專(zhuān)利名稱(chēng)：化學(xué)治療應(yīng)答者的確定的制作方法
專(zhuān)利說(shuō)明化學(xué)治療應(yīng)答者的確定 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)包含人肺癌細(xì)胞的生物樣品是否對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑和化學(xué)治療劑的組合敏感的方法，所述方法通過(guò)測(cè)定磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白在生物樣品中的過(guò)量表達(dá)而進(jìn)行。本發(fā)明還涉及獲得候選藥劑或者選擇在患者中用于抑制肺癌進(jìn)展的組合物的方法，在所述方法中使用磷酸化的Akt蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白。

背景技術(shù)：
由erbB1基因編碼的EGFR已經(jīng)以因果方式涉及人類(lèi)惡性腫瘤。特別地，已經(jīng)在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、頭癌、頸癌和胃癌以及成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中觀察到增加的EGFR表達(dá)。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，一種170-kD的糖蛋白，由N端細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和包含激酶結(jié)構(gòu)域的C端細(xì)胞內(nèi)區(qū)域組成。EGFR配體-誘導(dǎo)的二聚體化作用激活內(nèi)部的RTK結(jié)構(gòu)域(一種Src同源結(jié)構(gòu)域1，SH1)，這引起在細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域非催化尾的6個(gè)特異EGFR酪氨酸殘基的自動(dòng)磷酸化作用。
癌細(xì)胞中EGFR激活的細(xì)胞作用包括增加的增殖、促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、黏附、侵入、血管發(fā)生、以及通過(guò)抑制細(xì)胞程序性死亡而增加的細(xì)胞存活。激活的EGFR通過(guò)刺激促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)級(jí)聯(lián)反應(yīng)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖。一旦配體結(jié)合到EGFR上時(shí)，SOS鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子就通過(guò)Grb2連接蛋白補(bǔ)充到質(zhì)膜上，其在小G蛋白R(shí)as上刺激GTP交換成GDP，隨后激活由Raf、MEK和ERK組成的MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)。激活的ERKs(pMAPK，pERK1/2)又磷酸化并且激活轉(zhuǎn)錄因子，諸如ELK-1或c-Myc，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。
多種生長(zhǎng)因子途徑通過(guò)多種激酶的激活而促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的發(fā)展和存活。EGFR還經(jīng)由通過(guò)磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt途徑和STAT途徑進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)而增強(qiáng)癌細(xì)胞的存活。Akt還通過(guò)其它生長(zhǎng)因子激活，包括胰島素生長(zhǎng)因子-1、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及白細(xì)胞介素3和6。Akt的3個(gè)同種型1-3都是以相似的方式在活化結(jié)構(gòu)域的殘基T308和COOH-末端結(jié)構(gòu)域的S473被磷酸化(pAKT)。
Erlotinib(

是一種有效的表皮生長(zhǎng)因子受體(HER1/EGFR)酪氨酸-激酶抑制劑(TKI)，當(dāng)用作單獨(dú)的藥劑時(shí)，其為先前化學(xué)治療失敗的非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)患者提供生存益處(WO01/34574)。

的功效在許多試驗(yàn)中進(jìn)行研究。它的化學(xué)名為N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺。
TALENT試驗(yàn)是在一線(xiàn)NSCLC患者中進(jìn)行的安慰劑-對(duì)照的III期研究，所述患者接受吉西他濱和順鉑(這種同時(shí)的化學(xué)治療是非美國(guó)護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)(non-US standard of care)的)組合erlotinib(

150mg/天)或者組合安慰劑。初級(jí)目的是存活持續(xù)時(shí)間，次級(jí)目的是發(fā)展時(shí)間、反應(yīng)率；反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間；藥物動(dòng)力學(xué)和藥效參數(shù)，以及生活質(zhì)量。還評(píng)估了HER1/EGFR和HER2表達(dá)率。進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)的安全性分析。TALENT試驗(yàn)總的結(jié)果是陰性的。對(duì)于初級(jí)和次級(jí)目的，與單獨(dú)的吉西他濱和順鉑相比，erlotinib

