專利名稱：使用細(xì)胞葉酸維生素受體定量法而用于癌癥預(yù)后的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過定量確定維生素受體在癌細(xì)^^中表達(dá)的水平來用 于獲得癌癥預(yù)后的方法和試劑盒，并涉及指導(dǎo)控制或研制用于癌癥的有 效療法。本發(fā)明還涉及用于測定癌細(xì)月包上維生素受體存在的方法和試劑 盒，以篩選應(yīng)當(dāng)通過利用維生素受體靶向術(shù)的療法進(jìn)行治療的患者。
背景和概要
癌癥的有效治療方案常常取決于獲得可靠預(yù)測癌癥的能力，因此可 研制適于患者的最有效治療方案。臨床上重要的優(yōu)先順序在于提高預(yù)測 癌癥的能力和研制基于分子的治療法，以改進(jìn)對患者的管理和治療。在 確定最適治療方案中，關(guān)鍵在于對確診患有癌癥的患者屬于預(yù)測組進(jìn)行 確定，因此這決定了患者的存活率。
例如在北美洲中，乳腺癌是最常見的確診危急生命的惡性腫瘤。在 美國，乳腺癌是30-50歲女性死亡的主要原因，并且美國每年有出現(xiàn)超 過200,000個新病例。盡管還在使用胂瘤分級(Tumor grade)、核分級 (nuclear grade)、組織類型、DNA倍數(shù)性以及激素受體狀態(tài)，但腫瘤大 小和淋巴節(jié)狀況(nodal status)仍然是預(yù)測結(jié)果的最可靠方法。僅僅已經(jīng) 鑒定了幾種乳腺癌的腫瘤標(biāo)記物，并且那些標(biāo)記中的多數(shù)不足以可靠來 用于預(yù)測分析中。因此，迫切需要適于乳腺癌和其它癌癥的更好的預(yù)測 分析法。
此外，篩選應(yīng)當(dāng)通過特殊療法進(jìn)行治療的患者，可取決于檢測腫瘤 表面上的胂瘤標(biāo)記物的存在的能力，因此可測定靶向肺瘤標(biāo)記物的療法 是否是保險的。例如，在約25%的乳腺癌癥患者中發(fā)生人表皮生長因子 受體2(HER2)的過表達(dá)。已經(jīng)研制了針對HER2蛋白的單克隆抗體 Herceptin (Genentech,Inc.,San Fmncisco,CA)， 以4乍為乳&泉癌療法。然
而，并不將Herceptin⑧施用于乳腺癌癥患者，直到確定了乳腺癌癥患者 的HER2狀態(tài)為止。如果乳腺癌癥患者是HER2陽性，那么許可進(jìn)行 Herceptin⑧治療。
維生素受體在癌細(xì)胞中是過表達(dá)的。例如，高親合性葉酸受體被鑒 定為胎盤和滋養(yǎng)層細(xì)胞中的抗原所決定的單克隆抗體的膜相關(guān)糖蛋 白。高親合性葉酸受體在最普通細(xì)胞中是很少表達(dá)的，或是無法檢測 的。然而，它在上皮細(xì)胞源的癌中是過表達(dá)的或優(yōu)先表達(dá)的，也許這提 供了適于這些惡性細(xì)胞的生長優(yōu)勢。在〉90%的卵巢癌中，可檢測到葉 酸受體的高水平表達(dá)，但在子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、腎癌、肺癌、腦癌、 子宮癌、胰腺癌、膀胱癌、睪丸癌和結(jié)腸直腸癌、淋巴瘤及其它頭頸癌 中，檢測到葉酸受體表達(dá)的較低陽性度。
例如，根據(jù)所用的技術(shù)和所分析的組織，通過研究葉酸受體在乳腺 癌中的表達(dá)，已經(jīng)獲得了不同的結(jié)果。Ross等人測量了葉酸受體 mRNA,發(fā)現(xiàn)與正常乳房樣本相比，5種癌中的葉酸受體的mRNA水平 提高。然而，提高程度比在卵巢癌中所觀察到的水平低了約十倍(Ross 等,Cancer73:2432-2443(1994))。 Garin-Chesa等人使用小鼠單克隆抗體 LK26，以評價葉酸受體在各種新凍癌中的表達(dá)。研究了其中53個乳腺 癌，兩個顯示同質(zhì)的LK26染色，另九個癌顯示脂肪染色(Garm- Chesa 等，Am.J.Pathol.142(2)557-67(1993))。
申請人已經(jīng)研究了維生素受體在癌細(xì)胞中的過表達(dá)的用途，以分析 用于獲得癌癥的預(yù)測法和用于指導(dǎo)控制或研制適于患者的有效療法。該 方法利用確定維生素受體在癌細(xì)胞中的過表達(dá)量。申請人還研究了確定 癌細(xì)胞中維生素受體存在的方法的用途，以篩選應(yīng)當(dāng)通過利用維生素受 體靶向術(shù)的療法進(jìn)行治療的患者。
