaaaccagc441aaccccaaacgaaacagatatcaagaaacaacagcaactt481agcatgcctcccttcaaaacgcgcaaatccacggacacct521acagcscaccagcagcaacaaccagctgtccgacagccac561ctacatgcaatgtcgagccagcgacaatgagttcagtatt601ccgatatcgagacatgatagagtatccacggccacattcg641cctgggtgttgcatgtgctgcaggtgctgctcgtgtcgct681gcaacagtggcaacttcacgtgcaacagcgatcggtgcta721ctgttcagaaggatcgcagcgagcaccatcgccttcattt761cctatttaggcagctttgcagcgcaactgaaaaatagcag801cagcagcagtagcagcagcaacagcagcaacaacagcagc841acgcaaatattaaacggacttaataaacactcatggatat881ttttattgatatatttgaatttatctgctaaagtttgcct921agcaggatatcatgaaaagagactgttacacgatcttttg961gatccttataatacactagaacgtcccgttctcaatgaat1001cggacccgttacaattaagctttggtttaactttaatgca1041aattatcgatgtggacgagaaaaatcaattgctagtcact1081aatgtgtggttaaaactggagtggaacgacatgaatctcc1121gctggaacacctccgactatggcggagttaaggatctgcg1161aataccgccgcatcgcatctggaagccggacgtgctgatg1201tacaacagtgcggatgagggatttgacggcacctaccaga1241cgaacgtggtggtgcggaacaacggctcgtgtctatacgt1281tccgccggggatcttcaagtcgacgtgcaagatcgacatc1321acgtggttccccttcgatgaccagcggtgcgagatgaagttcggcagttggacctacgacggattccagctggatttacaattacaagatgaaactggcggtgatatcagcagttacgtgctcaacggcgagtgggaactactgggtgtgcccggcaaacgtaacgagatctattacaactgctgcccggaaccctatatagacatcaccttcgccatcatcatccgccgacgaacactgtactatttcttcaacctgatcataccttgtgtactgattgcctccatggccttgctcgg3ttc3ccctgccgccsgattcgggtgaaaaattatcgctgggtgttaccatcttgctctcgctgaccgtgtttctgaatatggttgccgagacaatgccggctacttccgatgcggtgccattgctgggtacatatttcaattgcataatgtttatggtagcttcatccgttgtgtcaacgattttagtattaaattatcatcatcgaaatgctgatacgcacgaaatgtccgaatggatacgcatcgtgtttttgtgctggctgccatggatattgcgaatgagtcgcccaggacgaccgctgatcctagagtttccgaccacgccctgttcggacacatcctccgagcggaagcaccagatactctccgacgttgagctgaaagagcgctcgtcgaaatcgctgctggccaacgtactagacatcgatgatgacttccggcacaattgtcgccccatgacgcccggcgg犯cactgccacscaacccggctttctatcgcacggtttatggacaaggcgacgatggcagcattgggccaattggcagcacccgaatgccggatgcggtcscccatcatacgtgcatcaaatcatcaactgaatatgaattaggtttaatcttaaaggaaattcgctttataactgatcagctacgtaaagatgacgagtgcaatgacattgccaatgattggaaatttgcagctatggtcgttgacagactgtgccttatcatattcacaatgttcgcaatattagccacaatggctgtactactatcagcaccacatattattgtctcgtagSEQUENCEIDNO:21atgagcttcccacaaccgcactcattgccggaggccactgcaaacggtggcagaatgctg61gtctatggcctgggacttttaattatgataccggcttgtgcggctggaccccatgagaag121cggctactccacgcccttctggacaactacaacagcctggagcgtccggtggtcaatgaa181tccgatccattgcaactgagcttcggactaacactcatgcagattatcgatgtggacgaa241aagaatcaactgcttataacgaatatttggctcaaattggaatggaacgatatgaatctt301cgatggaattcgagtgagttcggtggtgtgcgggatctgcgaattccgccacatcgccta361tggaaaccggatgtactgatgtacaacagtgccgacgagggcttcgatggaacgtacgcc42lacaaatgtggtggttcgcaataatgggagctgtctgtacgtaccgccaggtatattcaag481tcaacgtgtaaaatcgacattacgtggtttccattcgacgatcagagatgtgaaatgaaa541tttggttcgtggacctacgatgggttteagttggacctgcagttgc鄉(xiāng)acgaagctggt601ggcgacatttctagctttataaccaatggcgaatgggacttgttaggtgtgcccggtaaa661cgaaatgaaatctactataattgctgcccagaaccttatattgacataacattcgccatt721ttgataaggcgcaaaacgttgtactattttttcaatctgattgtgccgtgcgtactgatc781gcctccatggcactgctagggtttacactgccaccagattctggtgaaaagctttcgctt841ggagttacaattctattatcgcttacagtcttcctcaacatggtggccgaaacaatgccg901gcgacctccgatgcggtaccgctgctcggaacttatttcaattgcattatgtttatggtg961gcctcatcagttgtgtcaaccatacttgtcctcaattatcatcatagaaatccagatacg1021catgaaatgagtgaatggataagagtaatattcctttattggttaccttgcatattgcgc1081atgcaaagacccggacaggttggctacgaatgtccgccgccgccctcttcttcgagttcc1141tccgcatccggcgagaagaagcaacagatccaaaacgttgagctaaaggagagatcctcc120laagtctctgctggccaatgtgctcgatatagacgatgatttccgatgcaatcatcgatgt1261gccagcgcgactttgccccaccagcccacatattacaggacgatgtacaggcaaggggat1321gacggcagcgtgggacccgtgggaccagctggtccagttgtggacgggcgtttgcacgag1381gccatttcccacacctgtctgacatcctctgcggagtacgaactggcgctgatactcaag1441gagctgcgttggataacagaacagctcaaaaaagaggacgaaacaagcgacattacgcga1501gattggaaatttgctgccatggtcgtcgatcgtttgtgccttattattttcaccttgttt1561actattatagcaaccctcgctgtactcttctcagcgccgcatttcattttcccgtaSEQUENCEIDNO:3ggatccatggactccccgctgccagcgtcgctSEQUENCEIDNO:4ggatccttattgcacgattatgtgcggagcggaSEQUENCEIDNO:5tctagacaccatgaaaaatgcacaactgaaactgactSEQUENCEIDNO:6tctagactacgagacaataatatgtggtgctgaSEQUENCEIDNO:7tctagacaccatgagcttcccacaaccgcactcaSEQUENCEIDNO:8tctagattacgggaaaatgaaatgcggcgctgaSEQUENCEIDNO:9ggatccatgccaaaaactgaacggcgtSEQUENCEIDNO:10ggatcctcaagtctttttaggtctccgcctSEQUENCEIDNO.:11SNRMKELELKERSSSEQUENCEIDNO.:12actagtcaccatggactccccgctgccagcgtcgSEQUENCEIDNO.:13actagtttattgcacgattatgtgcggagcSEQUENCEIDNO.:14ggatccaccatgccaaaaactgaacggcgt權(quán)利要求1.宿主細胞包括(i)核酸，其與編碼受體亞單位的具有NCBI接收號No.NM205953的基因的編碼區(qū)的第79-1485位之間的核酸序列有至少50％同一性；(ii)核酸，其編碼離子通道亞單位，其中該宿主細胞能夠?qū)pinosyn響應。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宿主細胞，其中該受體亞單位是煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宿主細胞，其是無脊椎動物細胞。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宿主細胞，其中編碼該受體亞單位的該核酸是包括選自下面序列的核酸(a)具有NCBI接收號No.NM205953的序列；(b)具有接收號No.NM205953的編碼來自于黑腹果蠅受體亞單位的剪切變異體的序列；(c)序列，由于遺傳密碼的簡并性，其編碼與(a)-(b)中定義的所述序列相同的氨基酸序列。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宿主細胞，其中編碼該離子通道亞單位的該核酸是由該宿主細胞內(nèi)源性產(chǎn)生的。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宿主細胞，其中編碼該離子通道亞單位的該核酸是編碼配體門控性離子通道亞單位的核酸。