加化學(xué)療法(吉西他濱和順鉑)不存在明顯的益處(Gatzemeier，U.，等.，Proc Am Soc Clin Oncol 23(2004)617(Abstract7010))。在使用erlotinib加卡鉑和紫杉醇的基于美國(guó)的TRIBUTE研究中觀察到相同的結(jié)果(Herbst，R.S.，等.，J Clin Oncol(2004)ASCO AnnualMeeting Proceedings.Post-Meeting Edition；22(July 15 Suppl.)(Abstract7011))。將單獨(dú)的藥劑erlotinib作為二線(xiàn)或三線(xiàn)治療劑用于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)(BR.21；NCIC/OSIP)的隨機(jī)化安慰劑-對(duì)照的III期研究發(fā)現(xiàn)，與安慰劑(4.7個(gè)月)相比，使用erlotinib在存活上有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的提高(6.7個(gè)月)。
許多研究涉及非小細(xì)胞肺癌中生物標(biāo)記的研究以及它們與某些EGFR抑制劑藥物的關(guān)系。Han，等.，Int J Cancer 113(2005)109-115用Gefitinib(IressaTM，EGFR TKI)單一治療研究了65名患者。他們分析EGFR下游分子在化療-抗性非小細(xì)胞肺癌中作為gefitinib的應(yīng)答預(yù)見(jiàn)性標(biāo)記。Cappuzzo，F(xiàn).等.，JNCI 96(2004)1133-1141用Gefitinib(Iressa；EGFR TKI)單一治療研究了106名患者。他們?cè)诨加型砥诜切〖?xì)胞肺癌的患者中研究Akt磷酸化作用和gefitinib的功效，并且發(fā)現(xiàn)接受gefitinib的具有P-Akt-陽(yáng)性腫瘤的患者比患有P-Akt-陰性腫瘤的患者從所述治療受益更多。Vicent，S.等.，Br J Cancer 90(2004)1047-1052研究了111名NSCLC患者。他們發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中pERK被激活并且與晚期腫瘤相關(guān)。Han，S.W.等.，J Clin Oncol 23(2005)2493-2501用Gefitinib(EGFR TKI)單一治療研究了90名患者。他們分析表皮生長(zhǎng)因子受體突變?cè)谟胓efitinib治療的非小細(xì)胞肺癌患者中的預(yù)見(jiàn)性和預(yù)后作用。Mukohara，T.等.，Lung Cancer 41(2003)123-130研究了60名患者，每個(gè)階段20名患者，其進(jìn)行新佐劑化學(xué)治療或者放射治療。EGFR表達(dá)與pERK和pAkt表達(dá)相關(guān)。正如作者本身所提及的那樣，樣本的大小太小。Raben，D.等.，Int J RadiationOncology Biol.Phys 59(2004)27-38研究了對(duì)于非小細(xì)胞肺癌的靶向治療。Ono，M.等.，Mol Cancer Ther 3(2004)465-472檢驗(yàn)了9種NSCLC細(xì)胞系，并且用gefitinib處理。Hirsch，F(xiàn).R.等.，Curr Opin Oncol 17(2005)118-122綜述了Akt和MAPK的磷酸化作用狀況作為gefitinib抗性的潛在標(biāo)記。Meert，等.，Clinical Cancer Research 9(2003)2316-2326在EGFR抑制劑活性方面研究了NSCLC細(xì)胞系。EGFR和Her2表達(dá)水平都不與EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)。Brognard，J.等.，Cell Death and Differentiation 9(2002)893-904分析了19株NSCLC細(xì)胞系，其中17株表現(xiàn)出Erk1/2磷酸化作用和組成型活性。David，O.等.，Clinical Cancer Research 10(2004)6865-6871公開(kāi)pAkt的過(guò)量表達(dá)是NSCLC中獨(dú)立的預(yù)后因子。Kakiuchi，S.等.，Human Molecular Genetics 13(2004)3029-3043研究了33名NSCLC患者的基因組廣譜cDNA微點(diǎn)陣。所有微點(diǎn)陣都在單一治療設(shè)備中給予gefitinib。對(duì)于Akt/pAkt表達(dá)水平、EGFR基因狀況或者pEGFR染色以及gefitinib應(yīng)答之間的相關(guān)性沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何證據(jù)。Kim，R.H.等.，Cancer Cell 7(2005)263-273公開(kāi)了癌基因DJ-1表達(dá)與pAkt水平相等。Balsara，B.R.等.，Carcinogenesis 25(2004)2053-2059研究了110名具有TMA pAkt表達(dá)的NSCLC患者。在pAkt陰性和陽(yáng)性之間不存在存活的顯著差異。Hirami，Y.等.，Cancer Letters 214(2004)157-164研究了非小細(xì)胞肺癌中表皮生長(zhǎng)因子受體、pAkt和低氧誘導(dǎo)因子-1α的關(guān)系。Lee，S.H.等.，APMIS 110(2002)587-592分析NSCLC患者的43LN轉(zhuǎn)移。NSCLC中的Akt激活在腫瘤發(fā)育中而不是在發(fā)展中起作用。Engelman，J.A.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102(2004)3788-3793分析erbB-3在gefitinib-敏感性非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中介導(dǎo)磷酸肌醇3-激酶活性。David，O.，J Cell Mol Med 5(2001)430-433討論了Akt和PTEN在肺癌中作為新的診斷標(biāo)記的作用。Mantha，A.等.，Clin.Cancer Res.11(2005)2398-2407研究了抑制表皮生長(zhǎng)因子受體功能的甲羥戊酸途徑的靶向。
在WO 2004/046386中研究了與EGFR陽(yáng)性癌癥相關(guān)的預(yù)后標(biāo)記。US 2004/0157255公開(kāi)了應(yīng)答EGFR抑制劑藥物的基因表達(dá)標(biāo)記。WO 2004/063709公開(kāi)了測(cè)定對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體調(diào)節(jié)劑敏感性的生物標(biāo)記和方法。WO 01/00245描述了人源化抗-ErbB2抗體和用抗-ErbB2抗體諸如人源化抗-erbB2抗體治療癌癥的方法。
發(fā)明概述 還存在提供測(cè)定對(duì)EGFR抑制劑治療的敏感性、特別是EGFR抑制劑與化學(xué)治療劑組合治療的敏感性的方法的需要。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種測(cè)定包含人肺癌細(xì)胞的生物樣品是否對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑和化學(xué)治療劑的組合敏感的方法，所述方法包括測(cè)定磷酸化AKT蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白在生物樣品中的過(guò)量表達(dá)，由此磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的過(guò)量表達(dá)是包含人肺癌細(xì)胞的生物樣品對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑和化學(xué)治療劑的組合敏感的指示。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用與磷酸化的AKT蛋白結(jié)合的抗體或與磷酸化的MAPK蛋白結(jié)合的抗體來(lái)測(cè)定包含人肺癌細(xì)胞的生物樣品是否對(duì)表皮生長(zhǎng)因子抑制劑和化學(xué)治療劑的組合敏感。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供選擇用來(lái)在患者中抑制肺癌發(fā)展的組合物的方法，所述方法包括 a)在多種測(cè)試組合物存在下，分別暴露包含來(lái)自患者的對(duì)EGFR抑制劑和化學(xué)治療劑敏感的肺癌細(xì)胞的生物樣品的等分試樣； b)將與測(cè)試組合物接觸的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平與沒(méi)有接觸測(cè)試組合物的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行比較； c)選擇相對(duì)于沒(méi)有接觸測(cè)試組合物的等分試樣，在包含所述測(cè)試組合物的等分試樣中改變了磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平的測(cè)試組合物之一，其中在與所述測(cè)試組合物接觸的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平與在沒(méi)有接觸所述測(cè)試組合物的生物樣品的等分試樣中的磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平之間存在至少10％的差異是選擇所述測(cè)試組合物的指示。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了獲得候選藥劑的方法，所述方法包括 (a)將包含對(duì)EGFR抑制劑和化學(xué)治療劑敏感的肺癌細(xì)胞的生物樣品的等分試樣與候選藥劑接觸， (b)測(cè)定與所述候選藥劑接觸的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平，并且測(cè)定在沒(méi)有接觸所述候選藥劑的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平， (c)通過(guò)將與所述候選藥劑接觸的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平與在沒(méi)有接觸所述候選藥劑的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行比較，而觀察所述候選藥劑的效果， (d)從所述觀察到的效果獲得所述藥劑，其中在與所述候選藥劑接觸的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平與在沒(méi)有接觸所述候選藥劑的生物樣品的等分試樣中的磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平之間存在至少10％的差異是所述候選藥劑效果的指示。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提過(guò)通過(guò)按照本發(fā)明的方法獲得(derived)的候選藥劑和包括按照本發(fā)明的藥劑的藥物制劑。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的藥劑用來(lái)制備抑制肺癌發(fā)展的組合物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供生產(chǎn)藥物的方法，其包括本發(fā)明的方法的步驟和 (i)以足以對(duì)受試者提供治療有效量的所述藥物的量合成在步驟(c)中鑒定的候選藥劑或其類(lèi)似物或衍生物；和/或 (ii)將步驟(c)中鑒定的候選藥物候選藥劑或其類(lèi)似物或衍生物與藥用載體組合。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用Akt蛋白、MAPK蛋白、磷酸化Akt蛋白、磷酸化MAPK蛋白、選擇性與磷酸化Akt蛋白或磷酸化MAPK蛋白結(jié)合的抗體來(lái)獲得候選藥劑，或者來(lái)選擇在患者中抑制肺癌發(fā)展的組合物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含針對(duì)磷酸化MAPK和/或磷酸化Akt蛋白的抗體的試劑盒。
術(shù)語(yǔ)“生物樣品”應(yīng)該一般意指從個(gè)體、體液、細(xì)胞系、組織培養(yǎng)物或其它來(lái)源獲得的任何生物樣品。體液例如淋巴、血清、血漿、尿、精液、滑液和脊髓液。按照本發(fā)明，所述生物樣品包括肺癌細(xì)胞和非肺癌細(xì)胞(其它細(xì)胞)。獲得來(lái)自哺乳動(dòng)物的組織活檢和體液的方法是本領(lǐng)域公知的。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)的水平(level of expression)”或“表達(dá)水平(expressionlevel)”通常是指樣品中氨基酸產(chǎn)物或蛋白的量，優(yōu)選為按照本發(fā)明的樣品中磷酸化的氨基酸產(chǎn)物或或磷酸化的蛋白的量?！氨磉_(dá)”是指這樣的過(guò)程，即通過(guò)這樣的過(guò)程基因編碼的信息轉(zhuǎn)化成在在細(xì)胞中存在并且運(yùn)作的結(jié)構(gòu)，按照本發(fā)明包括它們的磷酸化作用。當(dāng)用于本文時(shí)，“表達(dá)的基因”包括轉(zhuǎn)錄成mRNA然后翻譯成蛋白并且翻譯后修飾如磷酸化的那些基因。只是為了完整，這一術(shù)語(yǔ)還應(yīng)該包括轉(zhuǎn)錄成RNA但是不翻譯成蛋白的那些表達(dá)的基因(例如，轉(zhuǎn)運(yùn)和核糖體RNAs)。術(shù)語(yǔ)“過(guò)量表達(dá)”和“低量表達(dá)(underexpression)”分別是指當(dāng)與用作對(duì)照的樣品中的基線(xiàn)表達(dá)水平相比時(shí)表達(dá)水平的向上或向下的偏差。因此，“過(guò)量表達(dá)”也是“增加的表達(dá)”，“低量表達(dá)”是“減少的表達(dá)”。
本文中術(shù)語(yǔ)“抗體”以最寬泛的意義應(yīng)用，并且特別涵蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(multispecific antibodies)(例如雙特異性抗體)、以及抗體片段，只要它們表現(xiàn)出理想的生物活性。
當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指從一群基本上均一的抗體獲得的抗體，即，包括所述群體的個(gè)體抗體是相同的，除了可能天然存在的突變之外，而且這種突變可能以較少量存在。單克隆抗體是高度特異的，針對(duì)單一的抗原性位點(diǎn)。此外，多克隆抗體制備物包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同的抗體，與多克隆抗體制備物相反，每一單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一的決定簇。除了它們的特異性，由于它們可以不受其它抗體的污染而合成，所以單克隆抗體是是有利的。修飾詞“單克隆”是指抗體的特征，即從基本上均一的抗體群體獲得，并且不解釋成(constructed)需要通過(guò)任何具體方法的抗體生產(chǎn)。例如，按照本發(fā)明應(yīng)用的單克隆抗體可以通過(guò)最先由Kohler，G.等.，Nature 256(1975)495描述的雜交瘤方法進(jìn)行制備，或者可以通過(guò)重組DNA方法進(jìn)行制備(參見(jiàn)，例如，U.S.Pat.No.4,816,567)?！翱贵w片段”包括完整的抗體的片段。
“結(jié)合”按照本發(fā)明的目的抗原(即磷酸化MAPK或磷酸化的pAKT蛋白)的抗體是這樣的一種抗體，即能夠以足夠的親和力與所述抗原結(jié)合，以致所述抗體用于檢測(cè)所述抗原的存在。按照本發(fā)明的抗體是一種結(jié)合磷酸化的MAPK或磷酸化的pAKT蛋白的抗體，與非磷酸化的MAPK或非磷酸化的pAKT蛋白相比，它通常優(yōu)選地結(jié)合磷酸化的MAPK或磷酸化的pAKT蛋白，或者不顯著地與非磷酸化的MAPK或非磷酸化的pAKT蛋白交叉反應(yīng)。在這樣的實(shí)施方案中，當(dāng)通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)測(cè)定時(shí)，所述抗體與非磷酸化的蛋白的結(jié)合程度應(yīng)該低于10％。換句話(huà)說(shuō)，它應(yīng)該特異性地結(jié)合磷酸化MAPK或磷酸化pAKT蛋白，并且不特異性地結(jié)合或者全然不結(jié)合非磷酸化MAPK或非磷酸化pAKT蛋白。
“化學(xué)治療劑”是用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；瘜W(xué)治療藥劑的實(shí)例包括烷基化試劑，諸如塞替派和環(huán)磷酰胺(CYTOXANTM)、烷基磺酸酯諸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；吖丙啶諸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；氮丙啶和methylamelamines，包括六甲蜜胺、三乙蜜胺(triethylenemelamine)、三乙磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、cholophosphamide、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、氮芥氧化物鹽酸鹽(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖、新氮芥，苯芥膽甾醇，潑尼莫司汀，曲磷胺，烏拉莫司汀；亞硝基脲(nitrosureas)，諸如卡莫司汀，氮脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，雷莫司??；抗生素諸如阿克拉霉素，放線(xiàn)菌素，authramycin，偶氮絲氨酸，博來(lái)霉素，放線(xiàn)菌素C，calicheamicin，carabicin，去甲柔紅霉素，嗜癌霉素，色霉素，放線(xiàn)菌素D，柔紅霉素，地托比星，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，多柔比星，表柔比星，依索比星，伊達(dá)比星，馬塞羅霉素，絲裂霉素，麥考酚酸，諾拉霉素，橄欖霉素，培洛霉素，poffiromycin，嘌羅霉素，三鐵阿霉素，羅多比星，鏈黑霉素，鏈佐星，殺結(jié)核菌素，烏苯美司，凈司他丁，佐柔比星；抗代謝物諸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類(lèi)似物諸如denopterin，甲氨喋呤，喋羅呤，三甲曲沙；嘌呤類(lèi)似物諸如氟達(dá)拉濱，6-巰嘌呤，thiamiprine，硫鳥(niǎo)嘌呤(thioguanine)；嘧啶類(lèi)似物諸如安西他濱，阿扎胞苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脫氧尿苷，去氧氟尿苷，依諾他濱，氟尿苷，5-FU；雄激素諸如卡普睪酮，屈他雄酮丙酸鹽，環(huán)硫雄醇，美雄烷，睪內(nèi)酯；抗腎上腺(anti-adrenals)諸如氨魯米特，米托坦，曲洛司坦；葉酸補(bǔ)償物諸如frolinic acid；醋葡醛內(nèi)酯；羥醛磷酰胺配糖(aldophosphamide glycoside)；5-氨基酮戊酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依達(dá)曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；尼曲吖啶；噴司他?。划惐?phenamet)；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；

雷佐生；西佐喃；鍺螺胺；細(xì)格孢氮雜酸；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；烏拉坦；長(zhǎng)春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司?。欢甯事洞?；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(″Ara-C″)；環(huán)磷酰胺；塞替哌；紫杉烷類(lèi)，例如，紫杉醇

，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西他賽(

，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥(niǎo)嘌呤；巰嘌呤；甲氨喋呤；鉑類(lèi)似物諸如順鉑和卡鉑；長(zhǎng)春堿；鉑；依托泊苷(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長(zhǎng)春新堿；長(zhǎng)春瑞濱；諾維本；諾消靈；替尼泊苷；道諾霉素；氨喋呤；適羅達(dá)；伊班膦酸鹽；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DMFO)；視黃酸；esperamicins；卡培他濱；以及任何上述物質(zhì)的藥用鹽，酸或衍生物。下列物質(zhì)也包含在本發(fā)明中，它們是作用調(diào)控或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素藥劑，諸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬，雷洛昔芬，芳香酶抑制的4(5)-咪唑(aromatase inhibiting 4(5)-imidazoles)，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬，keoxifene，LY117018，奧那司酮，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素諸如氟他胺，尼魯米特，比卡魯胺，亮丙立德，和戈舍瑞林；以及藥用鹽、酸或者任何上述物質(zhì)的衍生物?！盎瘜W(xué)治療劑”本身可以是上文提及的用于治療癌癥組合的化學(xué)化合物的組合，即，所述組合可以是吉西他濱/順鉑，還可以如順鉑/紫杉醇、順鉑/多西他賽、順鉑/長(zhǎng)春瑞濱、吉西他濱/卡鉑、或卡鉑/多西他賽。
術(shù)語(yǔ)“EGFR抑制劑”是指與EGFR結(jié)合并且任選地抑制EGFR活化的治療藥劑。這樣的藥劑的實(shí)例包括與EGFR結(jié)合的抗體和小分子。與EGFR結(jié)合的抗體的實(shí)例包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)，MAb 455(ATCC CRL HB8507)，MAb 225(ATCC CRL 8508)，MAb 528(ATCC CRL8509)(參見(jiàn)，US 4,943,533，Mendelsohn等.)以及其變體，諸如嵌合的225(C225或Cetuximab；

