專(zhuān)利名稱(chēng)：：診斷檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于檢測(cè)能識(shí)別豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的一種或多種蛋白質(zhì)和/或抗原的抗體的試劑盒、裝置和方法。所述抗體可存在于被PRRSV感染或有被PRRSV感染的風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象的生物液內(nèi)。本發(fā)明優(yōu)選用于PRRSV感染的診斷和預(yù)防。
背景技術(shù)：
：在美國(guó)，養(yǎng)豬業(yè)遭受經(jīng)濟(jì)損失的主要原因是豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)病毒或PRRSV。PRRSV是豬無(wú)法繁殖和呼吸系統(tǒng)疾病的致病因子。與PRRS相關(guān)的經(jīng)濟(jì)損失主要是由于該病毒可引起懷孕母豬流產(chǎn)以及正在成長(zhǎng)的豬患呼吸系統(tǒng)疾病綜合癥(PRDC)?，F(xiàn)在已經(jīng)實(shí)踐了不同的控制方法，其中包括使用疫苗和改善管理。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,690,940。盡管養(yǎng)豬場(chǎng)都會(huì)進(jìn)行常規(guī)的免疫，但是爆發(fā)PRRSV也并非罕見(jiàn)。PRRSV爆發(fā)最常見(jiàn)的原因是生物安全措施失效。已被PRRSV感染的后備母豬未經(jīng)檢測(cè)就放入飼養(yǎng)群中是生物安全措施失效的一個(gè)常見(jiàn)原因。如果養(yǎng)豬場(chǎng)采取簡(jiǎn)單而經(jīng)濟(jì)的方法來(lái)檢測(cè)PRRSV感染，這些問(wèn)題都可以解決。這種方法還可用于檢測(cè)母豬所生產(chǎn)的斷奶豬仔是否是無(wú)病毒的以及斷奶豬仔在環(huán)境適應(yīng)過(guò)程中是否能夠保持無(wú)病毒狀態(tài)。為了檢測(cè)PRRSV抗體，獸醫(yī)應(yīng)采集血樣并送到獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室。目前，ELISA、間接熒光抗體試驗(yàn)以及免疫過(guò)氧化物單層分析是常用的檢測(cè)抗PRRSV抗體的實(shí)驗(yàn)室方法。然而，這些方法需要昂貴的設(shè)備和訓(xùn)練有素的技術(shù)人員。利用這些方法至少需要3天才能得到結(jié)果，其中包括郵寄結(jié)果的時(shí)間。另外，養(yǎng)豬農(nóng)民為了采集樣品并將其送到診斷實(shí)驗(yàn)室也要付出經(jīng)濟(jì)成本。一種用于檢測(cè)PRRSV抗體的以養(yǎng)殖場(chǎng)為基礎(chǔ)的簡(jiǎn)單而快速的試驗(yàn)在獸醫(yī)診所或養(yǎng)豬合作組織的實(shí)驗(yàn)室中是十分有用的。利用PRRSV疫苗來(lái)根除疾病在農(nóng)戶(hù)水平上通常是不成功的。方法如撲殺全部種群并從新建立種群可以有效地根除養(yǎng)殖場(chǎng)的病毒。但是，這種方法不能用于所有養(yǎng)殖場(chǎng)，并且操作起來(lái)經(jīng)濟(jì)損失相當(dāng)大。另外，這種方法依賴(lài)于PRRSV的檢測(cè)。某些PRRS病毒株的核酸序列及其編碼的蛋白已有報(bào)道。利用組織樣品，其中包括肺組織，檢測(cè)PRRSV也有討論(參見(jiàn)WO96/06619)，其結(jié)果與PRRSV優(yōu)先在肺泡肺巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的結(jié)果一致。通過(guò)口鼻途徑感染以后，PRRSV在肺巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，再進(jìn)入肺淋巴結(jié)，然后通過(guò)血流進(jìn)入其他器官內(nèi)。