專利名稱：：使用生化標(biāo)志的肝脂肪變性診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供一種通過(guò)使用可方便檢測(cè)的生物學(xué)標(biāo)志的血清濃度來(lái)檢測(cè)患者的肝脂肪變性程度的新診斷方法，具體而言針對(duì)患有涉及肝脂肪變性的疾病的患者，或者針對(duì)已經(jīng)作出肝纖維化和/或存在肝壞死性炎癥損傷的陽(yáng)性診斷測(cè)試的患者。本發(fā)明也提供了實(shí)施本方法的診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
：脂肪肝，也稱肝脂肪變性，定義為脂肪在肝細(xì)胞中的過(guò)量積累(BravoAA，等.N.Engl.J.Med.2001:344;495-500;AnguloP.N.Engl.J.Med.2002Apr18;346(16):1221-31)。脂肪肝疾病涉及甘油三酸脂在肝細(xì)胞中的積累、肝細(xì)胞的壞死、炎癥(DayCP.BestPract.Res.Clin.Gastroenterol.2002;16:663-78;BrowningJD,Horton瓜J.Clin.Invest.2004;114:147-52)、肝小靜脈閉塞和經(jīng)常出現(xiàn)的纖維化，有時(shí)發(fā)展到肝硬化、肝細(xì)胞癌癥和與肝相關(guān)的死亡(El-SeragHB,等.Gastroenterology2004;126:460-468,Dam-LarsenS,等.Gut2004;53:750-5)。肝脂肪變性在世界范圍內(nèi)的罹患率是非常高的，其與幾個(gè)因素有關(guān)，比如酒精、糖尿病、超重、高血脂、胰島素抵抗、丙型肝炎基因3型、無(wú)p脂蛋白血癥和一些藥物(BellentaniS,等.Ann.Intern.Med.2000;132:112-7;LevitskyJ,MailliardME.Semin.LiverDis.2004;24:233-47)。非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)Alf臟對(duì)于可引起非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的胰島素抵抗的適應(yīng)性應(yīng)答，其自身可誘導(dǎo)纖維化應(yīng)答從而導(dǎo)致肝石更化(DayCP.BestPract.Res.Clin.Gastroenterol.2002;16:663-78)。在酒精性肝病的患者中(SorensenTI，等.Lancet.1984;2:241-4),慢性丙型肝炎(FabrisP,等.J.Hepatol.2004;41:644-51),以及可能在乙型肝炎患者中(PhillipsMJ,等.Am.J.Pathol.1992;140:1295-308)，肝脂肪變性的存在也與纖維化的U有關(guān)，帶有或者不帶有相關(guān)的壞死性炎癥損傷(酒精性或病毒性肝炎)。對(duì)于肝脂肪變性診斷沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)建議。通常推薦檢測(cè)GGT和ALT,并進(jìn)行肝活檢，以進(jìn)行分級(jí)和分期(BellentaniS,等.Ann.Intern.Med.2000;132:112-7;LevitskyJ，MailliardME.Semin.LiverDis.2004;24:233-47;BravoAA,等.N.Engl.J.Med.2001:344;495-500)。因?yàn)楦位顧z仍然是一個(gè)侵入性和昂貴的程序，并且可能取樣錯(cuò)誤，所以擁有一種快速且容易實(shí)施的檢測(cè)是有利的，該檢測(cè)將對(duì)患者的肝脂肪變性水平提供良好的預(yù)測(cè)值。對(duì)于纖維化的診斷，非侵入性的FibroTest(FT)(Biopredictive,ParisFrance,US專利號(hào)6,631,330)已證實(shí)可在慢性丙型肝炎(PoynardT,等.CompHepatol.2004;3:8)和乙型肝炎(MyersRP,等.JHepatol.:20(B;39:222"30)以及最近在酒精性肝病(CallewaertN，等.NatureMed2004;10;1匪6;NaveauS，等.ClinGastroenterolHepatol,印刷中)中作為替代標(biāo)志。然而，迄今為止，沒(méi)有研究表明單一生物學(xué)標(biāo)志或者一組生物學(xué)標(biāo)志可用作肝活檢的替代方案，用于在最普通的病因酒精性、病毒性肝炎和NAFLD中，診斷肝脂肪變性。因此，需要開(kāi)發(fā)一種診斷方法，其給出患者肝脂肪變性程度的良好預(yù)測(cè)值，并且足夠可靠到減少肝活檢的需求。此方法對(duì)于患有涉及肝脂肪變性的疾病的患者或者對(duì)于已經(jīng)作出肝纖維化或壞死性炎癥損傷的陽(yáng)性診斷測(cè)試的患者來(lái)說(shuō)，是特別有利的，以使得治療適應(yīng)于患者的確+刀疾病。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種診斷方法，其預(yù)期性地評(píng)估用以診斷肝脂肪變性的簡(jiǎn)單血清生化標(biāo)志的組合的預(yù)測(cè)值，具體而言是針對(duì)患有涉及肝脂肪變性的疾病的患者或者已經(jīng)作出肝纖維化和/或存在肝壞死性炎癥損傷的陽(yáng)性診斷測(cè)試的患者的肝臟。在高陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(顯著的肝脂肪變性的預(yù)測(cè))或者陰性預(yù)測(cè)值的范圍內(nèi)，活檢適應(yīng)癥的數(shù)量可得到降低。這就降低肝活檢的成本和風(fēng)險(xiǎn)的目的而言對(duì)于患者和社會(huì)都是有益的。圖1:所分析的以及包括在訓(xùn)練組與mi組中的患者的流程圖。圖2:SteatoTest、GGT(IU/L)和ALT(IU/L)與肝脂肪變性分級(jí)之間的相關(guān)性。有凹口的箱線圖顯示訓(xùn)練組中的關(guān)系(圖2A);!Hi組l中的關(guān)系，治療前的HCV患者(圖2B);發(fā)遮組2中的關(guān)系，治愈的HCV患者(圖2C);發(fā)汪組3中的關(guān)系，酒精性肝病(圖2D);以及對(duì)照組中的關(guān)系，禁食和不禁食健康志愿者以及不禁食供血者(圖2E)。每個(gè)箱內(nèi)部的水平線代表中位數(shù)和每個(gè)箱的寬度中位數(shù)±1.57四分位間距/A以評(píng)估組中位數(shù)之間95%的顯著性水平。陰影箱M蓋代表統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。每個(gè)箱上方和下方的水平線包含四分位間距(從第百分之25位數(shù)到第百分之75位數(shù))，從箱末端出發(fā)的垂直線包含相鄰值(較上的第百分之75位數(shù)加1.5倍的四分位數(shù)間距，較下的，第百分之25位數(shù)減1.5倍的四分位數(shù)間距)。在驗(yàn)證組3中，幾乎所有患者都具有脂肪變性，組S0和S1結(jié)合。圖3:在結(jié)合了對(duì)照組、訓(xùn)練組、驗(yàn)證組的整合數(shù)據(jù)庫(kù)中，SteatoTest、GGT(IU/L)和ALT(IU/L)與肝脂肪變性級(jí)別的相關(guān)性。