)和改造的人225(H225)(參見(jiàn)WO 96/40210，Imclone Systems Inc.)；結(jié)合11型突變體EGFR的抗體(US5,212,290)；如US 5,891,996所述與EGFR結(jié)合的人源化的和嵌合的抗體；以及結(jié)合EGFR的人抗體，諸如ABX-EGF(參見(jiàn)WO 98/50433，Abgenix)?？笶GFR抗體可以與細(xì)胞毒素試劑綴合，這樣產(chǎn)生一種免疫綴合物(參見(jiàn)，例如，EP 0 659 439 A2，Merck Patent GmbH)。與EGFR結(jié)合的小分子的實(shí)例包括ZD1839或Gefitinib(IRESSATM；Astra Zeneca)，CP-358774(

Genentech/OSI)和AG1478，AG1571(SU 5271；Sugen)。本申請(qǐng)中特別優(yōu)選的是EGFR酪氨酸激酶抑制劑，特別是小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑，例如

例如，“小分子”可以是具有低于每摩爾大約10,000克、優(yōu)選地低于每摩爾大約5,000克的分子量的肽或肽擬物。優(yōu)選地，“小分子”是一種化合物，即，有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物，其具有這樣的分子量低于每摩爾大約5,000克，優(yōu)選地低于每摩爾大約1,000克，更優(yōu)選地低于每摩爾大約500克，以及這樣的化合物的鹽、酯和其它藥用形式。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，EGFR抑制劑是EGFR酪氨酸激酶抑制劑，其為具有下述分子量的化合物低于每摩爾大約5,000克，優(yōu)選地低于每摩爾大約1,000克，以及這樣的化合物的鹽、酯和其它藥用形式。換句話(huà)說(shuō)，所述EGFR抑制劑是一種抑制EGFR酪氨酸激酶活性的化合物，并且具有這樣的分子量低于每摩爾大約5,000克，優(yōu)選地低于每摩爾大約1,000克，更優(yōu)選地低于每摩爾大約500克，以及這樣的化合物的鹽、酯和其它藥用形式。
“吉西他濱”是化學(xué)治療劑2′，2′-二氟脫氧胞苷(dFdC)，其為脫氧胞苷的嘧啶類(lèi)似物，其中脫氧核糖部分在2′位置包含2個(gè)氟原子(參見(jiàn)Heinemann，V.等.，Cancer Res 48(1988)4024)。它可以作為

從EliLilly和Company，Indianapolis，Indiana，USA商購(gòu)獲得。
當(dāng)貫穿本申請(qǐng)應(yīng)用時(shí)，“順鉑”是化學(xué)治療劑順-二氨基二氯鉑(參見(jiàn)US 5,562,925)，作為

從Bristol-Myers Squibb Company，New York，NY，USA商購(gòu)獲得?！绊樸K”是一種重金屬?gòu)?fù)合物，其包含一個(gè)中央的鉑原子，鉑原子被在順式位置上的2個(gè)氯原子和2個(gè)氨分子圍繞。
按照本發(fā)明，表述“包含對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑和化學(xué)治療劑的組合敏感的人肺癌細(xì)胞的生物樣品”應(yīng)該意指，與只用表皮生長(zhǎng)因子抑制劑治療比較，所述包含人肺癌細(xì)胞的生物樣品對(duì)用表皮生長(zhǎng)因子抑制劑和化學(xué)治療劑的組合治療敏感。“敏感”還可以理解為“與之反應(yīng)”或“表現(xiàn)出與之反應(yīng)”，特別是這樣的反應(yīng)對(duì)肺癌患者有益。因而，與只用表皮生長(zhǎng)因子抑制劑治療比較，可以測(cè)定肺癌患者是否對(duì)用表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑和化學(xué)治療劑的組合治療敏感。這意味著患者將從這樣的治療中受益。
“MAPK”蛋白是高度保守的胞質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的一員，叫作促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)或細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控的激酶(ERKs)。這一蛋白家族具有一些亞組。ERKs被激活并且酪氨酸或蘇氨酸被磷酸化，以應(yīng)答廣泛種類(lèi)的細(xì)胞外信號(hào)，包括滲透壓、熱激、促炎細(xì)胞因子、激素和分裂原。當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，術(shù)語(yǔ)“MAPK蛋白”優(yōu)選地是指MAPK蛋白家族的一員，包括或者優(yōu)選地由MAPK1和MAPK3組成。MAPK1(ERK2)的氨基酸序列是SEQ ID NO1，MAPK3(ERK1)(SEQ IDNO2)。這些氨基酸序列由mRNA序列編碼，即，對(duì)于MAPK1，cDNA序列SEQ ID NO3和4，對(duì)于MAPK 3，為SEQ ID NO5。MAPK1的初級(jí)磷酸化位點(diǎn)是Thr185和Tyr185，MAPK3的初級(jí)磷酸化位點(diǎn)是Thr202和Tyr204。這些磷酸化位點(diǎn)還由用于本發(fā)明的抗體識(shí)別，即，優(yōu)選地由針對(duì)MAPK1和MAPK3磷酸化形式的多克隆抗體血清識(shí)別。
術(shù)語(yǔ)“Akt”蛋白是指第二信使調(diào)控的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的Akt/PKB亞家族的蛋白，該亞家族蛋白具有3個(gè)成員，分別叫作Akt1/PKBα，Akt2/PKBβ(Staal，S.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987)5034-5037)和Akt3/PKBγ(Nakatani，K.等.，Biochem.Biophys.Res.Comm.257(1999)906-910；US 6,881,555)。所述同種型是相似的，并且響應(yīng)磷脂酰肌醇3′-OH激酶(PI3K)信號(hào)傳導(dǎo)通過(guò)磷酸化被激活。PI3K/Akt/PKB途徑似乎還對(duì)于腫瘤發(fā)生中的調(diào)控細(xì)胞存活/細(xì)胞死亡很重要(Dudek，H.等.，Science 275(1997)661-665)。當(dāng)用于本申請(qǐng)時(shí)，術(shù)語(yǔ)“Akt蛋白”是指Akt蛋白家族的一員，Akt蛋白家族包括或者優(yōu)選地由Akt1、Akt2和Akt3組成。Akt1/PKBα的磷酸化發(fā)生在兩個(gè)位點(diǎn)Thr308和Ser473上(Meier，R.，等.，J.Biol.Chem.272(1997)30491-30497)。等效的磷酸化位點(diǎn)發(fā)生在Akt2/PKBβ(Thr309和Ser474)和Akt3/PKBγ(Thr305和Ser472)中。術(shù)語(yǔ)“磷酸化的Akt”蛋白是指磷酸化的“Akt”蛋白，優(yōu)選地在上述位點(diǎn)磷酸化。當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，術(shù)語(yǔ)“MAPK蛋白”優(yōu)選是指MAPK蛋白家族的一員，該蛋白家族包括或者優(yōu)選地由MAPK1和MAPK3組成。Akt 1也叫作人RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(EC 2.7.1.37)(RAC-PK-α)，蛋白激酶B(PKB)(C-AKT)，并且Akt 1的氨基酸序列是SEQ ID NO6。AKT2也叫作人RAC-β絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(EC 2.7.1.37)(RAC-PK-β)，蛋白激酶Akt-2或蛋白激酶B，β(PKBβ)，并且Akt 2的氨基酸序列是SEQ ID NO7。AKT3也叫作人RAC-γ絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(EC 2.7.1.37)(RAC-PK-γ)，蛋白激酶Akt-3或蛋白激酶B，γ(PKBγ)(STK-2)，并且Akt 3的氨基酸序列是SEQ ID NO8。
發(fā)明詳述 文獻(xiàn)中闡釋了分子生物學(xué)和核酸化學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)之內(nèi)的。例如，參見(jiàn)Sambrook，J.等.，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989；Gait，M.J.(ed.)，Oligonucleotide Synthesis-A Practical Approach，IRLPress，1984；Hames，B.D.，和Higgins，S.J.(eds.)，Nucleic Acid Hybridisation-A Practical Approach，IRL Press，1985；以及系列叢書(shū)，Methods inEnzymology，Academic Press，Inc.，所有這些通過(guò)參考結(jié)合于此。本文提及的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和公布，上文所述和下文所述的，都通過(guò)參考結(jié)合于此。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供確定包含人肺癌細(xì)胞的生物樣品是否對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑和化學(xué)治療劑的組合敏感的方法，所述方法包括確定生物樣品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的過(guò)量表達(dá)，其中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的過(guò)量表達(dá)是包含人肺癌細(xì)胞的生物樣品對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑和化學(xué)治療劑的組合敏感的指示。
優(yōu)選地，在按照本發(fā)明的方法中，生物樣品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的過(guò)量表達(dá)通過(guò)下列步驟確定 a)測(cè)定生物樣品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平， b)測(cè)定在包含對(duì)表皮生長(zhǎng)因子抑制劑和化學(xué)治療劑的組合不敏感的人肺癌細(xì)胞的生物樣品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平， c)測(cè)定步驟a)和b)中而測(cè)定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異，由此確定磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的過(guò)量表達(dá)。
優(yōu)選地，步驟a)和b)中測(cè)定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異至少為10％。更優(yōu)選地，步驟a)和b)中測(cè)定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異至少為25％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)和b)中測(cè)定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異至少為50％，75％，100％，125％，150％，175％，200％，300％，400％，500％或1,000％。步驟a)和b)中測(cè)定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異可以多達(dá)10,000或50,000％。步驟a)和b)中測(cè)定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異優(yōu)選地在10％到10,000％之間，更優(yōu)選地25％到10,000％，50％到10,000％，100％到10,000％，甚至更優(yōu)選地25％到5,000％，50％到5,000％，100％到5,000％。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物樣品是原發(fā)性肺腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤(局部的或遠(yuǎn)端的)，例如，其可以通過(guò)肺部組織活檢或者通過(guò)組織活檢方式從其它器官獲得。例如，轉(zhuǎn)移瘤還可以是肝臟或淋巴節(jié)的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移瘤。必須理解當(dāng)轉(zhuǎn)移瘤發(fā)源于肺部時(shí)，這樣的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移瘤也包括肺癌細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是除肺癌以外的另一種癌癥，如胰腺癌。然而，具有實(shí)體瘤的其它癌癥也是可行的，諸如卵巢、結(jié)腸直腸、頭頸、腎細(xì)胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及胃腸癌，特別是胃癌。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，EGFR抑制劑是EGFR酪氨酸激酶抑制劑，特別是小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑，例如

