專利名稱：激光顯微解剖方法和用于激光顯微解剖的裝置的制作方法
激光顯微解剖方法和用于激光顯微解剖的裝置
本發(fā)明涉及一種激光顯微解剖方法，以該方法借助于激光器的激 光脈沖沿著封閉的切割線從放置在一個(gè)平面載體上的生物樣品上切下 切片。
本發(fā)明還涉及用于激光顯微解剖的裝置，其包含一個(gè)具有至少一 個(gè)定義一個(gè)光軸的物鏡的顯微鏡。此外設(shè)置一個(gè)發(fā)射激光束的脈沖激 光器，該激光束經(jīng)過物鏡沿著光軸指向樣品并且畫出一條封閉的切割 線。
在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)范圍內(nèi)有一種稱為顯微解剖的方法，以該方法用 聚焦激光束從一個(gè)基本上扁平的樣品(例如細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或組織 切片)中切下一小部分，所謂的切片。為了激光切割將生物樣品放置 在一個(gè)平面載體上，例如玻璃載物片或聚合物薄膜。在切割之后切片 提供給進(jìn)一步的生物或醫(yī)學(xué)(例如組織)檢驗(yàn)使用。
在1976年5月Journal of Microscopy第107巻19至24 頁(yè)G. Isenberg、 W.Bilser、 W.meier-Ruge、 E .Remy的文章"Cell surgery by laser micro—dissection: a preparative method"
中描述了這樣一種激光顯微解剖方法。在該文章中生物樣品放置在一 個(gè)載物片的底面。此生物樣品是吸附在一個(gè)載物片上的細(xì)胞培養(yǎng)物。 為了防止細(xì)胞固定黏附在基片上，使用了具有硅樹脂涂層的載物片， 其有助于降低在樣品和載物片之間的附著力。所述載物片放在一臺(tái)直 立的、耦合了一個(gè)脈沖式氦-氖激光器的顯微鏡內(nèi)。激光束聚焦在生物 樣品上。以該聚焦激光束沿著封閉的切割線通過接連排列通過激光脈 沖形成的切割孔切下感興趣的樣品區(qū)域，即切片。在此切割基于已知 的激光切除術(shù)原理，也就是說單獨(dú)的激光脈沖在切割線上產(chǎn)生等離子 體，所述等離子體"蒸發(fā)，，樣品物質(zhì)。在此最后的激光脈沖使切片與 周圍的生物樣品分離并且在此也導(dǎo)致切片在載物片上所要求的松動(dòng)。 然后切片在重力的作用下墜落并接放在一個(gè)收集器皿中并用于進(jìn)一步 的檢驗(yàn)。
DE 100 43 506 CI描述該方法的改進(jìn)方案。其中將需要檢驗(yàn)的、 要從中切下感興趣的樣品區(qū)域的樣品在非常薄的塑料薄膜上制成標(biāo)本。所述塑料薄膜的厚度在1-2fim數(shù)量級(jí)。PET薄膜和PEN薄膜可以
用作材料。樣品放入耦合了脈沖激光器的顯微鏡中。描述一個(gè)激光顯 微解剖方法，在該方法中切割線在切割臨近結(jié)束時(shí)不完全封閉，而是 在末端保留一個(gè)比較狹窄的并且同時(shí)穩(wěn)定的橋。該橋防止薄膜與感興 趣的樣品區(qū)域向聚焦平面外掀開并扭轉(zhuǎn)。在割斷該橋之前借助于一個(gè) 光闌放大激光束的光圏，但不改變顯微鏡的觀察口徑。通過放大激光 的光圈擴(kuò)大激光束的切割寬度。同時(shí)激光束焦點(diǎn)的位置相對(duì)于樣品保 持在同樣的位置不變。然后用加寬的激光光圈以最后的、已聚焦的、 切割激光脈沖割斷剩余的橋。在結(jié)束切割之后樣品在重力作用下墜落 并收集在一個(gè)收集器皿中?？墒强傮w來說，在最后的激光脈沖之前停 止切割線并且在最后的激光脈沖結(jié)束切割線之前，轉(zhuǎn)換用于激光光圈 的光闌，被證明是儀器技術(shù)上復(fù)雜的并且是費(fèi)時(shí)的。由應(yīng)用者確定一 個(gè)適當(dāng)?shù)氖Ｓ鄻虿⑶抑付ㄒ粋€(gè)合適的激光光圈也是不完全簡(jiǎn)單的，因 此有時(shí)切片不能完整地獨(dú)立制成標(biāo)本并且必須重復(fù)切割。
此外在這兩種方法中都觀察到，在不改變?cè)O(shè)備設(shè)置(光學(xué)鏡組、 激光器參數(shù)、聚焦位置等)的情況下相繼切割的切片在落入收集裝置 時(shí)不同程度地向旁邊漂移。該收集裝置例如可以是小樣品管，市場(chǎng)上 通常稱為PCR管。結(jié)果是，切片黏附在PCR管的側(cè)面內(nèi)壁上，而不是 落到管的底部。這使切片難以檢查，這對(duì)于使用者，例如病理學(xué)家來 說，在進(jìn)一步處理已切割的切片之前是一個(gè)重要的工作步驟。
因此德國(guó)專利申請(qǐng)DE 103 46 458建議對(duì)樣品的感興趣的樣品 區(qū)域進(jìn)行激光顯微解剖的 一個(gè)方法，在該方法中脈沖激光束的激光脈 沖同樣聚焦到樣品上，并且在該方法中，在最后的、完成切割的激光 脈沖中切除的主體與最后用來切割的激光脈沖的切割寬度匹配并優(yōu) 化，如此使得從等離子體傳遞到切片上的能量最大。然而在此在最后 的激光脈沖之前停止切割線也使應(yīng)用者感到費(fèi)時(shí)。
美國(guó)專利6,773,903同樣公開了切割所選擇的生物樣品區(qū)域的 一種顯微解剖方法。放置在載物片上的樣品位于一個(gè)在x-y坐標(biāo)平面 內(nèi)的可移動(dòng)工作臺(tái)上。在該顯微鏡內(nèi)耦合激光束并使x-y工作臺(tái)作相 應(yīng)移動(dòng)，如此使得激光束圍繞感興趣的樣品區(qū)域描繪一個(gè)相應(yīng)的封閉 的切割線。由此將感興趣的生物物質(zhì)與生物樣品分離?？墒莤-y工作 臺(tái)的控制在機(jī)械上是復(fù)雜的并且不能相應(yīng)在x-y平面內(nèi)的激光束那樣
準(zhǔn)確地控制，以將生物物質(zhì)與其余樣品分離。
因此本發(fā)明的技術(shù)問題是，給出一個(gè)激光顯微解剖方法，其在艱 難的樣品標(biāo)本制作中能夠以進(jìn)一 步改善的切割結(jié)果更舒適、更快捷地
切下切片。