本文所文獻(xiàn)的引用并不等于承認(rèn)這些文獻(xiàn)是相關(guān)的在先領(lǐng)域。有關(guān)日期的所有描述或有關(guān)文獻(xiàn)內(nèi)容的陳述的根據(jù)是申請(qǐng)人所提供的信息，并不等于承認(rèn)日期或文獻(xiàn)內(nèi)容的正確性。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于檢測(cè)對(duì)象被豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)病毒，即PRRSV感染的試劑盒、裝置和方法。檢測(cè)可通過(guò)利用包含一種或多種PRRSV編碼蛋白和/或抗原的組合物來(lái)完成，其中蛋白和/或抗原可與抗所述蛋白的抗體結(jié)合。因此，本發(fā)明可被視為是基于"抗體捕獲"隨后檢測(cè)抗體的原理而建立的?？贵w是指被PRRSV感染的對(duì)象體內(nèi)存在而未感染個(gè)體內(nèi)不存在的那些抗體。一種或多種PRRSV編碼的蛋白包括核殼(N)蛋白和/或一種或多種病毒包膜("E")蛋白。蛋白可以是PRRSV感染細(xì)胞表面上的糖蛋白。蛋白也可被認(rèn)為是用于檢測(cè)對(duì)象體內(nèi)抗體的PRRSV抗原，其中抗體可識(shí)別PRRSV蛋白，從而識(shí)別PRRSV。PRRSV蛋白和/或抗原優(yōu)選用于本發(fā)明的試劑盒、裝置和方法中以便于在早期時(shí)間點(diǎn)根據(jù)對(duì)抗PRRSV抗體的檢測(cè)來(lái)檢測(cè)PRRSV感染。這種檢測(cè)方法依賴(lài)于抗體的存在，其中抗體是感染后早期被感染對(duì)象體內(nèi)存在的抗至少一種如本文所述的PRRSV蛋白和/或抗原的抗體。在第一方面，本發(fā)明提供了使用包含一種或多種PRRSV表達(dá)的蛋白和/或抗原的組合物來(lái)制造或使用本文所述試劑盒或裝置的方法。在某些實(shí)施方式中，所述裝置是被本發(fā)明的組合物包被的平皿。這種平皿的非限制性例子包括各種尺寸的培養(yǎng)皿以及微量滴定板的孔。這種平皿可用于診斷試驗(yàn)以檢測(cè)抗組合物中所含的一種或多種PRRSV蛋白和/或抗原的抗體。因此，這種裝置可用于檢測(cè)是否存在抗組合物中所含的一種或多種PRRSV蛋白和/抗原的抗體。被檢測(cè)的抗體可以存在于生物液樣品中，如果存在抗體，它可以作為用來(lái)采集樣品的對(duì)象存在PRRSV感染的指示劑。因此，該裝置可作為一種診斷PRRSV感染是否存在的快速方式。在本發(fā)明的這種裝置的核心是以固定形式存在于組合物中的一種或多種PRRSV蛋白和/或抗原。作為非限制性的例子，PRRSV蛋白和/或抗原可直接，例如通過(guò)吸附(例如，包被)或通過(guò)結(jié)合，固定到裝置的表面。另外，蛋白和/或抗原還可以間接固定，例如通過(guò)使用與蛋白和/或抗原結(jié)合的試劑或通過(guò)使用既和表面結(jié)合又和蛋白或抗原結(jié)合的連接子。因此，固定的PRRSV蛋白和/或抗原可以被看作是"捕獲劑"用于抗蛋白和/或抗原的抗體的結(jié)合以形成包含蛋白和/或抗原的固定復(fù)合物。當(dāng)然，固定的"捕獲劑"可被看作是能"捕獲"與因子結(jié)合的抗體的因子。然后，如本文所述，利用"檢測(cè)劑"檢測(cè)復(fù)合物，例如，與復(fù)合物結(jié)合的標(biāo)記試劑。如果"檢測(cè)劑"與復(fù)合物結(jié)合則說(shuō)明樣品中存在抗-PRRSV抗體。在某些實(shí)施方式中，"檢測(cè)劑"上標(biāo)記有第二抗體，樣品中如果存在抗體，第二抗體則與抗體結(jié)合，其中第二抗體作為復(fù)合物的一部分被固定?？?PRRSV抗體的存在可作為對(duì)象體內(nèi)存在PRRSV感染的指示劑，其中樣品取自該對(duì)象。如果沒(méi)有抗-PRRSV抗體則說(shuō)明沒(méi)有感染。樣品優(yōu)選取自豬對(duì)象或懷疑被PRRSV感染的其他對(duì)象，但是可能被PRRSV或PRRSV載體感染的任何對(duì)象都可用于本發(fā)明的裝置中。"