專利名稱：5-氟-尿嘧啶免疫測定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型抗體和5-FU的單克隆抗體。本發(fā)明的抗血清可以通過使用本發(fā)明的免疫原免疫宿主動物而常規(guī)產(chǎn)生。合適的宿主動物包括嚙齒類，例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠等，或者較高等的哺乳動物，例如山羊、綿羊、馬等。根據(jù)用于引發(fā)動物中的免疫反應(yīng)的接受的規(guī)程，給以初始劑量、出血和加強注射，例如，在優(yōu)選實施方式中，小鼠接受100μg免疫原/小鼠初始劑量，i.p.和隨后兩次或多次100μg免疫原/小鼠加強注射進行六個月以上。通過周期性的出血，利用常規(guī)的免疫測定觀察免疫小鼠的血液樣品以發(fā)展對抗5-FU的免疫反應(yīng)。這些方法提供了篩選產(chǎn)生了具有需要活性的抗血清的宿主的方便方法。
根據(jù)上述計劃接著給小鼠i.p.或i.v.注射100μg免疫原連續(xù)三天，在細胞融合三天前開始，通過免疫Balb/c小鼠方便地產(chǎn)生單克隆抗體。當然也可以利用抗體領(lǐng)域中公知的其它方法。本文中詳細的完全免疫方法提供了用于5-FU抗體的血清抗體反應(yīng)的最佳方法。
從宿主的脾臟、外周血液、淋巴結(jié)或其它組織獲得的B淋巴細胞可以用作單克隆抗體產(chǎn)生細胞。最優(yōu)選的是從脾臟得到的B淋巴細胞。通過將這種B淋巴細胞與無限增殖細胞系融合得到能產(chǎn)生本發(fā)明需要的單克隆抗體的雜交瘤，該無限增殖細胞系為在雜交細胞上給予長期組織培養(yǎng)穩(wěn)定性的細胞系。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，無限增殖細胞可以為類淋巴母細胞或者漿細胞瘤細胞如骨髓瘤細胞，其自身是抗體產(chǎn)生細胞而且是惡性的。產(chǎn)生5-FU單克隆抗體的鼠類雜交瘤是通過融合小鼠骨髓瘤細胞和來自免疫了抗5-FU蛋白質(zhì)綴合物的小鼠的脾細胞而形成的。嵌合的和人源化的單克隆抗體可以通過克隆來自雜交瘤細胞的抗體表達基因并使用現(xiàn)在本領(lǐng)域公知的重組DNA方法將小鼠可變區(qū)連接到人恒定區(qū)或者將人框架區(qū)與來自供體小鼠或大鼠免疫球蛋白的互補決定區(qū)(CDR)組合來產(chǎn)生。實施鼠類單克隆抗體人源化的改進方法在國際專利申請WO92/11018中有闡述，其提供了增強親和力的抗體。
可以產(chǎn)生僅含有部分初級抗體結(jié)構(gòu)的多肽片段，該片段擁有一種或多種免疫球蛋白活性。這些多肽片段可以使用本領(lǐng)域公知的方法通過完整抗體的蛋白酶裂解來生產(chǎn)，或者使用定向誘變在含有抗體基因的表達載體中需要的位置插入終止密碼子來產(chǎn)生Fab片段或(Fab′)2片段。單鏈抗體可以通過將VL和VH區(qū)域與DNA接頭結(jié)合產(chǎn)生(見Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，855879-5883(1988)和Bird等人，Science，242423-426(1988))。
本發(fā)明的抗體對于5-FU是選擇性的，并且與如尿嘧啶、胞嘧啶、喃氟啶等的嘧啶堿沒有實質(zhì)上的交叉反應(yīng)性。沒有實質(zhì)上的交叉反應(yīng)性意味著本發(fā)明的抗體相對于具有不超過12％優(yōu)選不超過5％的這些代謝產(chǎn)物的5-FU具有交叉反應(yīng)性。
免疫測定 根據(jù)本發(fā)明，由式II-A的這些化合物的免疫原產(chǎn)生的前述綴合物和抗體可以用作確定患者樣品中5-FU的試劑。這種測定通過免疫測定進行。由式II-B的化合物形成的試劑綴合物與樣品中的5-FU競爭本發(fā)明產(chǎn)生的抗體上的結(jié)合部位的任何免疫測定可以用于確定患者樣品中5-FU的存在。在懷疑含有5-FU的樣品中進行這種分析5-FU的方法包括組合(a)含水介質(zhì)樣品，(b)本發(fā)明產(chǎn)生的5-FU抗體和(c)由式II-A和II-B的化合物形成的綴合物。樣品中5-FU的量可以通過測量結(jié)合添加到樣品和抗體的混合物中的已知量的綴合物的特異抗體的抑制來確定。將通過未知樣品抑制已知量綴合物的這種結(jié)合的結(jié)果與通過利用已知5-FU標準溶液的相同分析所得到的結(jié)果比較。在確定未知樣品中5-FU的量時，可以以任何順序添加樣品、由式II-B的化合物形成的綴合物以及抗體。
可以采用各種方法來測量結(jié)合到抗體的、由式II-A和II-B的化合物形成的綴合物的量。一種方法是綴合物與抗體的結(jié)合引起了熒光基團綴合物旋轉(zhuǎn)速率的降低。在液體混合物中熒光基團綴合物旋轉(zhuǎn)速率的降低量可以通過熒光極化技術(shù)來檢測，例如美國專利No.4,269,511和4,420,568所公開。
另一方面，抗體可以包被或吸收在納米粒子上，使得這些粒子與由式II-A和II-B的化合物形成的5-FU綴合物反應(yīng)時，這些納米粒子形成聚集體。然而，當包被或吸收納米粒子的抗體與樣品中的5-FU反應(yīng)時，來自結(jié)合到這些納米粒子的樣品的5-FU不產(chǎn)生抗體納米粒子的聚集。通過吸收率在分析混合物中可以測量聚集或凝聚的量。
另一方面，可以通過將抗體或者5-FU綴合物附著到如微量滴定板的固相載體或者任何其它包括固體粒子的常規(guī)固相載體上來進行這些分析。將抗體和蛋白附著到這種固體粒子上是本領(lǐng)域公知的。可以利用任何常規(guī)方法來進行這種附著。在許多情況下，為了有助于測量，可以將標記放置在抗體、綴合物或者固體粒子上，所述標記例如放射性標記或酶標記，作為檢測與抗體結(jié)合或未結(jié)合的由式II-B的化合物形成的綴合物的量的助劑。其它合適的標記包括發(fā)色團、熒光基團等。
