專(zhuān)利名稱(chēng)：：針對(duì)胃泌素釋放肽前體的抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及針對(duì)胃泌素釋放肽前體的抗體及其應(yīng)用，所述抗體廣泛用于包括小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的各種疾病的早期發(fā)現(xiàn)和治療監(jiān)測(cè)、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等°
背景技術(shù)：
在日本，死因的第1位是惡性腫瘤，其中肺癌死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，在男性中超過(guò)胃癌成為死因的第1位，在女性中也占第3位。肺癌在病理組織學(xué)上主要分為以下4種組織類(lèi)型，即發(fā)生于肺門(mén)部的肺鱗狀上皮癌和小細(xì)胞肺癌、發(fā)生于肺野部的肺腺癌和大細(xì)胞肺癌。尤其是小細(xì)胞肺癌，由于增殖快速，早期即發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此初診發(fā)現(xiàn)時(shí)大多己經(jīng)是轉(zhuǎn)移至全身的進(jìn)行性癌。關(guān)于該類(lèi)型癌的治愈率，對(duì)于病變局限于一側(cè)肺野的小細(xì)胞肺癌的局限型患者，其治愈率為約20%,對(duì)于已經(jīng)轉(zhuǎn)移至兩肺或其它內(nèi)臟的擴(kuò)散型患者，可以說(shuō)事實(shí)上難以治愈。此外，由于小細(xì)胞肺癌對(duì)抗癌劑的敏感性高，因此化學(xué)療法是首選的治療方法，相反，對(duì)于非小細(xì)胞肺癌，由于化學(xué)療法的療效差，因此外科療法是首選的治療方法。因此，小細(xì)胞肺癌是肺癌中特別需要早期發(fā)現(xiàn)、早期治療的癌癥，所以，對(duì)小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌的鑒別診斷對(duì)于確定治療方案極其重要。發(fā)現(xiàn)肺癌的方法之一是痰液檢查。然而，痰液檢查主要適于肺鱗狀上皮癌的檢查，對(duì)小細(xì)胞肺癌存在陽(yáng)性率低的問(wèn)題。此外，X射線(xiàn)攝影法也是廣泛使用的發(fā)現(xiàn)肺癌的方法，但對(duì)于發(fā)生于肺門(mén)部的肺鱗狀上皮癌和小細(xì)胞肺癌，肺門(mén)部由于受到心臟的影響，存在癌組織的陰影非常難以拍到的問(wèn)題。此外，關(guān)于小細(xì)胞肺癌，對(duì)肺野呈現(xiàn)異常陰影的患者，即使使用痰液細(xì)胞學(xué)診斷、胸部X射線(xiàn)單純攝影、CT掃描、支氣管內(nèi)窺鏡等，也難以早期發(fā)現(xiàn)該類(lèi)肺癌。此外，用于診斷癌癥的一些檢查方法，例如放射線(xiàn)照射、活組織檢查或支氣管內(nèi)視鏡等，會(huì)對(duì)患者造成痛苦，且需要昂貴的儀器和熟練的技術(shù)等。因此，正在進(jìn)行通過(guò)更簡(jiǎn)便的血液檢査，在能夠治愈的時(shí)期可高效診斷出癌癥腫瘤標(biāo)志物的研究。目前，在癌癥的發(fā)現(xiàn)、診斷、病情監(jiān)測(cè)指標(biāo)、復(fù)發(fā)診斷等中使用了30種以上的腫瘤標(biāo)志物。由于肺癌組織類(lèi)型多樣，所以還沒(méi)有報(bào)道過(guò)對(duì)所有類(lèi)型肺癌的發(fā)現(xiàn)或診斷都有效的腫瘤標(biāo)志物。因此，目前根據(jù)肺癌的組織類(lèi)型選擇和使用有效的標(biāo)志物。例如，對(duì)于肺腺癌，主要選擇使用癌胚抗原(CEA)或唾液酸化Lex-i抗原；對(duì)于肺鱗狀上皮癌，主要選擇使用鱗狀上皮癌相關(guān)抗原；對(duì)于小細(xì)胞肺癌，主要選擇使用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)等。然而，NSE存在如下缺點(diǎn)(1)針對(duì)可治愈的早期癌的陽(yáng)性率低，(2)治療引起測(cè)定值出現(xiàn)一過(guò)性上升，(3)采血時(shí)的溶血引起測(cè)定值上升，(4)小細(xì)胞肺癌患者與正常健康者的測(cè)定差值小等。因此，NSE對(duì)于小細(xì)胞肺癌來(lái)說(shuō)未必是有效的腫瘤標(biāo)志物。胃泌素釋放肽(GRP)是McDonald等在1978年從豬的胃組織中分離出的一種具有促胃泌素分泌作用的、由27個(gè)氨基酸組成的腦腸肽。已確認(rèn)人類(lèi)也存在GRP，并于1984年克隆出編碼人類(lèi)GRP的基因。國(guó)立癌中心的山口等，在認(rèn)為是來(lái)自神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的小細(xì)胞肺癌的生物學(xué)特性的研究過(guò)程中，測(cè)定了包括促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和降鈣素等15種以上的腦腸激素，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的小細(xì)胞肺癌株中，GRP以最高頻率且髙濃度地得到積極分泌(非專(zhuān)利文獻(xiàn)l)。并且，建立了配合血中GRP濃縮法的放射免疫測(cè)定法(RIA)，發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞肺癌患者與健康人相比，呈現(xiàn)出高的血中GRP濃度。然而，由于GRP在血中會(huì)快速分解，因此血中濃度低，此外，由于上述測(cè)定需要復(fù)雜的濃縮操作，因此臨床應(yīng)用困難。根據(jù)此后的研究可知，在各種細(xì)胞中，通過(guò)選擇性RNA剪切，產(chǎn)生3種GRP前體(ProGRP)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。這3種ProGRP，其第1-98位氨基酸序列是相同的，而第99位以后，通過(guò)選擇性RNA剪切，變成互不相同的氨基酸序列。該相同的第l-98位氨基酸序列在序列編號(hào)1中示出。