因此，換句話(huà)說(shuō)，在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述EGFR抑制劑是erlotinib或N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，化學(xué)治療劑是吉西他濱和/或順鉑。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，磷酸化的Akt蛋白或磷酸化的MAPK蛋白的過(guò)量表達(dá)是使用特異性結(jié)合磷酸化的蛋白并且優(yōu)選地不特異性或者全然不結(jié)合非磷酸化蛋白的試劑而測(cè)定的。優(yōu)選地，抗體、抗體衍生物或抗體片段特異性地結(jié)合磷酸化的AKT蛋白或者磷酸化的MAPK蛋白，并且優(yōu)選地不特異性地或全然不結(jié)合非磷酸化的AKT蛋白或非磷酸化的MAPK蛋白。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，磷酸化的AKT蛋白是在與Akt1蛋白氨基酸位置473對(duì)應(yīng)的氨基酸位置被磷酸化，或者M(jìn)APK蛋白在與MAPK1氨基酸位置202和204對(duì)應(yīng)的氨基酸位置被磷酸化。優(yōu)選地，MAPK蛋白的氨基酸序列為氨基酸序列SEQ ID NO1或2，AKT蛋白的氨基酸序列是氨基酸序列SEQ ID NO6，7或8。
存在可以用于本發(fā)明方法的許多不同類(lèi)型的免疫檢測(cè)，例如，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，熒光免疫吸附測(cè)定(FIA)，化學(xué)物質(zhì)聯(lián)接的免疫吸附測(cè)定(chemical linked immunosorbent assay，CLIA)，放射免疫測(cè)定(RIA)，和免疫印跡。關(guān)于可以應(yīng)用的不同免疫檢測(cè)的綜述，參見(jiàn)Lottspeich和Zorbas(eds.)，Bioanalytik，第一版1998，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Berlin，德國(guó)。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)水平應(yīng)用選自由下列各項(xiàng)組成的組的方法進(jìn)行測(cè)定蛋白質(zhì)組學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的過(guò)量表達(dá)通過(guò)下列步驟測(cè)定 a)將生物樣品進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色， b)在肉眼觀察生物樣品中細(xì)胞的染色后，對(duì)于磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平，指定一個(gè)選自數(shù)字1，2，3和4的等級(jí)，由此指定關(guān)于表達(dá)水平的最高可檢測(cè)的等級(jí)， c)確定在免疫組織化學(xué)染色的生物樣品中具有最高可檢測(cè)等級(jí)的細(xì)胞的百分比， d)將在免疫組織化學(xué)染色的生物樣品中具有最高可檢測(cè)等級(jí)的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)乘以指定的等級(jí)并且乘以100，和 e)當(dāng)步驟d)的乘法結(jié)果高于100時(shí)，確定生物樣品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白過(guò)量表達(dá)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供確定肺癌患者是否受益于表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑和化學(xué)治療劑的組合的方法，所述方法包括確定來(lái)自患者的樣品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的過(guò)量表達(dá)，其中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的過(guò)量表達(dá)是患者受益于表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑和化學(xué)治療劑組合的指示。上文所述的所有其它優(yōu)選的實(shí)施方案同等地適用于這一實(shí)施方案。優(yōu)選地，在按照本發(fā)明的方法中，來(lái)自患者的樣品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的過(guò)量表達(dá)通過(guò)下列步驟確定 a)測(cè)定來(lái)自患者的樣品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平， b)在來(lái)自肺癌患者的樣品中，測(cè)定磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平，其中所述肺癌患者不受益于表皮生長(zhǎng)因子抑制劑和化學(xué)治療劑的組合， c)確定步驟a)和b)測(cè)定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異，由此確定磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的過(guò)量表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“受益”意指與只用表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑治療相比，患者沒(méi)有從表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑和化學(xué)治療劑的組合治療中受益。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將與磷酸化的AKT蛋白結(jié)合的抗體或者與磷酸化的MAPK蛋白結(jié)合的抗體用來(lái)確定包含人肺癌細(xì)胞的生物樣品是否對(duì)表皮生長(zhǎng)因子抑制劑和化學(xué)治療劑的組合敏感。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了選擇抑制患者的肺癌發(fā)展的組合物的方法，所述方法包括 a)在多種測(cè)試組合物的存在下，將來(lái)自患者的包含對(duì)EGFR抑制劑和化學(xué)治療劑的組合敏感的肺癌細(xì)胞的生物樣品的等分試樣分別暴露； b)將與測(cè)試組合物接觸的生物樣品的等分試樣中磷酸化的Akt蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平與在不接觸測(cè)試組合物的生物樣品的等分試樣中磷酸化的Akt蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平相比較， c)選擇相對(duì)于沒(méi)有接觸測(cè)試組合物的等分試樣，在包含所述測(cè)試組合物的等分試樣中改變了磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平的測(cè)試組合物之一，其中在與所述測(cè)試組合物接觸的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平與在沒(méi)有接觸所述測(cè)試組合物的生物樣品的等分試樣中的磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平之間存在至少10％的差異是選擇所述測(cè)試組合物的指示。
優(yōu)選地，步驟c)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異為至少25％。更優(yōu)選地，步驟c)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異為至少50％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟c)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異為至少75％，100％，125％，150％，175％，200％，300％，400％，500％或1,000％。步驟c)中測(cè)定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異可以多達(dá)10,000或50,000％。步驟c)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異優(yōu)選地在10％到10,000％之間，更優(yōu)選地，25％到10,000％，50％到10,000％，100％到10,000％，甚至更優(yōu)選地25％到5,000％，50％到5,000％，100％到5,000％。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供獲得候選藥劑的方法，所述方法包括 (a)將包含對(duì)EGFR抑制劑和化學(xué)治療劑敏感的肺癌細(xì)胞的生物樣品的等分試樣與候選藥劑接觸， (b)測(cè)定與所述候選藥劑接觸的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平，并且測(cè)定在沒(méi)有接觸所述候選藥劑的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平， (c)通過(guò)將與所述候選藥劑接觸的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平與在沒(méi)有接觸所述候選藥劑的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行比較，而觀察所述候選藥劑的效果， (d)從所述觀察到的效果獲得所述藥劑，其中在與所述測(cè)試組合物接觸的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平與在沒(méi)有接觸所述測(cè)試組合物的生物樣品的等分試樣中的磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平之間存在至少10％的差異是所述候選藥劑效果的指示。
優(yōu)選地，步驟d)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異為至少25％。更優(yōu)選地，步驟d)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異為至少50％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟d)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異為至少75％，100％，125％，150％，175％，200％，300％，400％，500％或1,000％。步驟d)中測(cè)定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異可以多達(dá)10,000或50,000％。步驟d)中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異優(yōu)選地在10％到10,000％之間，更優(yōu)選地，25％到10,000％，50％到10,000％，100％到10,000％，甚至更優(yōu)選地25％到5,000％，50％到5,000％，100％到5,000％。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述候選藥劑是候選的抑制劑或候選的增強(qiáng)劑。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了通過(guò)按照本發(fā)明的方法獲得的候選藥劑。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包括按照本發(fā)明的藥劑的藥物制劑。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將按照本發(fā)明的一種藥劑用于制備抑制肺癌發(fā)展的組合物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供生產(chǎn)藥物的方法，其包括本發(fā)明的方法的步驟以及 (i)以足以對(duì)受試者提供治療有效量的所述藥物的量合成在步驟 (c)中鑒定的候選藥劑或其類(lèi)似物或衍生物；和/或 (ii)將步驟(c)中鑒定的候選藥物候選藥劑或其類(lèi)似物或衍生物與藥用載體組合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用Akt蛋白、MAPK蛋白、磷酸化Akt蛋白、磷酸化MAPK蛋白、選擇性與磷酸化Akt蛋白或磷酸化MAPK蛋白結(jié)合的抗體來(lái)獲得候選藥劑，或者來(lái)選擇在患者中抑制肺癌發(fā)展的組合物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，考慮包括針對(duì)磷酸化MAPK和/或磷酸化Akt蛋白的抗體的試劑盒。本領(lǐng)域已知的這樣的試劑盒還包括塑料器皿，例如，其可以在擴(kuò)增步驟中用作96或384孔形式的微量滴定板，或者只用作普通反應(yīng)管，例如由Eppendorf，Hamburg，德國(guó)制備，并且所述試劑盒包括實(shí)行按照本發(fā)明的方法的所有其它試劑，所述方法優(yōu)選地為免疫測(cè)定，例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、熒光免疫吸附測(cè)定(FIA)、化學(xué)物質(zhì)聯(lián)接的免疫吸附測(cè)定(CLIA)、放射免疫測(cè)定(RIA)和免疫印跡。關(guān)于可以應(yīng)用的不同免疫檢測(cè)的綜述，參見(jiàn)Lottspeich和Zorbas(eds.)，Bioanalytik，第一版1998，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Berlin，德國(guó)。
提供下述實(shí)施例、參考文獻(xiàn)、序列表和附圖以幫助理解本發(fā)明，在附上的權(quán)利要求中闡述本發(fā)明真正的范圍。應(yīng)該理解，在不背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)時(shí)，在提出的步驟中可以進(jìn)行更改。
附圖描述

