專利名稱：：用于測(cè)定糖蛋白Ibα(GPIBα)蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明處于生物化學(xué)測(cè)定系統(tǒng)、特別是用于測(cè)量蛋白質(zhì)的生物化學(xué)測(cè)定系統(tǒng)領(lǐng)域內(nèi)。更具體地，本發(fā)明涉及檢測(cè)并定量糖蛋白Iba(GPIba)蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
：在血管生物學(xué)中，血小板功能是正常的止血和血栓形成的基礎(chǔ)。血小板通過保持血管完整性和控制損傷后的出血而對(duì)維持正常血液循環(huán)作出貢獻(xiàn)(Ruggeri，J.Clin.Invest.99:559-564(1997))。盡管血小板栓的形成是存活所需要的防御機(jī)制，然而，它還可能促成了疾病如心肌梗死，尤其在動(dòng)脈粥樣硬化微環(huán)境下(Fuster，N.Engl.J.Med.326:242-250(1992))。此外，發(fā)達(dá)國家中發(fā)病率和死亡率的一個(gè)主要原因是急性血栓形成性動(dòng)脈閉塞(Ruggeri，J.Clin.Invest.99:4559-564(1997))。這凸顯以揭示血小板對(duì)血管損傷的應(yīng)答機(jī)制、以及檢測(cè)該復(fù)雜途徑中成分的商業(yè)方法為中心的研究的意義。血小板的受體復(fù)合體即糖蛋白(GP)Ib/IX/V在血小板應(yīng)答機(jī)制中是重要的。這種血小板受體直接與形成至受損血管壁的橋的馮.維勒布蘭德因子(vWF)結(jié)合(Miura,J.Biol.Chem.275:7539-7546(2000))。該效應(yīng)通過vWF與內(nèi)皮下基質(zhì)結(jié)合而觸發(fā)并受到微血管內(nèi)血流所提供剪切應(yīng)力的調(diào)節(jié)(Turitto，Blood65:823-829(1985))。該事件進(jìn)一步導(dǎo)致來自受損血管壁的膠原受體與血小^目互作用，引起血小板激活、血小板聚集并且形成封閉內(nèi)皮潰瘍和阻止血液滲漏的止血栓(Girma，Blood70:605-615(1987))。與vWF-膠原基質(zhì)結(jié)合的血小板受體GPIb/IX/V由四個(gè)亞基即GPIba、GPIbj8、GPIX和GPV組成(Modderman，J.Biol.Chem.267:364-369(1992))?；谄涔δ芗按笮。@些亞基中最重要的亞基是150誦kDaGPIba鏈(Uff，J.Biol.Chem.277:35657-35663(2002))。GPIba負(fù)責(zé)通過與vWF的Al-結(jié)構(gòu)域上的多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合而初始祐附至vWF。在GPIba內(nèi)的突變可以引起出血性病癥、貝-蘇綜合征(BSS)和vWF維勒布蘭德病(Pt-vWD)。vWF是GPIba的主要配體，與此同時(shí)已經(jīng)鑒定與該糖蛋白結(jié)合的其它蛋白質(zhì)，包括凝血酶、激肽原、因子XI、因子XII、P-選擇素和Mac-l(Uff，J.Biol.hem.277:35657-35663(2002))。GPIba的生物學(xué)重要性是顯而易見的，并且因此對(duì)筒單的、判定性生物學(xué)測(cè)定法以鑒定并定量GPIba的需要變得迫切。目前定量GPIba的可用生物學(xué)測(cè)定法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、受限于某些同種型并且操作成本昂貴。體內(nèi)(invivo)方法包括大鼠尾靜脈出血模型和狗Folts動(dòng)物模型，而瑞斯托菌素誘導(dǎo)的血小板凝集測(cè)定(RIPA)構(gòu)成目前可用的體外(invitro)測(cè)定法(Folts，Circulation83:IV3-IV14(1991)，Dejana，Thromb.Haemost.48:108-111(1982)，WeissJ.Clin.Invest.2:2708-16(1973))。這些測(cè)定法伴有背景噪音高、靈敏性有限、成本高、需要大量勞動(dòng)力，并且具有明顯的測(cè)定間變異性。因此，需要可以精確而迅速地在數(shù)種生物學(xué)樣品類型內(nèi)檢測(cè)并定量大范圍水平的GPIba的測(cè)定系統(tǒng)。更具體地是可以在研究實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下以及在臨床和診斷場(chǎng)所內(nèi)精確而高效地測(cè)量GPIba的方法。具備簡(jiǎn)單、精確并高度可重復(fù)性地檢測(cè)GPIba的生物學(xué)活性的新方法非常受歡迎。本發(fā)明滿足了這些要求并且還提供相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)將部分地在后續(xù)描述內(nèi)敘述，并且將部分地自此描述中顯而易見，或可以通過實(shí)施本發(fā)明獲知。本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)將通過在所附帶權(quán)利要求書中特別提出的組成部分和組合加以實(shí)現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解，如所要求那樣，在先的一般描ii^隨后的詳細(xì)描述僅是示例性和解釋性的，并且不限制本發(fā)明。發(fā)明筒述GPIba在血管生物學(xué)中的重要性已經(jīng)充分認(rèn)可，然而沒有檢測(cè)GPIba或測(cè)量其生物學(xué)活性的簡(jiǎn)單、有效的試驗(yàn)或診斷性測(cè)定法。描述于本文中的本發(fā)明涉及了開發(fā)高效、可重復(fù)性和價(jià)廉的用于檢測(cè)并定量GPIba的生物活性的方法。本發(fā)明可應(yīng)用于臨床和研究環(huán)境中。本發(fā)明還允if^t感而特異地區(qū)分GPIba的不同同種型并且因此在執(zhí)行質(zhì)量控制和檢測(cè)GPIba產(chǎn)生水平中極為有用。本測(cè)定法的敏感性和特異性包括，但不限于測(cè)定GPIba產(chǎn)生和純化過程中可能的污染性同種型，允許區(qū)分活性和非活性的GPIba-Fc融合蛋白的能力。本發(fā)明涉及確定生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba存在的測(cè)定方法，包括(a)提供包含GPIba的物質(zhì)；(b)使來自步驟(a)的物質(zhì)與結(jié)合GPIba的結(jié)合蛋白接觸；(c)添加對(duì)GPIba特異的檢測(cè)化合物；(d)添加結(jié)合來自步驟(b)的結(jié)合蛋白的復(fù)合物(complexingcompound);和(e)檢測(cè)來自步驟(c)的檢測(cè)化合物，其中陽性檢測(cè)信號(hào)預(yù)示著生物學(xué)樣品內(nèi)存在GPIba。