下文只要沒(méi)有特別說(shuō)明，本發(fā)明中的ProGRP、其部分序列、分解物等氨基酸殘基的編號(hào)均用序列編號(hào)1的氨基酸序列的編號(hào)表示。3種ProGRP的第1-27位氨基酸序列，與具有促胃泌素分泌活性的成熟GRP的氨基酸序列相同。這3種前體均通過(guò)激素前體切斷酶，分解為由第l-27位氨基酸序列構(gòu)成的成熟型GRP、以及由第31位以后的氨基酸序列構(gòu)成的不具有促胃泌素分泌活性的作為ProGRP分解物的C末端片段(ProGRP-Cfrag)。Holst等(非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)報(bào)道通過(guò)對(duì)由ProGRP的第42-53位氨基酸序列構(gòu)成的肽(以下稱(chēng)為ProGRP(42-53))使用抗血清進(jìn)行放射免疫測(cè)定(RIA)，發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞肺癌患者血漿中的ProGRP或ProGRP-Cfrag水平高。然而，該方法需要沉淀萃取操作，靈敏度也不足。此外，認(rèn)為用這種由11個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的短鏈肽進(jìn)行免疫時(shí)，未誘導(dǎo)出識(shí)別ProGRP的立體結(jié)構(gòu)抗原表位的抗體。三宅等著眼于ProGRP與GRP相比在血中的穩(wěn)定性高、以及作為3種ProGRP共同部分的第31-98位氨基酸序列對(duì)其它蛋白質(zhì)的氨基酸序列沒(méi)有顯示出相同性，使用由該氨基酸序列構(gòu)成的重組肽(以下稱(chēng)為ProGRP(31-98))作為抗原獲得的高效價(jià)抗血清，建立了無(wú)需沉淀萃取操作的高靈敏度RIA法(非專(zhuān)利文獻(xiàn)l)。通過(guò)該方法，使ProGRP成為與GRP同樣優(yōu)異的腫瘤標(biāo)志物。該方法在無(wú)需萃取操作方面是有利的，但是測(cè)定需要4天時(shí)間，且靈敏度不足，為10pM(77.3pg抗原/mL)，因此不能測(cè)定健康人血清中的ProGRP值，無(wú)法進(jìn)行臨床應(yīng)用。此外，上述Holst等和三宅等的RIA法是抑制法，因此只要ProGRP片段的一部分具有抗原性，就能進(jìn)行測(cè)定，但其靈敏度比三明治法低，因此需要高靈敏度的ProGRP測(cè)定法的臨床應(yīng)用難以實(shí)現(xiàn)。即為了在臨床上進(jìn)行ProGRP檢測(cè)，必須提高檢測(cè)靈敏度，尤其需要能在三明治法中使用的抗體。山口、青柳等以ProGRP的小細(xì)胞肺癌用腫瘤標(biāo)志物的臨床應(yīng)用為目的，開(kāi)發(fā)了以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)為原理、使用三明治法的簡(jiǎn)便且高靈敏度ProGRP測(cè)定試劑(專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。該方法在約2小時(shí)內(nèi)獲得結(jié)果，并且具有高靈敏度(2pg/mL)，因此目前在臨床上廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)對(duì)于小細(xì)胞肺癌，該方法比NSE靈敏度高并具有特異性。此外，發(fā)現(xiàn)使用該測(cè)定法，除了小細(xì)胞肺癌以外，在祌經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(甲狀腺髓樣癌等)、顯示神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤特征的癌(小細(xì)胞食道癌、小細(xì)胞胰癌、小細(xì)胞前列腺癌等)中，血清ProGRP值也上升，認(rèn)為今后也可以應(yīng)用于這些腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和治療監(jiān)測(cè)等中。然而，雖然在血中ProGRP的穩(wěn)定性比GRP高，但與其它通常的腫瘤標(biāo)志物相比，卻發(fā)現(xiàn)測(cè)定值分散。因此，以ProGRP為檢測(cè)對(duì)象的方法，存在下述制約，即測(cè)定樣品必須在采血后迅速凍干保存直至測(cè)定時(shí)為止(非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)。專(zhuān)利文獻(xiàn)l:第3210994號(hào)專(zhuān)利公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2:特開(kāi)平6-98794號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1:CancerResearch,1994年，第54巻，2136-2140頁(yè)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2:Eliot等，Mol.Endo.，1987年，第1巻，224-232頁(yè)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3:Holst，J,Clin.Oncol.，第7巻，1831-1838頁(yè)，1989年非專(zhuān)利文獻(xiàn)4:臨床檢查，第39巻，981-986頁(yè)，1995年
