專利名稱：檢測錯(cuò)折疊蛋白和朊病毒的方法
檢測錯(cuò)折疊蛋白和朊病毒的方法 與相關(guān)申請的交叉引用本發(fā)明依賴于2005年2月15日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/652,733 的申請日，并要求該申請的申請日的利益，其公開的全部內(nèi)容在此引入作為參考。發(fā)明背景本發(fā)明涉及在生物樣品中檢測蛋白質(zhì)的領(lǐng)域，更詳細(xì)地說，本發(fā)明涉及 ;險(xiǎn)測包含生物物質(zhì)的樣品中蛋白質(zhì)和朊病毒的方法和試劑盒，以及這些方法 和試劑盒所用的組合物。已經(jīng)確定或假定影響人類和動(dòng)物的許多疾病和病癥與錯(cuò)折疊的細(xì)胞蛋白 有關(guān)。天然發(fā)生的正常細(xì)胞蛋白的錯(cuò)折疊被認(rèn)為引起蛋白失去活性，或在很 多情況下，行為失常。正常細(xì)胞蛋白的錯(cuò)折疊經(jīng)常在受影響的細(xì)胞內(nèi)引起高 分子量沉積物或斑塊的形成。已知的或被認(rèn)為和正常細(xì)胞蛋白的此類錯(cuò)折疊 有關(guān)的疾病包括阿爾茨海默病(Alzheimer's disease , ( AD ))，其中A- (3蛋白 (淀粉狀蛋白(3)與其有關(guān)；腦淀粉狀血管病(cerebral amyloid angiopathy, (CAA));帕金森病(Parkinson's Disease),其中Lewy小體中的a-觸突核蛋 白沉積物與其有關(guān)；皮克病(Pick's Disease)牙口前顳癡呆(frontal temporal dementia),其中t蛋白與其有關(guān)；肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(Amylotrophic Lateral Sclerosis, (AML)),其中超氧化物岐化酶與其有關(guān)；亨廷頓病 (Huntington's Disease),其中亨廷頓蛋白與其有關(guān)；以及各種傳染性海綿狀腦 病 (Transmissible Spongiform Encephalopathies, TSE)), 如克雅病 (Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)), 變體克雅病 (variant Creutzfeldt畫Jakob disease, vCJD)， 牛海纟帛狀腦病(Bovine Spongiform Encephalopathy, BSE; 瘋牛 病)，其中朊病毒蛋白與其有關(guān)。與錯(cuò)折疊蛋白以及這些蛋白的相關(guān)沉積物及斑塊有關(guān)的許多疾病和病癥 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和病癥。的確，大多數(shù)疾病和病癥本質(zhì)上是神經(jīng)變性性 的，引起神經(jīng)細(xì)胞功能降低或神經(jīng)細(xì)胞死亡。由錯(cuò)折疊蛋白形成沉積物或斑
塊的機(jī)制以及沉積物或斑塊形成與和疾病有關(guān)的神經(jīng)變性過程之間的關(guān)系并 不是很清楚。形成斑塊的蛋白中的一類蛋白是朊病毒蛋白。目前，朊病毒蛋白是研究 的熱點(diǎn)，因?yàn)槠渑c農(nóng)業(yè)動(dòng)物和人類種群的神經(jīng)變性疾病有關(guān)，以及它們明顯 的通過生物物質(zhì)從一個(gè)動(dòng)物或人傳遞到另一個(gè)動(dòng)物或人，包括明顯的跨物種 傳遞。廣泛認(rèn)為朊病毒一一其是神經(jīng)變性疾病的感染媒介——其實(shí)完全是蛋白 質(zhì)的，并且已推測朊病毒蛋白是已知作為朊病毒的實(shí)體。朊病毒蛋白是稱為PrP27-30或PrpC的蛋白質(zhì)。其為大約28 KD的疏水糖蛋白，當(dāng)錯(cuò)折疊時(shí)，其 聚集成感染的大腦中作為斑塊或沉積物被發(fā)現(xiàn)的桿狀絲。朊病毒通常作為無 害的細(xì)胞蛋白存在。然而，朊病毒擁有變換其結(jié)構(gòu)并且導(dǎo)致人和動(dòng)物幾種癡 呆型致死性腦病的固有能力。占主導(dǎo)地位的假說是，和所有其它的感染性的 病原體不同，感染是由朊病毒蛋白非正常構(gòu)象引起的，該非正常構(gòu)象克當(dāng)模 板并將正常的朊病毒構(gòu)象變換為不正常的構(gòu)象。已經(jīng)克隆、測序并在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)了編碼朊病毒蛋白的完整基因。 PrPc由單拷貝的細(xì)胞基因編碼，且通常發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)元的外表面，通過蛋白質(zhì) C末端部分的糖脂部分附著于膜。已知發(fā)生蛋白從表面到內(nèi)部的循環(huán)，但此 循環(huán)的功能未被闡明。通過至今不清楚的翻譯后過程，在一定條件下，從正 常的PrpC形成PrpSc。于是發(fā)生神經(jīng)變性疾病，該過程在人類中可需要多達(dá)數(shù) 十年才變得臨床上明顯。從神經(jīng)變性疾病感染到顯示臨床癥狀在時(shí)間上的延遲是受到高度關(guān)注的 原因，因?yàn)檫@種延遲能容許疾病從一個(gè)個(gè)體向其它個(gè)體發(fā)生不為人察覺的傳 播。例如，該延遲可使得感染朊病毒的動(dòng)物遭到屠宰，并且使得潛在有傳染 性的產(chǎn)品從該動(dòng)物進(jìn)入動(dòng)物或人類食物流。同樣，該延遲可使得受感染的人 將有傳染性的物質(zhì)通過血液或器官捐獻(xiàn)傳遞給其它人。因此，監(jiān)視動(dòng)物或動(dòng)物產(chǎn)品(如肉類)和監(jiān)視獲得自人類的醫(yī)療樣品(例如血液捐獻(xiàn)和器官捐獻(xiàn))以 減少或排除朊病毒蛋白從受感染的個(gè)體向其它個(gè)體傳遞的可能性，對健康部 門、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及普通公眾都非常重要。通過許多方法可以區(qū)分正常的細(xì)胞蛋白(PrPc)與錯(cuò)折疊的有傳染性的蛋 白(PrpSc),最常見的是對蛋白酶如蛋白酶K降解的易感性或抵抗性，以及用 針對一種形式或其它形式的蛋白產(chǎn)生的抗體在蛋白酶消化之前或之后檢測。
許多目前用于檢測朊病毒相關(guān)的感染存在的技術(shù)依賴于腦中總的形態(tài)變 化，或免疫化學(xué)技術(shù)，該技術(shù)通常僅在臨床癥狀明顯后應(yīng)用，并且該技術(shù)要 求活組織檢查材料或死后取得的材料。當(dāng)然，等到腦中總的形態(tài)變化明顯時(shí)， 一個(gè)人可能已經(jīng)通過血液捐獻(xiàn)或器官或組織捐獻(xiàn)，將有傳染性的顆粒傳染至 其它人。同樣，等到動(dòng)物組織的死后分析完成時(shí)，來自該動(dòng)物的產(chǎn)品可能已 經(jīng)進(jìn)入食物流，并潛在地感染了其它動(dòng)物或甚至人類。毒蛋白的錯(cuò)折疊形式的催化增殖。例如，公布的美國專利申請2005/0026165 Al,其全部內(nèi)容在此引入作為參考，公開了肽探針檢測樣品中小量錯(cuò)折疊蛋 白的用途。在2005/0026165 Al中，將具有與錯(cuò)折疊蛋白結(jié)合的序列的肽與懷 疑含有錯(cuò)折疊蛋白的樣品接觸。如果存在錯(cuò)折疊蛋白，則探針和錯(cuò)折疊蛋白 結(jié)合。結(jié)合引起探針中構(gòu)象變化，該變化使得該探針和其它的探針分子結(jié)合。 其它探針分子與錯(cuò)折疊蛋白-探針復(fù)合物的結(jié)合引起新結(jié)合的探針的構(gòu)象變 化，其將新結(jié)合的探針分子轉(zhuǎn)變?yōu)槟芘c混合物中另 一個(gè)探針分子結(jié)合的構(gòu)象。 當(dāng)目標(biāo)錯(cuò)折疊蛋白存在時(shí)，探針的設(shè)計(jì)允許產(chǎn)生可檢測信號(hào)。盡管本領(lǐng)域存在許多檢測錯(cuò)折疊蛋白如有傳染性的朊病毒蛋白的技術(shù)，仍存有對快速、廉價(jià)、可靠、可重復(fù)、易于使用和/或提供改進(jìn)的靈敏度的改 進(jìn)技術(shù)的需要。改進(jìn)靈敏度實(shí)際上涉及所有其它的需求。而且，需要通過高 通量試劑盒便利地實(shí)施這種技術(shù)。發(fā)明概述本發(fā)明專注于本領(lǐng)域的需要，包括通過提供檢測構(gòu)象改變的蛋白如朊病 毒的方法和試劑盒增加纟企測靈#文度，該病毒與神經(jīng)變性疾病和病癥的任一成 員有關(guān)。構(gòu)象依賴性肽，如那些被設(shè)計(jì)來模擬將Prpc轉(zhuǎn)變?yōu)镻rP^也稱為 PrPTSE，并與PrPTSE同等使用)的折疊反應(yīng)的被標(biāo)記肽，為針對錯(cuò)折疊蛋白如 PrpSG的高敏感診斷試驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。由于信號(hào)擴(kuò)增獲得高靈敏性，因?yàn)榱硗?的肽，如被標(biāo)記的肽，在目標(biāo)富集的溶液中被募集，以經(jīng)歷類似的構(gòu)象變化， 使有效檢測含有錯(cuò)折疊蛋白的動(dòng)物和人類的血液或其它組織中的錯(cuò)折疊蛋白 如PrpSe成為可能，例如那些感染了某些與PrpK有關(guān)的疾病或患有阿爾茨海 默病的動(dòng)物或人類。在本發(fā)明的許多用途中，該方法和試劑盒可用于從人類或動(dòng)物中篩選存
在錯(cuò)折疊蛋白的樣品。另外，該方法和試劑盒可用于診斷目的，如"^斷具有 與錯(cuò)折疊蛋白如朊病毒蛋白有關(guān)的疾病或病癥的動(dòng)物或人類。該方法和試劑 盒可進(jìn)一步用于監(jiān)視隨時(shí)間的個(gè)體內(nèi)錯(cuò)折疊蛋白的量。通常，該方法和試劑 盒可與任一探針或一套探針一起使用，該探針允許包含錯(cuò)折疊蛋白的樣品中 錯(cuò)折疊蛋白構(gòu)象的催化增殖。因此，該方法和試劑盒廣泛應(yīng)用于許多疾病和 病癥的檢測，特別是那些性質(zhì)上為神經(jīng)變性的疾病和病癥。