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及檢測(cè)生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba的蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定方法，包括(a)提供包含GPIba的物質(zhì)；(b)使來自步驟(a)的物質(zhì)與結(jié)合GPIba的結(jié)合蛋白接觸；(c)添加對(duì)GPIba特異的檢測(cè)化合物；(d)添加結(jié)合來自步驟(b)的結(jié)合蛋白的復(fù)合物；和(e)檢測(cè)來自步驟(c)的檢測(cè)化合物，其中與已知標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較的檢測(cè)信號(hào)預(yù)示著生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba的蛋白質(zhì)濃度。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及檢測(cè)生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba的結(jié)合活性的測(cè)定方法，包括含(a)提供包含GPIba的物質(zhì)；(b)使來自步驟(a)的物質(zhì)與結(jié)合GPIba的結(jié)合蛋白接觸；(c)添加對(duì)GPIba特異的檢測(cè)化合物；(d)添加結(jié)合來自步驟(b)的結(jié)合蛋白的復(fù)合物；(e)檢測(cè)來自步驟(c)的檢測(cè)化合物，其中與已知標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較的檢測(cè)信號(hào)預(yù)示著生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba的蛋白質(zhì)濃度；和(f)計(jì)算GPIba的結(jié)合活性。在又一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及通過測(cè)量生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba同種型的結(jié)合活性而檢測(cè)GPIba同種型的測(cè)定方法，包括(a)提供包含GPIba的物質(zhì)和GPIba樣物質(zhì)；(b)使來自步驟(a)的物質(zhì)與結(jié)合GPIba的結(jié)合蛋白接觸；(c)添加對(duì)GPIba特異的檢測(cè)化合物；(d)添加結(jié)合來自步驟(b)的結(jié)合蛋白的復(fù)合物；(e)檢測(cè)來自步驟(c)的檢測(cè)化合物，其中與已知標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較的檢測(cè)信號(hào)預(yù)示著生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba的蛋白質(zhì)濃度；(f)計(jì)算GPIba同種型的結(jié)合活性；和(g)將同種型的結(jié)合活性與已知GPIba對(duì)照的結(jié)合活性比較。附圖簡(jiǎn)述虧1入本說明書并構(gòu)成其部分的附圖，以及連同;MS述共同起到解釋本發(fā)明原理的作用。圖1是GPIba結(jié)合測(cè)定方式的示意圖。首先混合生物素vWF、GPIba-Fc融合蛋白和BV-標(biāo)記的抗人Fc抗體并在室溫溫育2小時(shí)。溫育后，添加鏈親和素(SA)珠至此混合物并再溫育30分鐘。圖2是在vWF上的GPIba結(jié)合區(qū)域的示意圖。圖3是用于GPIba-vWF結(jié)合測(cè)定法的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖示。信號(hào)/背景(S/B)比對(duì)于本測(cè)定法接近于10，而ELISAGPIba結(jié)合測(cè)定法的S/B是處在其最大值2上，具有l(wèi)個(gè)log線性軸。圖4是用于GPIba-Al結(jié)合測(cè)定法的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖示。圖5是產(chǎn)物變體的結(jié)合活性的圖示。WT對(duì)應(yīng)于野生型GPIba。VI、V2和V3是功能增進(jìn)的GPIba變體。根據(jù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，功能增進(jìn)的變體具有增加的結(jié)合GPIba的能力。在vWF結(jié)合測(cè)定法中，可以容易地觀察到V3、V2、V1和WT之間的差異，而在A1結(jié)合測(cè)定法中，變體之間的差異極為有限。圖6是四種不同的低分子量(LMW)同種型在vWF結(jié)合測(cè)定法中結(jié)合活性的圖示。對(duì)照是未切割的GPIba分子。截段、截段1-276、截段1-282和截段Fc代表不同切割的GPIba同種型。圖7A是GPIba樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)的圖示。GPIba的原料藥物質(zhì)(BDS)貯藏在4°C并且將高分子量(HMW)的百分?jǐn)?shù)作為時(shí)間的函數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。圖7B是GPIba樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)的圖示。GPIba的原料藥物質(zhì)(BDS)貯藏在4°C并且將結(jié)合活性的百分?jǐn)?shù)作為時(shí)間的函數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。示。試驗(yàn)樣品包括未處理用于體內(nèi)試驗(yàn)的未處理動(dòng)物對(duì)照；LMW:低分子量的GPIba(典型截段)；加載在陰離子交換(AEX)柱分離前上載的對(duì)照樣品；全部石危酸鹽化全部石克酸鹽化作用位點(diǎn)經(jīng)石危酸鹽化的GPIba;和非硫酸鹽化硫酸鹽化作用位點(diǎn)均未經(jīng)硫酸鹽化的GPIba。圖9是來自狗Folts動(dòng)物模型的體外數(shù)據(jù)和體內(nèi)數(shù)據(jù)比較的圖示。試驗(yàn)樣品包括未處理用于體內(nèi)試驗(yàn)的未處理的動(dòng)物對(duì)照；單體完整的未經(jīng)切割的GPIba單體；LMW1和LMW2:來自AEX柱分離的GPIba的低分子量級(jí)分；全部硫酸鹽化全部硫酸鹽化作用位點(diǎn)經(jīng)硫酸鹽化的GPIba;和非硫酸鹽化硫酸鹽化作用位點(diǎn)均未硫酸鹽化的GPIba。圖IO是在AEX-HPLC上分離的硫酸鹽化同種型的圖示。圖11是在SEC-HPLC上通過大小分離的GPIba的同種型的圖示。圖12是GPIba測(cè)定法的可重復(fù)性和計(jì)算的變異百分?jǐn)?shù)的圖示。圖13A是GPIbcr測(cè)定法與對(duì)照(Fcprtnl)的結(jié)合特異性的圖示。圖13B是GPIbcr測(cè)定法與對(duì)照(Fcprtn2和Fcprtn3)的結(jié)合特異性的圖示。發(fā)明詳述除非另外定義，本文中所用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)一般技術(shù)人員通常所理解的相同含義。雖然與本文中所述的那些方法和材料相似的方法和材料可以用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，但是合適的方法和材料描述如下。