圖1在隨機(jī)分配到Erlotinib/吉西他濱/順鉑(A)或安慰劑/吉西他濱/順鉑治療的所有患者中的至死時(shí)間(OS)分析的Kaplan-Meier曲線(xiàn)(圓圈表示檢查的觀察時(shí)間，此時(shí)觀察在事件發(fā)生前結(jié)束)。
圖2在所有患者中用生物標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行至死時(shí)間(OS)分析的Kaplan-Meier曲線(xiàn)，其中所述患者隨機(jī)分配到Erlotinib/吉西他濱/順鉑(A)或安慰劑/吉西他濱/順鉑治療中(圓圈表示檢查的觀察時(shí)間，此時(shí)觀察在事件發(fā)生前結(jié)束)。
圖3在隨機(jī)分配到Erlotinib/吉西他濱/順鉑(A)或安慰劑/吉西他濱/順鉑治療的所有患者中的發(fā)展時(shí)間/死亡(PFS)分析的Kaplan-Meier曲線(xiàn)(圓圈表示檢查的觀察時(shí)間，此時(shí)觀察在事件發(fā)生前結(jié)束)。
圖4在所有患者中用生物標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行發(fā)展時(shí)間/死亡(PFS)分析的Kaplan-Meier曲線(xiàn)，其中所述患者隨機(jī)分配到Erlotinib/吉西他濱/順鉑(A)或安慰劑/吉西他濱/順鉑治療中(圓圈表示檢查的觀察時(shí)間，此時(shí)觀察在事件發(fā)生前結(jié)束)。
圖5在用安慰劑/吉西他濱/順鉑處理的所有生物標(biāo)記患者中至死時(shí)間(OS)分析的Kaplan-Meier曲線(xiàn)，將具有pMAPK H-Score≥100的患者(H)與具有pMAPK H-Score＜100的患者進(jìn)行比較(圓圈表示檢查的觀察時(shí)間，此時(shí)觀察在事件發(fā)生前結(jié)束)。
圖6在所有具有pMAPK H-Score＜100的生物標(biāo)記患者中至死時(shí)間(OS)分析的Kaplan-Meier曲線(xiàn)，將Erlotinib/吉西他濱/順鉑(A)與安慰劑/吉西他濱/順鉑治療進(jìn)行比較(圓圈表示檢查的觀察時(shí)間，此時(shí)觀察在事件發(fā)生前結(jié)束)。
圖7在分別具有pMAPK H-Score＜100和pMAPK H-Score≥100的所有生物標(biāo)記患者中至死時(shí)間(OS)分析的Kaplan-Meier曲線(xiàn)，將Erlotinib/吉西他濱/順鉑(LA，HA)與安慰劑/吉西他濱/順鉑(H)治療進(jìn)行比較(圓圈表示檢查的觀察時(shí)間，此時(shí)觀察在事件發(fā)生前結(jié)束)。
圖8在分別具有pMAPK H-Score＜100和pMAPK H-Score≥100的所有生物標(biāo)記患者中發(fā)展時(shí)間/死亡(PFS)分析的Kaplan-Meier曲線(xiàn)，將Erlotinib/吉西他濱/順鉑(LA，HA)與安慰劑/吉西他濱/順鉑(H)治療進(jìn)行比較(圓圈表示檢查的觀察時(shí)間，此時(shí)觀察在事件發(fā)生前結(jié)束)。
圖9在所有安慰劑/吉西他濱/順鉑治療的生物標(biāo)記患者中至死時(shí)間(OS)分析的Kaplan-Meier曲線(xiàn)，將pAKT1H-Score＜300(L)和pAKT1 H-Score≥300(H)進(jìn)行比較(圓圈表示檢查的觀察時(shí)間，此時(shí)觀察在事件發(fā)生前結(jié)束)。
圖10在所有Erlotinib/吉西他濱/順鉑治療的生物標(biāo)記患者中至死時(shí)間(OS)分析的Kaplan-Meier曲線(xiàn)，將pAKT1 H-Score＜300(L)和pAKT1 H-Score≥300(H)進(jìn)行比較(圓圈表示檢查的觀察時(shí)間，此時(shí)觀察在事件發(fā)生前結(jié)束)。
圖11在分別具有p AKT1 H-Score＜300和p AKT1 H-Score≥300的所有生物標(biāo)記患者中至死時(shí)間(OS)分析的Kaplan-Meier曲線(xiàn)，將Erlotinib/吉西他濱/順鉑(LA，HA)與安慰劑/吉西他濱/順鉑(H)治療進(jìn)行比較(圓圈表示檢查的觀察時(shí)間，此時(shí)觀察在事件發(fā)生前結(jié)束)。
實(shí)施例1 對(duì)于腫瘤組織樣品的生物標(biāo)記分析 關(guān)于臨床研究的探索性腫瘤生物標(biāo)記分析的目的是鑒定對(duì)于

治療的陽(yáng)性或陰性臨床結(jié)果預(yù)測(cè)為最好的那些標(biāo)記或標(biāo)記組合。由于本研究的臨床結(jié)果并不允許產(chǎn)生關(guān)于如何選擇從

治療受益更多的患者群體的假定，所以特別的重點(diǎn)是在這樣的標(biāo)記的鑒別上，所述標(biāo)記區(qū)分相對(duì)于單獨(dú)的化學(xué)治療對(duì)照組特別受益于

組合的患者(亞組)。另外，研究了區(qū)分相對(duì)于單獨(dú)的化學(xué)治療對(duì)照組對(duì)于

的具體組合有不利作用的患者(亞組)的標(biāo)記鑒別。
本研究的目的是分析與EGFR信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)的腫瘤-特異性生物標(biāo)記，例如，EGFR，HER2，pAKT和pMAPK。
生物標(biāo)記數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)相關(guān)(綜合的和治療特異性分析)。
材料和方法 臨床樣本 生物標(biāo)記分析在141名患者的樣本子集中進(jìn)行，對(duì)于這一分析已經(jīng)收到來(lái)自初始診斷的福爾馬林固定的石蠟包埋的(FFPE)組織塊。
用于IHC檢測(cè)的抗體
pMAPK IHC流程 1.從石蠟-排列-塊上切割約3-4μm厚的切片。
2.將切片封固在載玻片上，并且讓它們干燥過(guò)夜。
3.在二甲苯中將載玻片上的石蠟溶掉，接著進(jìn)行遞減的乙醇系列 -二甲苯過(guò)夜 -二甲苯2×10分鐘 -abs.乙醇2×10min. -96％乙醇2×5min. -80％乙醇1×5min. -70％乙醇2×5min. -PBS緩沖液10min.(更換緩沖液一次或兩次) 4.Antigene retrival/樣品預(yù)處理 在1×檸檬酸緩沖液pH6(Biocyc GmbH，貨號(hào)400300692)中高壓鍋5分鐘120℃。在TBS/PBS(1∶10)緩沖液中洗滌5分鐘。
5.過(guò)氧化物酶封閉 -將載玻片在3％H2O2中溫育10分鐘。
-在TBS/PBS緩沖液中洗滌2×5分鐘。
6.抗體溫育 -將載玻片置于用Tris-緩沖液稀釋的正常血清(1.5％)中或其它封閉溶液中。
-將以1∶150稀釋的一抗(Zymed兔抗磷酸-ERK1+2目錄號(hào)36-8800)加到載玻片上，并且在30℃濕潤(rùn)的室內(nèi)溫育2小時(shí)。
-在TBS/PBS緩沖液中洗滌2×5分鐘。
-將Envision Polymer HRP(Dako)置于載玻片上，并且在30℃濕潤(rùn)的室內(nèi)溫育30分鐘。
-在TBS/PBS緩沖液中洗滌2×5分鐘。
7.檢測(cè) -將載玻片用0.05M Tris緩沖液pH7.6洗滌20分鐘 -將載玻片用DAB-色原(Liquid DAB Dako code no.K3467)覆蓋5分鐘，并且將其溫育5-10分鐘。
-將載玻片用demin.水洗滌5分鐘以終止顏色反應(yīng)。
-用蘇木精(Harris

HTX 31000，Medite GmbH)進(jìn)行復(fù)染色 -用水潤(rùn)洗 -在HCL-乙醇中分辨 -在水中，，blue“5min -上升的乙醇系列 -二甲苯 -封蓋 pAKT IHC流程 流程同pMAPK，除了下列各項(xiàng) -比較4.在檸檬酸緩沖液pH9(Dako code no.S2367)中進(jìn)行樣品預(yù)處理 -比較6.一抗(abcam AKT phospho S473)以1∶450稀釋(比較6.) IHC數(shù)據(jù)報(bào)告 一名病理學(xué)家評(píng)估了所有的免疫染色。核染色強(qiáng)度(pAKT，pMAPK)通過(guò)肉眼檢查以4步等級(jí)(0，1，2，3)進(jìn)行評(píng)估。除了核染色強(qiáng)度以外，還記錄了陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)和分析失敗的原因(即，在組織點(diǎn)中缺少腫瘤細(xì)胞或在TMA載玻片上缺少組織點(diǎn))。
探索性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 生物標(biāo)記數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析目的在于研究通過(guò)單獨(dú)的每一標(biāo)記和/或通過(guò)適當(dāng)?shù)慕M合來(lái)預(yù)測(cè)臨床益處和/或毒性的潛能。
按照經(jīng)驗(yàn)，許多生物標(biāo)記在患者之間和患者內(nèi)部表現(xiàn)出傾斜的(skewed)統(tǒng)計(jì)學(xué)分布。通常還存在一些所述傾斜(skewness)的生化背景，原因在于變化過(guò)程有乘法結(jié)構(gòu)。當(dāng)要應(yīng)用線(xiàn)性統(tǒng)計(jì)學(xué)方法(例如，回歸)時(shí)，傾斜的分布存在問(wèn)題。當(dāng)在統(tǒng)計(jì)學(xué)模型中用作共變量(covariates)時(shí)，傾斜還可能使結(jié)果不清楚。因此，需要找到適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化，其將這些測(cè)定轉(zhuǎn)化成具有近似高斯形狀的分布。生物標(biāo)記區(qū)域的典型選擇是log(x+c)形式的轉(zhuǎn)化。這些轉(zhuǎn)化不改變值的順序，以便基于秩的非參數(shù)分析或截點(diǎn)保持不被轉(zhuǎn)化改變。當(dāng)要應(yīng)用線(xiàn)性多變量方法如判別分析和主成分分析時(shí)，這樣的轉(zhuǎn)化也是必要的。
敘述性地研究了不同標(biāo)記的基本統(tǒng)計(jì)學(xué)和相倚性。關(guān)于可靠性和有效性，進(jìn)行了比較不同檢測(cè)方法如IHC的方法學(xué)分析。對(duì)

的受益定義為臨床終點(diǎn)存活時(shí)間(或至死時(shí)間，TTD)，PFS時(shí)間(發(fā)展時(shí)間，TTP/D)，客觀反應(yīng)，最佳反應(yīng)(CR/PR/SD/PD)。
由這些分析產(chǎn)生的p-值不能以確定的意義來(lái)解釋?zhuān)凰鼈儽灰暈樘厥獾拿枋龉ぞ?，以指?dǎo)針對(duì)有效的候選預(yù)測(cè)規(guī)則的研究。考慮到它們對(duì)臨床終點(diǎn)預(yù)測(cè)(例如，尋找截點(diǎn))的潛力，在單變量水平上評(píng)估標(biāo)記。為了研究標(biāo)記的組合，應(yīng)用了進(jìn)一步的多變量技術(shù)(例如，線(xiàn)性判別分析，多Logistic回歸，帶旋轉(zhuǎn)的主成分分析，聚類(lèi)分析，CART方法)。研究了生物標(biāo)記和反應(yīng)與臨床共變量的相關(guān)性。將來(lái)自生物標(biāo)記的候選組用至事件時(shí)間變量進(jìn)行檢驗(yàn)(Kaplan-Meier曲線(xiàn)，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，logrank檢驗(yàn))。
結(jié)果 與全部研究群體比較，分析TMA樣本子集 考慮到基線(xiàn)患者特征和臨床結(jié)果參數(shù)，將具有用于生物標(biāo)記分析的樣品的患者子集與全部研究群體比較。概要在下表中顯示。

發(fā)現(xiàn) 具有生物標(biāo)記數(shù)據(jù)的患者子集對(duì)于BO16411研究群體不是典型性的。在主要群體和生物標(biāo)記亞組之間關(guān)于TTD和TTP風(fēng)險(xiǎn)比率存在差異。與主要的臨床群體相比，生物標(biāo)記亞組

-治療的患者具有更壞的預(yù)后(prognosis)。當(dāng)與主要研究群體比較時(shí)，一些基線(xiàn)共變量表明，生物標(biāo)記亞組--并且在這一亞組內(nèi)特別是