該技術(shù)問題通過具有權(quán)利要求1的特征的一種激光顯微解剖方法 來解決。
本發(fā)明的另一個(gè)技術(shù)問題是，給出一個(gè)激光顯微解剖裝置，用戶 用該裝置可以安全、快速并可靠地獲得所希望的切片。在此切片的獲 得與各自的樣品標(biāo)本不相關(guān)。
該技術(shù)問題通過包含權(quán)利要求10的特征的一種激光顯微解剖裝
置來解決。
明的激光顯微解剖方法中借助于激光束的讀
樣品上切下一個(gè)切片。在此沿著封閉的切割線引導(dǎo)激光束。樣品本身 放在平面載體上。在切割切片期間沿著封閉切割線連續(xù)改變確定激光 脈沖和切割線的參數(shù)。
通過圖像處理確定參數(shù)沿著封閉切割線的連續(xù)變化。從圖像處理 中獲得參數(shù)沿著封閉切割線連續(xù)變化的量。這些參數(shù)例如是樣品厚度、 樣品的紋理、著色在樣品內(nèi)部的分布等。
同樣也可以考慮，僅僅在閉合封閉的切割線之前才連續(xù)改變確定 激光脈沖和封閉切割線的參數(shù)。在樣品的其余切割期間參數(shù)保持恒定。
借助于在用戶界面上的滑塊可以改變確定在結(jié)束封閉的切割線之 前連續(xù)變化的參數(shù)。
借助于中央計(jì)算單元確定所述參數(shù)，其中由中央計(jì)算單元把相應(yīng) 的控制信號(hào)提供給光學(xué)系統(tǒng)的各個(gè)元件。
激光脈沖在擊中生物樣品之前通過所述光學(xué)系統(tǒng)，其中改變激光 脈沖關(guān)于光圈、衰減、各個(gè)激光點(diǎn)在切割線上的密度和激光脈沖聚焦 位置的參數(shù)。
光圈和衰減器的變化同時(shí)進(jìn)行。光圈和衰減器的變化與激光脈沖 同步，以便由此達(dá)到最高的切割速度。光圈的變化可以借助于針孔光 闌或彩虹器。
可以視各自激光器功率和樣品的局部特性匹配在切割線內(nèi)部各個(gè) 激光點(diǎn)的密度。
本發(fā)明的激光顯微解剖裝置包含具有至少一個(gè)定義光軸的物鏡的 一個(gè)顯微鏡。同樣設(shè)置了一個(gè)發(fā)射激光束的脈沖激光器，所述激光束 經(jīng)過物鏡沿著光軸指向樣品。所述激光束在樣品上描繪一條封閉的切 割線，由此將所選擇的一個(gè)樣品區(qū)域與剩余的周圍生物物質(zhì)分離。所 有在光軸上布置的、確定激光脈沖和切割線參數(shù)的元件都連接在中央 計(jì)算單元上。
中央計(jì)算單元借助于圖像處理通過各個(gè)元件的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)沿著 封閉切割線的參數(shù)的連續(xù)改變。
在此同樣可以使用中央計(jì)算單元，使中央計(jì)算單元僅僅在結(jié)束封 閉的切割線之前才連續(xù)改變確定激光脈沖和切割線的參數(shù)。
確定激光脈沖和切割線的參數(shù)的元件是一個(gè)X/Y移位單元、 一個(gè) 光圈單元、 一個(gè)衰減器單元、 一個(gè)聚焦單元、 一個(gè)UV激光器和一個(gè)偏 轉(zhuǎn)單元。在此中央計(jì)算單元給各個(gè)元件提供相應(yīng)的調(diào)節(jié)信號(hào)。
同樣激光顯微解剖裝置與一臺(tái)監(jiān)控器相連，在該監(jiān)控器上為用戶 顯示用戶界面。該用戶界面是一個(gè)滑塊，用該滑塊可以在結(jié)束封閉的 切割線之前確定參數(shù)的連續(xù)變化。中央計(jì)算單元在此同時(shí)改變光圈和 衰減器。
從附屬權(quán)利要求中可以在此得出本發(fā)明的進(jìn) 一 步的有利的實(shí)施方案。
下面借助示意圖更詳細(xì)地闡述本發(fā)明。圖示
圖l示出一種具有固定激光束的激光切割裝置；
圖2示出一種具有可移動(dòng)激光束的激光切割裝置；
圖3示出根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)背景的參數(shù)匯集，在該現(xiàn)有技術(shù)中直到切 割線結(jié)束參數(shù)保持不變；
圖4示出根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)背景的參數(shù)匯集，在該現(xiàn)有技術(shù)中在結(jié)束 完全切下樣品之前參數(shù)跳5夭式地改變；
圖5示出參數(shù)沿著一條封閉切割線的連續(xù)改變；
圖6示出參數(shù)在結(jié)束切割線之前的連續(xù)改變；
圖7示出一條切割線的示意圖，在該切割線中參數(shù)在整個(gè)切割線 期間連續(xù)改變；
圖8示出所述切割線的示意圖，在該切割線中參數(shù)在結(jié)束切割線 之前才改變；
圖9示出光圏A和衰減器K變化的總效果；


圖10示出光圏A和衰減器K變化的優(yōu)化的總效果；
圖11示出切割線，在這些切割線中對(duì)光圈光闌和衰減器進(jìn)行了 共同的調(diào)節(jié)；
圖12舉例地示出動(dòng)態(tài)范圍為40:1的衰減器和同樣動(dòng)態(tài)范圍的光 圈光闌的可能組合的局限；
圖13舉例地示出衰減器和光圏的控制曲線，其絕不僅僅局限于 曲率單調(diào)變化的走勢(shì)；
圖14示出依賴于衰減器角位的一條典型的校準(zhǔn)曲線；
圖15示出由預(yù)先給定的控制值形成的衰減器的特征曲線的線性
化；
圖16示意地舉例示出用于產(chǎn)生切割線的一個(gè)程序環(huán)；
圖17示出用戶界面圖的一部分，通過該用戶界面借助于滑塊在閉 合封閉的切割線之前調(diào)整參數(shù)的連續(xù)變化。
在圖中相同的元件用同一參考數(shù)字表示。