檢測(cè)劑"可以被標(biāo)記以便于直接檢測(cè)，例如，通過(guò)連接一個(gè)特殊的標(biāo)記物，一旦充分凝集就可以用肉眼觀察到。另外，因子可以被標(biāo)記以便于間接檢測(cè)，例如，通過(guò)連接一個(gè)酶，該酶被檢測(cè)的依據(jù)是其對(duì)可檢測(cè)底物的活性，或者該酶可產(chǎn)生一個(gè)可被檢測(cè)的產(chǎn)物。當(dāng)然，"檢測(cè)劑"可以是"第二因子"，第二因子可結(jié)合能與本發(fā)明的復(fù)合物結(jié)合的標(biāo)記或未標(biāo)記"初級(jí)"結(jié)合因子。本發(fā)明的裝置還可以包含控制位點(diǎn)或控制區(qū)，其中控制位點(diǎn)或控制區(qū)位于裝置內(nèi)，無(wú)論加載到裝置上的樣品內(nèi)是否存在PRRSV抗體，控制位點(diǎn)或控制區(qū)都能確保裝置正確行使功能。這種控制的基礎(chǔ)在于對(duì)樣品內(nèi)存在的其他分子或大分子實(shí)體的檢測(cè)。如果不能被所使用的裝置的組分結(jié)合，本發(fā)明的PRRSV蛋白和/或抗原以及包含PRRSV抗原和/或蛋白的組合物還可用于檢測(cè)抗PRRSV蛋白和/或抗原的抗體的方法中。這種方法可被設(shè)計(jì)成用于檢測(cè)來(lái)自于對(duì)象的生物液內(nèi)的這種抗體，例如懷疑已被PRRSV感染的個(gè)體。該方法包括使樣品或其稀釋形式與PRRSV編碼蛋白和/或抗原接觸以確定樣品中是否存在與蛋白和/或抗原結(jié)合的抗體。抗體與PRRSV蛋白和/或抗原結(jié)合形成復(fù)合物，檢測(cè)到這種復(fù)合物則說(shuō)明存在抗體，因而說(shuō)明對(duì)象體內(nèi)存在PRRSV感染，其中樣品取自該對(duì)象。樣品優(yōu)選來(lái)自豬對(duì)象，但是被PRRSV或PRRSV載體感染的任何對(duì)象都可用于本發(fā)明?？捎糜趯?shí)現(xiàn)本發(fā)明的生物液的范圍包括其中存在可檢測(cè)水平的抗PRRSV蛋白和/或抗原的抗體的任何液體。非限制性的例子包括對(duì)象的體液，如血液、血清、血漿、唾液、眼淚、粘液、鼻涕和陰道分泌物。當(dāng)然，這種液體的稀釋液也可作為樣品用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。在某些實(shí)施方式中，包含EDTA或其他二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑的稀釋劑與來(lái)自于對(duì)象的生物液樣品以1:1的比例混合來(lái)使用。在使用血清或血漿的實(shí)施方式中，可以省略稀釋步驟。樣品優(yōu)選來(lái)自于懷疑已被PRRSV感染的個(gè)體，所以被懷疑是因?yàn)榇嬖陲@示感染的癥狀。另外，本發(fā)明的方法可作為動(dòng)物常規(guī)篩選的一部分來(lái)使用，例如養(yǎng)殖場(chǎng)所使用的用于快速鑒定和分離被感染個(gè)體的那些方法。方法還可在特殊的情況下使用，例如，在將動(dòng)物從一個(gè)地方運(yùn)輸或轉(zhuǎn)移到另一個(gè)地方前用于鑒定感染和防止感染擴(kuò)散。在本發(fā)明的許多實(shí)施方式中，對(duì)象是豬，因此樣品可以是豬的體液或分泌物?？蓮闹蝎@取樣品以用于本發(fā)明的豬的非限制性例子包括公豬、后備母豬、母豬、育肥豬、豬仔和未斷奶小豬。豬可以是從出生到死亡之間的任何豬齡的豬。非限制性的例子包括約30到約40、41到約50、或51到約60天或更大的豬，都可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。在某些實(shí)施方式中，所述方法是以垂直免疫擴(kuò)散酶分析(VIDEA)為基礎(chǔ)的方法。該方法利用固定的PRRSV蛋白和/或抗原，其中蛋白和/或抗原是利用可通透屏障從包含或懷疑包含抗PRRSV抗體的樣品中分離的。