-相關(guān)的患者代表了更加病態(tài)的病例混合。KM圖(圖1-4)也應(yīng)該考慮。
pMAPK IHC分析的結(jié)果 ●pMAPK IHC數(shù)據(jù)表現(xiàn)出了充分的分散度，符合進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
為了測(cè)定pMAPK表達(dá)和臨床結(jié)果之間的相關(guān)性，通過(guò)敘述統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定了截點(diǎn)值Franklin H-得分通過(guò)結(jié)合染色強(qiáng)度和染色的腫瘤細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)而確定(pMAPK_hsco＝(pMAPK_Nuclear_Staining+1)*pMAPK_Nuclear_Pos_Cells；范圍0-400)?！瓣?yáng)性”pMAPK染色由＝/＞100的H-得分定義，除了染色是“陰性”的以外。
●Kaplan-Meier圖在圖5-8中顯示
發(fā)現(xiàn) ●對(duì)于用化學(xué)治療/安慰劑治療的患者，“陽(yáng)性”pMAPK表達(dá)與更壞的預(yù)后相關(guān)(TTDHR 4.882，p＝0.0001)，然而，“陰性”pAKT表達(dá)似乎與更長(zhǎng)的存活相關(guān) ●趨勢(shì)“陽(yáng)性pMAPK”患者可能受益于化學(xué)治療/

組合(HR0.500，p0.0516)(----) pAKT IHC分析的結(jié)果 ●pAKT IHC數(shù)據(jù)表現(xiàn)出充分的分散度，符合進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 ●為了確定pAKT表達(dá)和臨床結(jié)果之間的相關(guān)性，通過(guò)敘述統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定截?cái)嘀礔ranklin H-得分通過(guò)結(jié)合核染色強(qiáng)度和染色的腫瘤細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)而確定(pMAPK_hsco＝(pMAPK_Nuclear_Staining+1)*pMAPK_Nuclear_Pos_Cells；范圍0-400)。“陽(yáng)性”pAKT染色由＝/＞300的H-得分定義，否則染色是“陰性”。
●Kaplan-Meier圖在圖9-11中顯示 IHC和臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性
發(fā)現(xiàn) ●對(duì)于用化學(xué)治療/安慰劑治療的患者，“陽(yáng)性”pAKt表達(dá)與更壞的預(yù)后相關(guān)(TTDHR 2.258，p＝0.0573)，然而，“陰性”pAKT表達(dá)似乎與更長(zhǎng)的存活相關(guān) ●對(duì)于用化學(xué)治療/