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種新的ProGRP的測(cè)定方法，該測(cè)定方法以ProGRP為測(cè)定對(duì)象，但不存在現(xiàn)有方法中測(cè)定值分散和樣品凍干保存這種操作上的制約等問(wèn)題。本發(fā)明在ProGRP的分解物中發(fā)現(xiàn)能在血液樣品中穩(wěn)定保存的物質(zhì)，基于此，通過(guò)以該分解物中存在的穩(wěn)定的抗原表位為測(cè)定對(duì)象，解決了上述問(wèn)題。具體地說(shuō)，提供了以下各發(fā)明。(1)一種使用識(shí)別序列編號(hào)l所示的氨基酸序列的第40-75位的部分氨基酸序列構(gòu)成的肽的2種以上的不同抗體，測(cè)定胃泌素釋放肽前體及/或其分解物的方法。(2)—種使用識(shí)別序列編號(hào)l所示的氨基酸序列的第40-79位的部分氨基酸序列構(gòu)成的肽的2種以上的不同抗體，測(cè)定胃泌素釋放肽前體及/或其分解物的方法。(3)如(1)或(2)所述的方法，其中該方法為三明治免疫測(cè)定法。(4)一種與序列編號(hào)l所示的氨基酸序列的第40-60位的部分氨基酸序列構(gòu)成的肽結(jié)合、且與序列編號(hào)1中所示的氨基酸序列上的任意8個(gè)連續(xù)氨基酸序列構(gòu)成的肽不結(jié)合的抗體。(5)—種與序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的第40-60位的部分氨基酸序列構(gòu)成的肽結(jié)合、與由第31-53位的部分氨基酸序列構(gòu)成的肽不結(jié)合的抗體。(6)如(4)或(5)所述的抗體，其中該抗體由按照保藏編號(hào)FERMBP-08669保藏的雜交細(xì)胞瘤3D6-2產(chǎn)生。(7)按照保藏編號(hào)FERMBP-08669保藏的雜交細(xì)胞瘤3D6-2。(8)如(1)或(2)所述的方法，其中所述的2種以上的不同抗體的至少一種是(4)(6)中任一項(xiàng)所述的抗體。(9)如(1)或(2)所述的方法，其中所述的2種以上的不同抗體的至少一種是(4)(6)中任一項(xiàng)所述的抗體，其它抗體為識(shí)別序列編號(hào)1的氨基酸序列第71-75位的部分氨基酸序列構(gòu)成的肽的抗體。(10)—種含有(4)(6)中任一項(xiàng)所述的抗體并用于測(cè)定胃泌素釋放肽前體或其分解物的試劑盒。(11)如(10)所述的試劑盒，其是用于癌診斷的試劑盒。本發(fā)明的方法通過(guò)以新確認(rèn)的、在樣品中也能穩(wěn)定保存的ProGRP的某種分解物上的抗原表位為測(cè)定對(duì)象，除了能獲得與現(xiàn)有的測(cè)定方法相同的檢測(cè)靈敏度，還具有采取后的樣品的處理方法不易受到影響、能獲得再現(xiàn)性髙的測(cè)定值等效果。圖1表示單克隆抗體對(duì)由用多肽合成的8個(gè)連續(xù)氨基酸序列構(gòu)成的肽的反應(yīng)性。橫軸表示ProGRP(31-98)的8個(gè)連續(xù)氨基酸序列，縱軸表示吸光度。(A)表示GRP-3D6-2的反應(yīng)性、(B)表示GRP-3G2的反應(yīng)性、(C)表示GRP-2B10的反應(yīng)性。圖2表示使用與氨基酸編號(hào)第40-75位的部分肽結(jié)合的抗體3D6-2與2B10的測(cè)定法的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。橫軸表示ProGRP的濃度，縱軸表示吸光度。具體實(shí)施方式本發(fā)明以在樣品中存在的、與ProGRP或ProGRP-Cfrag相比在血中的保存穩(wěn)定性高的ProGRP分解物(ProGRP-Cdel)中殘存的抗原表位為免疫學(xué)測(cè)定法的對(duì)象。該P(yáng)roGRP-Cdel是現(xiàn)有方法的測(cè)定對(duì)象ProGRP-Cfrag的C末端一些氨基酸殘基缺失的、鏈長(zhǎng)更短的肽，是含有ProGRP的第40-75位氨基酸殘基上殘存的抗原表位的肽。推測(cè)可能是通過(guò)血液中存在的蛋白酶將ProGRP-Cfrag的第75-83位氨基酸殘基的某個(gè)殘基的C末端切斷，從而產(chǎn)生ProGRP-Cdel。關(guān)于該P(yáng)roGRP-Cdel，使用質(zhì)量分析裝置對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)，確認(rèn)在第79位Lys的C末端處被切斷。因此，ProGRP-Cdel是含有序列編號(hào)1的第40-79位氨基酸殘基上殘存的抗原表位的肽，所以，識(shí)別這些抗原表位的抗體也可以在本發(fā)明中使用。ProGRP-Cdel與ProGRP-Cfrag之間結(jié)構(gòu)上的差異僅是C末端有無(wú)20個(gè)左右氨基酸殘基，但是作為用于免疫學(xué)測(cè)定ProGRP或其分解物的對(duì)象蛋白質(zhì)的意義卻有很大不同?，F(xiàn)有方法中，使用識(shí)別上述C末端20幾個(gè)殘基部分的抗體。因此，該抗體已經(jīng)不能識(shí)別、捕捉缺失該部分的ProGRP-Cdel。該C末端部分切斷的進(jìn)行受到樣品自身或樣品采取后的保存狀態(tài)及時(shí)間的影響，推測(cè)這是現(xiàn)有方法中檢測(cè)信號(hào)受到樣品的保存狀態(tài)或時(shí)間影響的原因。另一方面，本發(fā)明中，使用識(shí)別ProGRP-Cdel上存在的抗原表位的抗體，即使樣品中存在ProGRP及ProGRP-Cfrag，或即使產(chǎn)生部分切斷，也能穩(wěn)定地識(shí)別ProGRP或其分解物，因此檢測(cè)信號(hào)受到樣品的保存狀態(tài)或時(shí)間的影響小，可以進(jìn)行再現(xiàn)性高的測(cè)定。本發(fā)明是一種以ProGRP-Cdd上的抗原表位作為測(cè)定對(duì)象，使用從可以識(shí)別由ProGRP的第40-75位氨基酸序列構(gòu)成的肽(ProGRP(40-75))上存在的抗原表位的抗體中選擇的、能分別識(shí)別ProGRP(40-75)上存在的2種以上不同抗原表位的不同抗體，通過(guò)三明治免疫測(cè)定法檢測(cè)ProGRP或其分解物的方法。此外，本發(fā)明還是一種使用從可以識(shí)別由ProGRP的第40-79位氨基酸序列構(gòu)成的肽(ProGRP(40-79))上存在的抗原表位的抗體中選擇的、能分別識(shí)別ProGRP(40-79)上存在的2種以上的不同抗原表位的不同抗體，通過(guò)三明治免疫測(cè)定法檢測(cè)ProGRP或其分解物的方法。特別是本發(fā)明中，不包含識(shí)別從ProGRP-Cfrag切斷除去的C末端部分序列上的抗原表位的抗體，優(yōu)選采用只使用識(shí)別ProGRP-Cdel上的抗原表位的抗體的三明治免疫測(cè)定法。