本文中提及的全部出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)完整地引用作為參考。此外，材料、方法和實(shí)施例僅是說明性的，并且將不是限制性的。本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將自詳述、附圖及自權(quán)利要求書中顯而易見?？s寫和定義本文中使用如下縮寫"ATCC"意指美國典型培養(yǎng)物保藏中心，"vWF"意指馮*維勒布蘭德因子，"GPIba"意指糖蛋白lb-a，"CHO"意指中國倉鼠卵巢細(xì)胞，"NIH3T3"意指國立衛(wèi)生研究院3T3細(xì)胞。如本文中所用，術(shù)語"抗體"意指，而不限于，多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、基因工程抗體、雙特異性抗體、抗體片段及代表抗體活性部分的單鏈。產(chǎn)生如上提及的每一抗體形式的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。如本文中所用，術(shù)語"生物學(xué)樣品"意指，而不限于任何(原核或真核)細(xì)胞、任何組織或器官，或者其重組技術(shù)或遺傳工程的任何產(chǎn)物。"生物學(xué)樣品，，還可以是血漿樣品、細(xì)胞培養(yǎng)上清液或來自純化過程的緩沖液。在血漿的情況下，其來源可以是來自任何哺乳動(dòng)物，包括但不限于猴、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、豬、狗、馬和人。血漿是全血中的包含可溶解蛋白質(zhì)的部分。備選地，該測(cè)定法可以在全血上實(shí)施，無需分離出血漿。細(xì)胞培養(yǎng)上清液可以分離自表達(dá)GPIba的任何細(xì)胞培養(yǎng)系。細(xì)胞系可以選自CHO細(xì)胞系、NIH-3T3細(xì)胞系或從ATCC得到的任意細(xì)胞系，任意的這些細(xì)胞系已經(jīng)被操作以表達(dá)GPIba。如本文中所用，術(shù)語"同種型"意指，而不限于，低分子量(LMW)GPIba、高分子量(HMW)GPIbo(見圖11)，GPIba的其它變體形式(Vl、V2、V3)和小分子，包括但不限于完全-危酸鹽化或部分;危酸鹽化的GPIba蛋白(見圖10)。描述本發(fā)明是特異而靈敏地檢測(cè)并定量生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba或GPIba樣雜質(zhì)存在的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定法包括(a)提供包含GPIba的物質(zhì)；(b)使來自步驟(a)的物質(zhì)與結(jié)合GPIba的結(jié)合蛋白接觸；(c)添加對(duì)GPIba特異的檢測(cè)化合物；(d)添加結(jié)合來自步驟(b)的結(jié)合蛋白的復(fù)合物；和(e)檢測(cè)來自步驟(c)的檢測(cè)化合物，其中陽性檢測(cè)信號(hào)預(yù)示著生物學(xué)樣品內(nèi)存在GPIba。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含GPIba的生物學(xué)物質(zhì)可以是血漿、來自細(xì)胞系的上清液或緩沖液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，血漿可以來源于選自猴、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、馬和人的哺乳動(dòng)物。上清液可以來自CHO細(xì)胞系、NIH-3T3細(xì)胞系或從ATCC得到的細(xì)胞系。在又一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)GPIba特異的檢測(cè)化合物是抗體或者更優(yōu)選地是抗體的Fab片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)GPIba特異的結(jié)合蛋白是具有與以上抗體的活性結(jié)合位點(diǎn)不同的結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)GPIba特異的結(jié)合蛋白是vWF的片段，如vWF的Al結(jié)構(gòu)域。該片段可以是vWF的Al結(jié)構(gòu)域的重組形式。備選地，對(duì)GPIba特異的結(jié)合蛋白是完整的vWF蛋白。在另一個(gè)方面，對(duì)GPIba特異的結(jié)合蛋白經(jīng)過生物素酰化或經(jīng)His標(biāo)記。在又一個(gè)實(shí)施方案，結(jié)合步驟(d)中結(jié)合蛋白的復(fù)合物是鏈親和素包被的磁珠或抗His抗體包凈皮的磁珠。另一個(gè)實(shí)施方案涉及用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的對(duì)GPIba特異的檢測(cè)化合物。更具體地，對(duì)GPIba特異的抗體的Fab片段用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記。在另一個(gè)方面，檢測(cè)與步驟(e)內(nèi)結(jié)合蛋白結(jié)合的檢測(cè)化合物還包含使化學(xué)發(fā)光物質(zhì)暴露于光下并測(cè)量與GPIba的存在相關(guān)聯(lián)的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的激發(fā)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，將鏈親和素包被的磁珠放置而使其與生物素?；膙WF接觸，其中生物素?；膙WF將與在分析物或生物學(xué)樣品內(nèi)的GPIba結(jié)合(圖1)。將用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的并對(duì)GPIba上另外的抗原位點(diǎn)特異的抗體與生物素?；膙WF接觸2小時(shí)(圖1)。該步驟后，使磁珠與生物素酰化的vWF接觸30分鐘。該過程與ELISA不同，因?yàn)樽疃鄡H存在2個(gè)步驟并且不需要洗滌步驟。接觸位點(diǎn)是在GPIba和vWF的Al結(jié)構(gòu)域之間(圖2)。檢測(cè)結(jié)合的GPIba通過使全部復(fù)合體(由鏈親和素包被的珠子、生物素酰化的vWF，GPIba和標(biāo)記的GPIbot特異的化學(xué)發(fā)光抗體組成)暴露于光下并測(cè)量發(fā)射至檢測(cè)器上的光信號(hào)而實(shí)施(圖1)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，用抗His抗體包被的磁珠替換鏈親和素包,皮的>^珠。將這些珠子放置而使其與His標(biāo)記的Al結(jié)構(gòu)域接觸，其中Al結(jié)構(gòu)域?qū)⑴c生物學(xué)樣品內(nèi)的GPIba結(jié)合?？贵w用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記并對(duì)GPIba上另外的抗原位點(diǎn)特異。