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細胞，其中編碼該配體門控性離子通道亞單位的該核酸選自編碼煙堿乙酰膽堿受體亞單位的核酸、編碼GABA受體亞單位的核酸、編碼5-羥色胺受體亞單位的核酸或編碼谷氨酸受體亞單位的核酸。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宿主細胞，其中編碼該離子通道亞單位的該核酸是編碼電壓門控性離子通道亞單位的核酸。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細胞，其中編碼該電壓門控性離子通道亞單位的該核酸選自編碼鈣、鈉、鉀或氯化物的電壓門控性離子通道亞單位的核酸。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細胞，其中編碼該煙堿乙酰膽堿受體亞單位的該核酸是包括選自下面序列的核酸(a)具有SEQIDNO:l的核酸序列；(b)核酸，其具有與具有SEQIDNO:l的基因的編碼區(qū)的第925-2424位之間的核酸序列至少50%同一性；(c)編碼煙堿乙酰膽堿受體亞單位的剪切變異體的核苷酸序列；(d)序列，由于遺傳密碼的簡并性，其編碼與(a)-(c)中定義的所述序列相同的氨基酸序列。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宿主細胞，進一步包括(Hi)編碼輔助蛋白的核酸。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的宿主細胞，其中編碼該輔助蛋白的該核酸是編碼無脊椎動物的輔助蛋白的核酸。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的宿主細胞，其中編碼該無脊椎動物的輔助蛋白的該核酸是包括選自下面序列的核酸(a)具有NCBI接收號No.NM068898的核酸；(b)序列，其具有與具有NCBI接收號No.NM068898的基因的編碼區(qū)的第1-1137位之間的核酸序列有至少36%的同一性；(c)編碼新桿狀線蟲(Caem^/2(3^/z'fee/egara)ric-3輔助蛋白剪切變異體的序列；(d)序列，由于遺傳密碼的簡并性，其編碼與(a)-(c)中定義的所述序列相同的氨基酸序列。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宿主細胞，進一步包括編碼離子通道亞單位的第二個核酸。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的宿主細胞，其中該第二個核酸是編碼煙堿a-7受體亞單位的核酸。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的宿主細胞，其中編碼該煙堿a-7受體亞單位的該第二個核酸是包括選自下面序列的核酸(a)核酸，其與具有SEQIDNO:2的基因的編碼區(qū)的第106-1617位之間的核酸序列有至少50%的同一性；(b)核酸，其編碼煙堿a-7受體亞單位，具有SEQIDNO:2;(c)編碼黑腹果蠅的煙堿a-7受體亞單位的該序列的剪切變異體;(d)序列，由于遺傳密碼的簡并性，其編碼與(a)-(c)中定義的所述序列相同的氨基酸序列。17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宿主細胞，其中編碼該受體亞單位的核酸包括載體。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的宿主細胞，其中該核酸可操作地連接于調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列確保該核酸在宿主細胞中表達。19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宿主細胞，其中編碼該離子通道亞單位的該核酸包括載體。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的宿主細胞，其中該核酸可操作地連接于調(diào)節(jié)序列，其中所述調(diào)節(jié)序列確保該核酸在該宿主細胞中表達。21.宿主細胞包括(i)核酸，其與編碼受體亞單位的具有NCBI接收號NO.NM205953的基因的編碼區(qū)的第79-1485位之間的核酸序列有至少50%的同一性；(ii)核酸，其編碼輔助蛋白，其中該宿主細胞能夠?qū)pinosyn響應。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的宿主細胞，其中該受體亞單位是煙堿乙酰膽堿受體a-6亞單位。23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的宿主細胞，其是無脊椎動物細胞。24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的宿主細胞，其中編碼受體亞單位的該核酸是包括選自下面序列的核酸(a)具有NCBI接收號No.NM205953的序列；(b)序列，其編碼黑腹果蠅的受體亞單位的剪切變異體，具有NCBI接收號No.NM205953;(c)序列，由于遺傳密碼的簡并性，其編碼與(a)-(b)中定義的所述序列相同的氨基酸序列。25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的宿主細胞，其中編碼輔助蛋白的該核酸是編碼無脊椎動物輔助蛋白的核酸。