三明治ELISA法的基本操作可以根據(jù)"超高靈敏度免疫測(cè)定法"(石川榮治，1993年，學(xué)會(huì)出版中心)或其它各種實(shí)驗(yàn)方法的說(shuō)明書(shū)中記載的方法進(jìn)行，本發(fā)明的實(shí)施中不特別需要特殊的操作，可以按下述工序進(jìn)行。艮口ProGRP或其分解物可以通過(guò)包括如下工序的測(cè)定法檢測(cè)(1)使與ProGRP(40-75)和/或ProGRP(40-79)結(jié)合的第一抗體與樣品中的ProGRP或其分解物反應(yīng)的工序，(2)由該抗體捕捉的ProGRP或其分解物與和(1)的抗體不同的、與ProGRP(40-75)和/或ProGRP(40-79)結(jié)合的第二抗體反應(yīng)的工序，以及(3)檢測(cè)由(2)產(chǎn)生的免疫復(fù)合物的工序。與ProGRP或其分解物結(jié)合的抗體，優(yōu)選使用只選擇與ProGRP(40-75)和/或ProGRP(40-79)結(jié)合的抗體，在可以重現(xiàn)再現(xiàn)性高的測(cè)定值的范圍內(nèi)，測(cè)定體系內(nèi)也可以含有該抗體以外的抗體。本發(fā)明中特別優(yōu)選的抗體的組合，是識(shí)別ProGRP的第40-60位氨基酸序列的單克隆抗體GRP-3D6-2和識(shí)別第71-75位氨基酸序列的單克隆抗體GRP-2B10的組合。單克隆抗體GRP-3D6-2識(shí)別ProGRP的第40-60位氨基酸序列，同時(shí)不識(shí)別由該氨基酸序列中任意的8個(gè)連續(xù)氨基酸序列構(gòu)成的肽。由此認(rèn)為，單克隆抗體GRP-3D6-2識(shí)別由ProGRP的第40-60位氨基酸序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)抗原表位。推測(cè)單克隆抗體GRP-2B10識(shí)別由71-75位氨基酸殘基構(gòu)成的序列抗原表位。使用上述2種單克隆抗體的本發(fā)明的方法的檢測(cè)靈敏度為4.5pg/mL。這與現(xiàn)有的使用單克隆抗體與多克隆抗體測(cè)定ProGRP(31-98)的方法具有基本相同的靈敏度，該靈敏度足以用于測(cè)定健康人的血中ProGRP。本發(fā)明中使用的抗體可以通過(guò)免疫小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、雞、山羊、綿羊、牛等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲得。免疫中使用的抗原優(yōu)選使用PmGRP(40-75)禾口/或ProGRP(40-79)，也可以使用ProGRP(31-98)的肽，免疫后使用ProGRP(40-75)和/或ProGRP(40-79)可以選擇得到期望的抗體。以小鼠為例，對(duì)免疫動(dòng)物的方法進(jìn)行說(shuō)明。將ProGRP(31-98)等肽與弗氏完全佐劑、TiterMaxGold(CytRx公司)等佐劑以l:1混合，使用互相流通的接頭連接的兩個(gè)注射器，使其反復(fù)通過(guò)接頭，或通過(guò)超聲波處理等方法制備乳劑。在皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)的任一部位或多個(gè)部位注入制備的含有抗原的乳劑。第一次免疫結(jié)束后，間隔14周，同樣進(jìn)行第二次免疫。以后同樣繼續(xù)免疫，直至抗體對(duì)血中的ProGRP(31-98)的抗體效價(jià)上升?？贵w效價(jià)的測(cè)定可以按照以下方式進(jìn)行以lpg/mL的濃度在PBS中溶解ProGRP(31-98)，以每孔50pL的容量添加到96孔微量滴定板的各孔中，于4'C吸附過(guò)夜。用含0.05%Tween20的PBS(PBS-T)將各孔洗滌后，用于測(cè)定。測(cè)定前，也可以用含1%BSA的PBS等進(jìn)行封閉。從眼窩靜脈叢、尾靜脈或尾動(dòng)脈等處采血，用PBS-T稀釋30倍后進(jìn)行離心。將所得上清液用PBS-T進(jìn)行系列稀釋?zhuān)扛睵roGRP(31-98)，在微量滴定板的各孔中添加50nL。在室溫下反應(yīng)30分鐘后，用PBS-T洗滌，在各孔中添加50|iL使用PBS-T等適當(dāng)稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗小鼠IgG溶液。再在室溫下反應(yīng)30分鐘后，添加過(guò)氧化氫、鄰苯二胺底物液，反應(yīng)30分鐘，添加50pL2NH2SO4，停止反應(yīng)，測(cè)定各孔的吸光度。在免疫的小鼠中，確認(rèn)對(duì)ProGRP的抗體效價(jià)充分上升后，取出脾臟，分離脾臟細(xì)胞。使用另外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤(例如SP2/0-Agl4等)和聚乙二醇等進(jìn)行融合。將融合成功的細(xì)胞用HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)。714天左右，每隔幾天半量交換培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)后，測(cè)定培養(yǎng)上清液的抗體效價(jià)。通過(guò)有限稀釋法克隆陽(yáng)性孔的細(xì)胞，獲得產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交細(xì)胞瘤。通過(guò)上述方法獲得的雜交細(xì)胞瘤克隆體例如有3D6-2(保藏編號(hào)FERMBP-8669)、ProGRP-2B10(保藏編號(hào)FERMBP-4110)。通過(guò)分析上述方法所得抗體的抗原表位，可以獲得識(shí)別并結(jié)合ProGRP(40-75)禾B/或ProGRP(40-79)上存在的抗原表位的抗體?？乖砦环治隹梢酝ㄟ^(guò)研究抗體對(duì)ProGRP(40-75)禾卩/或ProGRP(40-79)的反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。