陰影箱未覆蓋代表中位數(shù)間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。通過(guò)針對(duì)所有平均數(shù)間成對(duì)差異的Tukey-Kramer多重對(duì)比檢驗(yàn)，顯示所有級(jí)別之間都具有顯著性差異(P<0.05)。對(duì)于GGT和ALT，在"無(wú)脂肪變性，，和"<5%，，之間，以及"5-33%"和"33-100%"之間無(wú)顯著性差異。對(duì)于ALT,在"無(wú)脂肪變性"和"5-33%"、"<5%"和"5-33%"之間也無(wú)顯著性差異。具體實(shí)施例方式因此本發(fā)明提供了對(duì)患者或者對(duì)來(lái)自患者的血清或血漿樣品進(jìn)行肝脂肪變性診斷的方法，其包括以下步驟a)通過(guò)檢測(cè)在所述患者的血清或血漿中的濃度值，來(lái)研究5個(gè)生化標(biāo)志，其中所述標(biāo)志是-ApoAl(載脂蛋白Al),畫(huà)01.2畫(huà)巨球蛋白，-ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)，-GGT(，谷氨酰轉(zhuǎn)肽基酶)，和-甘油三酸酯；b)研究一個(gè)臨床標(biāo)志，其選自下組體重指數(shù)(體重/身高2)、腰圍、和(腰圍/臀圍)比值；c)將所述值通過(guò)包含所述標(biāo)志的邏輯函數(shù)(logisticfunction)相結(jié)合以獲得最終值，其中所述邏輯函數(shù)通過(guò)下述方法獲得i)將一群患者根據(jù)他們疾病的程度分到不同的組中；ii)通過(guò)線性分析確定在這些組之間有顯著性差異的因素；iii)邏輯回歸分析以評(píng)估用于診斷肝脂肪變性的標(biāo)志的獨(dú)立區(qū)別值；iv)通過(guò)將這些確定出的獨(dú)立因素相結(jié)合，建立邏輯函數(shù)；和d)分析所述邏輯函數(shù)的所述最終值，以確認(rèn)所述患者存在肝脂肪變性。肝脂肪變性可與多個(gè)因素相關(guān)，比如酒精、糖尿病、超重、高血脂、胰島素抵抗、丙型肝it基因型3、無(wú)p脂蛋白血癥和一些藥物。具體而言，本發(fā)明涉及酒精性與非酒精性脂肪變性的診斷。根據(jù)定義，就區(qū)別而言的最佳指標(biāo)("脂肪變性評(píng)分")，是結(jié)合了這些獨(dú)立因素的邏輯回歸函數(shù)。通過(guò)結(jié)合如在邏輯回歸中單獨(dú)確定的每個(gè)參數(shù)的相對(duì)權(quán)重，獲得邏輯函數(shù)，在所述標(biāo)志與肝脂肪變性的階段存在負(fù)相關(guān)時(shí)帶有負(fù)號(hào)。對(duì)于其值具有非常大的范圍的標(biāo)志，使用對(duì)數(shù)。借助于接收者工作特征(ROC)曲線對(duì)邏輯函數(shù)的性質(zhì)進(jìn)行分析，該曲線是根據(jù)診斷所需的閾值獲得的。獲得ROC曲線的方法在實(shí)施例中有所描述。在本發(fā)明中，根據(jù)肝脂肪變性的不同級(jí)別來(lái)對(duì)患者分類(無(wú)=0%、輕度=1-5%、中度=6-32%、以及(顯著的和重度)-33-100%，其中每個(gè)百分?jǐn)?shù)指脂肪變性中涉及的肝細(xì)胞的百分?jǐn)?shù))，但是如果只是對(duì)顯著的或重度級(jí)別的患者診斷，可以有所改變。這將導(dǎo)致另一條ROC曲線。對(duì)于患者是否存在肝脂肪變性的診斷可通過(guò)有關(guān)人群中肝脂肪變性的預(yù)期罹患率的數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)一步精確化。邏輯函數(shù)可進(jìn)一步包含其它的臨床或生化標(biāo)志。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，邏輯函數(shù)還包含患者的年齡和性別。在另一個(gè)實(shí)施方案中，邏輯函數(shù)也可包含其它生化標(biāo)志，比如總膽紅素、結(jié)合珠蛋白、AST(天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、葡萄糖和(膽固醇或HDL-膽固醇)。優(yōu)選地，邏輯函數(shù)將包含這些其它生化標(biāo)志的至少1或2個(gè)、更優(yōu)選地3到5個(gè)。更優(yōu)選地，邏輯函數(shù)還可包含總膽紅素、結(jié)合珠蛋白、葡萄糖和膽固醇。根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟a)中所計(jì)量的生化標(biāo)志是"簡(jiǎn)單的"生化標(biāo)志，其意味著它們可容易地使用本領(lǐng)域已知的方法計(jì)量(色譜、電'泳、ELISA實(shí)驗(yàn)......)?？赏ㄟ^(guò)如實(shí)施例中所述的統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算出邏輯函數(shù)中的不同系數(shù)，該系數(shù)用于針對(duì)不同標(biāo)志所獲得的值。具體而言，可用于實(shí)施本發(fā)明方法的合適的邏輯函數(shù)如下f-al-a2.[年齡(歲)+a3.[載脂蛋白Al(g/L)]-a4[體重指數(shù)(體重/身高2)]+a5丄og[.a,2-巨球蛋白(g/L)卜a6丄og[ALT(丙氨酸^J^轉(zhuǎn)移酶)(IU/L)]-a7丄og[總膽紅素(nmol/L)]-a8.[膽固醇(mmol/L)-a9丄og[GGT谷氨酰轉(zhuǎn)肽基酶)(IU/L)-al0.[葡萄糖(mmol/L)-all丄og[結(jié)合珠蛋白(g/L)-al2.[甘油三酸酯(mmol/L)+al3.[性別(女性=0，男性=1)，其中a包括在區(qū)間[6.68805-x%;6.68805+x%]中，a2包括在區(qū)間[1.55337E-02-x%;1.55337E-02+x%]中，a3包括在區(qū)間[1.161531-x%;1.161531+x%]中，a4包括在區(qū)間中,a5包4#在區(qū)間[1.74791-x%;1.74791+x%]中，a6包括在區(qū)間中，a7包括在區(qū)間中，a8包括在區(qū)間中，a9包才舌在區(qū)間[1.17922-x%;1.17922+x%]中，a10包括在區(qū)間[1.46963-x%;1.46963+x°/。]中，al1包括在區(qū)間中，a12包括在區(qū)間[1.17926-x%;U7926+x%]中，和a13包括在區(qū)間中."區(qū)間[a-x。/。;a+x。/。]"意為區(qū)間[(100-x)/100.a;(100+x)/100.a。優(yōu)選地，x是最多卯、80或70，更優(yōu)選地最多60、50或40,甚至更優(yōu)選地最多30、20、10或5。所有系數(shù)ai保留5位小數(shù)。例如，對(duì)于x等于卯，a13包括在區(qū)間-0.11889.[體重指數(shù)(體重/身高2)+1.74791丄(^[.01.2-巨球蛋白(g/L)l-0.96453丄og[ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)(IU/L)]-0.11958丄og[總膽紅素(jimol/L)-0.68125丄og[膽固醇(mmol/L)畫(huà)1.17922丄og[GGT(，谷氨酰轉(zhuǎn)肽基酶)(IU/L)-1.46963丄og[葡萄糖(mmol/L)-0.34512丄og[結(jié)合珠蛋白(g/L)-1.17926丄og[甘油三酸酯(mmol/L)+0.35052.