檢測(cè)結(jié)合的GPIba通過使全部復(fù)合體(由鏈親和素包,皮的珠子、生物素?；膙WF，GPIba和標(biāo)記的GPIba特異的化學(xué)發(fā)光抗體組成)暴露于光下并測(cè)量發(fā)射至檢測(cè)器上的光信號(hào)而實(shí)施(圖1)。在本發(fā)明中，生物學(xué)樣品或分析物可以選自但不限于血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液或來自純化過程的緩沖液。在血漿的情況下，來源可以是來自任何哺乳動(dòng)物，包括但不限于猴、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、馬和人。血漿是包含可溶解蛋白質(zhì)的全血的部分。備選地，該測(cè)定法可以在全血上實(shí)施，無需分離出血漿。細(xì)胞培養(yǎng)上清液可以分離自表達(dá)GPIbot的任何細(xì)胞培養(yǎng)系。細(xì)胞系可以選自CHO細(xì)胞系、NIH-3T3細(xì)胞系或從ATCC得到的任意細(xì)胞系，任意的這些細(xì)胞系已經(jīng)被操作以表達(dá)GPIba。包含GPIba的純化緩沖液可以選自TRIS、TRIS氯化鈉、甘氨酸、甘氨酸-氯化鈉、乙酸鈉、組氨酸緩沖液以及含氯化鈉、蔗糖和Tween的組氨酸緩沖液。EDTA也可以用作分析物。本發(fā)明的另一個(gè)方面是測(cè)量生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba的蛋白質(zhì)濃度的方法，其包括(a)提供包含GPIba的物質(zhì)；(b)使來自步驟(a)的物質(zhì)與結(jié)合GPIba的結(jié)合蛋白接觸；(c)添加對(duì)GPIba特異的檢測(cè)化合物；(d)添加結(jié)合來自步驟(b)的結(jié)合蛋白的復(fù)合物；和(e)檢測(cè)來自步驟(c)的檢測(cè)化合物，其中與已知標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較的檢測(cè)信號(hào)預(yù)示著生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba的蛋白質(zhì)濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含GPIba的生物學(xué)物質(zhì)可以選自血漿、來自細(xì)胞系的上清液或緩沖液。在另一個(gè)方面，血漿可以來源于哺乳動(dòng)物，包括，但不限于猴、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、馬和人。上清液可以來自CHO細(xì)胞系、NIH-3T3細(xì)胞系或從ATCC得到的細(xì)胞系。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)GPIba特異的檢測(cè)化合物是抗體或者備選地是抗體的Fab片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)GPIba特異的結(jié)合蛋白是具有與以上抗體的活性結(jié)合位點(diǎn)不同的結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)GPIba特異的結(jié)合蛋白是vWF的片段，如vWF的Al結(jié)構(gòu)域。該片段可以是vWF的Al結(jié)構(gòu)域的重組形式。備選地，對(duì)GPIba特異的結(jié)合蛋白是完整的vWF蛋白。在另一個(gè)方面，對(duì)GPIba特異的結(jié)合蛋白經(jīng)過生物素?；蚪?jīng)His標(biāo)記。在另一個(gè)方面，結(jié)合步驟(d)中結(jié)合蛋白的復(fù)合物是鏈親和素包被的磁珠或抗His抗體包被的磁珠。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)GPIba特異的抗體用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記。更具體地，對(duì)GPIba特異的Fab片段用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，GPIba的蛋白質(zhì)濃度如下測(cè)定，即用已知量的與vWF(圖3)或與vWF的重組Al結(jié)構(gòu)域(圖4)結(jié)合的GPIba生成標(biāo)準(zhǔn)曲線并將來自未知生物學(xué)樣品的光密度讀數(shù)與已知標(biāo)準(zhǔn)物的光密度讀數(shù)進(jìn)行比較。將鏈親和素包被的磁珠放置而使其與生物素?；膙WF接觸，其中生物素?；膙WF將與分析物內(nèi)的GPIba結(jié)合?？贵w用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記并對(duì)GPIba上另外的抗原位點(diǎn)特異的。結(jié)合性GPIba的檢測(cè)和定量通過使全部復(fù)合體暴露于光下并測(cè)量發(fā)射至檢測(cè)器上的光信號(hào)而實(shí)施。隨后將測(cè)量的值(光密度)與從已知標(biāo)準(zhǔn)物中產(chǎn)生的值比較并且可以外推出未知GPIba的濃度(圖3和圖4)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，經(jīng)生物素?；⒂脕斫Y(jié)合生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba的vWF可以是三種變體形式VI、V2和V3之一。全部三種變體形式具有超過vWF野生型形式的增加的結(jié)合活性，其中結(jié)合活性V3>V2>Vl(圖5)。當(dāng)測(cè)試變體形式結(jié)合A1的能力時(shí)，觀察到相似的趨勢(shì)，但是變體結(jié)合活性與總體結(jié)合活性之間的差異與完整vWF相比較不明顯(圖5)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及對(duì)照GPIba的低分子量(LMW)結(jié)合活性和高分子量結(jié)合活性(圖6)。本發(fā)明的這個(gè)方面允許將GPIba與其它相近的同種型區(qū)分開，當(dāng)在質(zhì)量控制環(huán)境下產(chǎn)生并純化GPIba時(shí)，本方法特別有意義。圖6顯示與野生型對(duì)照GPIba相比，GPIba的4種切割的不同LMW同種型(表示為截段產(chǎn)物)的差異性結(jié)合百分?jǐn)?shù)。結(jié)合活性在測(cè)定法中下降至42.5%,并且對(duì)于無Fc部分或結(jié)合蛋白的其它LMW同種型，幾乎沒有產(chǎn)生信號(hào)，顯示了將切割的分子與完整分子區(qū)分開的能力。在圖7A和7B中，GPIba的原料藥物物質(zhì)(BDS)在4°C貯藏不同時(shí)間段。隨著時(shí)間增長，樣品的高分子量(HMW)百分?jǐn)?shù)升高。在結(jié)合測(cè)定法中，在4。C貯藏較長時(shí)間的樣品顯示減少的結(jié)合活性。負(fù)相關(guān)允許使用本發(fā)明來監(jiān)測(cè)樣品內(nèi)GPIba的。/。HMW的聚集水平(即具有高百分?jǐn)?shù)的HMW的樣品顯示較低的結(jié)合活性)。