在圖1中示出了一個(gè)用于顯微解剖的裝置，其以一個(gè)固定激光束 和一個(gè)相對(duì)于激光束移動(dòng)的樣品4工作。該裝置包含一個(gè)具有可電動(dòng) 移動(dòng)的x-y工作臺(tái)2的顯微鏡1。該x-y工作臺(tái)2用于接納樣品吸持 器3,在該吸持器上安放要檢查的或要切割的樣品4。此外設(shè)置了一個(gè) 照明系統(tǒng)5,以該照明系統(tǒng)使用者能夠通過一個(gè)目鏡12可視觀察樣品 4。為了切割樣品4設(shè)置了一個(gè)激光束22，其耦合在顯微鏡的光軸IO 上。由激光器22產(chǎn)生的激光束31聚焦在要切割的樣品4上。所述x-y 工作臺(tái)2與一個(gè)控制單元15連接，其如此移動(dòng)x-y工作臺(tái)2,使得形 成所希望的切割線。然后通過在激光束31和樣品4之間的相對(duì)移動(dòng)借 助于所希望的切割線從樣品上切下相應(yīng)的樣品部分。在圖1中所示的 顯微鏡是一臺(tái)透射光顯微鏡，其中在顯微鏡支架8上的照明系統(tǒng)5布 置在x-y工作臺(tái)2和樣品4的下面。顯微鏡1包含至少一個(gè)物鏡9， 其布置在x-y工作臺(tái)2和樣品4的上部。所述物鏡定義一個(gè)光軸10， 其與照明系統(tǒng)5的光軸在一條直線上。在這個(gè)所描述的布置中以透射 光照明觀察樣品4。同樣也可以用一個(gè)倒置的顯微鏡實(shí)施激光切割，在 這種情況下照明系統(tǒng)5布置在x-y工作臺(tái)2的上面并且至少一個(gè)物鏡 布置在工作臺(tái)2的下面。由照明系統(tǒng)5發(fā)出的光通過一個(gè)聚光鏡11從
下面指向布置在x-y工作臺(tái)2上面的、具有樣品4的樣品吸持器3。 透過樣品4的光到達(dá)顯微鏡1的物鏡9。在顯微鏡內(nèi)部光經(jīng)過沒有示 出的透鏡和反射鏡通向至少一個(gè)目鏡12。同樣一個(gè)攝像機(jī)17與顯微 鏡1連接，該攝像機(jī)依賴于物鏡的放大倍數(shù)拍攝樣品4的部分圖像。 由攝像機(jī)拍攝的圖像數(shù)據(jù)傳遞給一個(gè)計(jì)算單元16，其自身方面與一個(gè) 監(jiān)視器18連接，在該顯示器上可以向用戶顯示所拍攝樣品區(qū)域的圖 像。在攝像機(jī)和計(jì)算單元之間同樣中間連接一個(gè)控制單元15。由激光 器22發(fā)出的激光束31經(jīng)過射束分離器13，比如二色分離器，耦合進(jìn) 入顯微鏡的光程。在激光束31耦合進(jìn)入顯微鏡1的光程之前，激光束 經(jīng)過一個(gè)光學(xué)系統(tǒng)，在該光學(xué)系統(tǒng)內(nèi)設(shè)置了多個(gè)元件14、 16和19。 該光學(xué)系統(tǒng)中的第一個(gè)元件是光圈單元14,其與控制單元15連接， 該控制單元自身方面再和計(jì)算單元16連接。該光圈單元14可以包含 一個(gè)彩虹器或多個(gè)不同針孔光闌的選擇。該光學(xué)系統(tǒng)中第二個(gè)元件19 是一個(gè)聚焦單元19，其自身方面同樣與控制單元15連接，該控制單 元同樣連接在計(jì)算單元16上。所述聚焦單元19主要用于補(bǔ)償主要在 可見光頻譜范圍內(nèi)校正的、顯微鏡1的物鏡9的紫外線的不同聚焦位 置。有選擇地也可以用聚焦單元19選擇確定的聚焦位置或者連續(xù)改變 在切割過程中激光焦點(diǎn)的焦點(diǎn)位置。該光學(xué)系統(tǒng)30中的第三個(gè)元件 16是一個(gè)衰減器單元16。該衰減器單元16同樣與一個(gè)獨(dú)立的控制單 元15連接，該控制單元再連接在所述計(jì)算單元上。由UV激光器22 產(chǎn)生激光束31，其導(dǎo)入光學(xué)系統(tǒng)30中。該UV激光器22同樣與計(jì)算 單元16連接。
可以在角位上改變衰減器16,并且衰減基于干涉原理。光圈單元 14、聚焦單元19和衰減單元16都可以通過獨(dú)立的控制單元15的控 制信號(hào)在位置或者傾斜狀態(tài)或大小上改變。在此電動(dòng)實(shí)現(xiàn)這些改變。 所述光圈單元14、聚焦單元19或衰減單元16與獨(dú)立的控制單元15 連接，控制單元自身方面經(jīng)過獨(dú)立的應(yīng)答線路15a連接在計(jì)算單元16 上。在此可以彼此獨(dú)立地調(diào)整光圈單元14、聚焦單元19和衰減單元 16。由于光圈單元14和衰減單元16的獨(dú)立調(diào)整組合實(shí)現(xiàn)最大的動(dòng)態(tài) 范圍(在樣品上激光功率的變化幅度)，并且與此無依賴地可以有針 對(duì)性地影響這些量，比如景深清晰度、分辨率和功率密度。以耦合進(jìn) 入光學(xué)系統(tǒng)30的激光束31,其通過光束分離器反射進(jìn)入顯微鏡1的光程IO，用單個(gè)激光脈沖切割樣品4?？墒窃诒景l(fā)明的意義上最佳切 割結(jié)果要求激光脈沖與光圈單元14、衰減單元16和聚焦單元19的變 化同步，其中必須考慮x-y工作臺(tái)2的移動(dòng)。
圖2示出用于顯微解剖的一個(gè)裝置，該裝置的x-y工作臺(tái)固定并 且通過同樣布置在光學(xué)系統(tǒng)30中的偏轉(zhuǎn)單元40以相應(yīng)的方式偏轉(zhuǎn)激 光束，以便從樣品4上切下任意形狀的切片。在該布置中所述x-y工 作臺(tái)2在切割過程中不移動(dòng)。在光學(xué)系統(tǒng)30中在由激光器22發(fā)出的 激光束的方向上首先布置衰減單元16,然后布置聚焦單元19,然后布 置光圈單元14并且最后布置偏轉(zhuǎn)單元40。偏轉(zhuǎn)單元40與一個(gè)獨(dú)立的 控制單元15連接，該控制單元自身方面經(jīng)過應(yīng)答線路15a與計(jì)算單 元16連接。偏轉(zhuǎn)單元40包括一對(duì)楔形板，通過與計(jì)算單元16連接 的控制單元15以適當(dāng)?shù)姆绞娇梢酝埔七@對(duì)楔形板，由此激光束在樣品 上畫出所希望的、切下的切片最終應(yīng)當(dāng)具有的形狀。正如已經(jīng)在圖1 的說明中提到的，光學(xué)系統(tǒng)30的所有元件分別與一個(gè)獨(dú)立的控制單元 15連接，這些控制單元經(jīng)過一個(gè)應(yīng)答線路15a連接在計(jì)算單元16上。