樣品通過(guò)多孔材料透過(guò)屏障，樣品中的抗PRRSV抗體擴(kuò)散通過(guò)屏障與PRRSV蛋白和/或抗原接觸?？贵w與蛋白禾口/或抗原的接觸導(dǎo)致復(fù)合物的形成，然后檢測(cè)復(fù)合物，如果有復(fù)合物形成則說(shuō)明樣品中存在抗體。檢測(cè)可以是采取一個(gè)區(qū)域的形式，其中含有復(fù)合物。在某些實(shí)施方式中，可通透屏障是瓊脂或瓊脂糖。在其他實(shí)施方式中，方法是以水平免疫擴(kuò)散酶分析(HIDEA)為基礎(chǔ)的方法。該方法與上述VIDEA相似，二者都利用固定的PRRSV蛋白和/或抗原。HIDEA方法包括通過(guò)可通透屏障從包含或懷疑包含抗PRRSV抗體的樣品中分離固定的蛋白/抗原。樣品直接提呈給屏障，這樣抗PRRSV抗體擴(kuò)散通過(guò)可通透屏障與PRRSV蛋白和/或抗原接觸。擴(kuò)散還可以是從樣品點(diǎn)向外呈放射狀擴(kuò)散，然后與屏障接觸?？贵w與蛋白和/或抗原的接觸導(dǎo)致復(fù)合物的形成，然后檢測(cè)復(fù)合物，如果有復(fù)合物形成則說(shuō)明樣品中存在抗體。檢測(cè)可以是采取圈或環(huán)的形式，其中含有復(fù)合物。在某些實(shí)施方式中，可通透屏障是瓊脂或瓊脂糖。本發(fā)明的各個(gè)方面都可用于與北美株抗原性相關(guān)的所有PRRSV株。因此，本發(fā)明的基礎(chǔ)通常被視為任何PRRSV病毒的蛋白。另外，提供了與制造這種裝置有關(guān)的方法。本發(fā)明的這種附加方面與本文所述的試劑盒、裝置和方法的組分的制備方法有關(guān)。本發(fā)明包括從感染PRRSV的細(xì)胞中制備PRRSV蛋白的方法。在某些實(shí)施方式中，在感染后的早期時(shí)間點(diǎn)收獲蛋白，這時(shí)蛋白的大部分或全部還依然保持著與被感染細(xì)胞聯(lián)系?；蛘邠Q一個(gè)說(shuō)法，大部分或全部PRRSV編碼蛋白或者存在于被感染細(xì)胞內(nèi)，或者與被感染細(xì)胞的細(xì)胞膜相連。在這種條件下，細(xì)胞外環(huán)境中存在的PRRSV顆粒相對(duì)很少，即使存在的話(huà)。另一方面提供了將第一結(jié)合因子固定在上述裝置的至少一個(gè)表面上的方法，例如但不限于PRRSV的N蛋白和/或一種或多種包膜蛋白。在本發(fā)明的其他方面，提供了包含本發(fā)明的裝置或用于實(shí)現(xiàn)本文所述的方法的試劑盒。其他方面包括用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所提供的一種或多種方法的組合物和制造條款。這種組合物的非限制性例子包括用于制備本發(fā)明的試劑盒或裝置的那些組合物。試劑盒的非限制性例子包括那些包含用于本文所公開(kāi)的方法中的，本發(fā)明的一種或多種組合物或因子或者本發(fā)明的一種或多種裝置的那些試劑盒。本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式的細(xì)節(jié)在附圖和下面的說(shuō)明中有描述。通過(guò)閱讀附圖、詳細(xì)描述和權(quán)利要求可以清楚地了解本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點(diǎn)。附圖簡(jiǎn)述圖1是代表兩個(gè)免疫擴(kuò)散酶分析(IDEA)的示意圖。圖中顯示的是垂直(VIDEA)和水平(HIDEA)實(shí)施方式，而圖中位置l、2和3是如何分別顯示陽(yáng)性、陰性和陽(yáng)性結(jié)果的。定義在本文中，術(shù)語(yǔ)豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)病毒，或PRRSV，是指可引起PRRS、神秘豬病(MSD)、豬不孕及呼吸綜合征(SIRS)(以前被稱(chēng)為"藍(lán)耳綜合征")、豬流行性流產(chǎn)及呼吸綜合征(PEARS)、瓦伯希綜合征(Wabashsyndrome)、神秘豬病(MPD)、豬瘟、英國(guó)的藍(lán)色流產(chǎn)病毒或藍(lán)耳病、荷蘭的藍(lán)耳病(abortusblau)、德國(guó)的豬藍(lán)耳病PRRSV蛋白是指由PRRSV基因組編碼的和/或僅僅作為PRRSV感染或PRRSV生命周期的結(jié)果而產(chǎn)生的任何多肽。