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，GPIba的石克酸鹽化形式具有差異性結(jié)合活性；完全硫酸鹽化的GPIba比非硫酸鹽化的GPIba具有更高的結(jié)合活性(圖8和圖9)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是計(jì)算生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba的結(jié)合活性的方法，其包括:(a)提供包含GPIba的物質(zhì)；(b)使來自步驟(a)的物質(zhì)與結(jié)合GPIba的結(jié)合蛋白接觸；(c)添加對(duì)GPIba特異的檢測(cè)化合物；(d)添加結(jié)合來自步驟(b)的結(jié)合蛋白的復(fù)合物；(e)檢測(cè)來自步驟(c)的檢測(cè)化合物，其中與已知標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較的檢測(cè)信號(hào)預(yù)示著生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba的蛋白質(zhì)濃度；和(f)計(jì)算GPIba的結(jié)合活性。在一個(gè)方面，包含GPIba的生物學(xué)物質(zhì)可以選自血漿、來自細(xì)胞系的上清液或緩沖液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，血漿可以源于哺乳動(dòng)物，包括但不限于猴、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、馬或人。上清液可以源自CHO細(xì)胞系、NIH-3T3細(xì)胞系或從ATCC得到的細(xì)胞系。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)GPIba特異的檢測(cè)化合物是抗體或備選地是抗體的Fab片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)GPIba特異的結(jié)合蛋白是具有與以上抗體的活性結(jié)合位點(diǎn)不同的結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)GPIba特異的結(jié)合蛋白是vWF的片段，如vWF的Al結(jié)構(gòu)域。該片段可以是vWF的Al結(jié)構(gòu)域的重組形式。更優(yōu)選地，對(duì)GPIba特異的結(jié)合蛋白是完整的vWF蛋白。在另一個(gè)方面，對(duì)GPIba特異的結(jié)合蛋白經(jīng)過生物素?；蚪?jīng)His標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合步驟(d)中結(jié)合蛋白的復(fù)合物是鏈親和素包被的磁珠或抗His抗體包被的磁珠。對(duì)GPIba特異的檢測(cè)化合物在本發(fā)明的某些方面中用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記。更具體地，對(duì)GPIba特異的Fab片段用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)與步驟(e)內(nèi)的結(jié)合蛋白結(jié)合的檢測(cè)化合物還包括使化學(xué)發(fā)光物質(zhì)暴露于光下并測(cè)量化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的激發(fā)，其中與已知標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較時(shí)，所述的激發(fā)預(yù)示著GPIba的蛋白質(zhì)濃度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(f)的結(jié)合活性X通過(A/B)x100%計(jì)算，其中A是通過vWF相互作用對(duì)GPIboc所測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度，并且B是通過(但不限于)A蛋白HPLC或Fc捕獲免疫測(cè)定法測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度。在本發(fā)明的又一個(gè)方面，GPIba的結(jié)合活性通過如下確定，即首先計(jì)算GPIba的濃度，隨后應(yīng)用式(A/B)xl00。/。，其中A是通過vWF相互作用對(duì)GPIba所測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度，并且B是通過(但不限于)A蛋白HPLC或Fc捕獲免疫測(cè)定法對(duì)試驗(yàn)參考所測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度。這些優(yōu)點(diǎn)明顯地勝過當(dāng)前的技術(shù)?？捎玫腉PIba檢測(cè)測(cè)定法包括體內(nèi)方法和體外方法。先前才艮道用于測(cè)量GPIba-Fc蛋白活性的一種方法是在實(shí)施例4內(nèi)所述的大鼠尾靜脈出血模型。由于GPIba在凝血、尤其在凝固/出血級(jí)聯(lián)中是必需，因此測(cè)量體內(nèi)出血時(shí)間是測(cè)量GPIba活性的間接途徑。使用該動(dòng)物模型的缺點(diǎn)是其間接性、耗時(shí)、費(fèi)力、昂貴和大的變異百分?jǐn)?shù)(至少在30%范圍)。先前才艮道的另一個(gè)方法是狗Folts動(dòng)物模型。實(shí)施例5內(nèi)描述的該方法專用于研究其中GPIba的功能被視為關(guān)鍵的不穩(wěn)定性心絞痛。盡管該方法可以直接測(cè)量GPIbaFc的功能，它也伴隨有包括時(shí)間、勞動(dòng)力、成本和精確性在內(nèi)的相同缺點(diǎn)。另一個(gè)用來檢測(cè)GPIba結(jié)合活性的方法是表面等離子共振(SPR)測(cè)定法。此方法能夠測(cè)量?jī)煞N蛋白質(zhì)之間的結(jié)合事件。然而，此方法極度費(fèi)時(shí)并且靈敏性低。SPR測(cè)定法通常將對(duì)數(shù)差異1視為背景噪音。還測(cè)試了作為檢測(cè)GPIba的可能測(cè)定法的常規(guī)ELISA。盡管ELISA消耗勞動(dòng)力最小，但是結(jié)果的非特異性高并且變異大，特別是當(dāng)捕獲抗原是vWR時(shí)。本發(fā)明的重要方面將克服因處于多聚體形式的vWF的已知"粘稠性"帶來在體外環(huán)境下使用它作為生理學(xué)相關(guān)試劑的困難。發(fā)明性步驟是開發(fā)均質(zhì)結(jié)合反應(yīng)以允許vWF在更天然的構(gòu)象下而不是在固定化條件下與GPIba結(jié)合。捕獲珠僅在反應(yīng)最后30分鐘才加入，^全部的混合物在最后溫育后立即在讀數(shù)儀上讀數(shù)。采用這種設(shè)計(jì)，vWF很難有機(jī)會(huì)與其它的非特異性分子或表面結(jié)合。這是唯一能夠特異而高效地測(cè)定GPIba活性的體外結(jié)合活性測(cè)定法。