圖3示出在根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)用于切片的切割方法中應(yīng)用的參數(shù)組。 在才黃坐標(biāo)上以百分比標(biāo)注了切割長(zhǎng)度。對(duì)此0%表示切割開始，100% 表示切割結(jié)束。在縱坐標(biāo)33上以任意單位標(biāo)注了依賴于切割長(zhǎng)度的各 個(gè)參數(shù)值。所有參數(shù)，比如焦點(diǎn)34、點(diǎn)距35、衰減器36和光圏37 在整個(gè)切割長(zhǎng)度上恒定不變。因此從衰減器36和光圏37的配合中得 出的總功率38同樣在整個(gè)切割長(zhǎng)度上恒定不變。
圖4同樣描述根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的在切片的切割過程中的參數(shù)組合。 在橫坐標(biāo)41上同樣以百分比標(biāo)注了切割長(zhǎng)度，并且在縱坐標(biāo)42上以 任意單位示出了參數(shù)值。在幾乎整個(gè)切割長(zhǎng)度上焦點(diǎn)43、點(diǎn)距44、衰 減器45和光圈46恒定不變。正如在圖3中所描述的，從衰減器45 的參數(shù)和光圏46的參數(shù)得出總功率47,其因此同樣直到在結(jié)束切割 線之前不久恒定不變。在結(jié)束切割長(zhǎng)度或切割線之前不久該系統(tǒng)插入 一個(gè)簡(jiǎn)短間隔，在該間隔內(nèi)改變光圏46的參數(shù)。因此在結(jié)束切割線之 前加大光圈。因此總功率也隨之改變，其基于較大的光圈因此也變大。 其它參數(shù)，比如衰減器45和焦點(diǎn)43在此保持恒定。
圖5示出了在整個(gè)切割長(zhǎng)度上連續(xù)變化的參數(shù)組。在橫坐標(biāo)50上 以百分比標(biāo)注了切割長(zhǎng)度，并且在縱坐標(biāo)51上標(biāo)注了各個(gè)參數(shù)的連續(xù) 變化的值。正如/人圖5中可以看出的，焦點(diǎn)52、點(diǎn)距53、衰減器54、 光圏55的參數(shù)并且也因此總功率56在整個(gè)切割長(zhǎng)度上改變。為補(bǔ)償 樣品的歪斜或?yàn)槭菇裹c(diǎn)配合不同的樣品厚度，必須改變焦點(diǎn)位置。同 樣可以隨著焦點(diǎn)的變化選擇一個(gè)確定的Z位置或者在切割過程或產(chǎn)生 切割線期間連續(xù)改變激光焦點(diǎn)的Z位置。通過各個(gè)激光脈沖的接連排 列產(chǎn)生切割線。在此，點(diǎn)相互接觸是重要的，以便由此形成使切片脫 離剩余樣品4的切割線。為此正如在圖5中示出的，同樣可以改變切 割線內(nèi)部各個(gè)激光脈沖的點(diǎn)距。變化的點(diǎn)距表明，在形成切割線期間 各個(gè)激光脈沖的直徑可以改變。同樣從光圈55和衰減器54的配合中 得出連續(xù)變化的總功率56,該總功率通過激光脈沖傳到樣品4上。在 圖5中描述的情況下量總功率56、光圈55、衰減器54、點(diǎn)距53、以 及焦點(diǎn)位置52連續(xù)地并且與激光脈沖同步改變，以便在最佳切割速度 的同時(shí)達(dá)到盡可能可靠的脫落。這些參數(shù)的估計(jì)值可以例如通過分析 在全部或在確定光譜范圍或者色彩通道內(nèi)的光密度，或者通過該方法 對(duì)樣品材料的"校準(zhǔn)"，也就是通過在通常不使用的樣品部分中的切 割試驗(yàn)來確定。在此存在附加的自由度，即通過衰減器和光圈光闌的 不同調(diào)整實(shí)現(xiàn)相同的激光總功率并且如此選擇性地按切割線的分段， 例如(a)或(b)優(yōu)化景深清晰度(小光圏)或焦點(diǎn)的功率密度(大光圏)。 通過在不同焦點(diǎn)位置上對(duì)顯微鏡圖像的對(duì)比度的分析也可以確定可能 的曲率和切片對(duì)光軸的公共斜率(c),并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)與激光 脈沖同時(shí)并且因此在不降低切割速度的情況下改變曲率和斜率。當(dāng)然 有選擇地例如通過分析在全部或確定光譜范圍或者色彩通道內(nèi)的光密 度d或也借助于另外的方法確定沿著預(yù)定切割曲線I或者Ii的樣品材 料切割特性的估計(jì)值。根據(jù)如此估計(jì)的光密度d與關(guān)于樣品材料或載 體材料的類型x的由用戶給定的數(shù)據(jù)一起得出如沿著I的激光總功率 P(見下面)、光圈A、衰減器K、點(diǎn)密度D和也許可能的焦點(diǎn)位置z 等的切割參數(shù)曲線并將這些參數(shù)的曲線存儲(chǔ)用于后續(xù)切割過程。這里 為了簡(jiǎn)化操作也可以考慮一些預(yù)定的單參數(shù)函數(shù)(P、 D、 z)=fx(d) 或(A、 K、 D、 z)=fx(d)。也可以通過所述方法對(duì)于樣品材料的"校 準(zhǔn)"，也就是通過在樣品4的通常不使用的部分中的切割試驗(yàn)來確定 最佳切割參數(shù)。
通過對(duì)在不同焦點(diǎn)位置上的顯微鏡圖像的對(duì)比度分析也可以確定
可能的曲率和切片或者樣品4對(duì)光軸10的公共斜率并且在本發(fā)明范圍 內(nèi)與激光脈沖同時(shí)并且因此在不降低切割速度的情況下改變曲率和斜率。