通過(guò)在微量滴定板上涂覆重組體中發(fā)現(xiàn)的ProGRP(31-98)、ProGRP(40-75)禾口/或ProGRP(40-79)、或用Fmoc法或Boc法化學(xué)合成的ProGRP(40-75)禾卩/或ProGRP(40-79)，使用上述免疫測(cè)定法研究對(duì)各肽的反應(yīng)來(lái)確定。此外，可以通過(guò)使用多肽法合成的肽確定在ProGRP的連續(xù)8-12個(gè)氨基酸左右的連續(xù)肽中存在的抗原表位。本發(fā)明中，還可以將使用的抗體固相化或標(biāo)記。各操作可以根據(jù)各種實(shí)驗(yàn)方法的說(shuō)明書(shū)中記載的方法進(jìn)行，本發(fā)明的實(shí)施中不特別需要特殊的操作。本發(fā)明除了上述方法以外，還提供用于測(cè)定樣品中的ProGRP或其分解物的試劑盒，尤其是通過(guò)測(cè)定ProGRP或其分解物進(jìn)行小細(xì)胞肺癌診斷或化學(xué)療法監(jiān)測(cè)的診斷藥試劑盒。該試劑盒含有至少2種識(shí)別ProGRP(40-75)禾卩/或ProGRP(40-79)上存在的抗原表位的抗體，其它還可以任意地含有反應(yīng)緩沖液、二抗稀釋液、ProGRP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、說(shuō)明書(shū)等其它組成物。作為試劑盒中含有的抗體的優(yōu)選例，為識(shí)別ProGRP(40-75)禾P/或ProGRP(40-79)上存在的抗原表位、且不識(shí)別由該肽上的8個(gè)連續(xù)氨基酸殘基構(gòu)成的肽的抗體，或識(shí)別ProGRP的第71-75位氨基酸序列的抗體，代表例為單克隆抗體GRP-3D6-2或單克隆抗體GRP-2B10。以下列舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1雜交細(xì)胞瘤的制備根據(jù)專(zhuān)利第3210994號(hào)的實(shí)施例1記載的方法制備重組體，精制大腸菌中發(fā)現(xiàn)的序列編號(hào)4所示的肽。專(zhuān)利第3210994號(hào)的實(shí)施例1中，該重組體記載為GRP(31-98)，正確的是GRP前體(ProGRP)的(31-98)部分，因此本文記載為ProGRP(31-98)。然后，根據(jù)專(zhuān)利第3210994號(hào)的實(shí)施例6中記載的方法，得到產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交細(xì)胞瘤。得到的雜交細(xì)胞瘤3D6-2(FERMBP-8669)于2004年3月23日在日本獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利微生物保藏中心保藏，ProGRP-2B10(FERMBP-4110)和ProGRP-3G2(FERMBP-4109)于1992年12月9日在日本工業(yè)技術(shù)院微生物工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)為日本獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利微生物保藏中心)保藏。將所得雜交細(xì)胞瘤移植入使用姥鮫烷等處理的小鼠腹腔中，回收腹水，使用結(jié)合蛋白質(zhì)A的瓊脂糖凝膠(Sepharose)柱，從腹水中精制各單克隆抗體。將從雜交細(xì)胞瘤3D6-2(FERMBP-8669)獲得的單克隆抗體命名為GRP-3D6-2。實(shí)施例2單克隆抗體的抗原表位分析(1)肽的合成與抗原表位的確定序列編號(hào)3中表示ProGRP(31-98)的核酸序列和氨基酸序列。根據(jù)該氨基酸序列，通過(guò)Fmoc法合成ProGRP(31-98)的部分肽。Pepl是ProGRP的第31-52位肽，Pep70是第40-60位肽，Pep3是第54-78位肽，Epi2是第82-96位肽，Pep5是第82-96位肽。合成的肽通過(guò)反相色譜法或反相色譜法和凝膠過(guò)濾聯(lián)用進(jìn)行精制。精制純度為80%以上。將各個(gè)肽用PBS稀釋成l嗎/mL的濃度，在96孔微量滴定板的各孔中添加100pL，于4"C吸附過(guò)夜。用PBS將各孔洗滌2次后，在各孔中添加含1%BSA的PBS，室溫下培養(yǎng)2小時(shí)，吸除。在各孔中添加100|iL稀釋成l嗎/mL濃度的單克隆抗體GRP-3D6-2，室溫下反應(yīng)60分鐘后，用含0.05%Tween20的PBS(PBS-T)洗滌5次后，在各孔中分別添加lOO^iL辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體溶液，室溫下反應(yīng)30分鐘。用PBS-T洗滌5次后，在各孔中分別添加100pL底物溶液(2mg/mL鄰苯二胺、含0.9pL/mL30%過(guò)氧化氫溶液的O.IM檸檬酸磷酸緩沖液、pH5.0)，室溫下反應(yīng)30分鐘后，在各孔中分別添加lOOpL2N硫酸，停止反應(yīng)。立即測(cè)定492nm處的吸光度，結(jié)果如表l所示。表1肽_氨基酸編號(hào)_OD492/63031-520.003Pep7040-600.822Pep354-780.003Epi270-900.004Pep582-960.002ProGRP_31-98_2.236_單克隆抗體GRP-3D6-2與作為陽(yáng)性對(duì)照的重組體ProGRP(31-98)和ProGRP的第40-60位氨基酸序列Pep70反應(yīng)。由此可知，GRP-3D6-2識(shí)別ProGRP的第40-60位氨基酸序列。此外，通過(guò)同樣的方法，發(fā)現(xiàn)GRP-2B10與Pep3和Epi2的肽反應(yīng)，GRP-3G2與Epi2和Pep5的肽反應(yīng)。(2)多肽的合成和抗原表位的確定基于ProGRP(31-98)的氨基酸序列，用多肽法合成每個(gè)氨基酸重疊的8個(gè)連續(xù)氨基酸序列構(gòu)成的61個(gè)肽。各肽末端結(jié)合生物素，委托和光純藥株式會(huì)社(大阪)合成。將用多肽法合成的各生物素化肽在二甲基甲酰胺中溶解，用PBS稀釋成l嗎/mL的濃度。在抗生物素蛋白固相的96孔微量滴定板的各孔中分別添加100nL該稀釋的各生物素化肽溶液，于4'C結(jié)合過(guò)夜。用含0.05e/。