[性別(女性=0，男性=1)]。根據(jù)使用邏輯函數(shù)對(duì)生物學(xué)標(biāo)志值進(jìn)行分析所獲得的最終值，可以對(duì)患者是否存在肝脂肪變性得出結(jié)論。也可以通#ROC曲線圖上將所述級(jí)別作為閾值，從而確定肝脂肪變性的級(jí)別。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如前所述的方法，其中邏輯函數(shù)的最終值另外用于診斷肝脂肪變性級(jí)別。根據(jù)肝活檢的組織學(xué)特征定義肝脂肪變性的不同級(jí)別。肝脂肪變性級(jí)別的更確切定義在實(shí)施例1中給出。根據(jù)本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括預(yù)測(cè)疾病發(fā)展的步驟，其基于從邏輯函數(shù)的最g推斷出的肝脂肪變性級(jí)別。具體地，臨M為0.30時(shí)的脂肪變性評(píng)分具有非常高的靈敏度，根據(jù)不同組(表4)其范圍為85%到100%，臨界值為0.70時(shí)脂肪變性評(píng)分具有非常高的特異性，其范圍為83%到100%。另外，如對(duì)于Fibrotest(Poynard2004ClinChem2004)已證實(shí)的，在Steato-評(píng)分與活檢之間的許多不一致是由于活檢的誤差(小樣本尺寸)造成的。預(yù)期本發(fā)明的方法將降低超過(guò)80%的肝活檢的需求。臨床醫(yī)生首次可對(duì)導(dǎo)致肝硬化或者解釋肝測(cè)試異常的主要組織學(xué)特征作出評(píng)估針對(duì)脂肪變性的脂肪變性評(píng)分、針對(duì)纖維化的纖維化評(píng)分(FibroTest，Biopredictive,巴黎，法國(guó))、針對(duì)慢性丙型和乙型肝炎的壞死性炎癥特征的活性評(píng)分(ActiTest，Biopredictive，巴黎，法國(guó))。活檢應(yīng)只在如針對(duì)纖維化評(píng)分(FibroTest)的描述出現(xiàn)無(wú)法解釋的成分時(shí)，即急性炎癥、Gilbert綜合征或'溶血(PoynardClinChem2004)情況下，做為第二線的標(biāo)士根據(jù)本發(fā)明，從邏輯函數(shù)的最終值推斷出的肝脂肪變性級(jí)別對(duì)于醫(yī)師根據(jù)疾病的階段選擇對(duì)患者合適的治療也是非常有價(jià)值的。所述肝脂肪變性級(jí)別也可被醫(yī)師用于決定是否對(duì)患者實(shí)施肝活檢。根據(jù)所調(diào)查的患者人群中肝脂肪變性的罹患率，使用本發(fā)明方法獲得的數(shù)據(jù)可用于決定對(duì)患者實(shí)施肝活檢的必要性。預(yù)期本發(fā)明的方法將降低約80%對(duì)肝活檢的需求。本發(fā)明的方法旨在用于患有涉及肝脂肪變性的任何疾病的患者，肝脂肪變性可狄成肝硬化。"涉及肝脂肪變性的疾病"意為任何可導(dǎo)致肝脂肪變性t艮的疾病。具體地，實(shí)施本發(fā)明的方法有利地用于對(duì)患有下列疾病的患者進(jìn)行肝脂肪變性檢測(cè)乙型和丙型肝炎、酒精中毒、血色素沉著病、代謝疾病、糖尿病、肥胖癥、自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、.a.l-抗胰蛋白酶缺乏癥、Wilson病。本發(fā)明的方法特別旨在用于已經(jīng)進(jìn)行過(guò)肝纖維化和/或肝壞死性炎癥損傷存在情況的診斷測(cè)試的患者。更優(yōu)選地，本發(fā)明的方法旨在用于已經(jīng)進(jìn)行過(guò)FibroTest/Acti-Test診斷測(cè)試的患者，如美國(guó)專利6,631,330所描述，此處通過(guò)參考引入本文。本發(fā)明也涉及診斷患者肝脂肪變性的試劑盒，其包含用于在給用了生化標(biāo)志之后確定所述患者是否存在肝脂肪變性的:^兌明書(shū)。所述說(shuō)明書(shū)可包含邏輯函數(shù)，其必須在確定了生化標(biāo)志的量之后使用。它可以是打印出來(lái)的支持材料，也可以是計(jì)算機(jī)可用的支持材料，比如軟件。所述說(shuō)明書(shū)還可包含取決于所尋找的閾值的ROC曲線，其允許對(duì)從邏輯函數(shù)獲得的最g進(jìn)行分析。它們也可包含不同的表格，以允許獲得預(yù)測(cè)值，這取決于患者人群中預(yù)期的肝脂肪變性罹患率。根據(jù)本發(fā)明的診斷試劑盒也可包含使得可以給用所關(guān)注的生物學(xué)標(biāo)志的元件。所述診斷試劑盒也可包含對(duì)肝脂肪變性的不同級(jí)別(無(wú)=0%,輕度=1-5%,中度=6-32%，顯著的=33-66%，重度=67-100%)以及其它中間級(jí)別進(jìn)行量化的i兌明書(shū)。本發(fā)明的方法可容易地進(jìn)行自動(dòng)化操作，標(biāo)志的給用自動(dòng)實(shí)施，數(shù)據(jù)4皮傳送到計(jì)算機(jī)或計(jì)算器，其將計(jì)算邏輯函數(shù)的值并借助于ROC曲線對(duì)其進(jìn)行分析，最終獲得在患者人群中肝脂肪變性的罹患率。因此醫(yī)師所獲得的數(shù)據(jù)更容易做出判斷，并且將允許對(duì)決定是否需要活檢或給予充分治療的過(guò)程進(jìn)行改進(jìn)。以下實(shí)施例意在描述本發(fā)明的一個(gè)方面，并給出了一套方法用以重復(fù)本發(fā)明的方法，但是不應(yīng)限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1患者與方法1.1.患者具有可用血清、一致的肝活檢、以及血清和活檢之間持續(xù)時(shí)間短于3個(gè)月的連續(xù)患者包含在內(nèi)(圖l)。非引入標(biāo)準(zhǔn)包括血清不可用、活檢不可用、以及活檢和血清的收集間隔超過(guò)3個(gè)月的患者。分析在第一組(訓(xùn)練組)實(shí)施，并且在3個(gè)不同的組(驗(yàn)汪組)進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)于此特定分析，回顧地包括訓(xùn)練組患者，但是在之前2000年9月到2004年8月的Fibrotest預(yù)期!Hi研究中已進(jìn)行了分析(PoynardT，等.Comp.Hepatol.2004;3:8;MyersRP,等.JHepatol.2003;39:222-30;RatziuV,等.H叩atology2003;38:510A)。他們都是在DepartmentofHepato-GastroenterologyofGroupeHospitalierPiti6-SalparBre，因?yàn)榛加蠳AFLD、丙型肝炎、乙型肝炎和酒精性肝病而住院的患者。對(duì)!HiE組1的患者(丙型肝炎患者)進(jìn)行回顧分析，其來(lái)源于一項(xiàng)對(duì)患有慢性丙型肝炎患者的肝脂肪變性的研究(PoynardT，等.Hepatology.2003;38:75-85)。為了這個(gè)目的，用于進(jìn)行PEG-IFN和Ribavirin的預(yù)期多中心隨機(jī)試驗(yàn)的先前未治療的患者包括在內(nèi)。使用基線處的生物學(xué)標(biāo)志和活檢結(jié)果。發(fā)汪組2的患者(未檢測(cè)出HCV的以前的丙型肝炎患者)是與驗(yàn)證組1中相同隨機(jī)試驗(yàn)的患者(PoynardT,等.Hepatology.2003;38:75-85)，其已經(jīng)"治愈"且病毒應(yīng)答不變，意味著在治療結(jié)束后24周檢測(cè)不到HCVRNA。