圖1一般性地描繪了依據(jù)本發(fā)明所用的催化增殖試驗(yàn)。圖2描繪了本發(fā)明所用的標(biāo)準(zhǔn)催化增殖試驗(yàn)的結(jié)果。圖3描繪了依據(jù)本發(fā)明的方法層析分離探針和錯(cuò)折疊朊病毒蛋白復(fù)合物 的結(jié)果。圖4描繪了如本發(fā)明所實(shí)施的濃縮的綿羊血漿，包括PBS對照的標(biāo)準(zhǔn)催 化增殖試驗(yàn)的結(jié)果。圖5描繪了用人類血漿樣品進(jìn)行的本發(fā)明的選擇性捕獲實(shí)施例的結(jié)果。 圖6描繪了選擇性捕獲錯(cuò)折疊蛋白診斷學(xué)(MPD)的方案劑量反應(yīng)。 圖7描繪了用綿羊血清樣品進(jìn)行的選擇性捕獲結(jié)果。 圖8描繪了從包含磁珠的固相連續(xù)洗滌捕獲的sCJD底物的效果。發(fā)明詳述本公開描述了檢測樣品中錯(cuò)折疊蛋白的方法和試劑盒。除非另有說明， 在此所用的所有術(shù)語具有生物技術(shù)、蛋白質(zhì)生物化學(xué)、以及醫(yī)學(xué)診斷學(xué)領(lǐng)域 內(nèi)通常的意義。如在此所用的，且與科學(xué)文獻(xiàn)中的用法一致，術(shù)語"朊病毒，，以及"朊 病毒蛋白，，交互使用以表示引起動(dòng)物和人類神經(jīng)變性疾病狀態(tài)的蛋白質(zhì)性物 質(zhì)。朊病毒和朊病毒蛋白交互使用以表示蛋白質(zhì)的正常細(xì)胞構(gòu)象和有傳染性 的或引起疾病的構(gòu)象。為了有助于清楚說明，使用特別的形式用PrpC表示 正常的細(xì)胞構(gòu)象，用Prpse表示引起疾病的構(gòu)象。術(shù)語"朊病毒"、"朊病毒蛋白"、和"PrpSc蛋白，，及其類似物在此交互 使用，以指PrP蛋白的易傳染的PrpSe形式。微粒主要包含，如果不是唯一包 含，PrP基因編碼的PrpSe分子組成的。朊病毒與細(xì)菌、病毒和類病毒不同。 已知的朊病毒感染動(dòng)物并引起綿羊瘙癢病(Scrapie), —種可傳染的綿羊和山 羊神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病，還引起牛海綿狀腦病(BSE)或"瘋牛病"，以及引起 貓的貓科動(dòng)物海綿狀腦病。四種已知的感染人類的朊病毒是(l)庫魯癥(kuru)、 (2)克雅病(Creutzfeldt-Jakob Disease) ( CJD ) 、 (3) GSS 綜合征 (Gerstmann-Straussler-Scheinker-Disease, GSS)以及(4)致死性家族失眠癥(fatal familial insomnia, FFI)。如在此所用的，"朊病毒，，包括在任何動(dòng)物特別是人有形式。"蛋白質(zhì)"指兩個(gè)或多個(gè)單個(gè)氨基酸(無論是否天然存在的)經(jīng)由肽鍵連 接的的任何聚合物，且當(dāng)連接于一個(gè)氨基酸(或氨基酸殘基)的a碳原子的羧酸 基的羧基碳原子與和相鄰氨基酸的a-碳原子連接的氨基的氨基氮原子共價(jià)連 接時(shí)出現(xiàn)。這些肽鍵以及包含它們的原子(即a-碳原子、羧基碳原子(和它們 的取代氧原子)以及氨基氮原子(和它們的取代氫原子))形成蛋白質(zhì)的多肽骨架 木。術(shù)語"蛋白質(zhì)"在其涵義內(nèi)可以理解為包括術(shù)語"多肽"以及"肽"(其 在此可交互使用)。另外，包含多種多肽亞單位或其它組分(例如RNA分子， 如在端粒末端轉(zhuǎn)移酶中出現(xiàn)的)的蛋白質(zhì)也可以理解為包括于在此所用的"蛋 白質(zhì)，，的含義內(nèi)。同樣，蛋白質(zhì)和多肽片段也在本發(fā)明范圍內(nèi)，且可在此稱 為"蛋白質(zhì)"。"構(gòu)象"指特殊的蛋白構(gòu)象，如，a-螺旋、平行及反平行P-鏈、亮氨酸 拉鏈、鋅指等。另外，構(gòu)象限制可包括沒有其他結(jié)構(gòu)信息的氨基酸序列信息。 "構(gòu)象改變"是從一種構(gòu)象到另一種構(gòu)象的變化。"構(gòu)象改變的蛋白質(zhì)，，是所有具有單一的初級氨基酸序列、但在個(gè)體內(nèi) 或體外既以正常的三維構(gòu)象又以與疾病有關(guān)的三維構(gòu)象存在的蛋白質(zhì)。構(gòu)象 改變的蛋白質(zhì)以任何可^r測方式與疾病有關(guān)。例如，它可引起疾病，可以是 疾病癥狀的因子，或存在于生物樣品中或體內(nèi)作為引起疾病的其它物質(zhì)的結(jié) 果，或是疾病的結(jié)果。構(gòu)象改變的蛋白質(zhì)既具有正常構(gòu)象又具有各種錯(cuò)折疊 構(gòu)象。還不清楚蛋白序列編碼正確折疊的確切機(jī)制。為了獲得折疊所編碼的天 然狀態(tài)，蛋白質(zhì)分子必須轉(zhuǎn)變?yōu)檫x自許多供選擇的可能性的唯一構(gòu)象。功能 性蛋白通常是可溶的，且可采用多種結(jié)構(gòu)，包括巻曲以及有序元件。有序元件包括a-螺旋，其在如肌紅蛋白和血紅蛋白等蛋白質(zhì)中占主導(dǎo)地位。在人類 老化過程中，在一些蛋白中，可溶性結(jié)構(gòu)(如a-螺旋區(qū))構(gòu)象改變成(3-片層結(jié) 構(gòu)，該(3-片層結(jié)構(gòu)發(fā)生與功能喪失有關(guān)的聚合。"構(gòu)象探針"是具有與目標(biāo)錯(cuò)折疊蛋白中出現(xiàn)的序列足夠相似的氨基酸 序列、以允許探針和目標(biāo)蛋白(通過任何已知的方式，如疏水相互作用或范德 瓦耳斯相互作用)結(jié)合的肽。構(gòu)象探針與錯(cuò)折疊蛋白的結(jié)合引起探針(或存在的 探針分子的一部分)從一種構(gòu)象改變?yōu)榱硪环N構(gòu)象，該構(gòu)象與當(dāng)探針與錯(cuò)折疊 蛋白接觸時(shí)所處的構(gòu)象不同。盡管非必須，但構(gòu)象探針在與錯(cuò)折疊蛋白結(jié)合 時(shí)可主要采用(3-片層構(gòu)象。構(gòu)象探針可以，但非必須，用可檢測標(biāo)記物如焚 光部分進(jìn)行標(biāo)記。"標(biāo)記物"指能檢測的分子，包括放射性同位素、熒光劑、發(fā)光劑 (luminescers)、化學(xué)發(fā)光劑、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、發(fā)色團(tuán)、染 料、金屬離子、金屬溶膠、配體如生物素以及其類似物。術(shù)語"熒光劑，，指 在可檢測范圍內(nèi)能顯示熒光的物質(zhì)或其一部分。可用于本發(fā)明的標(biāo)記的具體 實(shí)例包括，但不限于，熒光素、羅丹明、丹?；?dansyl)、傘形酮、德克薩斯 紅、魯米諾、acradimum esters、 NADPH、卩-半乳糖苦酶、辣根過氧化物酶、 葡糖氧化酶、堿性磷酸酶以及脲酶。標(biāo)記也可以為表位標(biāo)簽(如His-His標(biāo)簽)、 抗體或可檢測的寡核苷酸。至少有20種當(dāng)采用構(gòu)象改變的狀態(tài)時(shí)與人類疾病有關(guān)的蛋白質(zhì)。朊病毒 蛋白(Prpc)的正常野生型的形式優(yōu)選單體狀態(tài)，然而異常的引起疾病的形式 (Prpse)更易于采取多聚體狀態(tài)。本發(fā)明雖然集中于朊病毒檢測，但也同樣適 用于所有與采用構(gòu)象改變狀態(tài)的蛋白質(zhì)有關(guān)的疾病和病癥。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以通過多種試驗(yàn)或計(jì)算的方式測定，其中的幾個(gè)在下文描 述。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以用實(shí)驗(yàn)的方式通過任何能產(chǎn)生至少低分辨率結(jié)構(gòu)的方法 評價(jià)。目前這樣的方法包括X-射線衍射晶體分析法以及核》茲共振(NMR)光譜 學(xué)。NMR使生物分子的溶液構(gòu)象(而不是晶體結(jié)構(gòu))的測定成為可能。通常， 通過NMR光i普學(xué)測定的生物分子結(jié)構(gòu)與通過晶體學(xué)測定的相比具有適度的 分辨率。在研究生物分子結(jié)構(gòu)中，其它的有用的技術(shù)包括圓二色性(circular dichroism， CD)、焚光以及紫外可視吸收光譜。這些技術(shù)的詳細(xì)描述請參閱， 例如弗里曼/^司出片反的《Physical Biochemistry: Application to Biochemistry and Molecular Biology》 (W.H. Freeman & Co., 1982, Physical Biochemistry: Application to Biochemistry and Molecular Biology,2n .New York, NY)。依據(jù)本 發(fā)明，可以使用任何適合的技術(shù)。"等同物"指在序列上與待分析的蛋白質(zhì)的氨基酸序列相似，但具有至 少一個(gè)、但少于五個(gè)不同、替換、添加或缺失的氨基酸序列。因此，在一個(gè) 給定的序列中不實(shí)質(zhì)改變氨基酸基本功能的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換對描述本 發(fā)明的目的而言是等同的。"同源性"、"與......同源"、"同源物"、"同一性"以及"相似性"指兩個(gè)肽之間的序列相似性，其中同一性為更嚴(yán)格的比較。可通過比較可為了比 較的目的而進(jìn)行排列的每一序列中的位置而確定同源性和同一性。當(dāng)被比序 列中的位置被相同的氨基酸占據(jù)時(shí)，那么分子在該位置是相同的。氨基酸序 列同一性的程度是在氨基酸序列共有的位置上相同氨基酸的數(shù)量的函數(shù)。氨 基酸序列同源性或相似性的程度是氨基酸數(shù)量的函數(shù)，即，在氨基酸序列共 有的位置上結(jié)構(gòu)上相關(guān)的。"非同源性的"序列與本發(fā)明所用序列之一具有不 到40%同一性，盡管優(yōu)選不到25%的同一性。