因此，PRRSV特異性的以及非PRRSV感染細(xì)胞編碼的或表達(dá)的多肽都包含在這個(gè)術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)。PRRSV感染細(xì)胞編碼的，但是在沒(méi)有PRRSV感染和/或生命周期時(shí)不表達(dá)的內(nèi)源性多肽不屬于這個(gè)術(shù)語(yǔ)的范疇。然而，僅僅是作為PRRSV感染和/或生命周期的結(jié)果而表達(dá)的內(nèi)源性多肽處于這個(gè)術(shù)語(yǔ)的范圍之內(nèi)。該術(shù)語(yǔ)還包括因次級(jí)和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變而導(dǎo)致的其他形式的多肽，例如，非限制性的例子有部分或全部蛋白變性而產(chǎn)生的那些多肽。因此，多肽的變性形式也包括在該術(shù)語(yǔ)的范圍之內(nèi)。PRRSV抗原是指可被抗PRRSV抗體識(shí)別的PRRSV多肽的任何部分或片段。在某些情況下，部分或片段可以是帶有連接基序的肽，例如而不限于糖基序、磷酸根基序或脂質(zhì)基序。另外，部分或片段可以是不帶任何粘附非肽基序的肽。發(fā)明詳述及實(shí)施模式本發(fā)明涉及用于檢測(cè)抗PRRSV抗體的試劑盒、裝置和方法。檢測(cè)的基礎(chǔ)在于使用一種或多種可與抗所述蛋白的抗體結(jié)合的PRRSV編碼蛋白和/或抗原?？贵w是指那些存在于PRRSV感染對(duì)象體內(nèi)而不存在于未感染個(gè)體內(nèi)的抗體。本發(fā)明可被視為檢測(cè)捕獲抗體的"抗體捕獲"分析。本發(fā)明還可被視為用于檢測(cè)抗PRRSV抗體的以免疫擴(kuò)散為基礎(chǔ)的方法。本發(fā)明的基礎(chǔ)部分在于人們認(rèn)識(shí)到PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白，其中包括相關(guān)的核殼蛋白(N)、膜相關(guān)蛋白(M)以及至少4個(gè)包膜蛋白(E)，可用于檢測(cè)PRRSV對(duì)象體內(nèi)的抗體。換一種說(shuō)法，本發(fā)明的基礎(chǔ)部分在于發(fā)現(xiàn)了PRRSV感染對(duì)象體內(nèi)存在抗這些蛋白和/或其抗原性片段的抗體，因此，抗體的檢測(cè)提供了一種指示對(duì)象被PRRSV感染的良好方式。本發(fā)明還部分基于發(fā)現(xiàn)了某些條件和方法可用于獲得包含高濃度的與其他PRRSV蛋白和/或抗原相關(guān)的E蛋白的PRRSV蛋白和/或抗原組合物。因此，本發(fā)明包括從感染PRRSV的細(xì)胞中制備PRRSV蛋白和/或抗原的方法。在感染后的早期時(shí)間點(diǎn)收獲蛋白，這時(shí)蛋白的大部分或全部還依然保持著與被感染細(xì)胞聯(lián)系，或者是本發(fā)明的細(xì)胞相關(guān)性病毒組分(CAVC)的一部分。或者換一個(gè)說(shuō)法，大部分或全部PRRSV蛋白和/或抗原或者存在于被感染細(xì)胞內(nèi)，或者與被感染細(xì)胞的細(xì)胞膜相連。在這種條件下，細(xì)胞外環(huán)境中存在的PRRSV顆粒相對(duì)很少，即使存在的話(huà)。本發(fā)明的基礎(chǔ)部分在于意外地發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞被感染后的一段相對(duì)較短的時(shí)期內(nèi)，細(xì)胞可產(chǎn)生足量的PRRSV編碼蛋白，這些蛋白適用于本發(fā)明的檢測(cè)方法。在較早的時(shí)間點(diǎn)制備CAVC，例如在PRRSV顆粒產(chǎn)生和/或釋放到細(xì)胞外環(huán)境之前，還有提高安全性的好處，這樣所得到的CAVC就不會(huì)被非感染性的病毒顆粒污染。