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的宿主細胞，其中編碼無脊椎動物輔助蛋白的核酸是包括選自下面序列的核酸(a)具有NCBI接收號No.NM068898的核酸；(b)序列，其具有與具有NCBI接收號No.NM068898的基因的編碼區(qū)的第1-1137位之間的核酸序列有至少36%的同一性；(c)編碼新桿狀線蟲ric-3輔助蛋白剪切變異體的序列；(d)序列，由于遺傳密碼的簡并性，其編碼與(a)-(c)中定義的所述序列相同的氨基酸序列。27.檢測化學化合物影響受體亞單位的能力的方法，包括下述步(a)將(i)核酸，其與編碼受體亞單位的具有NCBI接收號No.NM205953的基因的編碼區(qū)的第79-1485位之間的核酸序列有至少50%同一性；(ii)核酸，其編碼離子通道亞單位，體外導入宿主細胞，以表達該受體亞單位和該離子通道亞單位，其中該宿主細胞能對spinosyn響應；(b)將該受體亞單位暴露于化學化合物；(C)評估被暴露的受體亞單位以檢測該化學化合物是否影響該受體亞單位。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中該評估步驟包括監(jiān)測離子轉(zhuǎn)運。29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中該評估步驟包括檢測該化合物與該受體亞單位結(jié)合的親和力。30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中該化學化合物是化學化合物的混合物。31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中該宿主細胞是非洲爪蟾(Xewopw/aev^)的卵母細胞。32.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中該宿主細胞是昆蟲細胞系。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的昆蟲細胞系選自果蠅Schneider細胞系、果蠅Kc細胞系、Sf9細胞系或HighFive細胞系。34.檢測化學化合物影響受體亞單位能力的方法，包括以下步驟:(a)將(i)核酸，其與編碼受體亞單位的具有NCBI接收號No.NM205953的編碼區(qū)的第79-1485位之間的核酸序列有至少50%同一性體外導入宿主細胞，以表達該受體亞單位，其中離子通道亞單位由該宿主細胞內(nèi)源性產(chǎn)生和表達，其中該宿主細胞能對spinosyn響應；(b)將該受體亞單位暴露于化學化合物；(c)評估被暴露的受體亞單位以檢測該化學化合物是否影響該受體亞單位。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中該評估步驟包括監(jiān)測離子轉(zhuǎn)運。36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中該評估步驟包括監(jiān)測該化合物與該受體的結(jié)合親和力。37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中該化學化合物是化學化合物的混合物。38.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中該宿主細胞是非洲爪蟾卵母細胞。39.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中該宿主細胞是昆蟲細胞系。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述的昆蟲細胞系選自果蠅Schneider細胞系、果蠅Kc細胞系、Sf9細胞系或HighFive細胞系。41.檢測化學化合物影響受體亞單位能力的方法，包括以下步驟(a)將(i)核酸，其與編碼受體亞單位的具有NCBI接收號No.NM205953的基因的編碼區(qū)的第79-1485位之間的核酸序列有至少50%同一性；(ii)分離的核酸分子，其編碼輔助蛋白，體外導入宿主細胞，以表達該受體亞單位和該輔助蛋白，其中該宿主細胞能對spinosyn響應5(b)將該表達受體亞單位暴露于化學化合物；(C)評估該被暴露的受體亞單位以檢測該化學化合物是否影響該受體亞單位。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中該評估步驟包括監(jiān)測離子轉(zhuǎn)運。43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中該評估步驟包括檢測該化合物與該受體的結(jié)合親和力。44.檢測化學化合物影響受體亞單位能力的方法，包括以下步驟:(a)核酸，其與編碼受體亞單位的具有NCBI接收號NO.NM205953的基因的編碼區(qū)的第79-1485位之間的核酸序列有至少50%同一性；(ii)分離的核酸分子，其編碼輔助蛋白，體外導入宿主細胞，以表達該受體亞單位，其中該宿主細胞內(nèi)源性產(chǎn)生和表達輔助蛋白，其中該宿主細胞能對spinosyn響應；(b)將該被表達受體亞單位暴露于化學化合物；(C)評估該被暴露的受體亞單位以檢測該化學化合物是否影響該受體亞單位。45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中該化學化合物是化學化合物的混合物。46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中該宿主細胞是非洲爪蟾卵母細胞。47.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中該宿主細胞是昆蟲細胞系。48.