相關(guān)的序列具有多于40%的 同一性，優(yōu)選至少約50%的同一性，更優(yōu)選至少約70。/。的同一性，再更優(yōu)選 至少90 %的同 一性，以及最優(yōu)選至少99 %的同 一性。術(shù)語"百分之......相同"指兩個(gè)氨基酸序列之間的序列同一性?？赏ㄟ^比較可為了比較的目的而進(jìn)行排列的每一序列中的位置而確定同源性和同一 性。當(dāng)被比序列中的等同位置被相同氨基酸占據(jù)時(shí)，分子在該位置是相同的； 當(dāng)?shù)韧恢脼橄嗤蛳嗨频陌被釟埢?例如在立體和/或電子特性上相似) 占據(jù)時(shí)，那么分子在該位置上可以稱為同源的(相似的)。同源性、相似性或同 一性百分比的表述指在為被比序列共有的位置上相同或相似氨基酸數(shù)量的函 數(shù)?？梢允褂酶鞣N排列運(yùn)算法則和/或程序，包括FASTA、BLAST或ENTREZ。 FASTA以及BLAST可以作為GCG序歹'J分析軟件包(University of Wisconsin, Madison, WI)的一部分獲得，且可以使用，例如缺省設(shè)置。ENTREZ可通過 National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda， MD獲得。如在此所用的術(shù)語"相互作用，，和"結(jié)合"意指分子間可檢測的相互作 用(如生物化學(xué)的相互作用)，例如，本質(zhì)上為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)-核 酸之間、核酸-核酸之間以及蛋白質(zhì)-小分子之間或核酸-小分子之間的相互作 用。
除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施將釆用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)化學(xué)、生物化學(xué)、分 子生物學(xué)、免疫學(xué)、醫(yī)學(xué)以及藥物學(xué)的常規(guī)方法?？赏ㄟ^參考當(dāng)前的文獻(xiàn)理解jt匕類4支術(shù),^口 M""/z。(is1 /"五"z少附o/ogy Vol. 278: Fluorescence Spectroscopy (L. Brand and M丄.Johnson, Eds" Academic Press, Inc., 1997) 、 Me^20tfo z力 E"zymo/ogy Vol. 309: Amyloid, Prions and Other Protein Aggregates (R. Wetzel, Ed. Academic Press, Inc., 1999)、 //aw必(9c^ Er/ er/膨"to/ 7ww柳o/c^， Vols.I-IV(D.M. Weir and C.C. Balckwell, Eds"1986, Blackwdl Scientific Publications)以及Z/a"必ooA: <5"w ^ce "w/ Co〃o/t/a/ C7zem^" (Birdi, K.S., Ed. CRC Press, 1997)。在本發(fā)明的第一方面中，提供了檢測樣品中錯(cuò)折疊蛋白的存在和/或量的 方法。通常，該方法包括提供包含或懷疑包含錯(cuò)折疊蛋白，如朊病毒的樣品； 提供至少一種構(gòu)象探針；將樣品和構(gòu)象探針混合以產(chǎn)生混合物；溫育混合物 足夠長的時(shí)間，以使得至少一分子錯(cuò)折疊蛋白以及至少一分子探針相結(jié)合， 以形成復(fù)合物；將混合物暴露于使復(fù)合物與混合物中至少一種其它物質(zhì)分離、 至少部分分離的條件下；檢測至少 一種探針和錯(cuò)折疊蛋白之間的聯(lián)系是否存 在，其中所說的檢測優(yōu)選通過加入第二種構(gòu)象探針以擴(kuò)大分析信號(hào)而得以加 強(qiáng)。當(dāng)然，在本方面的各種實(shí)施例中，這些步驟可以以不同順序進(jìn)行以獲得 所期望的目標(biāo)。依據(jù)本發(fā)明的方法，提供可以是任何導(dǎo)致包含或懷疑包含錯(cuò)折疊蛋白、 或包含存在且可以用于本方法的構(gòu)象探針的樣品的活性。因此，提供可以包 括從個(gè)體中移除組織、器官、身體部分或液體。同樣它可包括從獲得樣品的 個(gè)人、企業(yè)或政府機(jī)構(gòu)獲得生物樣品，例如血液或肉類。另外，它也包括取 得獲得自個(gè)體樣品，并以某種方式加工該樣品，如除去一種或多種生物物質(zhì) 或其它物質(zhì)。盡管本發(fā)明包括在樣品和探針結(jié)合前就對樣品進(jìn)行加工，但在 一些實(shí)施例中，并不進(jìn)行此類加工。至于提供至少一種構(gòu)象探針，此種提供 可包含用任何適合的技術(shù)合成一種或多種構(gòu)象探針，獲得通過另 一技術(shù)合成 的一種或多種探針，以及獲得兩種或多種探針的混合物、或至少一種探針和 污染物，接著至少在某一程度上從污染物中純化探針。樣品可以為包含或懷疑包含錯(cuò)折疊蛋白的任何樣品。懷疑包含錯(cuò)折疊蛋 白的樣品可以是取自存在與錯(cuò)折疊蛋白有關(guān)的疾病或病癥的任何動(dòng)物或人的 樣品。因此，懷疑的程度不需要很高；只要知道或者懷疑樣品所來自的個(gè)體 處于遭受與錯(cuò)折疊蛋白有關(guān)的疾病或病癥風(fēng)險(xiǎn)的種群中就足夠了 。樣品的實(shí)例包括但不限于，血液或血液產(chǎn)品或血液副產(chǎn)品；神經(jīng)組織，包括^f旦不限于 腦組織，肉類或肉類副產(chǎn)品；皮膚或皮膚產(chǎn)物(包括粘膜)；腸衣(intestine casings); 奶；以及尿液。在某些實(shí)施例中，與檢測錯(cuò)折疊蛋白的方法同時(shí)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)對照反 應(yīng)。在這些實(shí)施例中，對照反應(yīng)被認(rèn)為是本方法的一部分，盡管它們可以但 非必須在單獨(dú)的反應(yīng)容器中進(jìn)行。對照反應(yīng)可以是陽性對照，也可以是陰性 對照。可進(jìn)行任何數(shù)量的對照以鑒定或者監(jiān)視用于本發(fā)明方法中的任何步驟 或任何組分的進(jìn)行。在某些陽性對照中，已知提供的樣品具有至少一種錯(cuò)折 疊蛋白，因此被用于監(jiān)視反應(yīng)的成功，以及在適當(dāng)時(shí)用于監(jiān)視反應(yīng)的靈敏性。 在某些陰性對照中，已知樣品不包含錯(cuò)折疊蛋白(例如蒸餾水或基于水的緩沖 液)。而且，在某些實(shí)施例中，進(jìn)行一系列的對照反應(yīng)以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，將目 的樣品與其進(jìn)行比較。正如本領(lǐng)域?qū)τ跈z測樣品中物質(zhì)的其它試驗(yàn)所已知的， 可在檢測錯(cuò)折疊蛋白方法之前、與檢測錯(cuò)折疊蛋白方法同時(shí)或在檢測錯(cuò)折疊 蛋白方法之后進(jìn)行對照反應(yīng)。構(gòu)象探針可以為任何滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的構(gòu)象探針。各種適宜的示例性探針 公開于公布的美國專利申請2005/0026165 A1中，其全部內(nèi)容在此《I入作為參 考。優(yōu)選的構(gòu)象探針在此將在下文描述。構(gòu)象探針可以作為單一探針提供(即 相同肽的集合，其都具有相同的氨基酸序列)或可包括多個(gè)不同的探針(即兩個(gè) 或多個(gè)具有不同氨基酸序列的肽的集合，每一個(gè)肽以多拷貝出現(xiàn))。在優(yōu)選的 實(shí)施例中，將一個(gè)或多個(gè)構(gòu)象探針用可檢測的部分標(biāo)記。可檢測標(biāo)記的實(shí)例 包括但不限于，發(fā)光標(biāo)記、萸光標(biāo)記、放射性標(biāo)記以及免疫原性標(biāo)記。可以任何形式提供探針，包括但不限于，在水中的純?nèi)芤?、干粉、或水或有機(jī)液體中的分散體。因此，它們可以以組合物提供，所述組合物僅包含純化的探針、不同序列的純化的探針的混合物、或未純化的探針、或探針與一種或多種非探針物質(zhì)(如緩沖液、液體或檢測試劑)的混合物。探針可以包含單個(gè)標(biāo)記或多個(gè)標(biāo)記。在某些實(shí)施例中，每個(gè)探針上提供兩個(gè)或多個(gè)標(biāo)記。例如，本發(fā)明的一個(gè)探針可包含附著于探針的每一末端(N-末端以及C-末端)的標(biāo)記。在一些實(shí)施例中，探針在與目標(biāo)錯(cuò)折疊蛋白結(jié)合后構(gòu)象的變化導(dǎo)致兩個(gè)標(biāo)記變得緊密接近，與標(biāo)記沒有緊密接近時(shí)產(chǎn)生的信號(hào)相比，探針產(chǎn)生 的信號(hào)加強(qiáng)了。