圖6描述在結(jié)束切割線之前短暫地連續(xù)改變一些參數(shù)的情況。在 橫坐標(biāo)60上以百分比標(biāo)注了切割長(zhǎng)度并且在縱坐標(biāo)61上以任意單位 示出了各個(gè)參數(shù)的值。變化的參數(shù)值是焦點(diǎn)62、點(diǎn)距63、衰減器64、 光圈65和總功率66。在此焦點(diǎn)62可以在整個(gè)切割線上保持恒定或在 整個(gè)切割線上連續(xù)變化。對(duì)于其余參數(shù)，比如點(diǎn)距63、衰減器64、光 圈65并從而總功率66從切割線結(jié)束了大約60%時(shí)起連續(xù)增加。前面 提到的參數(shù)直到切割線的60%恒定不變。因此實(shí)現(xiàn)，通過在結(jié)束切割 線之前連續(xù)提高作用在樣品4上的總功率使切片與剩余的樣品材料或 載體可靠分離。在圖6中示出的參數(shù)調(diào)節(jié)中放棄沿著切割線明確確定 切割參數(shù)。力求在高的"高于一切"的切割速度下盡可能可靠地分離 切片。這里不留出部分切割曲線，而是在切割曲線的結(jié)束區(qū)域內(nèi)連續(xù) 提高激光功率(或者光圏和衰減器)和點(diǎn)距，以便使切片提前下降或 張力引起的豎起使切片離開焦點(diǎn)位置最小化。通過x類的單參數(shù)函數(shù) 來說明這種變化，這些函數(shù)確定激光功率和點(diǎn)距沿著切割線的變化。 根據(jù)典型的(已知的或者事先得出的)材料特性選擇x或通過一種"校 準(zhǔn)"選擇x。被證明對(duì)于使用者有益的是，有選擇地或者也附加地，通 過附加的一個(gè)調(diào)節(jié)量影響正確函數(shù)類的選擇，該調(diào)節(jié)量表明，各自材 料對(duì)于千擾作用，比如豎起、下降、傾斜或上滑和粘牢是多么重要， 并且該調(diào)節(jié)量然后例如規(guī)定總激光功率(或光圈和衰減器)和所屬點(diǎn) 密度在切割線將近結(jié)束時(shí)的變化。從而用戶可以以盡可能簡(jiǎn)單的方式 區(qū)分一方面不難處理的樣品材料和另一方面難以分離的樣品材料并且 相應(yīng)匹配切割過程。
在圖6的簡(jiǎn)化情況中不求出并采用沿著切割線I的光密度d，可 是確定優(yōu)化的參數(shù)分布(P,D) -gx(I)或(A,K,D,z) =gx(I),其中 gx仍是單參數(shù)函數(shù)類，其表明特別是在將近結(jié)束時(shí)參數(shù)沿著切割線I 的變化，以便實(shí)現(xiàn)不僅正如上面已經(jīng)討論的、在盡可能大部分的切割 線I上盡可能薄的切片，而且也在I的臨界末端范圍內(nèi)盡可能可靠的 脫離?？梢愿鶕?jù)典型的(已知或事先得出的)材料特性選擇x或再度 通過一種校準(zhǔn)，如在圖5的描述中已經(jīng)討論過的。被證明對(duì)于使用者
有益的是，有選擇地或也附加地，通過附加的一個(gè)調(diào)節(jié)量影響正確函
數(shù)gx的選擇，該調(diào)節(jié)量表明，各自材料對(duì)于提到的干擾作用，如傾斜、 上滑、粘牢或向上彎曲是多么重要，并且然后例如規(guī)定總激光功率P
(或A和K)和所屬點(diǎn)密度D在切割線將近結(jié)束時(shí)的變化。從而用戶
可以以盡可能簡(jiǎn)單的方式區(qū)分一方面不難處理的樣品材料和另一方面 難以分離的樣品材料并且相應(yīng)地優(yōu)化切割過程。
在圖6中描述的切割方法中也可以作為選擇地通過對(duì)在不同焦點(diǎn) 位置的顯微鏡圖像的對(duì)比度分析確定并且與激光脈沖同時(shí)而在不降低 切割速度的情況下校正可能的曲率和切片對(duì)光軸的公共斜率。
圖7示出一個(gè)切割線70，在該切割線內(nèi)部設(shè)置多個(gè)區(qū)域，在這些 區(qū)域內(nèi)改變?cè)跇悠?上激光脈沖的參數(shù)組合。在該實(shí)施形式中切割線 70劃分為四個(gè)區(qū)h戈71、 72、 73和74。如此例如在區(qū)i戈71和在區(qū)》或 73內(nèi)以恒定的參數(shù)進(jìn)行切割。在區(qū)域72內(nèi)和在區(qū)域74內(nèi)連續(xù)改變用 于產(chǎn)生切割線的參數(shù)。用戶或者借助于鼠標(biāo)(沒有示出)在監(jiān)視器18 上在樣品4的圖像上直接標(biāo)記所希望的切割線I，或許他僅僅粗略地 預(yù)先給定檢索范圍并且圖像識(shí)別全自動(dòng)地確定在樣品4的預(yù)定范圍內(nèi) 一個(gè)或多個(gè)/全部切割線Ii。
圖8示出用于形成切割線80的另一個(gè)實(shí)施形式。該切割線具有一 個(gè)在圖8中以81表示的始端。切割線的始端81與切割線的末端83 重合。從切割線的始端81出發(fā)直到在切割線上的位置82以恒定的參 數(shù)進(jìn)行切割。在該切割線上在切割線的始端81和位置82之間使用恒 定不變的參數(shù)。然后在切割線的位置82和始端或者末端81之間連續(xù) 改變或者提高參數(shù)。最早在大約完成切割線的60%之后開始，直到切 割線結(jié)束連續(xù)改變切割參數(shù)。在該切割過程中切割線的平均寬度為幾 |iun。
圖9示出在同時(shí)改變光圈和衰減器情況下的總效果。在橫坐標(biāo)90 上以任意單位標(biāo)注了控制值。在縱坐標(biāo)91上以對(duì)數(shù)單位標(biāo)注了強(qiáng)度。 光圈和衰減器必須同時(shí)變化，以便實(shí)現(xiàn)盡可能大的動(dòng)態(tài)范圍。衰減器 和光圈的組合控制提高功率調(diào)節(jié)的分辨率。通常僅僅粗略地以對(duì)數(shù)對(duì) 光圈進(jìn)行光闌分級(jí)。 一個(gè)光闌等級(jí)相當(dāng)于大于30%的強(qiáng)度變化。相反 可以用7%的分辨率并且更好地(更小的微步是可能的)調(diào)節(jié)衰減器。 通過光圈和衰減器組合的同時(shí)控制可以在分辨率優(yōu)于7% ( 100級(jí)每級(jí)
0.928)的同時(shí)實(shí)現(xiàn)高動(dòng)態(tài)(總動(dòng)態(tài)為大約1: 2000)。在圖9中以