感染的細(xì)胞可以是能被PRRSV有效感染的任何細(xì)胞。非限制性的例子包括體外或體內(nèi)的豬細(xì)胞。體外細(xì)胞的一個(gè)非限制性例子是來(lái)源于被PRRSV感染的豬對(duì)象的原代細(xì)胞。體內(nèi)細(xì)胞的一個(gè)非限制性例子是PRRSV通過(guò)口鼻途徑感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)，這種細(xì)胞隨后可被收獲用于制備PRRSV蛋白和/或抗原。另一個(gè)非限制性例子是使用猿細(xì)胞系MARC-145。根據(jù)本發(fā)明的方法制備的PRRSV蛋白和/或抗原包括至少一種PRRSVN、M和E蛋白。這些蛋白的組合物也可從本發(fā)明的細(xì)胞中制備。在某些實(shí)施方式中，制備出的蛋白/抗原中E蛋白的比例相較N和M蛋白高。因此，本發(fā)明提供了從PRRS病毒感染細(xì)胞中制備PRRS病毒蛋白和抗原的方法，該方法包括a)提供一個(gè)被PRRS病毒感染的細(xì)胞群；b)將無(wú)細(xì)胞PRRS病毒與感染細(xì)胞分離以形成包含細(xì)胞相關(guān)PRRS病毒蛋白和抗原的細(xì)胞；以及c)從步驟b)分離的細(xì)胞中提取或洗脫P(yáng)RRS病毒蛋白和抗原。在沒(méi)有無(wú)細(xì)胞病毒存在的例子中，步驟b)可以修改為只是簡(jiǎn)單從可能干擾本方法的其他材料中分離細(xì)胞，例如用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。步驟b)可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的任何方法完成，例如，通過(guò)離心產(chǎn)生細(xì)胞團(tuán)和上清，然后去除或丟棄上清，或者利用膜過(guò)濾去除上清，保留細(xì)胞。步驟c)可任選通過(guò)將細(xì)胞重懸在緩沖液中來(lái)完成。在某些實(shí)施方式中，提取或洗脫是用包含去污劑的溶液完成的，因此，用于重懸細(xì)胞的緩沖液可能包含去污劑。在其他實(shí)施方式中，該方法包括利用PRRS病毒感染細(xì)胞群足夠的時(shí)間以使每毫升上清如用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中的感染單位降低到不可檢測(cè)的水平。非限制性的例子包括低于1015的組織培養(yǎng)感染量(TCIDs()/ml)。用于本方法的細(xì)胞群可任選用PRRS病毒感染足夠的時(shí)間以觀察CPE。當(dāng)然，細(xì)胞被感染的時(shí)間未達(dá)到可以觀察到CPE或CPE早期階段的長(zhǎng)度時(shí)的細(xì)胞也可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了從PRRS病毒感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)中制備PRRS病毒蛋白和抗原的方法。該方法包括從PAM細(xì)胞群中制備所述的蛋白和抗原，其中PAM細(xì)胞是通過(guò)灌洗口鼻接種PRRS病毒的豬的肺而獲得的。PRRS病毒蛋白和抗原可從上述細(xì)胞中提取或洗脫。因此，細(xì)胞可重懸到提取緩沖液中。在某些實(shí)施方式中，提取或洗脫是用包含去污劑的溶液完成的，因此，用于重懸細(xì)胞的緩沖液可能包含去污劑。包含去污劑的溶液可以是適于提取或洗脫P(yáng)RRSV蛋白和/或抗原的任何溶液。一個(gè)非限制性的例子是使用非離子型去污劑，如聚(乙烯甘油)對(duì)-異辛基-苯基醚、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(諾乃P-40(NonidetP-40))或曲通X-100(TritonX-100)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，溶液中去污劑的濃度約為0.5%，例如，約0.5。/。曲通X-100溶液。本發(fā)明還提供了從PRRS病毒感染細(xì)胞中制備PRRS病毒蛋白和抗原的方法。