combo治療的患者，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相似的差異。
<110>霍夫曼-拉羅奇有限公司
<120>化學(xué)治療應(yīng)答者的確定
<130>23128
<150>EP05010244.1
<151>2005-05-11
<150>EP05011070.9
<151>2005-05-23
<160>8
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>360
<212>PRT
<213>智人
<400>1
Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Glu Met Val Arg Gly
1 5 10 15
Gln Val Phe Asp Val Gly Pro Arg Tyr Thr Asn Leu Ser Tyr Ile Gly
20 25 30
Glu Gly Ala Tyr Gly Met Val Cys Ser Ala Tyr Asp Asn Val Asn Lys
35 40 45
Val Arg Val Ala Ile Lys Lys Ile Ser Pro Phe Glu His Gln Thr Tyr
50 55 60
Cys Gln Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys Ile Leu Leu Arg Phe Arg His
65 70 75 80
Glu Asn Ile Ile Gly Ile Asn Asp Ile Ile Arg Ala Pro Thr Ile Glu
85 90 95
Gln Met Lys Asp Val Tyr Ile Val Gln Asp Leu Met Glu Thr Asp Leu
100 105 110
Tyr Lys Leu Leu Lys Thr Gln His Leu Ser Asn Asp His Ile Cys Tyr
115 120 125
Phe Leu Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Asn
130 135 140
Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Leu Asn Thr Thr
145 150 155 160
Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Ala Asp Pro
165 170 175
Asp His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg Trp
180 185 190
Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Ser Lys Gly Tyr Thr Lys Ser
195 200 205
Ile Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Ala Glu Met Leu Ser Asn
210 215 220
Arg Pro Ile Phe Pro Gly Lys His Tyr Leu Asp Gln Leu Asn His Ile
225 230 235 240
Leu Gly Ile Leu Gly Ser Pro Ser Gln Glu Asp Leu Asn Cys Ile Ile
245 250 255
Asn Leu Lys Ala Arg Asn Tyr Leu Leu Ser Leu Pro His Lys Asn Lys
260 265 270
Val Pro Trp Asn Arg Leu Phe Pro Asn Ala Asp Ser Lys Ala Leu Asp
275 280 285
Leu Leu Asp Lys Met Leu Thr Phe Asn Pro His Lys Arg Ile Glu Val
290 295 300
Glu Gln Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu Glu Gln Tyr Tyr Asp Pro Ser
305 310 315 320
Asp Glu Pro Ile Ala Glu Ala Pro Phe Lys Phe Asp Met Glu Leu Asp
325 330 335
Asp Leu Pro Lys Glu Lys Leu Lys Glu Leu Ile Phe Glu Glu Thr Ala
340 345 350
Arg Phe Gln Pro Gly Tyr Arg Ser
355 360
<210>2
<211>379
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gly Gly Gly Gly Gly Glu Pro Arg Arg
1 5 10 15
Thr Glu Gly Val Gly Pro Gly Val Pro Gly Glu Val Glu Met Val Lys
20 25 30
Gly Gln Pro Phe Asp Val Gly Pro Arg Tyr Thr Gln Leu Gln Tyr Ile
35 40 45
Gly Glu Gly Ala Tyr Gly Met Val Ser Ser Ala Tyr Asp His Val Arg
50 55 60
Lys Thr Arg Val Ala Ile Lys Lys Ile Ser Pro Phe Glu His Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Cys Gln Arg Thr Leu Arg Glu Ile Gln Ile Leu Leu Arg Phe Arg
85 90 95
His Glu Asn Val Ile Gly Ile Arg Asp Ile Leu Arg Ala Ser Thr Leu
100 105 110
Glu Ala Met Arg Asp Val Tyr Ile Val Gln Asp Leu Met Glu Thr Asp
115 120 125
Leu Tyr Lys Leu Leu Lys Ser Gln Gln Leu Ser Asn Asp His Ile Cys
130 135 140
Tyr Phe Leu Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala
145 150 155 160
Asn Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Ile Asn Thr
165 170 175
Thr Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ile Ala Asp
180 185 190
Pro Glu His Asp His Thr Gly Phe Leu Thr Glu Tyr Val Ala Thr Arg
195 200 205
Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Ser Lys Gly Tyr Thr Lys
210 215 220
Ser Ile Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Leu Ala Glu Met Leu Ser
225 230 235 240
Asn Arg Pro Ile Phe Pro Gly Lys His Tyr Leu Asp Gln Leu Asn His
245 250 255
Ile Leu Gly Ile Leu Gly Ser Pro Ser Gln Glu Asp Leu Asn Cys Ile
260 265 270
Ile Asn Met Lys Ala Arg Asn Tyr Leu Gln Ser Leu Pro Ser Lys Thr
275 280 285
Lys Val Ala Trp Ala Lys Leu Phe Pro Lys Ser Asp Ser Lys Ala Leu
290 295 300
Asp Leu Leu Asp Arg Met Leu Thr Phe Asn Pro Asn Lys Arg Ile Thr
305 310 315 320
Val Glu Glu Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu Glu Gln Tyr Tyr Asp Pro
325 330 335
Thr Asp Glu Pro Val Ala Glu Glu Pro Phe Thr Phe Ala Met Glu Leu
340 345 350
Asp Asp Leu Pro Lys Glu Arg Leu Lys Glu Leu Ile Phe Gln Glu Thr
355 360 365
Ala Arg Phe Gln Pro Gly Val Leu Glu Ala Pro
370 375
<210>3
<211>2934
<212>DNA
<213>智人
<400>3
gcccctccct ccgcccgccc gccggcccgc ccgtcagtct ggcaggcagg caggcaatcg 60
gtccgagtgg ctgtcggctc ttcagctctc ccgctcggcg tcttccttcc tcctcccggt120
cagcgtcggc ggctgcaccg gcggcggcgc agtccctgcg ggaggggcga caagagctga180
gcggcggccg ccgagcgtcg agctcagcgc ggcggaggcg gcggcggccc ggcagccaac240
atggcggcgg cggcggcggc gggcgcgggc ccggagatgg tccgcgggca ggtgttcgac300
gtggggccgc gctacaccaa cctctcgtac atcggcgagg gcgcctacgg catggtgtgc 360
tctgcttatg ataatgtcaa caaagttcga gtagctatca agaaaatcag cccctttgag 420
caccagacct actgccagag aaccctgagg gagataaaaa tcttactgcg cttcagacat 480
gagaacatca ttggaatcaa tgacattatt cgagcaccaa ccatcgagca aatgaaagat 540
gtatatatag tacaggacct catggaaaca gatctttaca agctcttgaa gacacaacac 600
ctcagcaatg accatatctg ctattttctc taccagatcc tcagagggtt aaaatatatc 660
cattcagcta acgttctgca ccgtgacctc aagccttcca acctgctgct caacaccacc 720
tgtgatctca agatctgtga ctttggcctg gcccgtgttg cagatccaga ccatgatcac 780
acagggttcc tgacagaata tgtggccaca cgttggtaca gggctccaga aattatgttg 840
aattccaagg gctacaccaa gtccattgat atttggtctg taggctgcat tctggcagaa 900
atgctttcta acaggcccat ctttccaggg aagcattatc ttgaccagct gaaacacatt 960
ttgggtattc ttggatcccc atcacaagaa gacctgaatt gtataataaa tttaaaagct1020
aggaactatt tgctttctct tccacacaaa aataaggtgc catggaacag gctgttccca1080
aatgctgact ccaaagctct ggacttattg gacaaaatgt tgacattcaa cccacacaag1140
aggattgaag tagaacaggc tctggcccac ccatatctgg agcagtatta cgacccgagt1200
gacgagccca tcgccgaagc accattcaag ttcgacatgg aattggatga cttgcctaag1260
gaaaagctca aagaactaat ttttgaagag actgctagat tccagccagg atacagatct1320
taaatttgtc aggacaaggg ctcagaggac tggacgtgct cagacatcgg tgttcttctt1380
cccagttctt gacccctggt cctgtctcca gcccgtcttg gcttatccac tttgactcct1440
ttgagccgtt tggaggggcg gtttctggta gttgtggctt ttatgctttc aaagaatttc1500
ttcagtccag agaattcctc ctggcagccc tgtgtgtgtc acccattggt gacctgcggc1560
agtatgtact tcagtgcacc ttactgctta ctgttgcttt agtcactaat tgctttctgg1620
tttgaaagat gcagtggttc ctccctctcc tgaatccttt tctacatgat gccctgctga1680
ccatgcagcc gcaccagaga gagattcttc cccaattggc tctagtcact ggcatctcac1740
tttatgatag ggaaggctac tacctagggc actttaagtc agtgacagcc ccttatttgc1800
acttcacctt ttgaccataa ctgtttcccc agagcaggag cttgtggaaa taccttggct1860
gatgttgcag cctgcagcaa gtgcttccgt ctccggaatc cttggggagc acttgtccac1920
gtcttttctc atatcatggt agtcactaac atatataagg tatgtgctat tggcccagct1980
tttagaaaat gcagtcattt ttctaaataa aaaggaagta ctgcacccag cagtgtcact2040
ctgtagttac tgtggtcact tgtaccatat agaggtgtaa cacttgtcaa gaagcgttat2100
gtgcagtact taatgtttgt aagacttaca aaaaaagatt taaagtggca gcttcactcg 2160
acatttggtg agagaagtac aaaggttgca gtgctgagct gtgggcggtt tctggggatg 2220
tcccagggtg gaactccaca tgctggtgca tatacgccct tgagctactt caaatgtggt 2280
ttatacctcg cagatacaag aatctttatg aatatacaat tctttttcct tctacagctt 2340
agctccgtct tttcaaccac gaacatttaa aacccgacct actagcactg ttctgtcctc 2400
aagtactcaa atatttctga tactgctgag tcagactgtc agaaaaagct agcactaact 2460
cgtgtttgga gctctatcca tattttactg atctctttaa gtatttgttc ctgccactgt 2520
gtactgtgga gttgactcgg tgttctgtcc cagtgcggtg cctcctcttg acttccccac 2580
tgctctctgt ggtgagaaat ttgccttgtt caataattac tgtaccctcg catgactgtt 2640
acagctttct gtgcagagat gactgtccaa gtgccacatg cctacgattg aaatgaaaac 2700
tctattgtta cctctgagtt gtgttccacg gaaaatgcta tccagcagat catttaggaa 2760
aaataattct atttttagct tttcatttct cagctgtcct tttttcttgt ttgatttttg 2820
acagcaatgg agaatgggtt atataaagac tgcctgctaa tatgaacaga aatgcatttg 2880
taattcatga aaataaatgt acatcttcta tcttcaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2934
<210>4
<211>1514
<212>DNA
<213>智人
<400>4
gcccctccct ccgcccgccc gccggcccgc ccgtcagtct ggcaggcagg caggcaatcg 60
gtccgagtgg ctgtcggctc ttcagctctc ccgctcggcg tcttccttcc tcctcccggt 120
cagcgtcggc ggctgcaccg gcggcggcgc agtccctgcg ggaggggcga caagagctga 180
gcggcggccg ccgagcgtcg agctcagcgc ggcggaggcg gcggcggccc ggcagccaac 240
atggcggcgg cggcggcggc gggcgcgggc ccggagatgg tccgcgggca ggtgttcgac 300
gtggggccgc gctacaccaa cctctcgtac atcggcgagg gcgcctacgg catggtgtgc 360
tctgcttatg ataatgtcaa caaagttcga gtagctatca agaaaatcag cccctttgag 420
caccagacct actgccagag aaccctgagg gagataaaaa tcttactgcg cttcagacat 480
gagaacatca ttggaatcaa tgacattatt cgagcaccaa ccatcgagca aatgaaagat 540
gtatatatag tacaggacct catggaaaca gatctttaca agctcttgaa gacacaacac 600
ctcagcaatg accatatctg ctattttctc taccagatcc tcagagggtt aaaatatatc 660
cattcagcta acgttctgca ccgtgacctc aagccttcca acctgctgct caacaccacc 720
tgtgatctca agatctgtga ctttggcctg gcccgtgttg cagatccaga ccatgatcac 780
acagggttcc tgacagaata tgtggccaca cgttggtaca gggctccaga aattatgttg 840
aattccaagg gctacaccaa gtccattgat atttggtctg taggctgcat tctggcagaa 900
atgctttcta acaggcccat ctttccaggg aagcattatc ttgaccagct gaaccacatt 960
ttgggtattc ttggatcccc atcacaagaa gacctgaatt gtataataaa tttaaaagct1020
aggaactatt tgctttctct tccacacaaa aataaggtgc catggaacag gctgttccca1080
aatgctgact ccaaagctct ggacttattg gacaaaatgt tgacattcaa cccacacaag1140
aggattgaag tagaacaggc tctggcccac ccatatctgg agcagtatta cgacccgagt1200
gacgagccca tcgccgaagc accattcaag ttcgacatgg aattggatga cttgcctaag1260
gaaaagctca aagaactaat ttttgaagag actgctagat tccagccagg atacagatct1320
taaatttgtc aggtacctgg agtttaatac agtgagctct agcaagggag gcgctgcctt1380
ttgtttctag aatattatgt tcctcaaggt ccattatttt gtattctttt ccaagctcct1440
tattggaagg tattttttta aatttagaat taaaaattat ttagaaaaaa aaaaaaaaaa1500
aaaaaaaaaa aaaa 1514
<210>5
<211>1866
<212>DNA
<213>智人
<400>5
cgttcctcgg cgccgccggg gccccagagg gcagcggcag caacagcagc agcagcagca 60
gcgggagtgg agatggcggc ggcggcggct caggggggcg ggggcgggga gccccgtaga 120
accgaggggg tcggcccggg ggtcccgggg gaggtggaga tggtgaaggg gcagccgttc 180
gacgtgggcc cgcgctacac gcagttgcag tacatcggcg agggcgcgta cggcatggtc 240
agctcggcct atgaccacgt gcgcaagact cgcgtggcca tcaagaagat cagccccttc 300
gaacatcaga cctactgcca gcgcacgctc cgggagatcc agatcctgct gcgcttccgc 360
catgagaatg tcatcggcat ccgagacatt ctgcgggcgt ccaccctgga agccatgaga 420
gatgtctaca ttgtgcagga cctgatggag actgacctgt acaagttgct gaaaagccag 480
cagctgagca atgaccatat ctgctacttc ctctaccaga tcctgcgggg cctcaagtac 540
atccactccg ccaacgtgct ccaccgagat ctaaagccct ccaacctgct cagcaacacc 600
acctgcgacc ttaagatttg tgatttcggc ctggcccgga ttgccgatcc tgagcatgac 660
cacaccggct tcctgacgga gtatgtggct acgcgctggt accgggcccc agagatcatg 720
ctgaactcca agggctatac caagtccatc gacatctggt ctgtgggctg cattctggct 780
gagatgctct ctaaccggcc catcttccct ggcaagcact acctggatca gctcaaccac 840
attctgggca tcctgggctc cccatcccag gaggacctga attgtatcat caacatgaag 900
gcccgaaact acctacagtc tctgccctcc aagaccaagg tggcttgggc caagcttttc 960
cccaagtcag actccaaagc ccttgacctg ctggaccgga tgttaacctt taaccccaat1020
aaacggatca cagtggagga agcgctggct cacccctacc tggagcagta ctatgacccg1080
acggatgagc cagtggccga ggagcccttc accttcgcca tggagctgga tgacctacct1140
aaggagcggc tgaaggagct catcttccag gagacagcac gcttccagcc cggagtgctg1200
gaggccccct agcccagaca gacatctctg caccctgggg cctggacctg cctcctgcct1260
gcccctctcc cgccagactg ttagaaaatg gacactgtgc ccagcccgga ccttggcagc1320
ccaggccggg gtggagcatg ggcctggcca cctctctcct ttgctgaggc ctccagcttc1380
aggcaggcca aggccttctc ctccccaccc gccctcccca cggggcctcg ggagctcagg1440
tggccccagt tcaatctccc gctgctgctg ctgctgcgcc cttaccttcc ccagcgtccc1500
agtctctggc agttctggaa tggaagggtt ctggctgccc caacctgctg aagggcagag1560
gtggagggtg gggggcgctg agtagggact cagggccatg cctgcccccc tcatctcatt1620
caaaccccac cctagtttcc ctgaaggaac attccttagt ctcaagggct agcatccctg1680
aggagccagg ccgggccgaa tcccctccct gtcaaagctg tcacttcgcg tgccctcgct1740
gcttctgtgt gtggtgagca gaagtggagc tggggggcgt ggagagcccg gcgcccctgc1800
cacctccctg acccgtctaa tatataaata tagagatgtg tctatggctg aaaaaaaaaa1860
aaaaaa 1866
<210>6
<211>480
<212>PRT
<213>智人
<400>6
Met Ser Asp Val Ala Ile Val Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly
1 5 10 15
Glu Tyr Ile Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Asn Asp
20 25 30
Gly Thr Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Gln Asp Val Asp Gln Arg
35 40 45
Glu Ala Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Gln Cys Gln Leu Met Lys
50 55 60
Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp
65 70 75 80
Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Glu Thr Pro Glu Glu Arg
85 90 95
Glu Glu Trp Thr Thr Ala Ile Gln Thr Val Ala Asp Gly Leu Lys Lys
100 105 110
Gln Glu Glu Glu Glu Met Asp Phe Arg Ser Gly Ser Pro Ser Asp Asn