使用治療結(jié)束后24周進(jìn)行的生物學(xué)標(biāo)志和活檢結(jié)果。此組是作為NAFLD的驗(yàn)汪組，因?yàn)榭赡艿牟《局咀冃砸呀?jīng)^皮所述治療治愈(PoynardT，等.Hepatology.2003;38:75-85)。回顧地包含發(fā)汪組3的患者(酒精性肝病患者)以用于該特定分析，但那時(shí)其預(yù)期地包含在1998年到2000年間的一群酒精中毒患者中，其一個(gè)主要的終點(diǎn)為生化標(biāo)志的鑒定。該群體的細(xì)節(jié)最近公布在FibroTest的！Hi研究中(NaveauS，等.Clin.Gastroenterol.Hepatol.2005印刷中)。所有的住院患者都是在Hepato-GastroenterologyDepartmentofH6pitalAntoineB6cl6re,因?yàn)榛加芯凭愿尾〉牟l(fā)癥而住院。不同組的患者特征在表1中列出。特征訓(xùn)練組驗(yàn)證組2驗(yàn)證組3HCV酒精性HCV已治愈的肝病患者數(shù)量3107120162活檢的年齡(歲)48.902,4)44.1(7.2)43.6(8.0)46.6(9.8)男性201(65%)川(65%)122(61%)47/62(76%)女性109(35%)60(35%)79(39%)15(24%)BMI(kfi/m2)25.4(5.1)27.7(5.0>26.5(4.8)24.2(4.1)活檢質(zhì)量長(zhǎng)度17.0(6.2)16.6(15.5J17.0(8.2)13.5(6.8)長(zhǎng)度>=15隱205(67%)82(48%)96(48%)15(24%)片段數(shù)量2.5口.3>--1.9(1.6)一個(gè)片段128/278(46%)--37(60%)活檢-血清持續(xù)時(shí)間，均值(天數(shù)范圍)(0-30)40(0-90)11(<M5)7(0-14)肝臟風(fēng)險(xiǎn)因素H(V21，(68%)171(100%)0(0%)0(0%)HBV18(6%)0(0%)0(0%)0(0%)NAFLD69(22。/。)0(0%)0(0%)0(0%)ALD12(4%)0(0%)0(0%)0(0%)每日^ft7v酒精^50g/day34/236(14%)0(0%)0(0%)62(100%)已治愈的HCV感染0(0%)0(0%)20，(100%)0(0%)代謝因素BM1>=27.092(30%)88(51%)77(38%)14(23%)葡萄糖>=6.0mmol/L63(20%)30(18%)27(13%)20(32%)4油三酸酯>=1.7i"moI/L67(22%)36(21%)54(27%)20(32%)月旦固醇>=6.0mmol/L61(20%)12(7%)26(13%)23(37%)代謝因素每個(gè)患者帶有的數(shù)量無(wú)132(43%)60(35%)96(48%)17(27%)一種101(33%)64(37%)72(週)20(32%J兩種52(17%)39(23%)31(15%)19(310/0)三種22(7%)S(5%)0(0%)5(8%)四種3(1%)0(0%)2(1%)1(2%)肝脂肪變性分級(jí)無(wú)(0%)130(42%)58(3,116(58%)2(3%)輕度(得分1-5%)40(13%)68(40%)63(31%)2(3%)中度(得分6-33%)69(22%)35(20%)17(8%)42(68%)顯著的(得分34-66。/。)36(12%)7(4%)4(3%)12(19%)重度(得分67_100%)35(11%)3(2%)1(0.5%)4(7%)活檢中的肝纖維化階段R)無(wú)62(20%)0(0%)16(S%)8(13%)n不帶有隔的纖維化127(41%)102(60%)1.36(68%)23(37%)F2少量隔52(17%)39(2，33(16%)11(18%)F3大量隔36(1，％)19(11%)9(4%)7(11%)F4硬化33(11%)11(6%)7(3%)13(21%)標(biāo)志(正常范圍)ASTIU/L(17-27女性；20-32男性)83(159)82(57)23(9)89(83)ALTU/L(11-26女性；16-35男性)109(14>118(94)19(10)72卿總膽紅素mol/L(l-21)14.8(2&2)U.l(4.8)8.8(4.6)21.5(9.6)GGTU,L(7-32女性；1149男性)112(183〉84(96)21(18)323(443>2巨球蛋白g/L(女性卜6"40;男性l-4-W^2.4(1.0>3.1(1.2)2.0(0.8)1.8(0.5}ApoAlg/L(卜2-l-7)1.4(0J)1.3(0.3)，■2(0.3)1.5(0.5)結(jié)合珠蛋白g/L(0.35-2.00)*0.95(0.57)0.78(0.45>0.86(0.43)1.39(0.63)5.5(3.2)5.4(1.2)5.3(1.0)5.8(1.6)膽g砵(mmol/L)4.9(1.3)4,5(1.0)5.0(1.0)5.4(1.9)甘油三酸酯(mmol/L>1.5(1,4)1.41.6(1.0)1.9(3.1)FibroTest0'42(0.28)0.47(0.26)0.29(0,20)0.43(0.28)SteatoTest0.49(0,25)0.53(0.22)0.36(0.22)0.58(0.25)數(shù)據(jù)是均值(SD)或比例。AST-天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。AU^丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。GGT-谷氨酰轉(zhuǎn)肽基酶。ApoA^栽脂蛋白al表l:所包含患者的特征也對(duì)對(duì)照組進(jìn)行了分析。它由禁食和未禁食的表面健康志愿者(之前包含在FibroTest的驗(yàn)證中(MunteanuM,等.Comp.Hepatol.2004;3,3))以及另外的未禁食供血者組成。1.2.血清才示志用不同的組對(duì)10個(gè)下述的生化標(biāo)志進(jìn)行評(píng)估ApoAl、ALT(丙氨酸JL^轉(zhuǎn)移酶)、AST(天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、01.2-巨球蛋白、GGT(Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽基酶)、總膽紅素、結(jié)合珠蛋白、膽固醇、葡萄糖和甘這些10個(gè)生化標(biāo)志包含根據(jù)年齡和性別調(diào)整的FibroTest-ActiTest(已獲專利的人工智能算法，USPTO6,631,330)的6個(gè)成員，再加上AST、膽固醇、葡萄糖和甘油三酸酯標(biāo)志，以及BMI。才艮據(jù)之前所乂>布的(PoynardT,等.CompHepatol.2004;3:8;MyersRP,等.JHepatol.2003;39:222-30;CallewaertN，等.NatureMed2004;10;l-6;NaveauS，等.ClinGastroenterolHepatol印刷中；Imbert-BismutF,等.ClinChemLabMed2004;42:323-33;MunteanuM，等.CompHepatol2004;3:3)確定FibroTest(Biopredictive,Paris,France;FibroSURELabCorp,Burlington,NC,USA)。