特異結(jié)合多肽抗原表位的抗體，其中該多肽由與具有NCBI接收號No.NM205953的基因的編碼區(qū)的第79-1485位之間的核酸序列有至少50%同一性的核酸編碼，其中表達由該核酸編碼的該多肽的該宿主細胞能對spinosyn響應。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的抗體，其中該抗原決定簇來源于367-380位氨基酸，并且該核酸序列是具有NCBI接收號No.NM205953的核酸序列。50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的抗體，其中該抗體是單克隆抗體。51.包括基因突變的生物體，其中該基因的編碼區(qū)具有與具有NCBI接收號No.NM205953的基因的編碼區(qū)的第79-1485位之間的核酸序列至少50%的同一性，并且其中該生物體包括顯示出比其來源的親本生物體對spinosyn降低的反應性的突變。52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的生物體，其中該生物體是無脊椎動物。53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的生物體，其中該無脊椎動物是果蠅。54.根據(jù)權(quán)利要求51所述的生物體，其中該生物體的基因組的該基因是純合子。55.根據(jù)權(quán)利要求51所述的生物體是無脊椎動物。56.根據(jù)權(quán)利要求51所述的生物體是昆蟲。57.載體，包括(a)反義核苷酸序列，其實質(zhì)上互補于(1)具有NCBI接收號NO.NM205953的基因的編碼區(qū)的第79-1485位之間的核酸序列有至少50%同一性的DNA分子的相應部分；(b)調(diào)節(jié)序列，其與該反義核苷酸序列操作性連接，以便該反義核酸序列在其轉(zhuǎn)化的細胞中表達，并且其中該轉(zhuǎn)化細胞展現(xiàn)了比未轉(zhuǎn)化細胞對spinosyn降低的響應。58.轉(zhuǎn)化有根據(jù)權(quán)利要求57所述的載體的細胞。59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的細胞，其中該細胞是無脊椎動物細胞。60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的細胞，其中該無脊椎動物細胞是黑腹果蠅細胞或新桿狀線蟲細胞。61.篩選化合物的方法，包括下述步驟(a)把化合物給藥于轉(zhuǎn)基因生物體，該轉(zhuǎn)基因生物體包括由根據(jù)權(quán)利要求57所述的載體轉(zhuǎn)化的細胞，(b)觀察該化合物對該生物體的效應。62.用于篩選化合物活性的試劑盒，該試劑盒包括包括由根據(jù)權(quán)利要求57所述的載體轉(zhuǎn)化的細胞的轉(zhuǎn)基因生物體。63.篩選抗spinosyn的生物體的方法，包括步驟(a)從該生物體獲得核酸；(b)檢測核酸的序列，該核酸與具有NCBI接收號No.NM205953的基因的編碼區(qū)的第79-1485核酸序列有至少50%的同一性；(c)比較該檢測的序列和來自于對spinosyn易感的生物體的相同基因的序列，其中該被篩選的生物體和該對spinosyn易感的生物體是來源于同一個物種。64.篩選化合物的方法，包括下述步驟(a)把該化合物給藥于轉(zhuǎn)基因生物體，該轉(zhuǎn)基因生物體包括由根據(jù)權(quán)利要求57所述的載體轉(zhuǎn)化的細胞；和(c)觀測該化合物對該生物體的效果。65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中該生物體是脊椎動物。66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中該脊椎動物是魚。67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中該魚是斑馬魚。68.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中該脊椎動物是小鼠。69.檢測化學化合物影響受體亞單位能力的方法，包括以下步驟:(a)將載體，其包括(i)核苷酸序列，其與具有NCBI接收號No.NM205953的基因的編碼區(qū)第79-1485位的核酸序列有至少50%同一性的核苷酸序列；(ii)與該核苷酸序列操作性連接的調(diào)節(jié)序列，導入生物體的一個或多個細胞中，以至于該核苷酸序列在其轉(zhuǎn)化的至少一個或多個細胞中表達，并且其中該轉(zhuǎn)化細胞展現(xiàn)了比未轉(zhuǎn)化細胞對spinosyn增強的響應。(b)將該被轉(zhuǎn)化細胞表達的該受體亞單位暴露于化學化合物；(C)評估該被暴露的受體亞單位以檢測該化學化合物是否影響該受體亞單位。70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中該轉(zhuǎn)化細胞包括組織培養(yǎng)物。71.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中該轉(zhuǎn)化細胞包括完整的生物體。全文摘要本申請屬于鑒定和表征新的殺蟲靶位的領(lǐng)域，特別是涉及宿主細胞，檢測和其抗體。文檔編號G01N33/94GK101180543SQ200680005904公開日2008年5月14日申請日期2006年2月23日優(yōu)先權(quán)日2005年2月23日發(fā)明者G·B·沃森,G·D·古斯塔夫松,J·M·哈斯勒,K·R·庫克,N·奧爾,S·舒安德,V·L·薩爾加多,耿超賢申請人:美國陶氏益農(nóng)公司