為方便起見，本發(fā)明的分析組分可以提供在試劑盒中，與預(yù)定量的用于分析5-FU的新試劑包裝組合。這些試劑包括本發(fā)明的抗體，還有由式II-A和II-B的化合物形成的綴合物。
除了這些必需的試劑，可以包括添加劑如輔助試劑，例如穩(wěn)定劑、緩沖劑等。各種試劑的相對量可以廣泛變化，以提供基本上使分析敏感性最佳化的試劑在溶液中的濃度。試劑可以在溶液中或者作為干粉，通常是凍干的，該試劑包括賦形劑，其在溶解時提供具有進行分析的合適濃度的試劑溶液。
實施例 在實施例中，指定使用下列縮寫 THF四氫呋喃 EA乙醇 DCM二氯甲烷 DMAP二甲氨基吡啶 NHS N-羥基-琥珀酰亞胺 EDC鹽酸1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺 TLC薄層色譜 ANS 8-苯胺基-1-萘磺酸 i.p.腹膜內(nèi) HRP辣根過氧化物酶 TMB 3，3′,5，5′-四甲基聯(lián)苯胺 TRIS鹽酸三(羥甲基)氨基甲烷 BSA牛血清白蛋白 BTG牛甲狀腺球蛋白 PBS磷酸鹽緩沖鹽水 di去離子水 在實施例中，方案1，方案2，方案3a、3b和方案4，下面闡述制備的特定化合物，并通過實施例中的編號表示。方案如下 方案1
方案2
方案3a
方案3b
方案4
實施例1 方案1，制備1-取代的5-FU活化酯[4] 在30℃下攪拌中向DMF(100mL)中的氟尿嘧啶(50g)[1]溶液中加入三乙胺(78g)。然后滴加乙基-4-溴丁酸酯(88.5g)。滴加完成后，將所得到的反應(yīng)混合物在室溫下攪拌48小時。過濾反應(yīng)混合物，并在減壓下除去溶劑。將殘留物在乙酸乙酯中結(jié)晶，提供了26g(29％)的化合物[2]。
向甲醇(100mL)中[2]的溶液(20g)中加入20％的氫氧化鉀水溶液(27mL)。所得溶液在室溫下攪拌3小時，然后在減壓下濃縮該混合物。將殘留物溶解在丙酮(50-100mL)中，并用濃HCl調(diào)節(jié)到pH為2-3。接著過濾，用丙酮洗滌。通過加熱將固體產(chǎn)物溶解在丙酮(50mL)中。冷卻至室溫后，通過添加乙酸乙酯(100mL)將固體沉淀出來。通過過濾收集固體產(chǎn)物，接著干燥得到約10g的[3]。用于酯的TLC條件是乙酸乙酯∶醚(3∶1)。用于酸的TLC條件是氯仿∶甲醇(15∶1)，2滴乙酸。
在0℃下向600mL的二氯甲烷中6.3g的化合物[3]中加入NHS。再向這種溶液中滴加于二氯甲烷中的DCC(4.8g)。在0℃下攪拌2小時，將得到的反應(yīng)混合物在室溫下攪拌15小時。將反應(yīng)混合物濃縮。在丙酮中結(jié)晶殘留物得到粗產(chǎn)物。在二氧化硅凝膠柱(用乙酸乙酯∶醚為3∶1來洗脫)上提純該粗產(chǎn)物，得到4g化合物[4]。
實施例2 方案2，制備1-取代的5-FU酸[5] 向乙腈(300mL)中化合物[4](3.2g)的溶液中添加水(900mL)，接著加入1.2 e.q.的對甲氨基苯甲酸。將所得反應(yīng)混合物在室溫下攪拌20小時。在減壓下濃縮該混合物，除去乙腈。形成沉淀并通過過濾收集。然后在丙酮中結(jié)晶得到2.8g粗產(chǎn)物。將該粗產(chǎn)物在二氧化硅凝膠柱(用氯仿∶甲醇為15∶1洗脫，1-2滴乙酸)上提純，得到2g化合物[5]。
實施例3a 方案3a，制備3-取代的5-FU酸衍生物[12]，[14] 在40℃下在設(shè)有冷凝器、溫度計和滴液漏斗的三頸燒瓶中攪拌80mL的POCl3中15.6g的5-FU[1]的混合物。在滴加了25mL的N，N-二甲基苯胺后，將所得混合物加熱回流3小時。在減壓下蒸發(fā)過量的POCl3。將混合物冷卻至室溫，并倒入75g的碎冰中。然后用氯仿(50mL三次)萃取。用水洗滌組合的萃取物，用MgSO4干燥，并濃縮，得到約50％產(chǎn)率的淺黃色固體化合物[7]。
在45℃下攪拌在48mL的2N NaOH溶液中16g的氯氧化物[7]的混合物1小時。反應(yīng)混合物的pH降低到7。再加入48mL 2N NaOH溶液，并持續(xù)攪拌至在反應(yīng)混合物中不再觀察到油性物質(zhì)。將混合物冷卻至室溫后，用濃HCl調(diào)節(jié)pH至pH為3。冷卻，產(chǎn)物[8]沉淀出來。收集化合物氯氧化物[8]，用水洗滌，直到洗滌溶液變成中性。產(chǎn)率約55％。
向裝有冷凝器、溫度計和dean stark裝置的三頸燒瓶中加入20mL甲苯、52mL苯甲醇和2.44g固體NaOH。將所得混合物回流至變干。然后，加入3g化合物[8]，并持續(xù)回流3小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，加入50mL水。用水洗滌有機相兩次(每次50mL)。將水相組合起來，在減壓下除去甲苯和苯甲醇的殘留物。用濃HCl調(diào)節(jié)溶液pH為3，冷卻下來，形成沉淀，收集該沉淀。在乙醇中再次結(jié)晶，得到約60％產(chǎn)率的化合物[9]。
將20mL苯、20mL水和0.5g四丁基溴化銨的混合物加熱至55℃后，將溶液A(在20mL 1N NaOH水溶液中2g的[9])和溶液B(在20mL苯中1.9g的乙基-4-溴丁酸酯)以交替滴加方式加入該混合物中。反應(yīng)混合物的pH控制在8-10。滴加完之后，將反應(yīng)混合物回流2個半小時。分離有機相，用5％NaOH和水洗滌，用MgSO4干燥。減壓下除去有機溶劑。在硅膠凝膠柱(用醚和乙酸乙酯為10∶1洗脫)上提純殘留物，得到約40％產(chǎn)率的油狀產(chǎn)物的化合物[10]。
將50mL甲醇中3g化合物[10]，0.3g 10％Pd/C的混合物在氫氣(15psi)下攪拌約24小時。通過過濾除去催化劑。向含有[10]的濾液中加入2g NaOH和50mL水。所得混合物在室溫下攪拌8小時。在減壓下除去甲醇。用濃HCl調(diào)節(jié)混合物的pH至3。冷卻后，形成沉淀，通過過濾收集。將該沉淀從乙醇中再結(jié)晶，得到約50％產(chǎn)率的[12]。