依據(jù)本方法，混合(combining)可以是引起樣品的至少一部分與包含一 種或多種探針的組合物的至少一部分形成單一組合物的任何作用。如在本方 法所用的，這個(gè)單一的組合物稱為混合物；然而，任何包含兩種組分的單一 組合物也包含于術(shù)語內(nèi)。因此，混合可包含向樣品中加入一種或多種^^果針的 液體組合物，或反之亦然。同樣，也包包含向樣品中加入一種或多種探針的 干組合物，或反之亦然。可將由此形成的混合物置于引起兩種組合物彼此充 分混合(例如離心、振蕩、或抽吸)的條件下，或者，僅僅將兩種組合物彼此加 入并允許通過筒單擴(kuò)散、溶化等混合。樣品和一種或多種探針如何混合并不 重要，只要允許兩者彼此接觸以便至少一種探針能接觸至少一種錯(cuò)折疊蛋白， 如果該蛋白存在的話。該方法包括溫育 一種或多種探針及樣品足夠長的時(shí)間，以使得至少一分 子錯(cuò)折疊蛋白與至少 一分子探針結(jié)合以形成復(fù)合物?；谝阎奈锢硖匦匀?一種或多種探針和/或錯(cuò)折疊蛋白的濃度、溫度、抑制或促進(jìn)蛋白質(zhì)和肽相互 作用的物質(zhì)是否存在等，溫育的時(shí)間可以變化。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以進(jìn) 行常規(guī)的試驗(yàn)，實(shí)施本發(fā)明，以便理解各種體系參數(shù)對溫育時(shí)間的影響。本發(fā)明的方法包括將樣品和一種或多種探針的混合物暴露于使探針和錯(cuò) 折疊蛋白的復(fù)合物(如果復(fù)合物存在的話)與混合物中的至少一種其它物質(zhì) 分離、至少部分分離的條件下。這個(gè)分離步驟可以在溫育步驟后進(jìn)行、與溫 育步驟同時(shí)進(jìn)行或部分地與溫育步驟同時(shí)進(jìn)行。在溫育和分離同時(shí)進(jìn)行的實(shí)施例中，可帶來某些益處。當(dāng)探針和目標(biāo)蛋 白發(fā)生結(jié)合時(shí)進(jìn)行分離，從而減少檢測錯(cuò)折疊蛋白的存在所需的時(shí)間，并消 除檢測錯(cuò)折疊蛋白的存在所需的步驟和試劑?？焖贆z測探針和目標(biāo)錯(cuò)折疊蛋 白的復(fù)合物是可能的，因?yàn)樘结樅湍繕?biāo)錯(cuò)折疊蛋白的復(fù)合物通常為具有獨(dú)特 的與眾不同的特性(典型地歸因于高水平的(3-折疊結(jié)構(gòu)的存在)的高分子量實(shí) 體。可用快速、良好表征的技術(shù)如大小排阻層析或過濾使復(fù)合物與樣品中的 其它物質(zhì)分離，至少部分分離。而且，同時(shí)進(jìn)行溫育和分離允許得到高靈敏性。也就是說，因?yàn)樵跈z測 前將混合物分離成兩個(gè)或更多級分，并且所用的分離技術(shù)優(yōu)選基于除去干擾 信號(hào)產(chǎn)生或;險(xiǎn)測的物質(zhì)的特性而加以選擇，所以包含探針-錯(cuò)折疊蛋白復(fù)合物 的級分相對于最初混合物具有改善的信噪比。由于包含探針-錯(cuò)折疊蛋白復(fù)合 物的級分不含或者基本上不含干擾物質(zhì)，檢測復(fù)合物存在所需的信號(hào)量將低
于混合物自身所需的信號(hào)量。依據(jù)本發(fā)明的方法，可以通過任何適宜的技術(shù)實(shí)現(xiàn)分離。探針和錯(cuò)折疊 蛋白復(fù)合物的一個(gè)方便的物理特征就是它們典型地具有大質(zhì)量。因此，分離 的適宜技術(shù)將利用復(fù)合物的大小，并可包括過濾或大小排阻層析。其它可利 用的物理特征對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，包括在各種條件下的溶 解性或疏水性，或例如對特定靜止相的親和力。在某些實(shí)施例中，分離可包 含探針、目標(biāo)多肽或者復(fù)合物與固體支持體如磁珠的結(jié)合，并依靠，至少部 分依靠，固體支持體的特性以獲得分離。本發(fā)明的方法包括檢測與錯(cuò)折疊蛋白結(jié)合的探針的存在。檢測可以通過 本領(lǐng)域檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的任何已知的方式完成。在某些實(shí)施例 中，標(biāo)記探針，并通過檢測與錯(cuò)折疊蛋白結(jié)合的探針?biāo)a(chǎn)生的信號(hào)的方式檢 測。在某些實(shí)施例中，探針包括兩個(gè)產(chǎn)生信號(hào)的部分，當(dāng)它們變得緊密接近 時(shí)候，它們的信號(hào)得以增強(qiáng)。在這些實(shí)施例中，設(shè)計(jì)探針的氨基酸序列，以 便探針與錯(cuò)折疊蛋白的結(jié)合使兩個(gè)產(chǎn)生信號(hào)的部分得以緊密接近。本發(fā)明通常包括優(yōu)先與錯(cuò)折疊蛋白的致病形式相互作用的肽。在某些實(shí) 施例中，與朊病毒非致病形式相比，在此所述的肽優(yōu)先與朊病毒的致病形式 相互作用。用本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例可獲得高靈敏性。獲得高靈敏性的適宜的肽的實(shí)例包括在此所述的那些肽。在某些實(shí)施例中，與PrpC相比，肽優(yōu)先與 PrP"相互作用。肽可以特異于來自單一物種或多個(gè)物種的PrP"。在優(yōu)選的實(shí)施例中，加入本發(fā)明的一種或多種末端標(biāo)記的肽，以便通過 在一種或多種肽與致病的錯(cuò)折疊蛋白或朊病毒之間形成復(fù)合物來捕獲致病的 朊病毒。接著通過固相的方式在樣品中富集復(fù)合物，所述固相包含一種或多 種賦予使復(fù)合物與樣品的至少一種其它組分、優(yōu)選不與固相結(jié)合的樣品的基 本上所有剩余部分分離、至少部分分離的能力的特性。接著用包含溶劑的組 合物如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS),將固相(該固相包含至少一些目標(biāo)復(fù)合物)富 集(下拉)，并且所述組合物優(yōu)選包含另外的可檢測的雙標(biāo)記肽，所述另外的 可檢測的雙標(biāo)記肽有時(shí)在此稱為檢測擴(kuò)增肽，以將信號(hào)擴(kuò)大至某一程度，且 為整個(gè)檢測方法增加至少某些額外的靈敏性。例如，用離心步驟或者在固相 是》茲珠的情況下通過使用磁體，從樣品富集(下拉)至少包含某些目標(biāo)復(fù)合 物的固相。 一旦固定的目標(biāo)復(fù)合物從樣品富集，可以用標(biāo)準(zhǔn)的微量移液管除 去剩余樣品造成的干擾。接著，可以用標(biāo)準(zhǔn)的洗滌緩沖液如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌固定的目標(biāo)復(fù)合物，以進(jìn)一步除去存在于最初的樣品中的污染或干 擾性物質(zhì)。接著將包含目標(biāo)肽以及捕獲肽的固定的目標(biāo)復(fù)合物在蒸餾水和Z或PBS中重懸浮，并加入檢測-擴(kuò)增雙標(biāo)記肽以增加整體檢測方法的特異性。 在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，樣品為血漿或血清。捕獲肽為生物素末端標(biāo)記的肌病毒才笨4十(biotin end-labeled prion probe):Biotin-VVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAVV (SEQ. ID.NO. 1)。固相為鏈霉抗生物素涂覆的磁珠，其能有效富集樣品中肽-錯(cuò)折疊蛋白復(fù) 合物的濃度。檢測-擴(kuò)增肽以嵌二萘(Pyrene)在兩端都標(biāo)記嵌二萘-VVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAVV -嵌二萘 (SEQ. ID. N0.2)。外部焚光劑如嵌二萘可以允許使用普通的熒光檢測技術(shù)檢測構(gòu)象變化。 任選地，肽的一個(gè)末端存在額外的賴氨酸殘基以增加嵌二萘標(biāo)記的有效性嵌二萘一 VVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAVVK -嵌二 萘(SEQ. ID. NO. 3)。朊病毒捕獲肽的有效實(shí)施例包括至少以下序列 生物素-KPKTNMKHVAGAAAAGAVV-OH (SEQ. ID. NO. 4) 生物素-GGGKPKTNMKHVAGAAAAGAVV-OH (SEQ. ID. NO. 5) 生物素-PPPKPKTNMKHVAGAAAAGAVV-OH (SEQ. ID. NO, 6) 生物素陽RRRKPKTNMKHVAGAAAAGAVV-OH (S￡Q. ID. NO. 7) 生物素-KKKKPKTNMKHVAGAAAAGAVV-OH (SEQ. ID. NO. 8) H2N-KPKTNMKHVAGAAAAGAVV-生物素(SEQ. ID. NO. 9) H2N-KPKTNMKHVAGAAAAGAVVGGG-生物素(SEQ. ID. NO. 10) H2N-KPKTNMKHVAGAAAAGAVVPPP-生物素(SEQ. ID. NO. 11) H2N-KPKTNMKHVAGAAAAGAVVRRR-生物素(SEQ. ID. NO. 12) H2N-KPKTNMKHVAGAAAAGAVVKKK-生物素(SEQ. ID. NO. 13) 生物素-VVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAVV陽OH(SEQ. ID. NO. 14)生物素-GGGVVAG AAAAGAVHKMNTKPKMKHVAG AAAAGAVV-OH(SEQ. ID. NO. 15) 生物素-PPPVVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAG AAAAGAVV-OH(SEQ. ID. NO. 16)生物素-RRRVVAGAA AAGAVHKMNTKPKMKHVAGAA AAGAVV-OH(SEQ. ID. NO. 17)生物素-KKKVVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAVV-OH(SEQ. ID. NO. 18)生物素-D VVDAGAADAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAD AAGADVVK -OH (SEQ. ID. NO. 19)生物素-KPKTNLKHVAGAAAAGAVV-OH (SEQ. ID. NO. 20) 生物素-GGGKPKTNLKHVAGAAAAGAVV-OH (SEQ. ID. NO. 21) 生物素-PPPKPKTNLKHVAGAAAAGAVV-OH (SEQ. ID. NO. 22) 生物素-RRRKPKTNLKHVAGAAAAGAVV-OH (SEQ. ID. NO. 23) 生物素-KKKKPKTNLKHVAGAAAAGAVV-OH (SEQ. ID. NO. 24)H2N-KPKTNLKHVAGAAAAGAVV陽生物素(SEQ. ID. NO. 25) H2N-KPKTNLKHVAGAAAAGAVVGGG-生物素(SEQ. ID. NO. 26) H2N-KPKTNLKHVAGAAAAGAVVPPP-生物素(SEQ. ID. NO. 27) H2N-KPKTNLKHVAGAAAAGAVVRRR-生物素(SEQ. ID. NO. 