Tween20的PBS(PBS-T)將各孔洗滌后，在各孔中添加lOOpL將各單克隆抗體GRP-3D6-2、GRP-3G2、GRP-2B10稀釋成l嗎/mL的溶液。室溫下反應(yīng)30分鐘后，用PBS-T洗漆5次，在各孔中分別添加100pL辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體溶液，再在室溫下反應(yīng)30分鐘后，用PBS-T洗滌5次，在各孔中分別添加100pL底物溶液(2mg/mL鄰苯二胺、含0.9)aL/mL30%過(guò)氧化氫溶液的O.IM檸檬酸磷酸緩沖液、pH5.0)，室溫下反應(yīng)30分鐘后，分別添加100pL2N硫酸，立即測(cè)定492nm處的吸光度。各單克隆抗體GRP-3D6-2、GRP-3G2、GRP-2B10對(duì)ProGRP(31-98)內(nèi)部的各肽的反應(yīng)如圖l(A)、(B)、(C)所示。如圖1(A)所示，單克隆抗體GRP-3D6-2與ProGRP(31-98)內(nèi)部的各8個(gè)連續(xù)氨基酸序列構(gòu)成的肽均不結(jié)合。認(rèn)為這是由于GRP-3D6-2不能識(shí)別ProGRP(31-98)的8個(gè)連續(xù)氨基酸序列構(gòu)成的肽，而能識(shí)別比8個(gè)連續(xù)氨基酸序列長(zhǎng)的肽形成的結(jié)構(gòu)抗原表位。另一方面，單克隆抗體GRP-3G2與81-88、82-89、83-卯、84-91這4段8個(gè)連續(xù)氨基酸序列構(gòu)成的肽結(jié)合。認(rèn)為單克隆抗體GRP-3G2的抗體能識(shí)別在該4段肽中存在的序列84-88的肽(圖l(B))。此外，單克隆抗體GRP-2B10的抗體與68-75、69-76、70-77、71-78這4段8個(gè)連續(xù)氨基酸序列構(gòu)成的肽結(jié)合。因此認(rèn)為單克隆抗體GRP-2B10能識(shí)別在該4段肽中存在的序列71-75位的肽(圖1(C))。由使用這些肽的抗原表位的確定結(jié)果可知，單克隆抗體GRP-3G2或單克隆抗體GRP-2B10識(shí)別的抗原表位是由5個(gè)殘基的氨基酸形成的連續(xù)抗原表位。此外，單克隆抗體GRP-3D6-2是能識(shí)別ProGRP(31-98)的至少40-60部分的肽、且與ProGRP(31-98)內(nèi)部的8個(gè)連續(xù)氨基酸序列構(gòu)成的肽不發(fā)生反應(yīng)的抗體。換句話(huà)說(shuō)，認(rèn)為被GRP-3D6-2識(shí)別的抗原表位由ProGRP(31-98)的至少40-60位氨基酸序列形成，該抗原表位是無(wú)法用各8個(gè)連續(xù)氨基酸序列構(gòu)成的肽形成的結(jié)構(gòu)抗原表位?？偨Y(jié)以上單克隆抗體識(shí)別的抗原表位的關(guān)系，如表2所示。實(shí)施例3通過(guò)組合單克隆抗體研究樣品的保存穩(wěn)定性在96孔微量培養(yǎng)板的各孔中，以4嗎/mL的濃度添加100pL1種或2種單克隆抗體(2種時(shí)為等量混合)，于4C培養(yǎng)過(guò)夜，進(jìn)行固相化。用GRP國(guó)3G2GRP-2B10GRP-3D6-2單克隆抗體抗原表位(ProGRP的氨基酸編號(hào))84-8871-7540-60含0.15MNaCl的lOmM磷酸緩沖液(pH7.3)洗滌2次后，加入350pL封閉液(含0.5%酪蛋白鈉的lOmM磷酸緩沖液，pH7.1)，靜置2小時(shí)，進(jìn)行封閉。除去封閉液后，在各孔中加入lOO)iL反應(yīng)液和50pL測(cè)定樣品，在37"C下反應(yīng)1小時(shí)。用洗滌液(含0.05%Tween20的10mM磷酸緩沖液，pH7.3)洗滌5次，添加100pLHRP標(biāo)記的1種或2種單克隆抗體(2種時(shí)為等量混合)溶液，在室溫下反應(yīng)30分鐘。用洗滌液洗滌5次，加入100pL底物溶液(2mg/mL鄰苯二胺、含0.9pL/mL30。/。過(guò)氧化氫溶液的0.1M檸檬酸磷酸緩沖液、pH5.0)，培養(yǎng)30分鐘，添加100pL2N硫酸，停止酶反應(yīng)。用酶標(biāo)儀(MicroplateReader)測(cè)定492nm處(參比波長(zhǎng)630nm)的吸光度。使用該測(cè)定法，將3個(gè)樣品分為分別在-2(TC下凍干保存的樣品和在室溫下保存17小時(shí)的樣品進(jìn)行測(cè)定。將凍干保存的樣品的ProGRP值設(shè)為100%，室溫下保存17小時(shí)時(shí)的測(cè)定值用百分比表示(表3)。固相化抗體與標(biāo)記抗體的組合分別是GRP-3G2與GRP-2B10、GRP-3G2與GRP-3D6-2、GRP-3G2與GRP-2B10/GRP-3D6-2時(shí)，保存17小時(shí)的樣品的ProGRP免疫活性分別平均降為69.6%、70.6%、69.2%。此外，現(xiàn)有方法的固相化抗體與標(biāo)記抗體的組合為GRP-3G2/GRP-2B10與多克隆抗體時(shí)，也減少至71.8%。另一方面，固相化抗體使用GRP-3D6-2、標(biāo)記抗體使用GRP-2B10時(shí)，即使在室溫下保存17小時(shí)，測(cè)定值也平均為89.3%，與其它抗體的組合相比，約20%的ProGRP的免疫活性得以保持(表3)。另外，多克隆抗體是使用專(zhuān)利第3210994號(hào)的實(shí)施例8中記載的方法獲得的抗體。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例4使用與ProGRP(40-75)結(jié)合的抗體的測(cè)定法在96孔微量培養(yǎng)板的各孔中，以4嗎/mL的濃度添加200pLGRP-3D6-2，于4'C培養(yǎng)過(guò)夜，進(jìn)行固相化。用含0.15MNaCl的10mM磷酸緩沖液(pH7.3)洗滌2次后，加入350nL封閉液(含0.5%酪蛋白鈉的10mM磷酸緩沖液，pH7.1)，靜置2小時(shí)，進(jìn)行封閉。除去封閉液后，在各孔中加入100pL反應(yīng)液和100pL測(cè)定樣品，在37。C下反應(yīng)1小時(shí)。用洗滌液(含0.05%Tween20的lOmM磷酸緩沖液，pH7.3)冼滌5次，添加200pLHRP標(biāo)記的GRP-2B10溶液，在室溫下反應(yīng)30分鐘。