在室溫下將50mL氯仿中的1g干燥的[12]、0.74g NHS、1.47g DDC的混合物攪拌過夜(約24小時)。在減壓下除去溶劑，在硅膠凝膠柱(用乙酸乙酯和甲醇10∶1來洗脫)上提純殘留物，得到約40％產(chǎn)率的化合物[13]。
在室溫下將30mL DMF中1g化合物[13]，0.5g 4-(氨甲基)-苯甲酸的混合物攪拌8小時。向反應(yīng)混合物中加入150mL水。用100mL乙酸乙酯洗滌所得到的混合物。使水相在4℃下靜置，通過過濾收集緩慢從溶液中沉淀出來的產(chǎn)物[14]，在P2O5的存在下在室溫真空下干燥，得到產(chǎn)率約65％的[14]。
實施例3b 方案3b，制備3-取代的5-FU酸衍生物[6] 將20mL苯、20mL水和0.5g四丁基溴化銨的混合物加熱至55℃后，向該混合物中同時加入溶液A(20mL 1N NaOH水溶液中2g[9])和溶液B(20mL苯中2.05g 4-溴丁酸乙酯)。將反應(yīng)混合物的pH控制在8-10。添加完之后，將反應(yīng)混合物回流兩個半小時。分離有機相，用5％NaOH和水洗滌，并用MgSO4干燥。在減壓下除去有機溶劑。在硅膠凝膠柱(用醚和乙酸乙酯10∶1洗脫)上提純殘留物，得到約38％產(chǎn)率的油狀產(chǎn)物的化合物[15]。
將60mL甲醇中2g化合物[15]，0.2g 10％Pd/C的混合物在氫氣(15psi)下攪拌約24小時。通過過濾除去催化劑。將含有化合物[16]的濾液濃縮至約20mL，然后加入1g NaOH和20mL水。所得混合物在室溫下攪拌8小時。在減壓下除去甲醇，并用濃HCl調(diào)節(jié)混合物的pH為3。冷卻后，形成沉淀，通過過濾收集。將該沉淀從乙醇中再結(jié)晶，得到約60％產(chǎn)率的[6]。
實施例4 從相應(yīng)的酸[3，5，12，14，6]制備NHS活化酯的一般方法 向攪拌的20mL干燥的CH2Cl2中NHS(1.39mmol)溶液中加入酸(0.695mmol)[3，5，12，14，6]和EDC(2.085mmol)。在氮氣氣氛下在室溫攪拌該溶液18小時。通過添加3mL鹽酸(0.3N)將該反應(yīng)終止，再攪拌5分鐘。分離有機層、干燥(Na2SO4)、過濾并蒸發(fā)(真空下)，產(chǎn)生白色固體。
實施例5 制備1-取代的5-FU KLH免疫原 向50mM磷酸鹽緩沖液(50mM，pH7.5)中5.86mL KLH(31.2mg/mL)中滴加實施例1中制備的0.692mL化合物[4](在DMSO中12.8mg/mL)，調(diào)節(jié)pH為8.5。在室溫下使混合物攪拌18小時。然后，通過滲析提純該免疫原性綴合物，并根據(jù)以前所描述的過程表征(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp385-390，1997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1997，Salamone等人，J.Forensic Sci.pp 821-826，1998)。
實施例6a 制備3-取代的5-FU BTG免疫原 向50mM磷酸鹽緩沖液(50mM，pH 7.5)中11.4mL BTG(16.9mg/mL)中滴加1.2mL DMSO，檢驗pH為7.5。向其中滴加實施例3a制備的0.227mL化合物[13](在DMSO中52.5mg/mL)，并再次檢驗pH為7.5。在室溫下使混合物攪拌18小時。然后，通過滲析提純該免疫原性綴合物，并根據(jù)以前所描述的過程表征(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1997，Salamone等人，J.Forensic Sci.pp 821-826，1998)。
實施例6b 制備3-取代的5-FU KLH免疫原 向50mM磷酸鹽緩沖液(50mM，pH 7.5)中8.3mL KLH(24.9mg/mL)中滴加0.922mL DMSO，檢驗pH為7.5。向其中滴加實施例3a制備的0.227mL化合物[13](在DMSO中52.6mg/mL)，并再次檢驗pH為7.5。在室溫下使混合物攪拌18小時。然后，通過滲析提純該免疫原性綴合物，并根據(jù)以前所描述的過程表征(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1997，Salamone等人，J.Forensic Sci.pp 821-826，1998)。
實施例7a 制備具有衍生物12的3-取代的5-FU BSA綴合物(10∶1比例) 向50mM磷酸鹽緩沖液(50mM，pH7.5)中BSA(50mg/mL)的1mL溶液中滴加0.111mL DMSO。滴加實施例4制備的化合物[12](在DMSO溶液中0.045mL 52.5mg/mL)的活化N-羥基琥珀酰亞胺酯。在室溫下使混合物攪拌過夜，產(chǎn)生3-取代的5-FU與BSA的綴合物。然后，通過滲析提純該綴合物，并根據(jù)以前所描述的過程表征(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1 997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1997，Salamone等人，J.ForensicSci.pp 821-826，1998)。
實施例7b 制備具有衍生物6的3-取代的5-FU BSA綴合物(1∶1比例) 向50mM磷酸鹽緩沖液(50mM，pH 7.5)中20mL BSA(50.0mg/mL)中滴加2.222mL DMSO，并檢驗pH為7.5。向其中滴加0.272mL實施例4制備的化合物[6](在DMSO溶液中20.0mg/mL)的活化N-羥基琥珀酰亞胺酯，再次檢驗pH為7.5。在室溫下使混合物攪拌18小時。然后，通過滲析提純該免疫原性綴合物，并根據(jù)以前所描述的過程表征(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1997，Salamone等人，J.Forensic Sci.pp 821-826，1998)。