28) H2N-KPKTNLKHVAGAAAAGAVVKKK-生物素(SEQ. ID. NO. 29) 生物素畫VVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVV-OH(SEQ. ID. NO. 30) 生物素-GGGVVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVV-OH(SEQ. ID. NO. 31) 生物素畫PPPVVAG AAAAG AVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVV-OH(SEQ. ID. NO. 32) 生物素-RRRVVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAG AAAAG AVV-OH(SEQ. ID. NO. 33) 生物素-KKKVVAGAAAAG AVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVV-OH(SEQ. ID. NO. 34)生物素-DVVDAGAADAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAADAAGADVVK-OH(SEQ. ID. NO. 35)用于朊病毒的;f全測擴(kuò)增肽的有效實(shí)施例至少包括以下序列(SEQ. ID. NO. 36)(SEQ. ID. NO. 43)其中Pyr為嵌二萘。當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)為A-P時(shí)，捕獲肽的有效實(shí)施例至少包括以下序列 生物素-KLVFFAEDVGSNKGAIIGLMK-OH (SEQ. ID. NO. 44) 生物素-GGGKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMK-OH (SEQ. ID. NO: 45) 生物素-PPPKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMK-OH (SEQ. ID. NO. 46) 生物素-RRRKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMK-OH (SEQ. ID. NO. 47) 生物素-KKKKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMK-OH (SEQ. ID. NO. 48) H2N-KLVFFAEDVGSNKGAIIGLMKGGG-生物素(SEQ. ID. NO. 49) H2N-KLVFFAEDVGSNKGAIIGLMKPPP-生物素(SEQ. ID. NO. 50) H2N-KLVFFAEDVGSNKGAIIGLMKRRR-生物素(SEQ. ID. NO. 51) H2N-KLVFFAEDVGSNKGAIIGLMKKKK-生物素(SEQ. ID. NO. 52) 雖然在此所述的實(shí)施例為優(yōu)選的，對于探針組合物、捕獲肽的標(biāo)記、檢 測-擴(kuò)增肽的標(biāo)記、固相組合物及活性、以及樣品來源和類型也存在同樣有效 的實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解基于所用的特定的分析技術(shù)，可以使用 多種標(biāo)i己和固相。只要肽基本上保留所期望的活性，肽的衍生物也可包括對天然序列的修
飾，如缺失、添加以及替換。這些修飾可以是故意的，如通過相應(yīng)基因序列 的定點(diǎn)誘變；也可以是偶然的，如通過產(chǎn)生該蛋白的宿主的突變，或者通過由于PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的錯(cuò)誤。而且，可以產(chǎn)生具有如下一個(gè)或多個(gè)效果的修飾 降低毒性、增加對朊病毒的親和力和/或特異性、促進(jìn)細(xì)胞加工，以及促進(jìn)向 B-細(xì)胞和/或T-細(xì)胞的呈遞。在此所描述的多肽可根據(jù)本領(lǐng)域多種方式制備， 包括重組技術(shù)、合成、從自然來源或組織培養(yǎng)物中純化。本發(fā)明的捕獲肽以及檢測-擴(kuò)增肽可以為約10到約100個(gè)殘基長度、優(yōu) 選約10-50個(gè)殘基、更優(yōu)選約15-約45個(gè)殘基之間的任何長度。例如，它們 可以為15-35個(gè)殘基、20-35個(gè)殘基、20-30個(gè)殘基、25-35個(gè)殘基、30-50個(gè) 殘基、至少具有IO個(gè)殘基的任何殘基數(shù)目或范圍、以及具有不多于100個(gè)殘 基的任何殘基數(shù)目或范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解本發(fā)明也包含這些范圍內(nèi) 任何具體的殘基長度。也可以使用標(biāo)記的類似物。為了舉例說明，檢測擴(kuò)增肽可用嵌二萘以外 的不同萸光部分雙標(biāo)記，例如嵌二萘丁酸鹽/酯(Pyrene butyrate)、琥珀酰亞胺 基l-嵌二萘(succinimidyl l-pyrene)、核黃素、玫紅酸、4-乙酰胺基-4，-異硫代 氰 酰 均 二 苯 乙 烯 -2,2，- 二 磺 酸 (4-acetamido-4'-isothiocyanatostilbene-2,2'陽disulfonic acid) 、 口丫""定(acridine)、 4-氨基-N-[3-乙烯基磺?；?苯基]萘二曱酰亞胺-3,5 二磺酸鹽/酯 (4-amino-N陽[3-vinylsulfonyl)phenyl] naphtha-alimide-3，5 disulfonate)、鄰氛基苯 曱酰胺(anthranilamide)、 香豆素(coumarin)、 焰紅染料(cyanosine)、 4，,6-diaminidino-2-苯基口引口呆(4，,6-diaminidino-2-phenyllindole, DAPI)、 二亞乙 基三胺五乙酸鹽/酯(diethylenetriamine pentaacetate)、 4，4，-二異石克代氰酰-二氬-均二苯乙歸-2，2，誦二石黃酸(4,4，-diisothiocyanatodi-hydro-stilbene-2,2，-disulfonic acid)、曙紅(eosin)、曙紅異硫氰酸鹽/酯(eosin isothiocyanate)、赤蘚紅 (erythrosine)、赤蘚紅B(erythrosin B)、異辟u氰酸鹽/酉旨(isothiocyanate)、乙非咬 (ethidium)、 焚光素、5-羧基焚光素(5-carboxyfluorescein, FAM)、 萸光素、熒 光素異石克氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate) 、 fluorescamine 、 賄化酪氛酸 (nitrotyrosine)、 副品纟工(pararosaniline)、 盼纟工(Phenol Red) 、 B-蓬纟工蛋白 (B-phycoerythrin)或鄰-酞二醛(o-phthaldialdehyde)。優(yōu)選的標(biāo)記將形成受激子 (excimer)的狀態(tài)，使便利的信號(hào)檢測成為可能。在使用在此所述的固相的任何方法中，固相可為纖維素、修飾的纖維素 中的一種或多種，或衍生自木質(zhì)素纖維素生物質(zhì)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙 烯、聚交酯、聚丙烯酰胺、硅、橡膠、多糖、乳膠、聚氟乙蜂、尼龍、聚氯乙烯、聚碳酸酯、淀粉、葡聚糖、殼多糖、沙子、硅石、浮石、瓊脂糖、玻 璃、金屬的其他物質(zhì)，以及以任何形式(如顆粒狀、小珠、平面、桿狀等)且具 有任何表面或整體修飾或激活作用的任何此類物質(zhì)，所述修飾選自由下列組成的纟且表面壽造4匕(surface roughening)、才及性i秀導(dǎo)(polarity induction)、酸'〖生或 械性原位生成(acid or base site generation),磁感應(yīng)(magnetic induction)、 熱處理、疏水性修飾以及各種類型的涂覆。固相可以為微?；蛞赃B續(xù)表面的形式， 且包括膜、網(wǎng)、板、丸、載玻片、圓盤、毛細(xì)管、中空纖維、針、大頭針、 芯片、固體纖維、凝膠以及小珠。具體的固相可包括在此討論的許多元件， 例如鏈霉抗生物素涂覆的^f茲珠，或疏水多聚體涂覆的玻璃微粒。捕獲肽優(yōu)選以生物素標(biāo)記(在肽的任一端或兩端單標(biāo)記)，并且固相優(yōu)選包 含鏈霉抗生物素涂覆的磁珠。鏈霉抗生物素是固相的優(yōu)選涂覆蛋白質(zhì)；然而， 本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到其并非是可以利用的唯一蛋白質(zhì)。例如，可以修飾 鏈霉抗生物素以改變其配體結(jié)合特異性，包括它的生物素結(jié)合特異性，以對 任何特定目的配體來說更高或更低?？墒褂玫纳锼仡愃莆镏辽侔?-亞氨 基生物素(2-iminobiotin)以及二氨基生物素(diaminobiotin)。盡管生物素-鏈霉抗生物素結(jié)合對特別有效，許多其它結(jié)合對也是可操作 的。為了舉例說明，但并非限制本發(fā)明的范圍，其它適合的結(jié)合對至少包括 生物素-抗生物素蛋白、抗原-抗體、半抗原-抗體、模擬表位(mimetope )-抗 體、受體-激素、受體-配體、激動(dòng)劑-拮抗物、凝集素-糖類、酶-底物或酶-底 物類似物以及蛋白A-抗體Fc。對于使用捕獲肽和檢測-擴(kuò)增肽的實(shí)施例，第一個(gè)肽和第二個(gè)肽可以基本 上相同或不同。"基本上相同"意指第一個(gè)肽試劑和第二個(gè)肽試劑的不同僅在 于第二個(gè)肽試劑包含可檢測的標(biāo)記。捕獲肽和檢須、]-擴(kuò)增肽可以衍生自朊病毒 相同區(qū)域的肽片段或朊病毒不同區(qū)域的肽片段。第一個(gè)肽試劑和第二個(gè)肽試 劑可以每個(gè)各自獨(dú)立地選擇。在本發(fā)明中可以使用任何適宜的檢測方式。