在本發(fā)明的一個例證性實(shí)施方案中，通過定量測定維生素受體在癌 細(xì)胞中的表達(dá)，提供了確定癌癥預(yù)后的方法。該方法的步驟包括定量測 定維生素受體在癌細(xì)胞中的表達(dá)，和確定癌癥預(yù)后。在另一個例i正性實(shí) 施方案中，維生素受體是葉酸受體。在另一個實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是乳 腺癌細(xì)胞，或者癌細(xì)胞選自卵巢癌細(xì)胞、子宮癌細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、 結(jié)腸直腸癌細(xì)胞、腦癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞以及肺癌細(xì)胞。在 癌細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞的實(shí)施方案中，乳腺癌包括淋巴結(jié)(node)陰性疾 病，但本發(fā)明不限于淋巴結(jié)陰性疾病。該方法的步-豫還包括確定適于癌的治療方案。
在另一個例證性實(shí)施方案中，定量測定的步驟包括使用抗體，進(jìn)行 免疫組化染色。在該實(shí)施方案中，抗體是多克隆抗體或其混合物，或者 是單克隆抗體或其混合物，或者是多克隆抗體和單克隆抗體的組合?？?替代的或另外的，定量測定的步驟包括使用應(yīng)用了放射性標(biāo)記配體的放 射受體分析，進(jìn)行原位雜交或受體定量。
在本發(fā)明的另 一 個例證性實(shí)施方案中，提供了確定癌癥預(yù)后的免疫 組化方法。該方法的步驟包括將癌細(xì)胞接觸耙向維生素受體的抗體、定 量測定維生素受體在癌細(xì)胞中的表達(dá)，和確定癌癥預(yù)后。在一個例證性 實(shí)施方案中，維生素受體是葉酸受體。在另一個實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是 乳腺癌細(xì)胞。在該實(shí)施方案中，乳腺癌是淋巴結(jié)陰性疾病，但本發(fā)明不' 限于淋巴結(jié)陰性疾病。在另一個實(shí)施方案中，癌細(xì)胞選自卵巢癌細(xì)胞、 子宮癌細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞、腦癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、 黑素瘤細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞以及肺癌細(xì)胞。
在其它例證性實(shí)施方案中，抗體是多克隆抗體或其混合物，或者是 單克隆抗體或其混合物，或者是多克隆抗體和單克隆抗體的組合。
在另一個實(shí)施方案中，提供了確定適于所篩選的癌癥患者的治療方 案的方法，以通過利用維生素受體靶向的療法而進(jìn)行治療。該方法的步 驟包括將來自患者的癌細(xì)胞接觸靶向維生素受體的抗體、定量測定維生 素受體在癌細(xì)胞中的表達(dá)，和確定適于癌癥患者的治療方案。
在本發(fā)明的另 一個例證性實(shí)施方案中，提供了用于確定癌的預(yù)測法 的原位雜交法。該方法的步驟包括將癌細(xì)胞接觸核酸探針、定量測定維 生素受體在癌細(xì)胞中的表達(dá)、以及確定癌癥預(yù)后，其中核酸〗笨針雜交編 碼維生素受體的核酸或雜交與維生素受體的編碼核酸互補(bǔ)的核酸。
在一個例證性實(shí)施方案中，維生素受體是葉酸受體。在另一個實(shí)施 方案中，癌細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞。在該實(shí)施方案中，乳腺癌包括淋巴結(jié)陰 性疾病，但本發(fā)明不限于淋巴結(jié)陰性疾病。在另一實(shí)施方案中，癌細(xì)胞 選自卯巢癌細(xì)胞、子宮癌細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞、腦 癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、'淋巴瘤細(xì)胞以及 肺癌細(xì)月包。
在本發(fā)明的另 一 個例證性實(shí)施方案中，提供了確定癌癥預(yù)后的方 法。該方法的步驟包括將癌細(xì)胞接觸結(jié)合配體的放射性標(biāo)記維生素受體 或其類似物、定量測定維生素受體在癌細(xì)胞中的數(shù)量，和確定癌癥預(yù) 后。