實施例8 制備具有衍生物5的1-取代的5-FU BSA綴合物(20∶1比例) 向冰浴中的50mM磷酸鹽緩沖液(50mM，pH 7.5)中BSA(50mg/mL)的14mL溶液中滴加14mL DMSO。滴加實施例4制備的化合物[5](在DMSO溶液中1.65mL 57mg/mL)的活化N-羥基琥珀酰亞胺酯。在室溫下使混合物攪拌過夜，產(chǎn)生1-取代的5-FU與BSA的綴合物。然后，通過滲析提純該綴合物，并根據(jù)以前所描述的過程表征(Wu等人，Bioconj.Chem.，8pp 385-390，1 997，Li等人，Bioconj.Chem.，8pp 896-905，1 997，Salamone等人，J.ForensicSci.pp 821-826，1998)。
實施例9 制備5-FU抗體 給10只雌性BALB/c系小鼠以100μg/小鼠i.p.免疫在完全弗氏佐劑(Complete Freund’s Adjuvant)中乳化的實施例5制備的5-FU-KLH或?qū)嵤├?a制備的5-FU-BTG。在用以100μg/小鼠在不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund’s Adjuvant)中乳化的相同免疫原初次注射后四星期，給小鼠加強一次。加強試驗后10天通過眼窩放血獲得從每只小鼠放出的血。在實施例12a、13和14中評價來自這些含有5-FU抗體的試驗放血的抗血清。對于單克隆抗體，給10雌性BALB/c小鼠i.p.免疫在完全弗氏佐劑中乳化的實施例6a制備的3-取代的5-FU-KLH 100μg/小鼠。在用100μg/小鼠的在不完全弗氏佐劑中乳化的相同免疫原初次注射后四星期，給小鼠加強一次。加強試驗后10天通過眼窩放血獲得從每只小鼠放出的血并將這些在實施例12a和15中篩查。為了融合前(第0天)4天開始制備單克隆抗體，給小鼠i.p.注射400μg(第3天)、200μg(第2天)和200μg(第1天)的PBS中的3-取代的5-FU-KLH免疫原連續(xù)3天。從挑選的小鼠分離脾細胞，并根據(jù)Coligan，J.E.等人，eds.，Current Protocols in Immunology，2.5.1-2.5.8，(1992)，Wiley & Sons，NY的方法，用具有50％聚乙二醇1500的2×107SP2/0細胞融合。將融合的細胞鋪板在用20％FetalClone I、2％L-谷氨酰胺(100mM)和2％50X HAT補充的DMEM/F12中的10個96孔板上。兩周后，通過ELISA分析雜交瘤上清抗-5-FU的存在(實施例12b)。陽性孔擴大，再次以相同的方法篩查。通過競爭ELISA(實施例12a和15)證實了5-FU結(jié)合的陽性克隆。根據(jù)Coligan，J.E.等人，eds.，Current Protocols in Immunology，2.5.8-2.5.17，(1992)，Wiley &Sons，NY.中公開的方法，通過有限稀釋將由ELISA鑒定的陽性克隆亞克隆一次或兩次。
實施例10 用5-FU衍生物5-BSA綴合物的微量滴定板敏化過程 在為蛋白質(zhì)結(jié)合而優(yōu)化的且每板含有96孔的聚苯乙烯微量滴定板(Nunc MaxiSorp C8或F8 Immunomodules)中進行測量5-FU濃度的ELISA方法。通過添加在0.05M pH＝9.6的碳酸氫鈉中10μg/mL的300μL 5-FU-BSA綴合物并在室溫下溫育3小時，用5-FU-BSA綴合物(實施例8所制備)包被每個孔。用0.05M pH＝9.6的碳酸氫鈉洗滌孔，接著在室溫下用400μL5％的蔗糖、0.2％酪蛋白酸鈉溶液阻斷30分鐘。除去包被后(post-coat)溶液后，在板在37℃下干燥過夜。
實施例11a 用5-FU衍生物12-BSA綴合物的微量滴定板敏化過程 在為蛋白質(zhì)結(jié)合而優(yōu)化的且每板含有96孔的聚苯乙烯微量滴定板(Nunc MaxiSorp C8或F8 Immunomodules)中進行測量5-FU濃度的ELISA方法。通過添加在0.05M pH＝9.6的碳酸氫鈉中10μg/mL的300μL5-FU-BSA綴合物并在室溫下溫育3小時，用5-FU-BSA綴合物(實施例7a所制備)包被每個孔。用0.05M pH＝9.6的碳酸氫鈉洗滌孔，接著在室溫下用400μL 5％的蔗糖、0.2％酪蛋白酸鈉溶液阻斷30分鐘。除去包被后溶液后，在板在37℃下干燥過夜。
實施例11b 用5-FU衍生物6-BSA綴合物的微量滴定板敏化過程 在為蛋白質(zhì)結(jié)合而優(yōu)化的且每板含有96孔的聚苯乙烯微量滴定板(Nunc MaxiSorp C8或F8 Immunomodules)中進行測量5-FU濃度的ELISA方法。通過添加在0.05M pH＝9.6的碳酸氫鈉中10μg/mL的300μL 5-FU-BSA綴合物并在室溫下溫育3小時，用5-FU-BSA綴合物(實施例7b所制備)包被每個孔。用0.05M pH＝9.6的碳酸氫鈉洗滌孔，接著在室溫下用375μL 5％的蔗糖、0.2％酪蛋白酸鈉溶液阻斷30分鐘。除去包被后溶液后，在板在37℃下干燥過夜。