使用所公布的建議預(yù)分析和分析步驟(PoynardT,等.CompHepatol.2004;3:8;MyersRP，等.JHepatol.2003;39:222-30;CallewaertN,等.NatureMed2004;10;l-6;NaveauS,等.ClinGastroenterolHepatol印刷中；Imbert-BismutF,等.ClinChemLabMed2004;42:323-33;MunteanuM,等.CompHepatol2004;3:3)。在訓(xùn)練組與對(duì)照組中，使用制造商的試劑通過(guò)Hitachi917分析儀或者M(jìn)odularDP分析儀(二者都是RocheDiagnosticsMannheim,德國(guó))檢測(cè)GGT、ALT、血清葡萄糖、甘油三酸酯、膽固醇和總膽紅素。<吏用自動(dòng)濁度i十(nephelemeter)BNII(DadeBehring;Marburg,德國(guó))檢測(cè)a2-巨球蛋白、載脂蛋白Al和結(jié)合珠蛋白。在發(fā)汪組1和2中，使用制造商的試劑通過(guò)Hitachi747或911(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN,USA)檢測(cè)GGT、ALT、血清葡萄糖、甘油三酸酯、膽固醇和總膽紅素。使用自動(dòng)濁度計(jì)BNII(DadeBehring;Marburg,德國(guó))檢測(cè)血清樣品中的載脂蛋白Al、a2-巨球蛋白和結(jié)冶^珠蛋白。在發(fā)汪組3中，使用制造商的試劑(Olympus,RungisFrance)通過(guò)自動(dòng)分析儀(OlympusAU640Automate)檢測(cè)ALT、GGT、血清葡萄糖、甘油三酸酯、膽固醇、總膽紅素和結(jié)合珠蛋白。使用自動(dòng)濁度計(jì)(BNII，DadeBehring;Marburg，德國(guó))檢測(cè)a2-巨球蛋白和載脂蛋白Al。變化實(shí)驗(yàn)的所有系數(shù)均低于10%。1.3.組織學(xué)分級(jí)組織學(xué)分級(jí)基于肝活檢實(shí)施。不同組應(yīng)用共同的規(guī)則，每組一個(gè)病理學(xué)家，在不知道患者特征的情況下，分析組織學(xué)特征。肝活檢樣品使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)處理。肝脂肪變性評(píng)分從0到4，為四級(jí)評(píng)分系統(tǒng)0=無(wú)脂肪變性、1-5%=輕度、6-32%=中度、33-66%=顯著的、67-100%=重度，所有百分?jǐn)?shù)指脂肪變性中涉及的肝細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(PoynardT，等.Hepatology.2003;38:75-85)。主要的組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)是存在2-4級(jí)脂肪變性(6%到100%之間)。實(shí)施例2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析4吏用了Fisher確切檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)、Student檢驗(yàn)、Mann-Whitney檢驗(yàn)以及使用Bonferroni所有成對(duì)和Tukey-Kramer多重比較檢驗(yàn)的方差分析，以考慮為多元分析而進(jìn)行的多重比較和多因素邏輯回歸(HintzeJL.NCSS2003UserGuide.NumberCruncherStatisticalSystems2003softwareNCSS，Kaysville，Utah)。在如表1所示的患者群中，對(duì)第一組(訓(xùn)練組)實(shí)施分析，并對(duì)3個(gè)不同組(驗(yàn)證組l、2和3)進(jìn)行l(wèi)^。根據(jù)肝脂肪變性評(píng)分系統(tǒng)，患者被分入幾個(gè)組中。主要結(jié)果是確認(rèn)患有2、3或4級(jí)(中度、顯著的或重度)肝脂肪變性的患者。在二次分析中，根據(jù)4級(jí)評(píng)分系統(tǒng)將患者分類。第一步由對(duì)在各組之間具有顯著性差異的因素的確定組成，通過(guò)使用卡方檢驗(yàn)、Student'st檢驗(yàn)或者M(jìn)ann-Whitney檢驗(yàn)的線性分析來(lái)完成。第二步由邏輯回歸分析組成，用以評(píng)價(jià)用于診斷纖維化的標(biāo)志的獨(dú)立區(qū)別值。第三步是構(gòu)建將這些已確定的獨(dú)立因素結(jié)M來(lái)的指標(biāo)。根據(jù)定義，就區(qū)別而言的最佳指標(biāo)("脂肪變性評(píng)分")是結(jié)合了這些獨(dú)立因素的邏輯回歸函數(shù)。在下文所有的實(shí)施例中，脂肪變性評(píng)分進(jìn)一步稱為"SteatoTest評(píng)分"。SteatoTest評(píng)分的范圍從0到1.00，較高的分?jǐn)?shù)意味著顯著損傷的可能性較高。4吏用靈敏度、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)和陰性預(yù)測(cè)值(NPV)、以及接收者工作特征(ROC)曲線下面積，來(lái)評(píng)價(jià)標(biāo)志的診斷值(HintzeJL.NCSS2003UserGuide.NumberCruncherStatisticalSystems2003softwareNCSS，Kaysville,Utah)。相應(yīng)的總體診斷值通過(guò)ROC曲線下面積進(jìn)行比較。在對(duì)患者進(jìn)行分類之后，根據(jù)為邏輯函數(shù)所獲得的值，對(duì)于不同的閾值(從O到1),以靈敏度對(duì)(1-特異性)作出ROC曲線。通常認(rèn)為其下面積具有至少0.7的值的ROC曲線是良好的診斷預(yù)測(cè)曲線。必須確認(rèn)ROC曲線是允許預(yù)測(cè)診斷方法質(zhì)量的曲線。ROC曲線下面積使用經(jīng)驗(yàn)非M方法來(lái)計(jì)算。也實(shí)施靈敏度分析以根據(jù)活檢樣品尺寸確定用于主要結(jié)果的標(biāo)志的準(zhǔn)確性。對(duì)于所有分析，使用雙側(cè)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)；0.05或更小的P值被認(rèn)為是顯著的。使用軟件NumberCruncherStatisticalSystems2003(NCSS,Kaysville,Utah)以用于所有的分沖斤(HintzeJL.NCSS2003UserGuide.NumberCruncherStatisticalSystems2003softwareNCSS,Kaysville,Utah)。如前文所定義的，對(duì)于不同的組獨(dú)立實(shí)施這些統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)施例3邏輯函數(shù)的確定"SteatoTest評(píng)分"定義為結(jié)合了這些獨(dú)立因素的邏輯回歸函數(shù)，其得出就肝脂肪變性存在或不存在之間的區(qū)別而言的最佳指標(biāo)。