用洗滌液洗滌5次，加入200pL底物溶液(2mg/mL鄰苯二胺，含0.9nL/mL30%過(guò)氧化氫溶液的O.IM檸檬酸磷酸緩沖液，pH5.0)，培養(yǎng)30分鐘，加入50pL5N硫酸，停止酶反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定492nm處(參比波長(zhǎng)630nm)的吸光度。其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖2所示。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，認(rèn)為可以檢測(cè)約為4.5pg/mL的ProGRP。該靈敏度在檢測(cè)健康人樣品中的ProGRP量方面具有足夠的靈敏度。試驗(yàn)例1使用現(xiàn)有方法和本發(fā)明實(shí)施例4的測(cè)定法，將5個(gè)樣品在4'C下保存l天、3天、7天后，測(cè)定樣品中ProGRP免疫活性，與保存前的測(cè)定值進(jìn)行比較?，F(xiàn)有方法按如下步驟進(jìn)行在96孔微量培養(yǎng)板的各孔中，以10|ig/mL的濃度添加100|iLGRP-3G2和GRP-2B10(等量混合)，于4°C培養(yǎng)過(guò)夜，進(jìn)行固相化。用含0.15MNaCl的lOmM磷酸緩沖液(pH7.3)洗滌2次后，加入350^L封閉液(含0.5%酪蛋白鈉的lOmM磷酸緩沖液，pH7.1)，靜置2小時(shí)，進(jìn)行封閉。除去封閉液后，在各孔中加入100pL反應(yīng)液和50|iL測(cè)定樣品，在37'C下反應(yīng)1小時(shí)。用洗滌液(含0.05%Tween20的lOmM磷酸緩沖液，pH7.3)洗滌5次，添加100pLHRP標(biāo)記的多克隆抗體溶液，在室溫下反應(yīng)30分鐘。用洗滌液洗滌5次，加入100|iL底物溶液(2mg/mL鄰苯二胺、含0.9ixL/mL3(P/。過(guò)氧化氫溶液的O.IM檸檬酸磷酸緩沖液、pH5.0)，培養(yǎng)30分鐘，加入100pL2N硫酸，停止酶反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定492nm處(參比波長(zhǎng)630nm)的吸光度。將在4X:下保存前的ProGRP值設(shè)為100%，各保存期后的測(cè)定值用百分比表示。結(jié)果如表4所示。使用現(xiàn)有方法時(shí)，樣品中的ProGRP測(cè)定值在4t:下保存1天時(shí)平均為94.5%，保存3天時(shí)平均為85.8%，保存7天時(shí)平均為67.8%，存在1天平均降低約4.93%的傾向。另一方面，本發(fā)明的測(cè)定方法中，樣品中的ProGRP測(cè)定值在4"C下保存1天時(shí)平均為96.9%，保存3天時(shí)平均為94.3%,保存7天時(shí)平均為86.9%，存在1天平均降低約2.29%的傾向。即本發(fā)明的測(cè)定方法與現(xiàn)有方法相比，顯示高2.15倍的保存穩(wěn)定性，尤其是在保存7天時(shí)，與現(xiàn)有方法相比，約19%的ProGRP免疫活性得以保持。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>試驗(yàn)例2對(duì)本發(fā)明中可使用的單克隆抗體GRP-3G2、GRP-2B10、GRP-3D6-2分另U識(shí)別的抗原表位進(jìn)行分析。通過(guò)Fmoc法合成ProGRP的第31-53位肽。合成的肽通過(guò)反相色譜法或反相色譜法和凝膠過(guò)濾聯(lián)用進(jìn)行精制。將包括實(shí)施例2中使用的各個(gè)肽在0.1%TFA中溶解，用PBS稀釋至10嗎/mL的濃度。96孔微量滴定板的各孔中以每孔100pL的容量，添加到96孔ELISA板的各孔中，于4'C吸附過(guò)夜。用PBS將各孔洗滌2次后，在各孔中添加含1%BSA的PBS，在室溫下培養(yǎng)2小時(shí)，吸除。在各孔中分別添加100pL稀釋成5|ig/mL濃度的單克隆抗體GRP-3G2、GRP-2B10、GRP-3D6-2，在室溫下反應(yīng)85分鐘后，用含0.05%Tween20的PBS(PBS-T)洗滌5次。在各孔中分別添加100pL用PBS-T適當(dāng)稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體溶液，再在室溫下反應(yīng)30分鐘。用PBS-T洗滌5次后，在各孔中分別添加100pL底物溶液(2mg/mL鄰苯二胺、含0.9nL/mL30%過(guò)氧化氫溶液的O.IM檸檬酸磷酸緩沖液、pH5.0)，室溫下反應(yīng)20分鐘后，在各孔中分別添加100pL2N硫酸，停止反應(yīng)。立即測(cè)定492nm處的吸光度。結(jié)果如表5所示。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>由表5可知，GRP-3G2、GRP-2B10、GRP-3D6-2的反應(yīng)的抗原表位顯示與實(shí)施例2基本相同的結(jié)果，GRP-3D6-2與31-53位的肽完全不反應(yīng)，因此確認(rèn)與42-53位的肽也不反應(yīng)。試驗(yàn)例3使用質(zhì)量分析裝置(LC-MS/MS)進(jìn)行ProGRP-Cdel的鑒定。將對(duì)ProGRP(31-98)范圍的各種肽顯示反應(yīng)性的兔子多克隆抗體在PBS(pH7.35)中溶解，使達(dá)到12.7mg/mL，根據(jù)用戶(hù)手冊(cè)結(jié)合3mLNHS-瓊脂糖湊走膠(Amersham公司)。在2例1.5mL人血清樣品中，添加20嗎重組ProGRP(31-98)，在室溫下保存24小時(shí)。然后，添加0.4mL上述兔子多克隆抗體結(jié)合瓊脂糖凝膠，在室溫下攪拌60分鐘。用洗滌液(含0.05%Tween20的10mM磷酸緩沖液pH7.3)洗滌該兔子多克隆抗體結(jié)合瓊脂糖凝膠，添加0.5mL9.5M尿素溶液，溶出結(jié)合在兔子多克隆抗體結(jié)合瓊脂糖凝膠上的物質(zhì)。回收溶出液，取其一部分，使用LC-MS/MS研究人血清樣品中保存的保存后的ProGRP(31-98)范圍的肽。