實施例12a 抗體篩查過程-滴定 使用由實施例7a、7b和8所描述的5-FU-BSA敏化的微量滴定板進行篩查5-FU抗體(在實施例9中制備)的ELISA方法。通過將含有5-FU抗體的抗血清在含有0.1％BSA和0.01％硫柳汞的磷酸鹽緩沖鹽水中稀釋為1∶100、1∶1000、1∶10000和1∶100000進行抗體篩查實驗。向每個5-FU-BSA敏化的孔(實施例11 a、11b和10所制備)中添加100μL稀釋的抗體，并在室溫下?lián)u動溫育10分鐘。在此溫育過程中，抗體結(jié)合到孔中的5-FU-綴合物。用0.02M TRIS、0.9％NaCl、0.5％Tween-80和0.00 1％硫柳汞，pH 7.8洗滌板孔三次，除去任何未結(jié)合的抗體。為了檢測孔中結(jié)合到5-FU-BSA綴合物的5-FU抗體的量，將用0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞在PBS中稀釋1/2000的、能特異結(jié)合鼠類免疫球蛋白并且當用底物溫育時可以產(chǎn)生有色產(chǎn)物的100μL的山羊抗小鼠抗體-HRP酶綴合物(Jackson Immunoresearch)添加到各孔中。在室溫下?lián)u動溫育10分鐘后，在該期間山羊抗小鼠抗體-HRP酶綴合物在孔中結(jié)合5-FU抗體，再洗滌該板三次以除去未結(jié)合的山羊抗小鼠抗體-HRP酶綴合物。為了顯出孔中的可測顏色，洗滌后接著添加100μL用于HRP的底物TMB(TMB Liquid Substrate，Sigma或BioFx)，以在室溫下?lián)u動溫育10分鐘顯色。顯色溫育后，向各孔中添加50μL終止液(在去離子水中1.5％的氟化鈉)，以終止顯色，搖動10秒后測定650nm時的吸光度(Molecular Devices Plate Reader)?？字锌贵w的量與所測的吸光度是成比例的，并表示為產(chǎn)生吸光度為1.5的稀釋度(滴度)。通過畫出所測抗體(x軸)的對數(shù)抗體稀釋度與650nm的吸光度(y軸)的圖，并推知吸光度為1.5時的滴度。該滴度確定了用于實施例13、14和15描述的間接競爭微量滴定板分析的抗體濃度(稀釋度)。
實施例12b 抗體篩查過程-單克隆篩查 使用由實施例7b所描述的5-FU-BSA敏化的微量滴定板進行篩查5-FU單克隆抗體(在實施例9中制備)的ELISA方法。向每個5-FU-BSA敏化的孔(實施例11b所制備)中添加含有0.1％BSA和0.01％硫柳汞的磷酸鹽緩沖鹽水50μL，并接著添加50μL單克隆培養(yǎng)物上清液，在室溫下?lián)u動溫育10分鐘。在此溫育過程中，抗體結(jié)合孔中的5-FU-綴合物。用0.02M TRIS、0.9％NaCl、0.5％Tween-80和0.001％硫柳汞，pH7.8洗滌板孔三次，除去任何未結(jié)合的抗體。為了檢測孔中結(jié)合5-FU-BSA綴合物的5-FU抗體的量，將用0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞在PBS中稀釋為預(yù)定的比活性(約1/2000)的、能特異結(jié)合鼠類免疫球蛋白并且當用底物溫育時產(chǎn)生有色產(chǎn)物的100μL的山羊抗小鼠抗體-HRP酶綴合物(Jackson Immunoresearch)添加到各孔中。在室溫下?lián)u動溫育10分鐘后，在該期間山羊抗小鼠抗體-HRP酶綴合物在孔中結(jié)合5-FU抗體，再洗滌該板三次以除去未結(jié)合的山羊抗小鼠抗體-HRP酶綴合物。為了顯出孔中的可測顏色，洗滌后接著添加100μL用于HRP的底物TMB(TMB Liquid Substrate，Sigma或BioFx)，以在室溫下?lián)u動溫育10分鐘時顯色。顯色溫育后，向各孔中添加50μL終止液(在去離子水中1.5％的氟化鈉)，以終止顯色，搖動10秒后測定650nm(Molecular Devices Plate Reader)時的吸光度?？字锌贵w的量與所測的吸光度是成比例的。具有大于兩倍背景的吸光度的樣品指定為陽性。
實施例13 測定IC50以及抗體與5-FU衍生物4綴合物的交叉反應(yīng)性的間接競爭微量滴定板免疫測定過程 使用由實施例7a描述的5-FU-BSA敏化的微量滴定板進行測量5-FU濃度的ELISA方法。將5-FU、尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶和喃氟啶在PBS中稀釋10倍濃度范圍為0.01-10000ng/mL。通過溫育50μL的分析物進行分析，用稀釋為實施例12a中測定的滴度的50μL抗體(用實施例5的免疫原在實施例9中制備)測量。在10分鐘的溫育過程中(室溫下，搖動)，存在抗體競爭結(jié)合孔中5-FU綴合物和溶液中的分析物。這種溫育后，用0.02M TRIS、0.9％NaCl、0.5％Tween-80和0.001％硫柳汞，pH7.8洗滌板孔三次，除去任何未結(jié)合的物質(zhì)。為了檢測孔中結(jié)合到5-FU-BSA綴合物的5-FU抗體的量，將用0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞在PBS中稀釋1/2000、能特異結(jié)合鼠類免疫球蛋白并且當用底物溫育時產(chǎn)生有色產(chǎn)物的100μL的山羊抗小鼠抗體-HRP酶綴合物(Jackson Immunoresearch)添加到各孔中。在室溫下?lián)u動溫育10分鐘后，在該期間山羊抗小鼠抗體-HRP酶綴合物在孔中結(jié)合5-FU抗體，再洗滌該板三次以除去未結(jié)合的第二綴合物。為了顯出孔中的可測顏色，洗滌后接著添加100μL用于HRP的底物TMB(TMB LiquidSubstrate，Sigma或BioFx)，以在室溫下?lián)u動溫育10分鐘顯色。顯色溫育后，向各孔中添加50μL終止液(在去離子水中1.5％的氟化鈉)，以終止顯色，搖動10秒后測定650nm(Molecular Devices Plate Reader)時的吸光度。孔中抗體的量與所測的吸光度是成比例的，且與樣品中5-FU的量成反比。將含有分析物的孔中顏色的吸光度與沒有分析物的比較，產(chǎn)生標準曲線。給定分析物的IC50值定義為要求抑制不含有分析物的孔的50％的吸光度的分析物的濃度。將給定分析物的交叉反應(yīng)性計算為表達成百分比的5-FU的IC50與尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶和喃氟啶的IC50的比例。當用實施例5的免疫原在實施例9中產(chǎn)生的抗體測量時，相對于5-FU，尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶的百分比交叉反應(yīng)性小于7％，喃氟啶為200％。結(jié)果列于表I中。