在表2中給出了針對(duì)10個(gè)生化標(biāo)志的每一個(gè)、FibroTest評(píng)分和SteatoTest評(píng)分，以及它們與纖維化的獨(dú)立相關(guān)性(P值)而言就肝脂肪變性存在情況下的患者特征。在訓(xùn)練組中，在單因素分析中與2-4級(jí)的脂肪變性存在情況的相關(guān)性最顯著的因素是BMI、年齡、ALT、AST、GGT、葡萄糖和甘油在邏輯回歸分析中，最顯著的因素是BMI(OR=0.89P=0.0002)、GGT(OR=0.31P=0.002)、載脂蛋白Al(OR=3.20P=0.01)、a2-巨球蛋白(OR=5.74P=0.02)、ALT(OR=0.38P=0.03)和甘油三酸酯(OR=0.31P=0.04)。在驗(yàn)證組中，觀察到相似的差異，最顯著的是BMI、GGT、ALT和甘油三酸酯(表2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>對(duì)訓(xùn)練組確定的結(jié)合了9個(gè)標(biāo)志和年齡、性別以及BMI的最佳邏輯函數(shù)(SteatoTest評(píng)分)如下f-6.68805-l,55337E-02.[年齡(歲)+1.161531.[載脂蛋白Al(g/L)-0.11889[體重指數(shù)(體重/身高2)+1.74791丄og[.a,2-巨球蛋白(g/L)-0.96453丄og[ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)(IU/L)國(guó)0.11958丄og[總膽紅素(nmol/L)-0.68125.Log[膽固醇(mmol/L)]-1.17922丄og[GGT(，谷氨酰轉(zhuǎn)肽基酶)(IU/L)]-1.46963丄og[葡萄糖(mmol/L)-0.34512丄og[結(jié)合珠蛋白(g/L)-1.17926丄og[甘油三酸酯(mmol/L)+0.35052.[性別(女性=0,男性=1)I。此函數(shù)是從訓(xùn)練組通過(guò)結(jié)^個(gè)參數(shù)按照在邏輯回歸中所單獨(dú)確定的相對(duì)權(quán)重而獲得的，當(dāng)標(biāo)志與肝脂肪變性的階段負(fù)相關(guān)時(shí)具有負(fù)號(hào)。在值具有非常大的范圍時(shí)，對(duì)標(biāo)志^:用對(duì)數(shù)。SteatoTest評(píng)分的值對(duì)于訓(xùn)練樣本和^￡樣本(表2)與肝脂肪變性的存在與否具有高相關(guān)性，其結(jié)合了9個(gè)標(biāo)志(a2-巨球蛋白、ALT、apoAl、結(jié)合珠蛋白、GGT和總膽紅素)，根據(jù)年齡、性別和BMI進(jìn)糊整。本工作的重要發(fā)現(xiàn)之一是，當(dāng)結(jié)合了標(biāo)志時(shí)，與以前所推薦的經(jīng)典常規(guī)測(cè)試如GGT和ALT相比，在脂肪變性的診斷值上有非常顯著的改善。胰島素抵抗的筒單標(biāo)志比如BMI、葡萄糖、甘油三酸酯提高了ALT和GGT的診斷值。這在之前沒(méi)有在不同病因的肝脂肪變性中得到證實(shí)。另外，首次證實(shí)對(duì)于肝脂肪變性的診斷而言，ALT的診斷值大大高于GGT。同樣有意思的是，相比于ALT，GGT的值不隨著脂肪變性的嚴(yán)重性而增長(zhǎng)。實(shí)施例4數(shù)據(jù)分析4.1SteatoTest評(píng)分用于肝脂肪變性診斷的可發(fā)汪性(Fiability)對(duì)于不同的患者組SteatoTest評(píng)分的診斷值(ROC曲線下面積)在表3中顯示。具有0.30、0.50和0.70臨界值的SteatoTest評(píng)分的靈敏度、特異性以及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值在表4中顯示。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>*高于GGT(p<0.0001)和ALT(pO.0001)￡高于GGT(p=0.007)和ALT(p<0.0001)$高于GGT(p:0.02)**高于GGT(p=0.002)表3:在訓(xùn)練組和-瞼證組中，用于診斷脂肪變性的脂肪變性得分、GGT和ALT的值[ROC曲線下面積(AUROC)]。臨界值敏感性特異性陽(yáng)性陰性預(yù)測(cè)值預(yù)測(cè)值訓(xùn)練組罹患率=45%N=310SteatoTest0.300.91(127/140)0.45(77/170)0.58(127/220)0.86(77/90)0.500.69(97/140)0.74(126/170)0.69(97/141)0.75(126/169)0.700.45(63/140)0.89CI52/170)0.78(63/81)0.66(152/229)GGT50rU/L0.66(92/140)0.55(94/170)0.55^92/168)0.66(94/142)ALT50IU/L0.77(108/140)0.3S(60/170;0.50(108/218)0.65(60/92)驗(yàn)證組l罹患率=26%N=171SteatoTest0.300.98(44/45)0.24(30/126)0.31(44/140)0.97(30/31)0.500.89(40/45)0.58(73/126)0.43(德3)0.94(73/78)0.700.44(20/45)0.83(105/126)0.49(20/41)0.81(105/130)GGT50IU/L0.62(28/45)0.61(72/126)0.34(2證)0.81(72夠ALT50IU/L1.00(45/45)0.06(8/126)0.28(45/163)1.00(8/8)驗(yàn)證組2懼患率=11%N=201SteatoTest0.301.00(22/22)0.56(100/179)0.22(22/101)1.00(100/100)0.500.68(15/22)0.79(142/179)0.29(15/52)0.95(142/149)0.700.32(7/22)0.92(165/179)0.33(7/21)0.92(165/,GGT50IU/L0.09(2/22)0.97(174/179)0.29(2/7)0.90(174/194)ALT50IU/L0.05(1/22)0.98(176/179)0.25(1/3;0.89(176/197)驗(yàn)證組3罹患率=94%N=62SteatoTest0.300.85(49/58)0.00(0/4)0.93(49/53)0.00,0.500.62(36/58)1.00(4/4)1.00(36/36)0.15(4/26)0.700.40(23/58)1.00闊1.00(23/23)0.10(4/39)GGT50IU/L0.90(52/58)0.00(0/4)0.93(52/56)0.00(0/6)ALT50IU/L0.53(31/58)0.75(3/4)0.97(31/32)0.10(3/30)表4:用于預(yù)測(cè)大于5。/。的肝脂肪變性的脂肪變性得分的診斷值所有結(jié)果顯示，對(duì)于肝脂肪變性診斷，SteatoTest評(píng)分可達(dá)到非常高的診斷值(ROC曲線下面積，見(jiàn)表3)，以及高特異性、靈敏度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值或陰性預(yù)測(cè)值(見(jiàn)表4)。SteatoTest評(píng)分的診斷值(ROC曲線下面積)在訓(xùn)練組與發(fā)汪組1、2和3之間具有高度的可重現(xiàn)性(表3)。靈敏度在訓(xùn)練組與驗(yàn)證組1、2和3之間也頗具可重現(xiàn)性(表4)。