在包含涉及使用標(biāo)記肽的試 驗(yàn)的實(shí)施例中，適宜用于本發(fā)明的可檢測標(biāo)記包括任何能檢測的分子，包括 放射性同位素、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、發(fā)色團(tuán)、熒光半導(dǎo)體納米晶體(fluorescent semiconductornanocrystals)、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、發(fā)色團(tuán)、染 料、金屬離子、金屬溶膠、配體(如生物素、鏈霉抗生物素或半抗原)及其類似 物。另外的標(biāo)記包括但不限于使用熒光的那些標(biāo)記，以及包括那些在可檢測 的范圍能顯示熒光的物質(zhì)及其部分?？捎糜诒景l(fā)明的標(biāo)記的具體例子包括辣根過氧化物酶(HRP)、熒光素、FITC、若丹明、丹酰(dansyl )、傘形S同、dimethyl acridiniumester(DMAE)、德克薩斯紅、魯米那、NADPH以及P-半乳糖苷酶。 另外，可檢測標(biāo)記可包括寡核苷酸標(biāo)簽，其能用任何已知的核酸檢測方法， 包括PCR、 TMA、 b-DNA以及NASBA檢測。所述部分或化學(xué)實(shí)體可以復(fù)合于或共價(jià)結(jié)合于肽的氨基或羧基端或其附 近，該氨基或羧基端優(yōu)選用短的疏水肽序列末端加帽。在本發(fā)明優(yōu)選的方面， 探針肽的氨基端或羧基端都用大小范圍約為1-5個(gè)氨基酸的小疏水肽加帽。 這些肽可以為天然的或合成的，但優(yōu)選天然的(即衍生自目標(biāo)蛋白質(zhì)的(3-片層 形成區(qū)域)。茇光團(tuán)優(yōu)選附著于探針的氨基和/或羧基末端(優(yōu)選兩者)或其附 近，并可以為例如嵌二萘、色氨酸、熒光素或若丹明。優(yōu)選熒光團(tuán)當(dāng)位于正 確的幾何取向時(shí)形成受激子。"受激子(excimer)"為并非必須是共價(jià)的加合物，且在受光子激發(fā)的 分子實(shí)體以及相同的未受激發(fā)的分子實(shí)體之間形成。加合物實(shí)際上是暫時(shí)的，并且只存在到其通過發(fā)射光子發(fā)出突光時(shí)。通過在比通常的發(fā)射光譜寬的波 長下產(chǎn)生新的熒光波段，有可能辨認(rèn)受激子(或受激子的形成)。受激子可與 熒光共振能量轉(zhuǎn)移區(qū)別開，因?yàn)榧ぐl(fā)光譜與單體相同。受激子的形成依賴于 熒光團(tuán)的幾何排列，并且很大程度上受它們之間距離的影響。通過測量可以分析受激子形成的條件下的熒光光譜，可實(shí)現(xiàn)與^t分析靶 標(biāo)相互作用后優(yōu)選的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。通常，以嵌二萘作為示范性的熒光團(tuán)，激發(fā) 波長可為約350nm,觀察波長365-600 nm。單體嵌二萘激發(fā)后的正常發(fā)射(簡 單熒光)記錄為最大波長約370-385 nm。本發(fā)明的方法可以定性、半定性或定量。當(dāng)半定量或定量地實(shí)施本方法 時(shí)，所述方法可進(jìn)一步產(chǎn)生目的樣品中錯(cuò)折疊蛋白濃度的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲 線，接著將從測試樣品中獲得的結(jié)果與一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線做比較。通過參 考此處教導(dǎo)以及標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)方法學(xué)，取決于測定特定目的樣品的需要，本領(lǐng) 域技術(shù)人員能理解如何基本上定性、基本上定量或半定量地實(shí)施本發(fā)明。在本發(fā)明的另一方面，檢測方法可以與診斷人或非人類動(dòng)物受試者的朊 病毒有關(guān)疾病的方法一起使用；確?；旧蠠oPrpSc的血液供給、血液產(chǎn)品供 給或食物供給；分析用于移植的器官和組織樣品；以及監(jiān)視醫(yī)療設(shè)備的凈化。 該方法包括通過在此所述任何方法從收集的血液樣品檢測血液樣品(如全血、 血漿、血小板或血清)中的朊病毒的步驟；除去檢測出致病的朊病毒的任何樣 品；以及對未檢測到致病的朊病毒的樣品進(jìn)行組合以提供基本上無致病的朊 病毒的血液供給。在實(shí)施例中，該方法可通過僅僅將錯(cuò)折疊蛋白與探針結(jié)合 以及除去探針-錯(cuò)折疊蛋白復(fù)合物，可以省略檢測步驟本身。作為一般性問題， 除去的蛋白的量可以以多種方式表示，如利用除去的百分比、除去的對數(shù)單 位、或除去的相對量(例如倍數(shù)減少)。例如，當(dāng)實(shí)施于TSE蛋白或顆粒時(shí)， 該方法能獲得一定對數(shù)單位的除去的感染性，如至少或約3個(gè)對數(shù)單位的除 去的感染性，至少或約2個(gè)對數(shù)單位的除去的感染性，或至少或約1個(gè)對數(shù) 單位的除去的感染性。當(dāng)實(shí)施于加料樣品(spiked sample)時(shí)，該方法優(yōu)選4吏 感染性至少減少3個(gè)對數(shù)單位?？蛇x地，在地方性(endemic)樣品中，該方 法優(yōu)選導(dǎo)致樣品感染性低于2個(gè)對數(shù)單位，更優(yōu)選感染性低于1個(gè)對數(shù)單位。 另一個(gè)表示除去的目標(biāo)物質(zhì)量的方式是參考除去百分比。在實(shí)施例中，該方 法可除去至少25%的目標(biāo)蛋白、至少40%目標(biāo)蛋白、至少50%目標(biāo)蛋白、 至少60 %目標(biāo)蛋白、至少65 %目標(biāo)蛋白、至少75 %目標(biāo)蛋白、至少80 %目 標(biāo)蛋白、至少85%目標(biāo)蛋白、至少90%目標(biāo)蛋白、至少95%目標(biāo)蛋白、至 少98%目標(biāo)蛋白或至少99%或更多目標(biāo)蛋白，如至少99.5%、 99.9%、以及 99.99%的目標(biāo)蛋白。在其它的方面，本發(fā)明包括制備基本上不含致病的朊病毒的食物供給品 的方法，包括下列步驟用任何在此所述的檢測方法，檢測朊病毒、樣品收 集自將進(jìn)入食物供給的活的或死的有機(jī)體，或樣品收集自預(yù)計(jì)進(jìn)入食物供給 的食物；鑒定4僉測到致病性朊病毒的樣品；以及在4企測了致病朊病毒的樣品 中，從食物供給中除去任何活的或死的有機(jī)體或預(yù)計(jì)進(jìn)入食物供給的食物。 這樣的食物供應(yīng)基本上不含致病的朊病毒。在其它的方面，本發(fā)明提供從樣品中基本上除去致病的錯(cuò)折疊蛋白和朊 病毒的方法。這個(gè)方法包括提供本發(fā)明的捕獲肽、本發(fā)明的固相以及本發(fā)明 的一種或多種檢測-擴(kuò)增肽。懷疑含有錯(cuò)折疊蛋白或朊病毒的蛋白與能產(chǎn)生高 捕獲率的優(yōu)選肽一起溫育，接著與優(yōu)選的固相接觸一段時(shí)間，借此，捕獲肽 與錯(cuò)折疊蛋白或朊病毒之間形成的復(fù)合物(如果存在的話)從樣品中富集。 可優(yōu)化該技術(shù)以獲得錯(cuò)折疊蛋白或朊病毒期望的除去效率，而通過向下拉相
中加入優(yōu)選的雙標(biāo)記肽而可以方便地監(jiān)測效率，使得分析技術(shù)可監(jiān)測錯(cuò)折疊 蛋白或朊病毒濃度隨時(shí)間的降低。在此所述的任何方法中，樣品可以為生物樣品，所述生物樣品獲得或書亍 生自活的或一度存活的有機(jī)體，如器官、全血、血液級分、血液組分、血漿、血小板、血清、腦脊液(CSF)、腦組織、神經(jīng)系統(tǒng)組織、肌肉組織、骨髓、尿 液、淚液、非神經(jīng)系統(tǒng)組織、器官和/或活組織檢查或尸體剖^r。在優(yōu)選的實(shí) 施例中，生物樣品包含血液、血液級分或血液組分。在另一方面，本方面提供了實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。在某些實(shí)施例中， 試劑盒為診斷樣品中至少 一種錯(cuò)折疊蛋白存在、以及由此診斷與至少 一種錯(cuò) 折疊蛋白有關(guān)的疾病或病癥的診斷試劑盒。在其它的實(shí)施例中，試劑盒為篩 選人類醫(yī)療產(chǎn)品如血液、器官或組織中與疾病或病癥有關(guān)的錯(cuò)折疊蛋白的存 在的檢測試劑盒。在其它的實(shí)施例中，試劑盒為監(jiān)測與錯(cuò)折疊蛋白有關(guān)的疾 病或病癥的進(jìn)展的檢測試劑盒。通常，本發(fā)明的試劑盒包含實(shí)施本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施所必需的一些 或所有組分。因此，本發(fā)明的試劑盒包含至少一種構(gòu)象探針，如捕獲肽和/或 檢測-擴(kuò)增肽，其與預(yù)先確定的錯(cuò)折疊蛋白結(jié)合。 一個(gè)或多個(gè)探針和其它組分 可以于試劑盒中的 一個(gè)或多個(gè)適合的容器內(nèi)提供。試劑盒也可包含溫育和/或 分離一種或多種探針和一種或多種樣品或探針-錯(cuò)折疊蛋白復(fù)合物所需要的 一些或所有的緩沖液、試劑以及供給品。試劑盒可包含足夠的組分以一次或 多次進(jìn)行本發(fā)明的方法。試劑盒的容器可以為任何適于容納本發(fā)明的一種或多種物質(zhì)的材料，如 小瓶或安瓿。容器可由如玻璃、塑料、金屬、紙、或紙產(chǎn)品的材料制作。在 某些實(shí)施例中，容器為玻璃安瓿或塑料安瓿或可用如塞子、帶螺紋的密封塞 (stopper and crimp seal)或塑料帽或金屬帽如螺口帽密封的小瓶。通常，容器與 封口由能用熱(干或濕)、輻射或與化學(xué)藥品接觸而滅菌的材料制成。在某些實(shí)施例中，容器包含足夠量的肽以實(shí)施依據(jù)本發(fā)明的至少一種方 法的至少一個(gè)實(shí)施例。因此，試劑盒可以是診斷試劑盒、分離試劑盒、測試 試劑盒或?qū)φ赵噭┖屑捌渌?。在某些?shí)施例中，容器作為更大試劑盒的組分 而提供，其包括適宜的包裝以及任選地用法說明和其它的有關(guān)肽的使用的信 息。通常，試劑盒包含一些或所有供給品和試劑以實(shí)施一個(gè)或多個(gè)對照反應(yīng)， 以確保試劑盒正確運(yùn)行以及提供測試樣品可與之比較的基線結(jié)果。