離散級(jí)示出衰減器的變化92。同樣在圖9中以離散級(jí)示出了光圈93 的變化，其中正如前面提到的，在光圈調(diào)節(jié)中的級(jí)大于在衰減器調(diào)節(jié) 中的級(jí)。從光圏和衰減器的組合控制中得出的強(qiáng)度總效杲以曲線94示 出。曲線94從而示出在總效果中在強(qiáng)度上升時(shí)的周期跳躍。在切割過 程期間不僅隨意改變光圈A而且隨意改變激光束31的衰減器K。在實(shí) 踐中并非A和K的所有組合都是不相關(guān)的或?qū)τ诖_定的應(yīng)用是有意義 的。原則上存在許多A和K的組合，這些組合都導(dǎo)致在樣品上相同的 總功率輸入P,類似于照相術(shù)光闌B和曝光時(shí)間t的多個(gè)組合導(dǎo)致膠 片同樣的曝光。A表示光圏直徑的對(duì)數(shù)并且K表示衰減器透射的對(duì)數(shù)， 那么有簡(jiǎn)化的P=A+K (P也以對(duì)數(shù)單位表示)，由此可見，A和K的 (無限)多個(gè)值可能導(dǎo)致相同的和P。但是在此也與照相術(shù)類似，如果 平均功率輸入P(在照相術(shù)中是平均曝光)相同，則結(jié)果可能完全不同。 在照相術(shù)中通過所謂的"自動(dòng)程序"考慮這種特性，也就是說在這個(gè) 可使用的曝光范圍內(nèi)B和t的值以一種確定的模式變化，各自的模式 根據(jù)應(yīng)用變換或匹配，例如是否希望有最大的景深清晰度或是否希望 有最小的移動(dòng)模糊。"自動(dòng)程序"的想法，也就是使A和K一起變化 的一種模式，可以與在此描述的方法和所屬的裝置一起用于改善在激 光顯微解剖中的功率控制。
借助于光圈光闌和衰減器獨(dú)自可達(dá)到的動(dòng)態(tài)范圍在實(shí)踐中是有限 的，在具體情況中限制在大約為70:1或者30:1的數(shù)值?？墒亲罴训?切割質(zhì)量典型地要求在較大范圍上改變總效果。通過光圏光闌和衰減
當(dāng)大"功率變化，因?yàn)?個(gè)元件的;節(jié)路徑小于僅僅以光圈光S和衰 減器單獨(dú)實(shí)現(xiàn)的變化，并仍然合計(jì)實(shí)現(xiàn)約等于2000:1的動(dòng)態(tài)范圍。
在最簡(jiǎn)單的情況下(參見圖9)在控制值的預(yù)定范圍內(nèi)單調(diào)改變光 圈和衰減器，以實(shí)現(xiàn)所述的大動(dòng)態(tài)范圍。然而由此(正如上面已經(jīng)提 到的)也許得出不一樣大的效果級(jí)別。如此在該實(shí)例中衰減器的與光 圈的較大分級(jí)相比更為精細(xì)的分級(jí)不能完全得到利用。
圖10同樣示出衰減器和光圈的總效果的組合。在此在橫坐標(biāo)100 上以任意單位標(biāo)注了控制值。在縱坐標(biāo)101上仍以對(duì)數(shù)單位標(biāo)注了強(qiáng) 度。曲線92示出衰減器的變化。在此非連續(xù)地、階躍上升地改變衰減
器。繼而如此改變衰減器，使強(qiáng)度首先上升兩級(jí)并且在一個(gè)第三級(jí)再
度下降。該模式在衰減器的整個(gè)調(diào)節(jié)中延續(xù)。正如在圖9中已經(jīng)示出 的，以不連續(xù)的階躍改變光圈。由變化的光圈和變化的衰減器的組合 產(chǎn)生的總效果用曲線94示出?？梢郧宄闯?，強(qiáng)度連續(xù)階梯式上升， 其中每一級(jí)是一樣大的。因此也可以說總效果以準(zhǔn)連續(xù)式上升。加之， 從衰減器和光圏的適當(dāng)組合調(diào)節(jié)中得到 一個(gè)總效果，該總效果基本可 以以更精細(xì)的分級(jí)進(jìn)行調(diào)節(jié)。通過衰減器的優(yōu)化控制，該控制補(bǔ)償在 簡(jiǎn)單情況下(圖9)產(chǎn)生的誤差，可以在-2000:l的全范圍內(nèi)在保持 衰減器較精細(xì)分級(jí)的情況下實(shí)現(xiàn)總效果的單調(diào)的指數(shù)變化。
圖11示出所產(chǎn)生的切割線112、 113和114，在這些切割線中按 照在圖10中描述的方法共同調(diào)節(jié)了光圈光闌和衰減器。在此切割線 112、 113和114的每一個(gè)以光圈光闌和衰減器的不同參數(shù)組切割。 所有切割線112、 113和114都示出切割寬度115的連續(xù)增加。根據(jù) 按照在圖10中描述方法的光圈光闌和衰減器的調(diào)節(jié)每一個(gè)切割線 112、 113和114未顯現(xiàn)切割寬度115的跳躍。在切割線112、 113 或114的末端切割寬度為大約IO拜至50jim。通過功率值的細(xì)孩炎校正 的可能性也證明了采用針孔光闌代替彩虹器是絕對(duì)有益的。原則上彩 虹器有這樣的優(yōu)點(diǎn)，即光圈值的變化穩(wěn)定并且不存在這樣的"危險(xiǎn)"， 即在調(diào)節(jié)期間激光脈沖會(huì)射到在針孔光闌的預(yù)定孔之間的空間并因此 阻斷激光脈沖。相反針孔光闌的光圈值有更準(zhǔn)確的定義并且針孔光闌 構(gòu)造小而輕，如此調(diào)節(jié)僅僅需要幾ms并因此完全可以在激光脈沖的等 待時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)。
圖12示范闡述了動(dòng)態(tài)范圍40:1的衰減器與相同動(dòng)態(tài)范圍的光圏 光闌的可能組合的限制。這里如此同時(shí)控制衰減器和光圏光闌，使得 在0-100的控制值內(nèi)按照累計(jì)曲線G實(shí)現(xiàn)402:1、也就是1600:1的 總功率的嚴(yán)格指數(shù)變化。
也在圖9和10中實(shí)現(xiàn)的最簡(jiǎn)單和最普遍的情況下，在控制值的全 部范圍內(nèi)不4義衰減器而且光圏光闌以相同方式按照恒定上升的曲線E 和F變化。因此沒有實(shí)現(xiàn)確定調(diào)節(jié)值的特殊選擇。
可是例如在控制值的盡可能大的范圍內(nèi)保持盡可能低的光圈值也 是合理的，以保證切割光學(xué)系統(tǒng)的盡可能大的景深清晰度和/或也盡可 能低的圖像誤差。相反優(yōu)選盡可能大的光圏也可能是合理的，以便對(duì)于特殊的基片保證盡可能高的空間(側(cè)向和軸向)分辨率并同時(shí)保證 在焦點(diǎn)上的盡可能高的功率密度(通過隨著光圈的增加焦點(diǎn)斑點(diǎn)減小，
功率密度超比例升高！)。這種情況相當(dāng)于控制曲線，比如H和I的 結(jié)對(duì)，在第一種情況下I代表光圈并且H代表衰減器，并且在第二種 情況下反之。