此外，作為對(duì)已建立的聚集、硫酸鹽化作用測(cè)定法需要的替代，本測(cè)定法可以用來極為迅速并精確地監(jiān)測(cè)已表達(dá)的GPIba-Fc融合蛋白。又一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明篩選靶向GPIba的小分子的用途，因?yàn)楸緶y(cè)定法對(duì)來自抑制劑的影響極為敏感。本發(fā)明的新測(cè)定方法具有勝過現(xiàn)存GPIba檢測(cè)系統(tǒng)的數(shù)個(gè)優(yōu)點(diǎn)(1)本文中所述的本發(fā)明利用一步驟或兩步驟直接測(cè)定法，所述測(cè)定法測(cè)量GPIba并且僅需要一個(gè)測(cè)定GPIba活性的步驟。(2)本測(cè)定法使用對(duì)其捕獲過程是特異的、明確的化學(xué)結(jié)合作用，而不是非特異性結(jié)合作用。(3)檢測(cè)位點(diǎn)是使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)技術(shù)的穩(wěn)定位點(diǎn)。(4)循環(huán)利用檢測(cè)底物，從而允許有效地放大讀出信號(hào)。(5)本測(cè)定法無需洗滌步驟并且因此具有高的測(cè)定通量。(6)本測(cè)定法利用具有增強(qiáng)特異性的試劑并且因此具有最小基質(zhì)干擾性。(7)本測(cè)定法利用具有增強(qiáng)特異性的試劑并且因此具有高靈敏性。(8)本發(fā)明的新測(cè)定系統(tǒng)提供比其它現(xiàn)存用于GPIba的檢測(cè)測(cè)定法高2-5倍的信號(hào)對(duì)噪聲比。(9)本發(fā)明的新測(cè)定系統(tǒng)拔_供跨2對(duì)數(shù)的顯著線性標(biāo)度。總體而言，與本領(lǐng)域可用的檢測(cè)方法相比，提出的發(fā)明更快捷、更便宜、可重復(fù)性(見圖12)、更特異(圖13A和13B)、更靈敏并且能夠?qū)⒒钚訥PIba-Fc融合蛋白與非活性形式區(qū)分開(圖5和6)。實(shí)施例制本文中所述并要求保護(hù)的本發(fā)明。本發(fā)明的如此變體，包括目前已知的或今后開發(fā)的全部等效物的替換(這處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi))，以及在配方上的改變或在實(shí)發(fā)沒計(jì)上的細(xì)微改變，將視為處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例l:準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線緩沖液通過添加15的R5CD1介質(zhì)至30ml緩沖液(PBS,含0.05%、Tween20和0.5%BSA)產(chǎn)生。該緩沖液足夠用于90個(gè)測(cè)定平板(基于96孔平板)。為制備標(biāo)準(zhǔn)物，將4pl標(biāo)準(zhǔn)物貯存液添加至20ml標(biāo)準(zhǔn)曲線緩沖液內(nèi)。這提供0.2卩g/ml濃度的標(biāo)準(zhǔn)物。通過吸取2ml已制備的標(biāo)準(zhǔn)物并添加1ml標(biāo)準(zhǔn)曲線緩沖液而制備系列稀釋物。此稀釋物足夠用于8個(gè)測(cè)定平板。在96孔平板內(nèi)，每孔分配50;d。每一平板通過平板讀數(shù)儀讀數(shù)并將光密度(透光度)對(duì)已知標(biāo)準(zhǔn)物的濃度作圖，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)施例2:制備對(duì)照具有0.08pg/ml濃度的對(duì)照樣品通過將20GPIba參考標(biāo)準(zhǔn)添加至105pl介質(zhì)內(nèi)得到。1^，通過吸取5W上ii^照并添加至10ml緩沖液內(nèi)進(jìn)行1:2000稀釋。這足夠用于18個(gè)測(cè)定平板(基于96孑L平板)。在96孔平板內(nèi)，每孔分配50/d。實(shí)施例3:GPIba-vWF結(jié)合測(cè)定方案如下方案概述了檢測(cè)并定量來自生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba的水平的方法。該方案包括在檢測(cè)GPIba的存在以及測(cè)量GPIba的蛋白質(zhì)濃度和結(jié)合活性的過程內(nèi)所用試劑、方法、設(shè)備和軟件。在96孔微量滴定平板(Corning/Costar，Wilkes-Barre，PA)內(nèi)以每孔50/d體積分配GPIba標(biāo)準(zhǔn)物(濃度1mg/ml;自制重組蛋白)。對(duì)照隨后如上所述制備并每孔分配5(^1。為制備樣品，從每一樣品中吸取至少5W并在緩沖液內(nèi)稀釋樣品至0.08和0.04/ig/ml，終體積約lml(制備至少500pi)并每孔分配50/d。為制備生物素-vWF，對(duì)每個(gè)測(cè)定平板每6ml緩沖液吸取2gl生物素-vWF貯存液(濃度1.31mg/ml，自制綴合物；vWF:AmericanDiagnostica，Greenwich,CT;生物素Pierce,Rockford，IL)。為制^^親和素珠，添加192pl珠貯存液(濃度10mg/ml;來自IGEN，Bioveris，Gaithersburg，MD，或來自DynalBiotech,LakeSuccess,NY)至每個(gè)測(cè)定平板每6ml緩沖液并且每孔分配50/d。全部標(biāo)準(zhǔn)物和對(duì)照將稀釋于R5CD1介質(zhì)內(nèi)。將試劑和樣品才艮據(jù)如下方法在平板內(nèi)分配添加50W標(biāo)準(zhǔn)物(0.2Ag/ml至0.005/tg/ml)、對(duì)照或樣品；添加50/U終濃度0.4pg/ml(抗FcORI-TAG抗體，H&存濃度1.07mg/ml，原始材料來自JacksonImmunoResearch，WestGrove,PA的"Fq片段特異的親和純F(ab')2片段山羊抗人IgG")的抗FcORI-TAGAb。在添加標(biāo)記抗體后，添加50的b-vWF(終濃度0.1gg/ml)和50/d的b-vWF(終濃度O.l/tg/ml)。在室溫溫育2小時(shí)并混合。溫育后，添加50鏈親和素綴合的珠子(終濃度16/tg珠/孔)并在室溫溫育30分鐘，同時(shí)混合。微量滴定平板在M8或M384分析儀上讀數(shù)。為使用M8或M384分析儀，首先必須校準(zhǔn)。為實(shí)現(xiàn)校準(zhǔn)，運(yùn)行"水對(duì)照"96孔平板。通過添加250/iLRODi水至全部孔而制備96孔微量平板。將平板置于分析儀內(nèi)，并啟動(dòng)平板讀數(shù)儀。全部孔內(nèi)的結(jié)果應(yīng)當(dāng)是相似的。其次，通過將250jttL陽性校準(zhǔn)物添加至第1、2、3、7、8和12列中的孔內(nèi)而制備96孔微量平板。將250]LiL陰性校準(zhǔn)物添加至4、5、6、9、10和11列中的孔內(nèi)。將平板置于分析儀內(nèi)，并開啟平板讀數(shù)儀。如果信息;1精確的，繼續(xù)對(duì)平板讀數(shù)。若全部陽性校準(zhǔn)物CV小于7%并且值是得數(shù)80,000±10%時(shí)，則質(zhì)量控制(QC)是可接受的。在右邊窗口內(nèi)應(yīng)該不顯示警告消息。若QC處于這些指標(biāo)之外，則查閱用戶手冊(cè)以尋找問題提示建議。