在100pL溶出液中添加lpL250mM甲基-PECVNHS酯(Pierce)溶液/DMSO，在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。添加5|iL1MTris-HCl(pH8)，在室溫下培養(yǎng)30分鐘，停止反應(yīng)后，添加800pL丙酮，沉淀蛋白質(zhì)。離心后，干燥沉淀，向其中添加15pLPromega公司的修飾胰蛋白酶溶液(20ng/]iL/50mM碳酸氫銨)，在3(TC下消化過(guò)夜。在消化后的樣品中添加15pL0.1%甲酸，取以15000rpm離心5分鐘的上清液5pL，進(jìn)行LC-MS/MS分析((LC部分)Agilent1100系列毛細(xì)管LC系統(tǒng)，(柱)AgillentZorbaxSB-C18，5,，150復(fù)5mm，(MS/MS)BmkerDaltonicsHCT-plus}。在0.1%甲酸存在下進(jìn)行分離，流量為15pL/分鐘，乙腈梯度為0-35。/。線(xiàn)性/0-120min、35-95。/。線(xiàn)性/120-125min。將柱溶出液導(dǎo)入ESI部分，獲得MS/MS數(shù)據(jù)，通過(guò)數(shù)據(jù)分析軟件制作峰列表，通過(guò)MatrixScience公司的MASCOTserver進(jìn)行分析。甲基-PE04-NHS具有修飾蛋白質(zhì)分子內(nèi)的N末端氨基和賴(lài)氨酸的側(cè)鏈氨基的性質(zhì)。因此，在發(fā)現(xiàn)的肽片段內(nèi)只要N末端存在被標(biāo)記的物質(zhì)，則其在消化前處于N末端游離的狀態(tài)。此外，在側(cè)鏈氨基修飾的賴(lài)氨酸部位沒(méi)有通過(guò)胰蛋白酶引起消化，因此只要C末端賴(lài)氨酸的側(cè)鏈被修飾，則其在消化前已經(jīng)在該部分被切斷。在兩血清樣品中，發(fā)現(xiàn)了C末端賴(lài)氨酸被標(biāo)記的片段NHQPPQPK(72-79)。因此認(rèn)為，至少Lys-79的C末端被切斷的片段是通過(guò)血清處理產(chǎn)生的。而且，雖然N末端沒(méi)有被標(biāo)記，但兩血清樣品中觀察到SVSER(37-41)這樣的片段，表明在Ser-36的C末端有被切斷的可能性。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的方法通過(guò)以新確認(rèn)的、在樣品中也能穩(wěn)定保存的ProGRP的某種分解物上的抗原表位作為測(cè)定對(duì)象，除了能獲得與現(xiàn)有的測(cè)定方法相同的檢測(cè)靈敏度，而且采取后的樣品的處理方法難以受到影響，能獲得再現(xiàn)性高的測(cè)定值等，對(duì)血中ProGRP的檢測(cè)有效。權(quán)利要求1.一種使用識(shí)別序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的第40-75位的部分氨基酸序列構(gòu)成的肽的2種以上的不同抗體，測(cè)定胃泌素釋放肽前體和/或其分解物的方法。2.—種使用識(shí)別序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的第40-79位的部分氨基酸序列構(gòu)成的肽的2種以上的不同抗體，測(cè)定胃泌素釋放肽前體和/或其分解物的方法。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述方法為三明治免疫測(cè)定法。4.一種與序列編號(hào)l所示的氨基酸序列的第40-60位的部分氨基酸序列構(gòu)成的肽結(jié)合，且與序列編號(hào)1所示的氨基酸序列上的任意8個(gè)連續(xù)氨基酸序列構(gòu)成的肽不結(jié)合的抗體。5.—種與序列編號(hào)l所示的氨基酸序列的第40-60位的部分氨基酸序列構(gòu)成的肽結(jié)合，與由第31-53位的部分氨基酸序列構(gòu)成的肽不結(jié)合的抗體。6.如權(quán)利要求4或5所述的抗體，其中所述抗體由按照保藏編號(hào)FERMBP-08669保藏的雜交細(xì)胞瘤3D6-2產(chǎn)生。7.按照保藏編號(hào)FERMBP-08669保藏的雜交細(xì)胞瘤3D6-2。8.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述的2種以上的不同抗體的至少一種是權(quán)利要求46的任一項(xiàng)中所述的抗體。9.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述的2種以上的不同抗體的至少一種是權(quán)利要求46中任一項(xiàng)所述的抗體，其它抗體為識(shí)別序列編號(hào)1的氨基酸序列第71-75位的部分氨基酸序列構(gòu)成的肽的抗體。10.—種含有權(quán)利要求46中任一項(xiàng)所述的抗體并用于測(cè)定胃泌素釋放肽前體或其分解物的試劑盒。11.如權(quán)利要求10所述的試劑盒，其是用于癌診斷的試劑盒。全文摘要本發(fā)明提供一種不存在測(cè)定值分散和樣品處理等操作上的制約等問(wèn)題的新的ProGRP測(cè)定方法。具體而言，是一種使用識(shí)別序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的第40-75位的部分氨基酸序列構(gòu)成的肽的2種以上的不同抗體，測(cè)定胃泌素釋放肽前體和/或其分解物的方法。此外，還提供一種使用識(shí)別序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的第40-79位的部分氨基酸序列構(gòu)成的肽的2種以上的不同抗體，測(cè)定胃泌素釋放肽前體和/或其分解物的方法。本發(fā)明的方法除了能獲得與現(xiàn)有的測(cè)定方法相同的檢測(cè)靈敏度，還具有采取后的樣品容易處理、能獲得再現(xiàn)性高的測(cè)定值等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)G01N33/53GK101160526SQ200680012079公開(kāi)日2008年4月9日申請(qǐng)日期2006年4月13日優(yōu)先權(quán)日2005年4月13日發(fā)明者青柳克已申請(qǐng)人:株式會(huì)社先端生命科學(xué)研究所