在試劑盒的某些配置中，試劑盒包含多個(gè)容器，每一個(gè)容器可以包含肽 (構(gòu)象探針，即捕獲肽和/或檢測-擴(kuò)增肽)以及其它的有益于進(jìn)行本發(fā)明方法的 一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例的物質(zhì)。在試劑盒包含另外的組分或物質(zhì)的實(shí)施例中，它 們可以與肽和/或組合物容納于相同的或一個(gè)或多個(gè)不同的容器中。當(dāng)試劑盒 包含多個(gè)容器或一個(gè)容器和其它組分時(shí)，容器和組分被認(rèn)為處于試劑盒內(nèi)的 包裝組合中。當(dāng)有多個(gè)容器時(shí)，每一個(gè)容器包含足夠?qū)嵤┍景l(fā)明的單個(gè)方法， 如診斷樣品中的錯(cuò)折疊蛋白的肽。本發(fā)明的試劑盒可包含有益于研究肽和錯(cuò)折疊蛋白的物質(zhì)。此類研究包括如下試驗(yàn)檢測和/或研究各種肽的特性、功能以及效力；校準(zhǔn)儀器；從樣 品中分離錯(cuò)折疊蛋白；研究肽和(各種階段的和活性的)微粒之間的相互作用； 校準(zhǔn)肽的大?。恍?zhǔn)分離技術(shù)；檢查各種配體和蛋白質(zhì)的相互作用；以及研 究表面介導(dǎo)的反應(yīng)。在某些實(shí)施例中，容器作為試劑盒的組分提供，該試劑盒包含適宜的包 裝以及任選地說明書和/或有關(guān)試劑盒內(nèi)含物的其它信息。試劑盒通常是由結(jié) 實(shí)的材料所制成，如紙板或塑料，以及包含直接印刷在上面的說明書或其它 信息。本領(lǐng)域技術(shù)人員將立刻意識(shí)到通過本發(fā)明可想象到許多不同的容器尺 寸和內(nèi)容物的配置，因此并非所有的改變都需要詳細(xì)地在此敘述。實(shí)施例在以下實(shí)施例中，將對本發(fā)明進(jìn)一步描述，這些實(shí)施例對本發(fā)明的優(yōu)選 實(shí)施方式作出說明，并不能認(rèn)為是以任何方式對本發(fā)明所做的限制。實(shí)施例1: ^r測生物樣品中的朊病毒蛋白基本上按公開的美國專利申請2005/0026265 Al的描迷，進(jìn)行鼠腦樣品中 朊病毒蛋白的構(gòu)象增殖試驗(yàn)，如圖1所示。用如下所述的兩端用嵌二萘標(biāo)簽 進(jìn)行標(biāo)記的鼠特異性回文結(jié)構(gòu)33-mer探針(SEQ. ID. NO. 49)進(jìn)行試驗(yàn)。下文 提供其它的人類/倉鼠以及綿羊/牛朊病毒探針并且用于檢測那些種類的朊病H2N-VVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVV-COOH (鼠序列；SEQ. ID. NO. 53) (人類/倉鼠序列；SEQ. ID. NO. 54) H2N-VVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAVV-COOH (綿羊/牛序列；SEQ. ID. NO. 55) 為了改進(jìn)標(biāo)記，已對上述序列進(jìn)行了修飾使其在C-末端包含另外的賴 氨酸(K)殘基以允許加入嵌二萘標(biāo)簽(SEQ. ID. NO. 56-58)。H2N-VVAGAAAAGAVHKLNTKPKLKHVAGAAAAGAVVK-COOH(SEQ. ID. NO. 56) H2N-VVAGAAAAGAMHKMNTKPKMKHMAGAAAAGAVVK-COOH(SEQ. ID. NO. 57) H2N-VVAGAAAAGAVHKMNTKPKMKHVAGAAAAGAWK-COOH(SEQ. ID. NO. 58)實(shí)施例2:用鼠腦組織證明錯(cuò)折疊蛋白診斷學(xué)(Misfolded Protein Diagnostics, MPD)試驗(yàn)的動(dòng)力學(xué)組分獲得綿羊瘙癢病感染動(dòng)物以及健康動(dòng)物的鼠腦組織，并在蔗糖梯度上分 級。進(jìn)行實(shí)施例1的MPD試驗(yàn)，用磷鎢酸作為沉淀劑，隨后加入鼠特異性 肽探針。按照顯示于圖2 X-軸上的時(shí)程，讓混合物在Tris : TFE(50:50)混合 物中反應(yīng)。結(jié)果顯示在樣品中適宜地檢測朊病毒蛋白，其高于正常腦組織的 背景水平。實(shí)施例3:依據(jù)本發(fā)明對含朊病毒的樣品進(jìn)行分級分離 獲得綿羊血清，并與綿羊特異性肽探針(參見上述序列)混合，并溫育混 合物足夠長的時(shí)間，以使探針與血清中任何朊病毒蛋白結(jié)合。將混合物直接 施加于瓊脂糖4B柱，并收集級分。通過在發(fā)光平板讀數(shù)計(jì)上在350 nm激發(fā) 并從350-600 nm掃描，分析級分的熒光。在圖3中描繪了來自健康和被感 染的血清中每一級分的發(fā)光。這一數(shù)據(jù)為反應(yīng)性級分從柱子中的洗脫提供了 直觀描繪。如所看到的，使用本發(fā)明的方法，不但可將有傳染性的血清與健 康的血清區(qū)分開，而且可以實(shí)時(shí)發(fā)生。因?yàn)樵诜旨壡皩㈦暮蜆悠芬黄饻赜?所以針對錯(cuò)折疊蛋白的試驗(yàn)在分級過程中進(jìn)行。實(shí)施例4:未分級的綿羊血清樣品的MPD試驗(yàn)
按如下方式進(jìn)行MPD試驗(yàn)。獲得正常的綿羊血清以及朊病毒感染的綿羊血清，并直接施用于瓊脂糖4B柱，收集級分。PBS也在瓊脂糖4B 4主上 層析，作為陰性對照。本質(zhì)上，該過程與圖3中所描述的一致，例外的是在 通過瓊脂糖4B柱分級之前未將探針加入至血清中。對于每種樣品(感染的、未感染的、PBS)，將從實(shí)施例3中確定的含有 最高信噪比的級分獨(dú)立地與綿羊特異的探針結(jié)合，并評價(jià)。來自被感染樣品 的顯示受激子對單體的最高比例的級分被選擇用于在此顯示的動(dòng)力學(xué)試驗(yàn) 數(shù)據(jù)。對于健康的以及PBS對照也選擇相同的級分?jǐn)?shù)量。對于時(shí)程(動(dòng)力學(xué)) 試驗(yàn)，提供足夠的時(shí)間以使探針與樣品中任何朊病毒蛋白結(jié)合，使用典型的 50:50三氟乙醇溶劑條件進(jìn)行MPD試驗(yàn)。然后在焚光掃描平板讀數(shù)計(jì)上測試 混合物的熒光，獲得的數(shù)據(jù)顯示于圖4中。數(shù)據(jù)顯示，以與圖2中顯示的彩: 據(jù)相似的方式，在分級的綿羊血清中清楚可見該測定的成功動(dòng)力學(xué)。實(shí)施例5:用人類血漿樣品進(jìn)行選擇性捕獲MPD將200 pl人類血漿樣品(所述人類血漿樣品或者為sCJD,或者為匯集 的正常的)用生物素標(biāo)記的肽溫育過夜。以25:100、 25:200、 50:100或0:100 的生物素肽與珠的比例加入被覆鏈霉抗生物素的Dynal磁珠。用磁鐵從血漿 樣品中除去富集的目標(biāo)物質(zhì)。洗滌和重懸浮后，加入雙標(biāo)記(嵌二萘)的熒光 團(tuán)肽，并在溫育后，捕獲發(fā)射掃描。圖5顯示了 sCJD血漿樣品和匯集的正 常人血漿(NHP)之間成功的信號(hào)分離。實(shí)施例6:選擇性捕獲MPD試驗(yàn)劑量反應(yīng)采用與實(shí)施例5相同的方案，不同之處在于sCJD85-137樣品用正常人 血漿以1:2、 1:4以及1:8稀釋(圖6)。將純的人sCJD血漿用正常血漿稀釋導(dǎo) 致熒光信號(hào)成比例地、并且如同期望的在選擇性捕獲MPD試驗(yàn)中以劑量反 應(yīng)的方式減少。盡管起始sCJD85-137樣品中存在的PrpTSE的實(shí)際水平未知， 作為臨床樣本，期望的最高水平為30-30 IU/ml。用這一近似值，以及200(il 的測試體積，純樣品可能含有4-6 IU， 1:2、 1:4以及1:8兩倍連續(xù)稀釋將分 別含有2-3IU、 1-1.5 IU以及0.5-0.75 IU。這些結(jié)果反映了 LOD(檢測水平) 接近1 IU。 實(shí)施例7:用綿羊血清樣品的選擇性捕獲MPD方案采用與實(shí)施例5相同的方案，不同之處在于測試的樣品為兩個(gè)不同的綿 羊瘙癢病綿羊血清樣品以及兩個(gè)正常的健康的綿羊血清樣品(圖7)。對綿羊 血清樣品來說，選擇性捕獲MPD方案是成功的。在正常的綿羊血清和受感 染的綿羊瘙癢病(prpS(:或PrpTSE)綿羊血清之間，信噪比極好。實(shí)施例8:從磁珠上順序洗滌捕獲的sCJD底物的效果 圖8顯示了 PrPTSE(sCJD 85-137)底物與生物素標(biāo)記的捕獲肽相結(jié)合，以 及與固相P茲珠)有效相互作用的直接證據(jù)。在PBS中重復(fù)洗滌引起PrPTSE 脫離。這個(gè)試驗(yàn)證明雙標(biāo)記的熒光團(tuán)肽的相互作用if又決于什么與磁J朱上的 "下拉(pull-down)"物質(zhì)結(jié)合。生物素標(biāo)記的肽捕獲目標(biāo)(PrpTSE)物質(zhì)，而 生物素標(biāo)記的肽自身與覆蓋磁珠表面的鏈霉抗生物素結(jié)合。這一物質(zhì)可以通 過連續(xù)的PBS洗滌洗掉。圖8顯示當(dāng)洗滌的次數(shù)增加時(shí)，對于sCJD樣品， 與熒光團(tuán)標(biāo)記的檢測肽的受激子峰，即430-500 nm有關(guān)的信號(hào)顯著減少， 但對于匯集的正常人血漿樣品則不是這樣。特別地，圖8A以及圖8B顯示 兩個(gè)樣品中受激子對單體的比例(圖8A)以及顯示兩個(gè)未洗滌樣品的峰值發(fā) 射的熒光掃描(圖8B)，而圖8C和圖8D顯示樣品洗滌三次后來自相同測試 的數(shù)據(jù)，而圖8E以及圖8F顯示樣品洗滌5次后來自相同測試的數(shù)據(jù)。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在本發(fā)明實(shí)施過程中做各種的修飾和變化而未 偏離本發(fā)明范圍或精神是顯而易見的?？紤]到本發(fā)明的說明書以及實(shí)施，本 發(fā)明其它的實(shí)施例對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。說明書以及實(shí)施例 僅意欲作為示例性，而本發(fā)明真正的范圍和精神在隨后的權(quán)利要求書中指 明。