實施例14 測定抗體與5-FU衍生物13綴合物的IC50和交叉反應(yīng)性的間接競爭微量滴定板免疫測定過程 使用由實施例8描述的5-FU-BSA敏化的微量滴定板進行測量5-FU濃度的ELISA方法。將5-FU、尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶和喃氟啶在PBS中稀釋10倍濃度范圍為0.01-10000ng/mL。通過溫育50μL的分析物進行分析，用稀釋為實施例12a中測定的滴度的50μL抗體(在實施例9中制備)測量。在10分鐘的溫育過程中(室溫下，搖動)，在孔中抗體競爭結(jié)合5-FU綴合物和溶液中的分析物。這種溫育后，用0.02M TRIS、0.9％NaCl、0.5％Tween-80和0.001％硫柳汞，pH 7.8洗滌板孔三次，除去任何未結(jié)合的物質(zhì)。為了檢測孔中結(jié)合5-FU-BSA綴合物的5-FU抗體的量，將用0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞在PBS中稀釋1/2000、能特異結(jié)合鼠類免疫球蛋白并且當用底物溫育時產(chǎn)生有色產(chǎn)物的100μL的山羊抗小鼠抗體-HRP酶綴合物(JacksonImmunoresearch)添加到各孔中。在室溫下?lián)u動溫育10分鐘后，在該期間山羊抗小鼠抗體-HRP酶綴合物在孔中結(jié)合5-FU抗體，再洗滌該板三次以除去未結(jié)合的第二綴合物。為了顯出孔中的可測顏色，接著添加100μL用于HRP的底物TMB(TMB Liquid Substrate，Sigma或BioFx)，以在室溫下?lián)u動溫育10分鐘顯色。顯色溫育后，向各孔中添加50μL終止液(在去離子水中1.5％的氟化鈉)，以終止顯色，搖動10秒后測定650nm(Molecular Devices PlateReader)時的吸光度。孔中抗體的量與所測的吸光度是成比例的，且與樣品中5-FU的量成反比。將含有分析物的孔中顏色的吸光度與沒有分析物的比較，產(chǎn)生標準曲線。給定分析物的IC50值定義為要求抑制不含有分析物的孔的50％的吸光度的分析物的濃度。將給定分析物的交叉反應(yīng)性計算為表達成百分比的5-FU的IC50與尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶和喃氟啶的IC50比例。當用實施例6a的免疫原在實施例9中產(chǎn)生的抗體測量時，相對于5-FU，尿嘧啶的百分比交叉反應(yīng)性小于8％，胞嘧啶的小于0.03％，喃氟啶的小于1％且胸腺嘧啶約12％。結(jié)果列于表I中。
實施例15 測定抗體與5-FU衍生物13綴合物的IC50和交叉反應(yīng)性的間接競爭微量滴定板免疫測定過程 使用由實施例7b描述的5-FU-BSA敏化的微量滴定板進行測量5-FU濃度的ELISA方法。取決于樣品，將5-FU、尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶和喃氟啶在PBS中稀釋10倍濃度范圍為0.1-1000000ng/mL。通過溫育50μL的分析物進行分析，用稀釋為實施例12a中測定的滴度的50μL抗體(在實施例9中制備)測量。在10分鐘的溫育過程中(室溫下，搖動)，在孔中抗體競爭結(jié)合5-FU綴合物和溶液中的分析物。這種溫育后，用0.02M TRIS、0.9％NaCl、0.5％Tween-80和0.001％硫柳汞，pH7.8洗滌板孔三次，除去任何未結(jié)合的物質(zhì)。為了檢測孔中結(jié)合5-FU-BSA綴合物的5-FU抗體的量，將用0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞在PBS中稀釋為預(yù)定的比活性(約1/2000)、能特異結(jié)合鼠類免疫球蛋白當且用底物溫育時產(chǎn)生有色產(chǎn)物的100μL的山羊抗小鼠抗體-HRP酶綴合物(Jackson Immunoresearch)添加到各孔中。在室溫下?lián)u動溫育10分鐘后，在該期間山羊抗小鼠抗體-HRP酶綴合物在孔中結(jié)合5-FU抗體，再洗滌該板三次以除去未結(jié)合的第二綴合物。為了顯出孔中的可測顏色，洗滌后接著添加100μL用于HRP的底物TMB(TMB Liquid Substrate，Sigma或BioFx)，以在室溫下?lián)u動溫育10分鐘顯色。顯色溫育后，向各孔中添加50μL終止液(在去離子水中1.5％的氟化鈉)，以終止顯色，搖動10秒后測定650nm(Molecular Devices Plate Reader)時的吸光度?？字锌贵w的量與所測的吸光度是成比例的，且與樣品中5-FU的量成反比。將含有分析物的孔中顏色的吸光度與沒有分析物的作比較，產(chǎn)生標準曲線。給定分析物的IC50值定義為要求抑制不含有分析物的孔的50％的吸光度的分析物的濃度。將給定分析物的交叉反應(yīng)性計算為表達成百分比的5-FU的IC50與尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶和喃氟啶的IC50比例。當用實施例6b的免疫原在實施例9中產(chǎn)生的單克隆抗體測量時，相對于5-FU，尿嘧啶的百分比交叉反應(yīng)性小于8％，胞嘧啶的小于0.01％，喃氟啶的約為1％且胸腺嘧啶小于4％。結(jié)果列于表II中。