一旦正確地校準(zhǔn)機(jī)器，將含待測(cè)試樣品的平板置于Stacker內(nèi)，選擇待運(yùn)行的程序并啟動(dòng)平板讀數(shù)儀。保存全部數(shù)據(jù)。為分析收集的數(shù)據(jù)，在MicrosoftExcel下打開文件并下載數(shù)據(jù)至Softniax-Pro。使用根據(jù)如下平板圖建立起來的模板分析數(shù)據(jù)。如下代表用于該測(cè)定法的網(wǎng)格圖。包括標(biāo)準(zhǔn)物(std)、對(duì)照和樣品(S)。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>標(biāo)準(zhǔn)物認(rèn)可指標(biāo)如下8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物中至少6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物在兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)點(diǎn)間讀數(shù)的CV應(yīng)當(dāng)40。/。。對(duì)照認(rèn)可指標(biāo)要求對(duì)照回收率需要在80%至120°/。范圍內(nèi)。樣品認(rèn)可指標(biāo)要求重復(fù)樣品間讀數(shù)的CV應(yīng)當(dāng)40%。僅考慮范圍內(nèi)的讀數(shù)。實(shí)施例4:大鼠尾靜脈出血如下的實(shí)施例4戈表體內(nèi)測(cè)定法，以測(cè)定GPIba的效力和所觀察到的體外數(shù)據(jù)是否與體內(nèi)試驗(yàn)相關(guān)。35只(35)雄性Wister大鼠(l-2月齡，200-230克；CharlesRiverLaboratoriesInternational,Inc.,Wilmington,MA)分成5組，每組7只動(dòng)物。5個(gè)組大鼠才艮據(jù)下表接受不同的方案處理表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>在大鼠夾內(nèi)固定每只大鼠并使用滅菌刀片剃光毛發(fā)，距離大鼠后端基部1.5英寸在尾部4故皮下切口。同時(shí)，靠近切口部位靜脈內(nèi)注射相等劑量(體積根據(jù)每只大鼠體重變動(dòng))。在^15分鐘內(nèi)范圍內(nèi)，記錄出血事件和凝結(jié)百分?jǐn)?shù)。將每一組的數(shù)據(jù)進(jìn)行平均，并且作圖為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。如可以在圖8內(nèi)觀察到，體內(nèi)動(dòng)物模型出血時(shí)間與體外結(jié)合測(cè)定結(jié)果相關(guān)。在圖8中，未處理、LMW、加載、完全硫酸鹽化和非硫酸鹽化分別指GPIba的低分子量同種型、AEX(陰離子交換)柱中所用的原材料，6個(gè)石克酸鹽化作用位點(diǎn)均被硫酸鹽化和疏酸鹽化作用位點(diǎn)均未被疏酸鹽化的GPIba。圖8顯示本發(fā)明體外結(jié)合測(cè)定法與大鼠尾出血?jiǎng)游锬Ｐ椭g的相關(guān)性。實(shí)施例5:狗Folts動(dòng)物模型如下實(shí)施例代表作為研究不穩(wěn)定性心絞痛方面的模型被廣泛接受的狗Folts動(dòng)物模型。該模型可相當(dāng)肯定地判斷抗血小板劑和抗凝血?jiǎng)┰诓环€(wěn)定性心絞痛的臨床環(huán)境下的成效。該模型涉及開胸制備并且包括分離冠狀動(dòng)脈左旋支。將超聲流量探頭放置在該動(dòng)脈上并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血液流量。重度狹窄和血管損傷的雙重傷害引起血小板堆積;5Uk栓形成。當(dāng)動(dòng)樂^f皮完全阻塞時(shí)，如零血流量顯示，通過震動(dòng)阻塞性血栓機(jī)械性地破壞血小板栓。通過冠狀動(dòng)脈血流量(CFR)的周期性流量減少監(jiān)測(cè)重復(fù)的血栓形成。當(dāng)觀察到5個(gè)連續(xù)CFR時(shí)，治療性地施用GPIba和其它用于比較的因子。以尺度0-4記錄反應(yīng)(圖9)。在圖9中，未處理、單體、LMW、加載、完全石克酸鹽化和非石克酸鹽化分別指未處理的GPIba、未切割的GPIba、GPIba的低分子量同種型、AEX(陰離子交換)柱中所用的原材料，6個(gè)石克酸鹽化作用位點(diǎn)均被硫酸鹽化的和硫酸鹽化作用位點(diǎn)均未被硫酸鹽化的GPIba。與圖8相似，圖9顯示本發(fā)明和可用的體內(nèi)測(cè)定系統(tǒng)之間顯著相關(guān)。本文中所引用的全部參考文獻(xiàn)在本文中完整地并且以相同程度地引用作為參考用于全部目的，如同每個(gè)出版物或?qū)＠暾?qǐng)#1特別地和單獨(dú)地提及以便完整地引用作為參考用于所有目的。當(dāng)引用作為參考的出版物和專利或?qū)＠暾?qǐng)至如此程度而與本說明書內(nèi)包含的公開相抵觸時(shí)，該說明書將優(yōu)于和/或在先于任何此類相抵觸的材料。將表述本說明書和權(quán)利要求書內(nèi)所用成分的量、反應(yīng)條件等的全部數(shù)字在任何情況下理解為受術(shù)語"約，，修飾。因此，除非明確地說明，否則說明書和后續(xù)權(quán)利要求書內(nèi)描述的數(shù)字參ltA概數(shù)，其可以根據(jù)由本發(fā)明意圖得到的所需特性而變化。至少，并且不意圖將等效物原理的應(yīng)用限于權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，每個(gè)數(shù)字^t應(yīng)當(dāng)根據(jù)有效數(shù)字位數(shù)和常用約數(shù)方法進(jìn)行解釋。可以產(chǎn)生本發(fā)明的眾多修改和變體而不脫離本發(fā)明的精神和范圍，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。本文中所述的具體實(shí)施方案僅以舉例的方式提供并且無論如何不意圖是限制性的。本說明書和實(shí)施例將應(yīng)當(dāng)僅視為是舉例，本發(fā)明的真實(shí)范圍和精神將通過如下權(quán)利要求書指出。權(quán)利要求1.檢測(cè)生物學(xué)樣品內(nèi)GPIbα存在的方法，包括(a)提供包含GPIbα的物質(zhì)；(b)使來自步驟(a)的物質(zhì)與結(jié)合GPIbα的結(jié)合蛋白接觸；(c)添加對(duì)GPIbα特異的檢測(cè)化合物；(d)添加結(jié)合來自步驟(b)的結(jié)合蛋白的復(fù)合物；和(e)檢測(cè)來自步驟(c)的檢測(cè)化合物，其中陽性檢測(cè)信號(hào)預(yù)示著生物學(xué)樣品內(nèi)存在GPIbα。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中包含GPIba的生物學(xué)樣品是血漿。3.權(quán)利要求2所述的方法，其中血漿來自哺乳動(dòng)物。4.權(quán)利要求3所述的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。5.權(quán)利要求1所述的方法，其中包含GPIba的生物學(xué)樣品來自細(xì)胞系的上清液。6.