在一個例證性實(shí)施方案中，維生素受體是葉酸受體。在另一個例證 性實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞。在該實(shí)施方案中，乳腺癌包括淋巴結(jié)陰性疾病，但本發(fā)明不限于淋巴結(jié)陰性疾病。在另一實(shí)施方案中， 癌細(xì)胞選自卵巢癌細(xì)胞、子宮癌細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞、腦癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞以及肺癌細(xì)胞。在另一個例證性實(shí)施方案中，放射性標(biāo)記配體是放射性標(biāo)記葉酸或其類似物。
在本發(fā)明的另一個例證性實(shí)施方案中，提供用于實(shí)施免疫組化染色 分析的試劑盒。試劑盒包括校準(zhǔn)顯微照片，其中校準(zhǔn)顯微照片來自用維生素受體抗體染色過的癌組織。在一個例證性實(shí)施方案中，試劑盒還包 括維生素受體的抗體。在另一個實(shí)施方案中，試劑盒還包括用于免疫組化染色的試劑。在另一個實(shí)施方案中；試劑盒包括用于校準(zhǔn)顯微照片和用于實(shí)施免疫組化染色分析的說明書。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供用于實(shí)施原位雜交熒光分析的試 劑盒。在該例證性實(shí)施方案中，試劑盒包含校準(zhǔn)顯微照片，其中校準(zhǔn)顯微照片來自癌組織，而癌組織的核酸已經(jīng)與熒光標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行原 位雜交。核酸探針雜交編碼維生素受體的核酸，或者探針雜交互補(bǔ)于維 生素受體的編碼核酸的核酸。在另一個實(shí)施方案中，試劑盒還包含熒光標(biāo)記的核酸探針。在另一個實(shí)施方案中，試劑盒包含用于原位雜交的試劑。在另一個實(shí)施方案中，試劑盒包含用于校準(zhǔn)顯微照片和用于實(shí)施熒光原位雜交分析的說明書。
在另一個例證性實(shí)施方案中，提供用于實(shí)施維生素受體結(jié)合分析的 試劑盒。在該例證性實(shí)施方案中，試劑盒包含可確定癌細(xì)胞上的維生素受體數(shù)量范圍的校準(zhǔn)表，其中該范圍與癌的有效結(jié)果對比無效結(jié)果有關(guān)。在另一個例證性實(shí)施方案中，試劑盒還包含放射性標(biāo)記的維生素受 體結(jié)合配體，或其類似物。在另一個例證性實(shí)施方案中，試劑盒還包含用于實(shí)施維生素受體結(jié)合分析的試劑。在另一個例證性實(shí)施方案中，試劑盒還包含用于實(shí)施維生素受體結(jié)合分析的說明書。
附圖簡述


圖1顯示在包含細(xì)粒狀弱斑點(diǎn)的乳腺癌細(xì)胞中，葉酸受體的強(qiáng)度1 + 免疫組化斑點(diǎn)。
圖2顯示在包含粗粒狀斑點(diǎn)的乳腺癌細(xì)胞中，葉酸受體的強(qiáng)度2+免疫組化斑點(diǎn)。
圖3顯示在包含濃密度粗粒狀的乳腺癌細(xì)胞中，葉酸受體的強(qiáng)度3+ 免疫組化斑點(diǎn)。
圖4顯示疾病復(fù)發(fā)對比葉酸受體染色平均強(qiáng)度的實(shí)例。
圖5顯示用葉酸受體a的單克隆抗體(mAb 343;組A和組B )來 免疫組化染色胰腺癌的實(shí)例。組A和組B顯示柱細(xì)胞(空箭頭)的頂端 表面的膜染色，組B顯示柱細(xì)胞(實(shí)箭頭)的粒狀細(xì)胞質(zhì)染色。組C顯 示通過非免疫的mlgGl進(jìn)行切片溫育。
圖6顯示用葉酸受體cc的單克隆抗體(mAb 343; A組和B組)來 免疫組化染色子宮內(nèi)膜(endometnod)癌的實(shí)例。組A和組B顯示在腺狀 上皮細(xì)胞中的明顯的細(xì)胞質(zhì)和頂膜染色(空箭頭)。未染色表示腺體(組 B中的實(shí)箭頭)之間的基質(zhì)。組C顯示通過非免疫的mlgGl進(jìn)行切片溫 育。
圖7顯示用葉酸受體oc的單克隆抗體(mAb 343;組A和組B )來 免疫組化染色子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的實(shí)例。顯示了鱗狀細(xì)胞的集中細(xì)胞質(zhì) 染色(組B中的空箭頭)。組C顯示通過非免疫的mlgG!進(jìn)行切片溫育。
詳細(xì)i兌明