另外，在所研究的不同A^中觀察到的SteatoTest評(píng)分的靈敏度和特異性很可能在更普遍的人群中會(huì)有所提高，這是因?yàn)樵谥驹刚吆凸┭咧杏^察到了非常好的特異性(圖2E)，并且因?yàn)槟壳暗难芯堪藬?shù)量有限的具有一些代謝風(fēng)險(xiǎn)因素比如肥胖癥的患者。對(duì)于一些患者，通過(guò)活檢和通過(guò)SteatoTest評(píng)分對(duì)肝脂肪變性存在的診斷是不一致的。通過(guò)生化標(biāo)志和活檢預(yù)測(cè)的存在>5%的肝脂肪變性之間的不一致，其原因在于如前文詳細(xì)描述的各自的失敗風(fēng)險(xiǎn)因素(PoynardT,等.Clin.Chem.2004;50:1344-55)。顯著不一致被定義為按照SteatoTest評(píng)分的預(yù)測(cè)或按照對(duì)活檢樣品的觀察，在預(yù)測(cè)>5%的肝脂肪變性(2-4級(jí))中的不一致，和在>5%的肝脂肪變性百分比上有30%或更大的差異。SteatoTest評(píng)分失敗的風(fēng)險(xiǎn)因素有溶血、Gilbert病、急性炎癥和肝外膽汁郁積。活檢失敗的風(fēng)險(xiǎn)因素有活檢組織大小(小于25mm)和斷裂(多于一個(gè)片段)。當(dāng)活檢組織小于15mm并且斷裂，再加上存在至少一種代謝風(fēng)險(xiǎn)因素時(shí)，懷疑會(huì)發(fā)生可歸因于活檢(假陰性)的失敗。在訓(xùn)練組中，在ST預(yù)測(cè)的與活檢樣本中所觀察到的脂肪變性百分比之間，有56例(18%)的顯著性不一致。在具有與慢性乙肝有關(guān)的急性藥物性肝炎的一例中，懷疑失敗可歸因于ST(ST假陽(yáng)性)。在具有^^量的活檢樣本(中位數(shù)長(zhǎng)度13mm,2個(gè)片段)以及至少一項(xiàng)代謝風(fēng)險(xiǎn)因素的16例中，懷疑失敗可歸因于活檢(活檢假陰性)。對(duì)于^Hli且，在組1中17例(16%)、組2中20例(10%)以及組3中13例(21%)觀察到顯著不一致。在具有大范圍纖維化(F3或F4階段)的患者中更經(jīng)常XRL察到顯著的不一致135例中的38例(28%)相對(duì)于609例中的91例(15%P=0.001)。相比于侵入性且昂貴的活檢珍斷，非常重要的是，注意到本發(fā)明的方法不會(huì)導(dǎo)致大量的過(guò)度處理患者或者排除掉需要治療的患者。本申請(qǐng)中出示的數(shù)據(jù)增強(qiáng)了根據(jù)本發(fā)明的診斷方法的可靠性。4.2.SteatoTest評(píng)分與其它非侵入性診斷測(cè)試的比較(FibroTest,GGT50IU/LetALT50IU/L)對(duì)使用SteatoTest評(píng)分(使用9個(gè)生化參數(shù)，根據(jù)年齡、性別和BMI進(jìn)行調(diào)整)獲得的結(jié)果與使用通常被認(rèn)為是用于指示肝脂肪變性存在與否的獨(dú)立標(biāo)志比如GGT和ALT獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。對(duì)于GGT和ALT使用相同的標(biāo)準(zhǔn)臨^Hi:50IU/L。在所述的臨^IHi以下，對(duì)肝脂肪變性的診斷視為陰性，若在該臨界值以上，則認(rèn)為是陽(yáng)性。才艮據(jù)肝脂肪變性的存在情況對(duì)于單個(gè)生化標(biāo)志、FibroTest、以及SteatoTest評(píng)分而言的患者特征在表2中顯示。與FibroTest相比，SteatoTest評(píng)分允許在所分析的所有組中，尤其是對(duì)于訓(xùn)練組和發(fā)汪組2(表2),對(duì)肝脂肪變性存在與否進(jìn)行更好的區(qū)別。對(duì)于主要終點(diǎn)(即2-4級(jí)肝脂肪變性)的診斷，SteatoTest評(píng)分、顯示。SteatoTest評(píng)分在所有所分析的組中相比于GGT50IU/L具有更高的ROC曲線下面積，在訓(xùn)練組和^ili且1中相比于ALT50IU/L具有更高的ROC曲線下面積(表3)。臨刷直為0.30、0.50或0.70的SteatoTest評(píng)分、GGT50IU/L和ALT50IU/L的靈敏度、特異性以及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值在表4中顯示。對(duì)于2-4級(jí)肝脂肪變性的診斷，分別根據(jù)訓(xùn)練組和IHE組，臨^Hi為0.50的SteatoTest評(píng)分達(dá)到良好的靈敏度(0.69，0.89，0.68和0.62)和良好的特異性(0.74，0.58,0.79，1.00)。另夕卜，在所有所分析的組中，此臨^IMi為0.50的SteatoTest評(píng)分顯示出比GGT50IU/L和ALT50IU/L更高的陽(yáng)性值和陰性值，只是發(fā)逸組l中的ALT50IU/L的陰性預(yù)測(cè)值除外。另外，有關(guān)不同級(jí)別的肝脂肪變性之間的區(qū)別，在所有所分析的組中，相比于GGT50IU/L和ALT50IU/L,SteatoTest評(píng)分達(dá)到了最佳程度(圖2)。不同級(jí)別的肝脂肪變性之間的區(qū)別也在整合的基礎(chǔ)上進(jìn)行分析，其由訓(xùn)練組、三個(gè)發(fā)逸組以及對(duì)照組所包括的所有受試者組成(884個(gè)受試者)。在SteatoTest評(píng)分與從對(duì)照到"33-100%，，(3-4級(jí)，見(jiàn)圖3)的脂肪變性級(jí)別之間有非常顯著的整體相關(guān)性。通過(guò)對(duì)所有均值間的成對(duì)差異進(jìn)行Tukey-Kramer多重比較檢驗(yàn)，對(duì)于SteatoTest評(píng)分而言，在所有級(jí)別之間都有顯著性差異(P<0.05)。相比之下，對(duì)于GGT和ALT,在"無(wú)脂肪變性，，(0級(jí))和"<5%"(l級(jí))之間無(wú)顯著差異。對(duì)于ALT,甚至在"無(wú)脂肪變性，，(0級(jí))和"6-32%"(2級(jí))之間、"<5%"(l級(jí))和"6-32%"(2級(jí))之間、以及"6國(guó)32%"(2級(jí))和"33國(guó)66%，,(3級(jí))之間無(wú)顯著差異。總之，本發(fā)明給出了至少5種、優(yōu)選9種生化標(biāo)志的結(jié)合，根據(jù)年齡、性別和BMI進(jìn)行調(diào)整，用于檢測(cè)肝脂肪變性存在與否。本發(fā)明中所使用的標(biāo)志從來(lái)沒(méi)有以此種方式結(jié)合，尤其是與患者的年齡、性別和BMI結(jié)合，以給出良好的預(yù)測(cè)值，如ROC曲線下面積所示例說(shuō)明的。在對(duì)所述標(biāo)志的值進(jìn)行自動(dòng)測(cè)量后，可對(duì)本發(fā)明的診斷方法進(jìn)行自動(dòng)分析，并且可有利地應(yīng)用于患有涉及肝脂肪變性的疾病的患者，以減少肝活檢的適應(yīng)癥。權(quán)利要求1.