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Glu Met Glu Val Ser Leu Ala Lys Pro Lys His Arg
130 135 140
Val Thr Met Asn Glu Phe Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr
145 150 155 160
Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr
165 170 175
Ala Met Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Val Ala Lys Asp Glu Val
180 185 190
Ala His Thr Leu Thr Glu Asn Arg Val Leu Gln Asn Ser Arg His Pro
195 200 205
Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr His Asp Arg Leu Cys
210 215 220
Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser
225 230 235 240
Arg Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala Glu
245 250 255
Ile Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys Asn Val Val Tyr
260 265 270
Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile
275 280 285
Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Lys Asp Gly Ala
290 295 300
Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val
305 310 315 320
Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly
325 330 335
Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln
340 345 350
Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg Phe
355 360 365
Pro Arg Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu
370 375 380
Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Asp Ala Lys
385 390 395 400
Glu Ile Met Gln His Arg Phe Phe Ala Gly Ile Val Trp Gln His Val
405 410 415
Tyr Glu Lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu
420 425 430
Thr Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Met Ile Thr
435 440 445
Ile Thr Pro Pro Asp Gln Asp Asp Ser Met Glu Cys Val Asp Ser Glu
450 455 460
Arg Arg Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Thr Ala
465 470 475 480
<210>7
<211>481
<212>PRT
<213>智人
<400>7
Met Asn Glu Val Ser Val Ile Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly
1 5 10 15
Glu Tyr Ile Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Ser Asp
20 25 30
Gly Ser Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Glu Ala Pro Asp Gln Thr
35 40 45
Leu Pro Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Glu Cys Gln Leu Met Lys
50 55 60
Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe Val Ile Arg Cys Leu Gln Trp
65 70 75 80
Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Asp Ser Pro Asp Glu Arg
85 90 95
Glu Glu Trp Met Arg Ala Ile Gln Met Val Ala Asn Ser Leu Lys Gln
100 105 110
Arg Ala Pro Gly Glu Asp Pro Met Asp Tyr Lys Cys Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Asp Ser Ser Thr Thr Glu Glu Met Glu Val Ala Val Ser Lys Ala Arg
130 135 140
Ala Lys Val Thr Met Asn Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys
145 150 155 160
Gly Thr Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Arg Glu Lys Ala Thr Gly Arg
165 170 175
Tyr Tyr Ala Met Lys Ile Leu Arg Lys Glu Val Ile Ile Ala Lys Asp
180 185 190
Glu Val Ala His Thr Val Thr Glu Ser Arg Val Leu Gln Asn Thr Arg
195 200 205
His Pro Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ala Phe Gln Thr His Asp Arg
210 215 220
Leu Cys Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His
225 230 235 240
Leu Ser Arg Glu Arg Val Phe Thr Glu Glu Arg Ala Arg Phe Tyr Gly
245 250 255
Ala Glu Ile Val Ser Ala Leu Glu Tyr Leu His Ser Arg Asp Val Val
260 265 270
Tyr Arg Asp Ile Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His
275 280 285
Ile Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Ser Asp Gly
290 295 300
Ala Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu
305 310 315 320
Val Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu
325 330 335
Gly Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn
340 345 350
Gln Asp His Glu Arg Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg
355 360 365
Phe Pro Arg Thr Leu Ser Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ala Gly Leu
370 375 380
Leu Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Pro Ser Asp Ala
385 390 395 400
Lys Glu Val Met Glu His Arg Phe Phe Leu Ser Ile Asn Trp Gln Asp
405 410 415
Val Val Gln Lys Lys Leu Leu Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser
420 425 430
Glu Val Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Asp Glu Phe Thr Ala Gln Ser Ile
435 440 445
Thr Ile Thr Pro Pro Asp Arg Tyr Asp Ser Leu Gly Leu Leu Glu Leu
450 455 460
Asp Gln Arg Thr His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Ile Arg
465 470 475 480
Glu
<210>8
<211>479
<212>PRT
<213>智人
<400>8
Met Ser Asp Val Thr Ile Val Lys Glu Gly Trp Val Gln Lys Arg Gly
1 5 10 15
Glu Tyr Ile Lys Asn Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Thr Asp
20 25 30
Gly Ser Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Lys Pro Gln Asp Val Asp Leu Pro
35 40 45
Tyr Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Lys Cys Gln Leu Met Lys Thr
50 55 60
Glu Arg Pro Lys Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp Thr
65 70 75 80
Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Asp Thr Pro Glu Glu Arg Glu
85 90 95
Glu Trp Thr Glu Ala Ile Gln Ala Val Ala Asp Arg Leu Gln Arg Gln
100 105 110
Glu Glu Glu Arg Met Asn Cys Ser Pro Thr Ser Gln Ile Asp Asn Ile
115 120 125
Gly Glu Glu Glu Met Asp Ala Ser Thr Thr His His Lys Arg Lys Thr
130 135 140
Met Asn Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe Gly
145 150 155 160
Lys Val Ile Leu Val Arg Glu Lys Ala Ser Gly Lys Tyr Tyr Ala Met
165 170 175
Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Ile Ala Lys Asp Glu Val Ala His
180 185 190
Thr Leu Thr Glu Ser Arg Val Leu Lys Asn Thr Arg His Pro Phe Leu
195 200 205
Thr Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr Lys Asp Arg Leu Cys Phe Val
210 215 220
Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Glu LeuPhe Phe His Leu Ser Arg Glu
225 230 235 240
Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Thr Arg Phe Tyr Gly Ala Glu Ile Val
245 250 255
Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Gly Lys Ile Val Tyr Arg Asp Leu
260 265 270
Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile Lys Ile Thr
275 280 285
Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Thr Asp Ala Ala Thr Met Lys
290 295 300
Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val Leu Glu Asp
305 310 315 320
Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly Val Val Met
325 330 335
Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln Asp His Glu
340 345 350
Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Asp Ile Lys Phe Pro Arg Thr
355 360 365
Leu Ser Ser Asp Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu Ile Lys Asp
370 375 380
Pro Asn Lys Arg Leu Gly Gly Gly Pro Asp Asp Ala Lys Glu Ile Met
385 390 395 400
Arg His Ser Phe Phe Ser Gly Val Asn Trp Gln Asp Val Tyr Asp Lys
405 410 415
Lys Leu Val Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu Thr Asp Thr
420 425 430
Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Thr Ile Thr Ile Thr Pro
435 440 445
Pro Glu Lys Tyr Asp Glu Asp Gly Met Asp Cys Met Asp Asn Glu Arg
450 455 460
Arg Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Arg Glu
465 470 47權(quán)利要求
1.一種確定包含人肺癌細(xì)胞的生物樣品是否對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑和化學(xué)治療劑的組合敏感的方法，所述方法包括
測(cè)定磷酸化AKT蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白在所述生物樣品中的過(guò)量表達(dá)，
由此所述磷酸化AKT蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的過(guò)量表達(dá)是所述包含人肺癌細(xì)胞的生物樣品對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑和化學(xué)治療劑的組合敏感的指示。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述磷酸化AKT蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白在所述生物樣品中的過(guò)量表達(dá)通過(guò)下列步驟測(cè)定
a)測(cè)定所述生物樣品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平，
b)測(cè)定在包含對(duì)表皮生長(zhǎng)因子抑制劑和化學(xué)治療劑的組合不敏感的人肺癌細(xì)胞的生物樣品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平，
c)測(cè)定在步驟a)和b)中測(cè)定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異，由此確定磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的過(guò)量表達(dá)。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中步驟a)和b)中測(cè)定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異為至少10％。
4.按照權(quán)利要求2-3中任一項(xiàng)的方法，其中步驟a)和b)中測(cè)定的磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平的差異為至少25％。
5.按照權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物樣品是原發(fā)性肺腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤。
6.按照權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中EGFR抑制劑是erlotinib或N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺。
7.按照權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述化學(xué)治療劑是吉西他濱或順鉑。
8.按照權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述磷酸化的Akt蛋白或磷酸化的MAPK蛋白的過(guò)量表達(dá)是使用特異性結(jié)合磷酸化蛋白的試劑測(cè)定的。
9.權(quán)利要求8的方法，其中抗體、抗體衍生物或抗體片段特異性地結(jié)合所述磷酸化的AKT蛋白或磷酸化的MAPK蛋白。
10.按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述磷酸化的AKT蛋白是在與Akt1蛋白氨基酸位置473對(duì)應(yīng)的氨基酸位置被磷酸化，或者所述MAPK蛋白在與MAPK1氨基酸位置202和204對(duì)應(yīng)的氨基酸位置被磷酸化。
11.按照權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法，其中MAPK蛋白的氨基酸序列為氨基酸序列SEQ ID NO1或2，AKT蛋白的氨基酸序列是氨基酸序列SEQ ID NO6，7或8。
12.按照權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法，其中表達(dá)水平是應(yīng)用選自由下列各項(xiàng)組成的組的方法進(jìn)行測(cè)定蛋白質(zhì)組學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。
13.按照權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的過(guò)量表達(dá)通過(guò)下列步驟測(cè)定
a)將所述生物樣品進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，
b)在肉眼觀察生物樣品中細(xì)胞的染色后，對(duì)于所述磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平，指定一個(gè)選自數(shù)字1，2，3和4的等級(jí)，由此指定關(guān)于表達(dá)水平的最高可檢測(cè)等級(jí)，
c)確定在免疫組織化學(xué)染色的生物樣品中具有最高可檢測(cè)等級(jí)的細(xì)胞的百分比，
d)將在免疫組織化學(xué)染色的生物樣品中具有最高可檢測(cè)等級(jí)的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)乘以指定的等級(jí)并且乘以100，和
e)當(dāng)步驟d)的乘法結(jié)果高于100時(shí)，確定所述生物樣品中磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白過(guò)量表達(dá)。
14.結(jié)合磷酸化AKT蛋白的抗體或結(jié)合磷酸化MAPK蛋白的抗體的應(yīng)用，其用于確定包含人肺癌細(xì)胞的生物樣品是否對(duì)表皮生長(zhǎng)因子抑制劑和化學(xué)治療劑的組合敏感。
15.一種選擇抑制患者的肺癌發(fā)展的組合物的方法，所述方法包括
a)在多種測(cè)試組合物的存在下，將來(lái)自患者的包括對(duì)EGFR抑制劑和化學(xué)治療劑的組合敏感的肺癌細(xì)胞的生物樣品的等分試樣分別暴露；
b)將與所述測(cè)試組合物接觸的生物樣品的等分試樣中磷酸化的Akt蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平與在不接觸所述測(cè)試組合物的生物樣品的等分試樣中磷酸化的Akt蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白的表達(dá)水平相比較，
c)選擇相對(duì)于沒(méi)有接觸所述測(cè)試組合物的等分試樣在包含所述測(cè)試組合物的等分試樣中改變了磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平的測(cè)試組合物之一，其中在與所述測(cè)試組合物接觸的生物樣品的等分試樣中的磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平與在沒(méi)有接觸所述測(cè)試組合物的生物樣品的等分試樣中的磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平之間至少10％的差異是選擇所述測(cè)試組合物的指示。
16.一種獲得候選藥劑的方法，所述方法包括
a)將包含對(duì)EGFR抑制劑和化學(xué)治療劑敏感的肺癌細(xì)胞的生物樣品的等分試樣與候選藥劑接觸，
b)測(cè)定與所述候選藥劑接觸的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平，并且測(cè)定在沒(méi)有接觸所述候選藥劑的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平，
c)通過(guò)將與所述候選藥劑接觸的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平與在沒(méi)有接觸所述候選藥劑的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行比較，而觀察所述候選藥劑的效果，
d)從所述觀察到的效果獲得所述藥劑，其中在與所述候選藥劑接觸的生物樣品的等分試樣中磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平與在沒(méi)有接觸所述候選藥劑的生物樣品的等分試樣中的磷酸化Akt蛋白和/或磷酸化MAPK蛋白的表達(dá)水平之間至少10％的差異是所述候選藥劑效果的指示。
17.按照權(quán)利要求16的方法，其中所述候選藥劑是候選抑制劑。
18.按照權(quán)利要求16的方法，其中所述候選藥劑是候選增強(qiáng)劑。
19.一種候選藥劑，其是通過(guò)按照權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)的方法獲得的。
20.一種藥物制劑，其包含按照權(quán)利要求19的藥劑。
21.按照權(quán)利要求19的藥劑用于制備抑制肺癌發(fā)展的組合物的應(yīng)用。
22.一種生產(chǎn)藥物的方法，其包括權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)的方法的步驟；和
i)以足以對(duì)受試者提供治療有效量的所述藥物的量合成在步驟
(c)中鑒定的候選藥劑或其類(lèi)似物或衍生物；和/或
ii)將步驟(c)中鑒定的候選藥物候選藥劑或其類(lèi)似物或衍生物與藥用載體組合。
23.Akt蛋白、MAPK蛋白、磷酸化的Akt蛋白、磷酸化的MAPK蛋白、與磷酸化的Akt蛋白或磷酸化的MAPK蛋白選擇性結(jié)合的抗體的應(yīng)用，其用于獲得候選藥劑或者用于選擇抑制患者中肺癌的發(fā)展的組合物。
24.一種試劑盒，其包括針對(duì)磷酸化的MAPK和/或磷酸化的Akt蛋白的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測(cè)定包含人肺癌細(xì)胞的生物樣品是否對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑和化學(xué)治療劑的組合敏感的方法，所述方法通過(guò)測(cè)定磷酸化的AKT蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白在生物樣品中的過(guò)量表達(dá)而進(jìn)行。本發(fā)明還涉及用于獲得候選藥劑或者用于選擇抑制患者肺癌發(fā)展的組合物的方法，其中應(yīng)用磷酸化的Akt蛋白和/或磷酸化的MAPK蛋白。
文檔編號(hào)G01N33/574GK101166979SQ200680014065
公開(kāi)日2008年4月23日 申請(qǐng)日期2006年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月11日
發(fā)明者烏爾里克·布倫沙伊特, 阿斯特麗德·黑勒, 韋雷娜·盧策, 約阿希姆·默克斯, 卡羅爾·沃德 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司