權(quán)利要求5所述的方法，其中細(xì)胞系是CHO細(xì)胞系。7.權(quán)利要求l所述的方法，其中檢測(cè)化合物包含抗體。8.權(quán)利要求7所述的方法，其中檢測(cè)化合物包含F(xiàn)ab片段。9.權(quán)利要求1所述的方法，其中結(jié)合蛋白包含具有與權(quán)利要求7所述抗體的結(jié)合位點(diǎn)不同的結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。10.權(quán)利要求9所述的方法，其中結(jié)合蛋白是馮.維勒布蘭德因子(vWF)的片段。11.權(quán)利要求10所述的方法，其中片段是vWF的Al結(jié)構(gòu)域。12.權(quán)利要求9所述的方法，其中結(jié)合蛋白是完整的vWF蛋白。13.權(quán)利要求l所述的方法，其中結(jié)合蛋白是經(jīng)生物素?；?。14.權(quán)利要求11所述的方法，其中vWF的Al結(jié)構(gòu)域是經(jīng)His-標(biāo)記的。15.權(quán)利要求13所述的方法，其中完整的vWF是經(jīng)生物素?；?。16.權(quán)利要求1所述的方法，其中與結(jié)合蛋白結(jié)合的復(fù)合物是鏈親和素包纟皮的磁珠。17.權(quán)利要求1所述的方法，其中與結(jié)合蛋白結(jié)合的復(fù)合物是抗His抗體包,皮的磁珠。18.權(quán)利要求7所述的方法，其中對(duì)GPIba特異的檢測(cè)化合物用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記。19.權(quán)利要求8所述的方法，其中對(duì)GPIba特異的Fab片段用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記。20.權(quán)利要求1所述的方法，其中對(duì)步驟(e)內(nèi)的檢測(cè)化合物的檢測(cè)還包括使化學(xué)發(fā)光物質(zhì)暴露于光下并測(cè)量化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的激發(fā)。21.測(cè)量生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba的蛋白質(zhì)濃度的方法，包括(a)提供包含GPIba的物質(zhì)；(b)使來自步驟(a)的物質(zhì)與結(jié)合GPIba的結(jié)合蛋白接觸；(c)添加對(duì)GPIba特異的檢測(cè)化合物；(d)添加結(jié)合來自步驟(b)的結(jié)合蛋白的復(fù)合物；和(e)檢測(cè)來自步驟(c)的檢測(cè)化合物，其中與已知標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較的檢測(cè)信號(hào)預(yù)示著生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba的蛋白質(zhì)濃度。22.權(quán)利要求21所述的方法，其中對(duì)檢測(cè)化合物的檢測(cè)還包括使化學(xué)發(fā)光物質(zhì)暴露于光下并測(cè)量化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的激發(fā)，與已知標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較的激發(fā)預(yù)示著GPIba的蛋白質(zhì)濃度。23.檢測(cè)生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba的結(jié)合活性的方法，包括(a)提供包含GPIba的物質(zhì)；(b)使來自步驟(a)的物質(zhì)與結(jié)合GPIba的結(jié)合蛋白接觸；(c)添加對(duì)GPIba特異的檢測(cè)化合物；(d)添加結(jié)合來自步驟(b)的結(jié)合蛋白的復(fù)合物；(e)檢測(cè)來自步驟(c)的檢測(cè)化合物，其中與已知標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較的檢測(cè)信號(hào)預(yù)示著生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba的蛋白質(zhì)濃度；和(f)計(jì)算GPIba的結(jié)合活性。24.權(quán)利要求23所述的方法，其中(f)的結(jié)合活性X通過(A/B)xl00。/。計(jì)算，其中A是通過vWF相互作用對(duì)GPIbot所測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度，并且B是通過A蛋白HPLC或Fc捕獲免疫測(cè)定法測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度。25.測(cè)量生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba同種型的結(jié)合活性而檢測(cè)GPIba同種型的方法，包括(a)提供包含GPIba的物質(zhì)和GPIba樣物質(zhì)；(b)使來自步驟(a)的物質(zhì)與結(jié)合GPIba的結(jié)合蛋白接觸；(c)添加對(duì)GPIba特異的檢測(cè)化合物；(d)添加結(jié)合來自步驟(b)的結(jié)合蛋白的復(fù)合物；(e)檢測(cè)來自步驟(c)的檢測(cè)化合物，其中與已知標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較的檢測(cè)信號(hào)預(yù)示著生物學(xué)樣品內(nèi)GPIba的蛋白質(zhì)濃度；①計(jì)算GPIba同種型的結(jié)合活性；和(g)將同種型的結(jié)合活性與已知GPIba對(duì)照的結(jié)合活性相比較。26.權(quán)利要求25所述的方法，其中(f)的結(jié)合活性X通過(A/B)x100%計(jì)算，其中A是通過vWF相互作用對(duì)GPIba所測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度，并且B是通過A蛋白HPLC或Fc捕獲免疫測(cè)定法測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度。全文摘要本發(fā)明提供用于檢測(cè)生物學(xué)樣品內(nèi)GPIbα的存在、濃度和結(jié)合活性的新測(cè)定系統(tǒng)。用于確定生物學(xué)樣品內(nèi)GPIbα的存在的方法包括(a))提供包含GPIbα的物質(zhì)；(b)使來自步驟(a)的物質(zhì)與結(jié)合GPIbα的結(jié)合蛋白接觸；(c)添加對(duì)GPIbα特異的檢測(cè)化合物；(d)添加結(jié)合來自步驟(b)的結(jié)合蛋白的復(fù)合物；和(e)檢測(cè)來自步驟(c)的檢測(cè)化合物，其中陽性檢測(cè)信號(hào)預(yù)示著生物學(xué)樣品中存在GPIbα。文檔編號(hào)G01N33/86GK101176000SQ200680013504公開日2008年5月7日申請(qǐng)日期2006年4月21日優(yōu)先權(quán)日2005年4月22日發(fā)明者J·H·周申請(qǐng)人:惠氏公司