在一般情況下人們發(fā)現(xiàn)，對(duì)于在預(yù)定任務(wù)范圍內(nèi)的控制所有(和 只有這些！)曲線對(duì)都是可能的，即其完全在平行四邊形ABCD內(nèi)從A 向D延伸，并且成對(duì)地對(duì)稱于A至D線(或者等效于此對(duì)于一個(gè)確 定的控制值其和表明預(yù)定的值G)。
在圖13中示出了衰減器和光圈的控制曲線，絕不僅僅局限于曲率 單調(diào)變化的曲線，而也可能是轉(zhuǎn)折點(diǎn)和(近似)恒定值的范圍。如此 可能要求，在控制值周圍盡可能大的范圍內(nèi)例如為30附近(L)確保 按照曲線K的盡可能恒定的光圏。按照上述考慮從而可以直接從A-D 的對(duì)稱或者從G的求和條件中推導(dǎo)出衰減器的所屬控制曲線J。
光圈光闌A和衰減器K的組合控制，特別是在應(yīng)用根據(jù)圖10的誤 差校正的情況下，要求被調(diào)節(jié)的衰減器值K高度準(zhǔn)確?？上捎玫?衰減器表現(xiàn)出依賴于傾角alpha的、典型近似于具有最大值和最小值 的偏移的余弦形特征曲線K=f0xcos (fl+f2xalpha)+l+f3 (f0至 f3 是獨(dú)立參數(shù))而不是所希望的單調(diào)指數(shù)形狀 K=g0xexp(—glxalpha)。
在本發(fā)明的意義上因此為了確保精確度確定獨(dú)立衰減器的配合參 數(shù)(四個(gè)或多個(gè))或在散布足夠小的情況下確定衰減器的生產(chǎn)批次的 平均參數(shù)(參見圖14)并且存放在激光頭的存儲(chǔ)區(qū)域內(nèi)。通過配合函 數(shù)的反演如此可以從預(yù)定的控制值中確定所屬傾角并且如此使衰減器 的特征曲線(參見圖15)"線性化"。在具體情況中可能例如要求了， 控制值的三級(jí)相當(dāng)于1.25的系數(shù)(指數(shù)特征曲線)。由此得出具有 loglO (強(qiáng)度)oc-0 . 0323x控制值的強(qiáng)度的指數(shù)特征曲線。
為了最優(yōu)化切割速度計(jì)算和移動(dòng)在時(shí)間上"交叉"進(jìn)行，也就是 說在各個(gè)元件(光圈單元14、衰減器單元16、聚焦單元19和偏轉(zhuǎn)單 元40或x-y工作臺(tái)2 )向新位置運(yùn)行或等待所希望的激光頻率的預(yù)定 周期運(yùn)行完成期間，就進(jìn)行各自接下來位置的費(fèi)時(shí)計(jì)算。如果隨后已 有關(guān)于所有元件已到達(dá)其應(yīng)有位置并且激光脈沖的預(yù)定等待時(shí)間已過
的應(yīng)答，則觸發(fā)激光觸發(fā)器并立刻發(fā)出隨后射擊位置的定位指令。
在圖16中圖解示范描述了用于產(chǎn)生切割線的程序環(huán)，其按如下形 式運(yùn)行
1) 向偏轉(zhuǎn)單元40的楔形板發(fā)出前往最后已計(jì)算出的角位(a, (3)的指令；
2) 根據(jù)當(dāng)前的點(diǎn)距D計(jì)算后面的射擊坐標(biāo)(x,y);
3) 將這些射擊坐標(biāo)換算為偏轉(zhuǎn)單元40的楔形板的角位(a, (3) (通常是最費(fèi)時(shí)的)；
4) 等待所有元件已到達(dá)其理論位置，并且所選擇的激光周期已
過；
5) 觸發(fā)激光觸發(fā)器并且復(fù)位周期計(jì)數(shù)器；
6) 計(jì)算點(diǎn)距值(dx,dy)、功率P的新值，從中計(jì)算出光圈A 和衰減器K并且也許可能焦點(diǎn)位置F的值；
7) 向光圏光闌、衰減器和焦點(diǎn)電機(jī)發(fā)出運(yùn)行到新位置的指令；
8) 只要還沒有到達(dá)切割曲線的末端點(diǎn)就返回1)。
為了啟動(dòng)該序列必須已曾計(jì)算出了切割曲線第 一點(diǎn)的角位(a， (3)， 并且光圈A、衰減器K和焦點(diǎn)位置F必須已經(jīng)進(jìn)入切割曲線的啟動(dòng)點(diǎn) 的起始位置。
在圖6中示出的切割方法中在本發(fā)明的意義上是有利的，在切割 線的末端控制最后激光射擊的位置并且也許校正性地干預(yù)。在此直接 在結(jié)束切割曲線之前，應(yīng)當(dāng)始終如此定位在激光顯微解剖中具有最高 激光功率的最后的激光脈沖，以去除切片盡可能大的范圍，確保脫離 盡可能可靠。如果最后的射擊離切割線的起始點(diǎn)太遠(yuǎn)，存在切片懸吊 著的危險(xiǎn)；如果最后的點(diǎn)設(shè)置太緊密，則存在這樣的危險(xiǎn)，即切片不 是像所希望的一樣分離，而是(正如經(jīng)常觀察到的)已經(jīng)從聚焦平面 "旋轉(zhuǎn)出來，，并且因此對(duì)于最后的射擊"夠不著"。
然而通常由使用者任意確定的切割曲線的總長(zhǎng)，很難得剛好是點(diǎn) 距的倍數(shù)，特別是如果在擴(kuò)展的模式中點(diǎn)距不保持恒定。因此本發(fā)明 在切割過程開始之前計(jì)算由所選擇的切割參數(shù)得出的最后脈沖的位 置，并通過參數(shù)的簡(jiǎn)單變化迫使最后脈沖具有一個(gè)有利的位置，而不 致于由此出現(xiàn)干擾性的中斷或在切割曲線或者切割線中出現(xiàn)空隙。
通過同步于激光脈沖改變激光功率參數(shù)(光圏和衰減器)達(dá)到最高的切割速度。由此產(chǎn)生有利的副效應(yīng)，其在自動(dòng)切割多個(gè)子區(qū)域的
情況下同樣使流通量最大化。
通過點(diǎn)密度與各自的激光功率和局部的樣品特性的匹配可以確保
各個(gè)激光射擊形成一個(gè)切片。因此防止了或避免了切片懸吊、傾斜等。
在分離感興趣的區(qū)域時(shí)也能夠?qū)崿F(xiàn)脈沖傳遞的優(yōu)化。
同時(shí)改變光圈和衰減器得到盡可能大的動(dòng)態(tài)范圍。
衰減器和光圈光闌的組合控制提高功率調(diào)節(jié)的分辨率。
通過按照確定的模式通過光圈和衰減器改變有效的激光功率可以
最佳地考慮樣品(在提供使用的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)部)的確定特性。