一種對(duì)患者或者對(duì)來(lái)自患者的血清或血漿樣本進(jìn)行肝脂肪變性診斷的體外方法，其包括以下步驟a)通過(guò)檢測(cè)在所述患者的血清或血漿中的濃度值，來(lái)研究5個(gè)生化標(biāo)志，其中所述標(biāo)志是-ApoA1(載脂蛋白A1)，-α.2-巨球蛋白，-ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)，-GGT(γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽基酶)，和-甘油三酸酯；b)研究一個(gè)選自體重指數(shù)(體重/身高2)、腰圍和(腰圍/臀圍)比值的臨床標(biāo)志；c)將所述值通過(guò)包含所述標(biāo)志的邏輯函數(shù)相結(jié)合以獲得最終值，其中所述邏輯函數(shù)通過(guò)下述方法獲得i)將一群患者根據(jù)他們疾病的程度分到不同的組中；ii)通過(guò)線性分析確定在這些組之間有顯著性差異的因素；iii)進(jìn)行邏輯回歸分析以評(píng)估用于診斷肝脂肪變性的標(biāo)志的獨(dú)立區(qū)別值；iv)通過(guò)將這些確定出的獨(dú)立因素結(jié)合，建立邏輯函數(shù)。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述邏輯函數(shù)還考慮患者的年齡和性別。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述邏輯函數(shù)還包含至少一個(gè)選自總膽紅素、結(jié)合珠蛋白、AST(天冬氨酸氬基轉(zhuǎn)移酶)、葡萄糖和(膽固醇或HDL-膽固醇)的生化標(biāo)志。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述邏輯函數(shù)包含總膽紅素、結(jié)合珠蛋白、葡萄糖和膽固醇。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述邏輯函數(shù)是f=al-a2.[年齡(歲)+a3.[載脂蛋白Al(g/L)-a4[體重指數(shù)(體重/身高2)+a5。Log[.a1.2-巨球蛋白(g/L)-a6Log[ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)(IU/L)]-a7。Log[總膽紅素(nmol/L)]-a8.[膽固醇(mmoi/L-a9.Log[GGT(γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽基酶)(IU/L)-al0.[葡萄糖(mmol/L)]-all.Log[結(jié)合珠蛋白(g/L)-al2.[甘油三酸酯(mmol/L)+al3.[性別(女性=0，男性-l)，其中al包括在區(qū)間[6.68805-90％;6.68805+90%]中，a2包括在區(qū)間[1.55337E-02-900/0;1.55337E-02+90％]中，a3包括在區(qū)間[1.161531-90％;1.161531+90%]中，a4包括在區(qū)間0.11889-90%;0.11889+90%]中，a5包括在區(qū)間[1.74791-90%;1.74791+90%]中，a6包括在區(qū)間中，a7包括在區(qū)間中，a8包括在區(qū)間中，a9包括在區(qū)間[1.17922-90%;1.17922+90％]中，al0包括在區(qū)間[1.46963-90%;1.46963+90%]中，al1包括在區(qū)間中，a12包括在區(qū)間[1.17926-90%;1.17926+90%]中，和a13包括在區(qū)間中。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述邏輯函數(shù)是f=6.68805-1.55337E-02.[年齡(歲)+1.161531.[載脂蛋白Al(g/L)-0.11889[體重指數(shù)(體重/身高2+1.74791.Log[.a.2-巨球蛋白(g/L)-0.96453.Log[ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)(IU/L)]-0.11958.Log[總膽紅素(nmol/L)-0.68125丄og[膽固醇(mmol/L)-1.17922丄ogGGT谷氨酰轉(zhuǎn)肽基酶)(IU/L)-1.46963.Log葡萄糖(mmol/L)-0.34512.Log[結(jié)合珠蛋白(g/L)-1.17926丄og[甘油三酸酯(mmol/L)+0.35052.性別(女性=0，男性=1)。7.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述患者患有涉及脂肪變性的疾病。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述疾病包含在下組中乙型和丙型肝炎、酒精中毒、血色素沉著病、代謝疾病、糖尿病、肥胖癥、自身免疫性肝病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、alfa.1-抗胰蛋白缺乏癥和Wilson病。9.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述患者已經(jīng)進(jìn)行了肝纖維化和/或肝壞死性炎癥損傷存在情況的診斷測(cè)試。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述診斷測(cè)試是FibroTest/Acti-Test。11.用于診斷患者體內(nèi)肝脂肪變性的試劑盒，其包含a)確定所述患者體內(nèi)存在肝脂肪變性的說(shuō)明書(shū)；b)用于檢測(cè)5種生化標(biāo)志的血清濃度值的試劑，其中所述標(biāo)志是ApoAl(載脂蛋白Al)，α2-巨球蛋白，ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)，GGT(Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽基酶)，和甘油三酸酯；c)任選地，至少一種用于檢測(cè)總膽紅素、結(jié)合珠蛋白、AST(天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、葡萄糖或(膽固醇或HDL-膽固醇)的血清濃度值的試劑；d)使用邏輯函數(shù)的說(shuō)明書(shū)，該函數(shù)用于將所述值與選自體重指數(shù)(體重/身高2)、腰圍和(腰圍/臀圍)比值的一個(gè)臨床標(biāo)志結(jié)合以獲得最終值。12.根據(jù)權(quán)利要求ll的試劑盒，其還包含ROC曲線。13.根據(jù)權(quán)利要求11的試劑盒，其還包含允許根據(jù)在患者人群中肝脂肪變性的預(yù)計(jì)罹患率獲得預(yù)測(cè)值的表格。14.根據(jù)權(quán)利要求11的試劑盒，其還包含用于量化肝脂肪變性不同級(jí)別(無(wú)=0%、輕度=1-5%、中度=6-32%、顯著的=33-66%和重度=67-100%)以及其它中間級(jí)別的說(shuō)明書(shū)。全文摘要本發(fā)明提供一種通過(guò)使用可方便檢測(cè)的生物學(xué)標(biāo)志的血清濃度來(lái)檢測(cè)患者的肝脂肪變性程度的新診斷方法，具體而言針對(duì)患有涉及肝脂肪變性的疾病的患者，或者針對(duì)已經(jīng)作出肝纖維化和/或存在肝壞死性炎癥損傷的陽(yáng)性診斷測(cè)試的患者。本發(fā)明也提供了實(shí)施本方法的診斷試劑盒。文檔編號(hào)G01N33/576GK101175998SQ200680007206公開(kāi)日2008年5月7日申請(qǐng)日期2006年2月3日優(yōu)先權(quán)日2005年2月3日發(fā)明者蒂埃里·普瓦納爾申請(qǐng)人:巴黎國(guó)立醫(yī)院(Ah-Hp)