表1使用多克隆抗體具有相關(guān)化合物的5-氟尿嘧啶免疫測定的交叉反應(yīng)性 表2用3-取代的-5-FU化合物-BSA綴合物(實施例7b)包被的平板使用3-取代的-KLH(實施例6b)的單克隆抗體的5-氟尿嘧啶免疫測定的交叉反應(yīng)性 這些表中的結(jié)果證明由式II-A的化合物形成免疫原以及由式II-A或II-B的化合物形成的試劑的重要性。從這些結(jié)果可以看出，當免疫原是由式II-A而不是由II-B形成時，產(chǎn)生不與喃氟啶交叉反應(yīng)的抗體。是通過由式II-A化合物的免疫原提供的抗體以及由II-A或II-B的化合物提供的試劑載體產(chǎn)生了準確的5-FU免疫測定，以監(jiān)控用5-FU治療的患者。
權(quán)利要求
1.一種檢測樣品中5-氟-尿嘧啶的免疫測定，該免疫測定包括提供以下混合物，a)樣品，b)基本上不與喃氟啶交叉反應(yīng)的、與5-氟-尿嘧啶選擇性反應(yīng)的抗體，和c)載體與式II-B的化合物、或式II-A的化合物或者它們的混合物的綴合物；使樣品中的5-氟-尿嘧啶和所述綴合物與所述抗體結(jié)合以及隨后測量在所述結(jié)合或未結(jié)合所述抗體的混合物中所述綴合物的量，由此可以測定樣品中5-氟-尿嘧啶的存在，
其中，Y為有機間隔基團；
X為能結(jié)合到所述載體的末端官能團；并且p為0-1的整數(shù)；
其中X、Y和p與上述相同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品為人樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫測定，其中所述抗體由含有免疫原性載體的免疫原產(chǎn)生，所述免疫原性載體含有與下式化合物綴合的多胺聚合物
其中p、X和Y與上述相同。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫測定，其中所述抗體結(jié)合到固體載體上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫測定，其中所述固體載體為微量滴定板。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫測定，其中所述固體載體為納米粒子。
7.一種選擇性地結(jié)合到5-氟-尿嘧啶且基本上不結(jié)合到喃氟啶的抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體，其中所述抗體為單克隆抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體，其中所述抗體衍生自小鼠、兔子或大鼠。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗體，其中所述抗體與尿嘧啶和胞嘧啶基本上不交叉反應(yīng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體，其中，所述抗體衍生自免疫原性載體，所述免疫原性載體含有綴合到下式化合物的多胺聚合物
其中，Y為有機間隔基團；
X為能結(jié)合多胺聚合物的末端官能團；并且
p為0-1的整數(shù)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的抗體，其中所述抗體為單克隆抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的抗體，其中所述抗體衍生自小鼠、兔子或大鼠。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗體，其中所述抗體與尿嘧啶和胞嘧啶基本上不交叉反應(yīng)。
15.一種下式的化合物
其中，Y為有機間隔基團；
X為能結(jié)合載體的末端官能團；并且
p為0-1的整數(shù)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的化合物，其中p為0。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的化合物，其中X為
-N＝C＝R4或
其中R3為氫或者與它的附著氧原子一起形成反應(yīng)性酯，且R4為氧或硫。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的化合物，其中X為
且R3為氫。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的化合物，其中X為
且R3形成反應(yīng)性酯。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的化合物，其中所形成的酯為低級烷基酯、亞氨酸酯或者氨基酯。
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的化合物，其中p是1。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的化合物，其中Y為含有1-10個碳原子的亞烷基，
-NH-(CH2)m-或者
其中，n和o為0-6的整數(shù)，m為1-6的整數(shù)。
23.一種下式的化合物或其混合物
其中，Y為有機間隔基團；
X為能結(jié)合載體的末端官能團；并且p為0-1的整數(shù)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的化合物，其中p為0。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的化合物，其中X為
-N＝C＝R4或
其中R3為氫或者與它的附著氧原子一起形成反應(yīng)性酯，且R4為氧或硫。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的化合物，其中X為