通過在激光頭中存儲(chǔ)的、獨(dú)立校準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)衰減器K的"線性化，，。
線。 '；"、'、 ，
此外可以，或者事先在樣品的"校準(zhǔn)范圍，，內(nèi)，或者在切割期間 在對(duì)切割結(jié)果連續(xù)的、自動(dòng)的光學(xué)控制下從圖像分析中確定切割過程 的最佳參數(shù)。也許還可以自動(dòng)修整或者重新切割非最佳分離的樣品區(qū) 域。
圖17示出用戶界面圖170的一部分，在該用戶界面上借助于至 少一個(gè)滑塊171、 172、 173在結(jié)束封閉的切割線之前調(diào)節(jié)參數(shù)的連續(xù) 變化。用戶界面170在監(jiān)視器18上顯示給用戶。用第一滑塊171可 以調(diào)節(jié)入射到樣品上的激光脈沖的總功率。正如已經(jīng)描述的，從衰減 器和光圈的適當(dāng)組合調(diào)節(jié)中得出總功率。用第二滑塊172可以調(diào)節(jié)在 樣品上設(shè)置切割線的速度。為此隨之相應(yīng)調(diào)節(jié)激光脈沖的重復(fù)率。用 第三滑塊173可以調(diào)節(jié)，在接近切割線末端參數(shù)應(yīng)該改變多大。
權(quán)利要求
1.激光顯微解剖方法，以該方法借助于激光器的激光脈沖沿著封閉的切割線從放置在一個(gè)平面載體上的生物樣品上切下切片，其特征在于，同步于激光脈沖沿著封閉的切割線連續(xù)改變確定激光脈沖和切割線的參數(shù)。
2. 按照權(quán)利要求l的方法，其特征在于，通過圖像處理獲得沿 著封閉切割線連續(xù)改變參數(shù)的量。
3. 按照權(quán)利要求2的方法，其特征在于，參數(shù)包含樣品厚度、 樣品載體的偏斜、樣品紋理和樣品著色。
4. 按照權(quán)利要求1至3之一的方法，其特征在于，僅僅在結(jié)束 封閉的切割線之前連續(xù)改變確定激光脈沖和切割線的參數(shù)。
5. 按照權(quán)利要求1至4之一的方法，其特征在于，借助于中央 計(jì)算單元確定參數(shù)，并且由中央計(jì)算單元給光學(xué)系統(tǒng)的各個(gè)元件提供 控制信號(hào)。
6. 按照權(quán)利要求1至5之一的方法，其特征在于，激光脈沖在 到達(dá)生物樣品之前經(jīng)過光學(xué)系統(tǒng)，其中根據(jù)光圏、衰減、各個(gè)激光點(diǎn) 在切割線上的密度和激光脈沖的焦點(diǎn)位置來改變激光脈沖的參數(shù)。
7. 按照權(quán)利要求6的方法，其特征在于，同時(shí)改變光圈和衰減器。
8. 按照權(quán)利要求6的方法，其特征在于，同步于最高切割速度 的激光脈沖改變光圈和衰減器。
9. 按照權(quán)利要求6的方法，其特征在于，根據(jù)各自激光功率和 樣品的局部特性匹配在切割線內(nèi)部各個(gè)激光點(diǎn)的密度。
10. 用于激光顯微解剖的裝置，包含一個(gè)具有至少一個(gè)定義光軸 (10 )的物鏡(9 )的顯微鏡(1 )、發(fā)射激光束的脈沖激光器(6 ),該激光束經(jīng)過物鏡沿著光軸指向樣品(4 )并且畫出 一個(gè)封閉的切割線， 其特征在于，所有在光軸上布置的、確定激光脈沖和切割線的參數(shù)的 元件連接在一個(gè)中央計(jì)算單元上。
11. 按照權(quán)利要求10所述的裝置，其特征在于，中央計(jì)算單元 借助于圖像處理通過元件的協(xié)調(diào)調(diào)整沿著封閉切割線連續(xù)改變參數(shù)。
12. 按照權(quán)利要求10所述的裝置，其特征在于，中央計(jì)算單元 僅僅在結(jié)束封閉的切割線之前才連續(xù)改變確定激光脈沖和切割線的參數(shù)。
13. 按照權(quán)利要求10至12之一所述的裝置，其特征在于，確定 激光脈沖和切割線的參數(shù)的元件包含一個(gè)X/Y移位單元、 一個(gè)光圈單 元、 一個(gè)衰減單元、 一個(gè)聚焦單元、 一個(gè)UV激光器和一個(gè)偏轉(zhuǎn)單元。
14. 按照權(quán)利要求10至12之一所述的裝置，其特征在于，中央 計(jì)算單元給元件提供相應(yīng)的調(diào)節(jié)信號(hào)。
15. 按照權(quán)利要求10至14之一所述的裝置，其特征在于，設(shè)置 了一個(gè)顯示用戶界面的監(jiān)視器，其中用戶界面包含一個(gè)滑塊，用該滑 塊可以在結(jié)束封閉切割線之前確定參數(shù)的連續(xù)改變。
16. 按照權(quán)利要求13所述的裝置，其特征在于，所述X/Y移位 單元包含一個(gè)X/Y工作臺(tái)和一個(gè)控制單元。
17. 按照權(quán)利要求13所述的裝置，其特征在于，所述光圈單元 包含一個(gè)可調(diào)節(jié)的針孔光闌或彩虹器和控制單元。
18. 按照權(quán)利要求13所述的裝置，其特征在于，所述衰減器單 元包含一個(gè)濾光器和一個(gè)控制單元。
19. 按照權(quán)利要求13所述的裝置，其特征在于，所述UV激光器 直接與計(jì)算單元連接。
20. 按照權(quán)利要求13所述的裝置，其特征在于，所述偏轉(zhuǎn)單元 包含一對(duì)楔形板和一個(gè)控制單元。
全文摘要
公開了一種激光顯微解剖方法和用于激光解剖的裝置。借助于激光器的激光脈沖沿著一條封閉切割線從放置在平面載體上的生物樣品上切下切片。同步于激光脈沖沿著封閉切割線連續(xù)改變確定激光脈沖和切割線的參數(shù)。所有布置在光軸上的、確定激光脈沖和切割線的參數(shù)的元件都連接在一個(gè)中央計(jì)算單元上。
文檔編號(hào)G01N1/28GK101198855SQ200680021248
公開日2008年6月11日 申請(qǐng)日期2006年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月16日
發(fā)明者J·韋斯納 申請(qǐng)人:萊卡微系統(tǒng)Cms有限責(zé)任公司