權(quán)利要求
1.檢測樣品中錯(cuò)折疊蛋白的存在或量的方法，所述方法包括提供含有或懷疑含有錯(cuò)折疊蛋白的樣品，提供至少一種構(gòu)象捕獲肽，將樣品與構(gòu)象捕獲肽混合以產(chǎn)生混合物，溫育混合物足夠長的時(shí)間，以使得至少一分子的錯(cuò)折疊蛋白與至少一分子的捕獲肽結(jié)合，以形成復(fù)合物，將混合物暴露于使復(fù)合物，如果復(fù)合物存在的話，與混合物中至少一種其它物質(zhì)分離、至少部分分離的條件下，以及檢測至少一種捕獲肽以及錯(cuò)折疊蛋白之間的結(jié)合是否存在。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，還包括在暴露以及檢測步驟之間加入至少一 種雙標(biāo)記的月太。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中溫育和暴露同時(shí)進(jìn)行。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中至少一種構(gòu)象捕獲肽是SEQ.ID.NO. 1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中至少一種雙標(biāo)記的肽是SEQ. ID. NO. 2 或SEQ. ID. NO. 3。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法檢測朊病毒蛋白。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中至少 一種構(gòu)象捕獲肽選自由SEQ. ID. NO. 4-35組成的組。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該方法是診斷與A- (3相關(guān)的疾病的診 斷方法。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中至少一種構(gòu)象捕獲肽選自由SEQ. ID. NO. 44-52組成的組。
10. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中至少一種雙標(biāo)記的肽選自由SEQ. ID. NO. 36-43組成的組。
11. 根據(jù)權(quán)利要求4、 7或9任一項(xiàng)的方法，其中至少一種構(gòu)象肽包含生 物素類似物，所述生物素類似物是2-亞氨基生物素、二氨基生物素或與所 選擇的固相表面形成有效的相互作用的任何其它生物素衍生物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求5或10的方法，其中至少一種雙標(biāo)記的肽包含選自由 下列組成的組的部分嵌二萘丁酸鹽/酯、琥珀酰亞胺基l-嵌二萘、核黃素、 玫紅酸、4-乙酰胺基-4，-異硫代氰酰均二苯乙烯-2，2，-二磺酸，吖咬，4-氨基 -N-[3-乙烯基磺?；?笨基]萘二曱酰亞胺-3，5 二磺酸鹽/酯、鄰氨基苯曱酰胺、 香豆素、焰紅染料、4，,6-diaminidino-2-苯基吲咮(DAPI)、 二亞乙基三胺五乙 酸鹽/酯、4,4，-二異硫代氰酰-二氫-均二苯乙烯-2,2，-二磺酸、曙紅、曙紅異硫 氰酸鹽/酯、赤蘚紅、赤蘚紅B、異硫氰酸鹽/酯、乙非啶、熒光素、5-羧基 焚光素(FAM)、熒光素、異石克氰酸熒光素、fluorescarnine、硝基酪氨酸、副品 紅、酚紅、B-藻紅蛋白或鄰-酞二醛。
13. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中暴露步驟通過固相手段完成，所述固 相包含一種或多種選自下組的物質(zhì)纖維素、修飾的纖維素、木質(zhì)素纖維素 生物質(zhì)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚交酯、聚丙烯酰胺、硅、橡膠、多 糖、乳膠、聚氟乙烯、尼龍、聚氯乙烯、聚碳酸酯、淀粉、葡聚糖、殼多糖、 沙子、硅石、浮石、瓊脂糖、玻璃和金屬。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述固相被修飾以增加暴露步驟中所 期望的分離，所述修飾選自由下列組成的組表面糙化、極性誘導(dǎo)、酸或堿 原位生成、磁感應(yīng)、熱處理、疏水性修飾以及將化學(xué)或生物活性涂覆層置于 固體表面。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述固相包含用鏈霉抗生物素涂覆的 磁珠。
16. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法診斷與錯(cuò)折疊蛋 白相關(guān)的疾病。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中該方法是篩選動(dòng)物產(chǎn)品的方法。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中該方法是篩選人血液產(chǎn)品、人組織或 人器官的方法。
19. 從樣品中除去致病的錯(cuò)折疊蛋白的方法，包含權(quán)利要求1-18中任 一項(xiàng)的方法，且還包含在至少 一個(gè)時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測致病的錯(cuò)折疊蛋白的除去。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中從樣品中除去至少25%的致病的錯(cuò)折疊蛋白。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中從樣品中除去至少50%的致病的錯(cuò) 折疊蛋白。
22. 根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中從樣品中除去基本上所有致病的錯(cuò)折疊蛋白。
23. —種試劑盒，包含一種或多種能夠與錯(cuò)折疊蛋白相結(jié)合的肽，所述肽選自由SEQ ID NO. 1-58組成的組。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23的試劑盒，其中所述試劑盒包含至少一種構(gòu)象捕獲 肽以及至少一種雙標(biāo)記的檢測肽，并且其中所述一種或多種構(gòu)象捕獲肽選自 由SEQ.ID.NO. 1、 4-35以及44-52組成的組，并且其中所述一種或多種雙標(biāo) 記的;f企測肽選自由SEQ. ID. NO. 2-3以及36-43組成的組。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24的試劑盒，其進(jìn)一步包含固相，所述固相包含一種 或多種選自下組的物質(zhì)纖維素、修飾的纖維素、木質(zhì)素纖維素生物質(zhì)、聚 苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚交酯、聚丙烯酰胺、硅、橡膠、多糖、乳膠、 聚氟乙烯、尼龍、聚氯乙烯、聚碳酸酯、淀粉、葡聚糖、殼多糖、沙子、硅 石、浮石、瓊脂糖、玻璃和金屬。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，其中修飾固相以在暴露步驟中增加所期 望的分離，所述修飾選自由下述組成的組表面糙化、極性誘導(dǎo)、酸或堿原 位生成、磁感應(yīng)、熱處理、疏水性修飾以及將化學(xué)或生物活性涂覆層置于固 體表面。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26的試劑盒，其中所述固相包含用鏈霉抗生物素涂覆 的磁珠。
28. 根據(jù)權(quán)利要求23 -27任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述試劑盒能診斷與錯(cuò) 折疊蛋白有關(guān)的疾病。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28的試劑盒，其中所述試劑盒包含篩選動(dòng)物產(chǎn)品的方法。
30. 根據(jù)權(quán)利要求28的試劑盒，其中所述方法是人血液產(chǎn)品、人組織或 人器官的篩選方法。
31. 根據(jù)權(quán)利要求23 -27任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述試劑盒能從樣品中 除去致病的錯(cuò)折疊蛋白。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31的試劑盒，其中從樣品中除去至少25%的致病的錯(cuò) 折疊蛋白。
33. 根據(jù)權(quán)利要求31的試劑盒，其中從樣品中除去至少50%的致病的錯(cuò) 折疊蛋白。
34. 根據(jù)權(quán)利要求31的試劑盒，其中從樣品中除去基本上所有的致病的 錯(cuò)折疊蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測樣品中構(gòu)象改變的蛋白，如朊病毒或其它與疾病狀態(tài)有關(guān)的蛋白的方法和試劑盒。該方法包括選擇性地從干擾對肽與構(gòu)象改變的蛋白質(zhì)的復(fù)合物進(jìn)行檢測的物質(zhì)中捕獲和分離肽與構(gòu)象改變的蛋白質(zhì)的復(fù)合物，以及優(yōu)選通過加入第二雙標(biāo)記的肽來擴(kuò)增檢測信號(hào)。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101156068SQ200680011062
公開日2008年4月2日 申請日期2006年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月15日
發(fā)明者韜 潘, 賈斯米特·塞西, 辛迪·S·奧澤 申請人:阿德利夫股份有限公司