通過定量測定維生素受體在癌細(xì)胞中的表達(dá)和通過指導(dǎo)控制或研 究用于癌癥的有效療法，提供用于預(yù)測癌癥的方法和試劑盒。還提供用 于確定維生素受體在癌細(xì)胞中存在(即檢測維生素受體)的方法和試劑 盒，以篩選應(yīng)當(dāng)通過利用維生素受體靶向術(shù)的療法進(jìn)行治療的患者。在 例證性實(shí)施方案中，維生素受體是葉酸受體，癌細(xì)胞選自卵巢癌細(xì)胞、 子宮癌細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞、腦癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、 黑素瘤細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、'淋巴瘤細(xì)胞以及肺癌細(xì)胞?？赏ㄟ^外 科手術(shù)從患者切除該方法中所用的癌組織。在癌細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞的實(shí) 施方案中，乳腺癌包括淋巴結(jié)陰性疾病，但本發(fā)明不限于淋巴結(jié)陰性疾 病。該方法可在原發(fā)性惡性物質(zhì)上進(jìn)行實(shí)施，并具有用于新陳代謝疾病 的預(yù)測價值。
在其它例證性實(shí)施方案中，通過使用例如免疫組化染色法、熒光原位雜交法、Southern印跡法、斑點(diǎn)印跡雜交、利用了》欠射性標(biāo)記配體的 放射受體分析法等等的方法，確定維生素受體的表達(dá)量。在使用了免疫 組化染色法的實(shí)施方案中，所用的抗體是多克隆抗體或其混合物，或者 是單克隆抗體或其混合物，或者是多克隆抗體和單克隆抗體的組合。
還在其它的例證性實(shí)施方案中，提供了使用任何上述特征的免疫組 化染色法或原位雜交法或利用了放射性標(biāo)記配體的放射受體分析。
在本發(fā)明的另 一 個例證性實(shí)施方案中，提供用于實(shí)施免疫組化染色 分析的試劑盒。試劑盒包含校準(zhǔn)顯微照片，其中校準(zhǔn)顯微照片來自用維 生素受體抗體染色過的癌組織。在一個例證性實(shí)施方案中，試劑盒還包 含維生素受體的抗體。在另一個實(shí)施方案中，試劑盒還包含用于免疫組 化染色的試劑。在另一個實(shí)施方案中；試劑盒包含用于校準(zhǔn)顯微照片和 /或用于實(shí)施免疫組化染色分析的說明書。
還在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，提供用于實(shí)施熒光原位雜交的試 劑盒。在該例證性實(shí)施方案中，試劑盒包含校準(zhǔn)顯微照片，其中校準(zhǔn)顯 微照片來自癌組織，而癌組織的核酸已經(jīng)與熒光標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行原 位雜交。核酸探針雜交編碼維生素受體的核酸，或者探針雜交互補(bǔ)于維 生素受體的編碼核酸的核酸。在另一個實(shí)施方案中，試劑盒還包含熒光 標(biāo)記的核酸探針。在另一個實(shí)施方案中，試劑盒包含用于原位雜交的試 劑。在另一個實(shí)施方案中，試劑盒包含用于校準(zhǔn)顯微照片和/或用于實(shí)施 熒光原位雜交分析的說明書。
1在另一個例證性實(shí)施方案中，提供用于實(shí)施維生素受體結(jié)合分析的 試劑盒。在該例證性實(shí)施方案中，試劑盒包含可確定癌細(xì)胞上的維生素 受體數(shù)量范圍的校準(zhǔn)表，其中該范圍與癌的有效結(jié)果對比無效結(jié)果有 關(guān)。在另一個例證性實(shí)施方案中，試劑盒還包含放射性標(biāo)記的維生素受 體結(jié)合配體，或其類似物。在另一個例證性實(shí)施方案中，試劑盒還包含 用于實(shí)施維生素受體結(jié)合分析的試劑。在另一個例證性實(shí)施方案中，試 劑盒還包含用于校準(zhǔn)表和/或用于實(shí)施維生素受體結(jié)合分析的說明書。