且R3為氫。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的化合物，其中X為
且R3形成反應(yīng)性酯。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的化合物，其中所形成的酯為低級烷基酯、亞氨酸酯或者氨基酯。
29.根據(jù)權(quán)利要求23所述的化合物，其中p為1。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的化合物，其中X為
-N＝C＝R4或
其中R3為氫或者與它的附著氧原子一起形成反應(yīng)性酯，且R4為氧或硫。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的化合物，其中Y為含有1-10個碳原子的亞烷基，
-NH-(CH2)m-或者
其中，n和o為0-6的整數(shù)，m為1-6的整數(shù)。
32.一種載體與下式化合物的綴合物
其中，Y為有機間隔基團；
X為能結(jié)合載體的末端官能團；并且
p為0-1的整數(shù)。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的綴合物，其中p為0。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的綴合物，其中X為
-N＝C＝R4或
其中R3為氫或者與它的附著氧原子一起形成反應(yīng)性酯，且R4為氧或硫。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的綴合物，其中p為1且Y為含有1-10個碳原子的亞烷基，
-NH-(CH2)m-或者
其中n和o為0-6的整數(shù)，m為1-6的整數(shù)。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的綴合物，其中所述載體含有由
或
連接的一個或多個氨基，其中R4為氧或硫。
37.一種載體與下式化合物的綴合物
其中，Y為有機間隔基團；
X為能結(jié)合載體的末端官能團；并且
p為0-1的整數(shù)；
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的綴合物，其中p為0。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的綴合物，其中X為
-N＝C＝R4或
其中R3為氫或者與它的附著氧原子一起形成反應(yīng)性酯，且R4為氧或硫。
40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的綴合物，其中p為1。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的綴合物，其中Y為含有1-10個碳原子的亞烷基，
-NH-(CH2)m-或者
其中n和o為0-6的整數(shù)，m為1-6的整數(shù)。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的共軛物，其中X為
-N＝C＝R4或
其中R3為氫或者與它的附著氧原子一起形成反應(yīng)性酯，且R4為氧或硫。
43.一種含有免疫原性載體的免疫原，所述免疫原性載體含有連接到下式化合物的多胺聚合物
其中，Y為有機間隔基團；
X為能結(jié)合多胺聚合物的末端官能團；并且
p為0-1的整數(shù)。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的免疫原，其中p為0。
45.根據(jù)權(quán)利要求43所述的免疫原，其中所述p為1。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的免疫原，其中Y為含有1-10個碳原子的亞烷基，
-NH-(CH2)m-或者
其中n和o為0-6的整數(shù)，m為1-6的整數(shù)。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的免疫原，其中所述免疫原性聚合物含有由
或
連接的一個或多個氨基，
其中R4為氧或硫。
48.一種用于測定患者樣品中5-氟-尿嘧啶的存在的試劑盒，該試劑盒包括在分隔的容器中的試劑，試劑中的一種為載體與式II-B的化合物、或者II-A化合物或者它們的混合物的綴合物；
并且第二容器含有基本上與5-氟-尿嘧啶選擇性反應(yīng)并且基本上與喃氟啶和尿嘧啶不交叉反應(yīng)的抗體，
其中，Y為有機間隔基團；
X為能結(jié)合載體的末端官能團；并且
p為0-1的整數(shù)；
其中X、Y和p與上述相同。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的試劑盒，其中所述綴合物在所述第一容器中以預(yù)定量存在。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的試劑盒，其中所述試劑盒用于測定所述樣品中5-氟-尿嘧啶的量。
51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的試劑盒，其中所述抗體由免疫原性多胺多肽的免疫原產(chǎn)生，所述免疫原性多胺多肽鏈接到下式的化合物
其中p、X和Y與上述相同。
全文摘要
新型5-氟-尿嘧啶的綴合物和新型5-氟-尿嘧啶免疫原以及由這些免疫原產(chǎn)生的單克隆抗體，這些免疫原用于定量和監(jiān)控生物分泌物中5-氟-尿嘧啶的免疫測定。
文檔編號G01N33/53GK101147063SQ200680009624
公開日2008年3月19日 申請日期2006年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月8日
發(fā)明者S·薩拉莫內(nèi), J·B·考特尼, D·斯托克 申請人:薩拉戴克斯生物醫(yī)學(xué)公司