根據(jù)本發(fā)明，如本文中所用的"定量測定"或"定量"，意味著確 定維生素受體在癌細(xì)胞上的數(shù)量，或意味著確定維生素受體在癌細(xì)胞中 直接或間接表達(dá)的水平。在實(shí)施例5、 8、 9和10中描述了如本文中所 用的"定量測定"或"定量"的含義實(shí)例，其中將免疫組化染色(實(shí)施例5、 8和9)定義為染色強(qiáng)度l + 、 2+或3+。例如，對于熒光原位雜交 (FISH),通過統(tǒng)計胞核中的表示維生素受體基因存在的信號、并將維生 素受體基因的信號量與未進(jìn)行擴(kuò)增的基因的信號量進(jìn)行比較，得到擴(kuò)增 基因的信號與未擴(kuò)增基因的信號(實(shí)施例10)的比值，從而對維生素受 體基因的擴(kuò)增進(jìn)行定量。對于擴(kuò)增HER-2/new基因的定量法，所述的方 法是本領(lǐng)域中已知的。例如，"定量測定"或"定量"還意謂著通過使 用利用了放射性標(biāo)記配體的維生素受體結(jié)合分析(實(shí)施例11),確定癌 細(xì)胞上維生素受體的絕對量。
需要本文所述的"定量"類型，使得醫(yī)生根據(jù)通過維生素受體結(jié)合 分析所測定的免疫組化染色強(qiáng)度或熒光強(qiáng)度或受體數(shù)量，可對患者分 組，例如"有效結(jié)果，，組或"無效結(jié)果"組，這以便醫(yī)生確定適于患者 的最有效的治療方案。高染色強(qiáng)度是與無效結(jié)果相關(guān)(例如2+或3+免 疫組化染色強(qiáng)度或熒光強(qiáng)度)，并且所述的患者應(yīng)當(dāng)接收主動治療方 案。
本發(fā)明的方法和試劑盒可用于人臨床醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)用途?？蓡为?dú)使 用本文所述的方法和試劑盒，或者聯(lián)合其它的預(yù)測方法、或預(yù)測指示物 (例如本文所述的指示物)、或預(yù)測試劑盒、或用于研制適于癌的有效 療法的試劑盒進(jìn)行使用本文所述的方法和試劑盒，或者聯(lián)合用于確定癌 細(xì)胞上維生素受體的存在的方法或試劑盒進(jìn)行使用本文所述的方法和 試劑盒，以篩選應(yīng)當(dāng)通過利用了維生素受體靶向術(shù)的療法進(jìn)行治療的患 者。當(dāng)單獨(dú)使用維生素受體表達(dá)而不使用另 一種預(yù)測指示物以確定預(yù)測 法時，維生素受體表達(dá)被認(rèn)為是獨(dú)立的預(yù)測因子。
癌細(xì)胞是致癌的癌細(xì)胞群體，包括良性胂瘤和惡性腫瘤(如，轉(zhuǎn)移 性)，或癌細(xì)胞是非致癌的。癌細(xì)胞群體可自發(fā)出現(xiàn)的，或通過宿主動體是化學(xué)性、病毒性、i放射性誘導(dǎo)的。本發(fā)明可用于獲;尋適:或檢測癌上的維生素受體的預(yù)測法，癌例如是癌瘤、肉瘤、'淋巴瘤、霍奇金病 (Hodgekin，s disease, HD)、黑素瘤、間皮細(xì)胞瘤、Burkitt淋巴瘤、鼻咽 癌、白血病以及骨髓癌(如，多發(fā)性骨髓瘤)。癌細(xì)胞群體包括但不限 于，腦癌、口腔癌、甲狀腺癌、內(nèi)分泌癌、皮膚癌、胃癌、食道癌、子 宮內(nèi)膜癌、喉癌、其它頭頸癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、膀胱癌、 骨癌、卵巢癌(如血清、子宮內(nèi)膜樣以及粘蛋白樣的)、子宮頸癌、子
宮癌、乳腺癌、睪丸癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、肝癌、以及肺癌(如， 惡性腺瘤和間皮細(xì)胞瘤)，或任何過表達(dá)維生素受體的其它癌。
例如，已知在前述段落中的多數(shù)癌種類是維生素受體陽性的(參見Ross等，Owcer 73: 2432- 2443 (1994); Garin-Chesa等，J附.尸^/2。/. 142(2): 557-67 (1993); Franklin等，/獻(xiàn)，/. Qwce廠 S甲/ /. 8: 89-95 (1994); Li等，./ A^wc A/e^. 37:665-672 (1996); Toffoli, /獻(xiàn)Owcer 74: 193-198 (1997); Veggian, r畫r 75:510-513 (1989); Weitman等， 7 e^^/x'/z 52: 3396-3401;以及Bueno等，./. 7Tzo廠.Ow/. Swk 121: 225-233 (2001))。
作為獲得癌癥預(yù)后的結(jié)果所研制的治療性方案包括，例如，在下列 出版物中所述的維生素受體靶向療法或這些療法的組合美國專利申請
發(fā)明者C·P·利蒙, L·C·哈特曼, P·R·埃利斯, P·S·羅 申請人:普渡研究基金會;恩多塞特公司;梅奧醫(yī)學(xué)教育和研究基金會