這種方法包括從體外或體內(nèi)方法制備的細(xì)胞群中制備所述的蛋白和抗原。對(duì)于體外方法來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)或MARC-145細(xì)胞系，感染PRRSV后收獲細(xì)胞。對(duì)于不使用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的體內(nèi)方法來(lái)說(shuō)，口鼻接種PRRS病毒后通過(guò)灌洗豬的肺來(lái)獲得PAM細(xì)胞。比較使用不同PRRSV分離株以及病毒接種后不同天數(shù)所產(chǎn)生的抗原，通過(guò)比較試驗(yàn)可以預(yù)先確定達(dá)到最高抗原產(chǎn)量所需要的最佳條件。當(dāng)然，本發(fā)明包括含有游離PRRSV蛋白和/或抗原的組合物，其中的游離PRRSV蛋白和/或抗原是利用本文公開(kāi)的任何方法制備的。組合物可用于使用PRRSV蛋白和/或抗原的任何目的。非限制性的例子包括用于制備抗蛋白/抗原的抗體；用作PRRSV蛋白的參照標(biāo)記；以及用作免疫原性組合物，例如疫苗制劑，可任選加入合適的佐劑，這種疫苗給予動(dòng)物后可產(chǎn)生免疫反應(yīng)。組合物的其他非限制性例子包括其中的蛋白/抗原是可溶或凍干(冷凍干燥)形式的那些組合物。在某些實(shí)施方式中，組合物溶解在適于包被表面的溶液中，例如本發(fā)明的裝置的表面。這種溶液可以使蛋白包被在培養(yǎng)皿的底部。非限制性的例子包括用pH9.6的0.06M碳酸鹽緩沖液稀釋的PRRSV蛋白/抗原溶液。溶液可用于包被平皿或孔的表面，例如聚苯乙烯或玻璃培養(yǎng)皿或多孔培養(yǎng)板的孔。倒掉未吸附的材料，然后任選用不含蛋白/抗原的緩沖液洗滌一次或多次。包被可在各種溫度下進(jìn)行，其中包括25。C以下，包被時(shí)間也可以各不相同。在某些實(shí)施方式中，包被可在4'C或約4。C進(jìn)行約72小時(shí)。因此，本發(fā)明還提供了用病毒蛋白和/或抗原包被表面的方法，所述方法包括a)提供一種包含如本文所述的一種或多種PRRS病毒蛋白和抗原的溶液；以及b)使所述的溶液與表面接觸一段時(shí)間以使所述的蛋白和抗原吸附到所述平皿的表面。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)利用如本文所述的包含去污劑的溶液從PRRSV感染細(xì)胞中提取或洗脫蛋白和/或抗原。在其他實(shí)施方式中，被包被的表面是用聚苯乙烯或玻璃或類(lèi)似材料制備的。優(yōu)選用乙醇洗滌表面，然后將其吸干。PRRSV蛋白/抗原溶液可用于清潔表面，使其吸附約2-4小時(shí)到過(guò)夜。蛋白/抗原可被稀釋到最佳濃度，約0.01到0.001%之間，優(yōu)選用碳酸鈉-碳酸氫鈉包被緩沖液稀釋以促使蛋白/抗原粘附到表面上。包被緩沖液的濃度優(yōu)選在約0.01M到0.1M之間(pH9到10)，其中每升溶液包含約0.84到8.4gNaHC03和0.11到10.6gNa2CO3。包被期過(guò)后，倒掉或用其他方式去掉多余的溶液。被包被的表面用蒸餾水或不含蛋白/抗原的緩沖液洗滌。用PRRSV蛋白和/抗原包被以后可以選擇再用封閉劑，例如而不限于，溶于pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)中的1。/。牛血清白蛋白(BSA)包被。包被可在各種溫度下進(jìn)行，其中包括約37"C包被不同的時(shí)間。在某些實(shí)施方式中，包被可以在37t:或約37"C進(jìn)行約1小時(shí)。使用封閉劑以后，去掉溶液，任選再用水或不含試劑的緩沖液洗滌一次或多次。包被以后，將可通透屏障層加到包被表面。屏障可以溶液的形式使用，在變干后形成可通透屏障。非限制性的例子包括瓊脂和/瓊脂糖溶液，這種溶液變干后形成由凝膠樣材料組成的可通透屏障。因此，可使用融化的瓊脂或瓊脂糖層，然后使其固定。瓊脂層的厚度并不是關(guān)鍵的，可以從至少約1.5mm，優(yōu)選從約2mm，到約10mm。制備瓊脂層的溶液濃度為約0.75到1.5%之間，優(yōu)選約1%。作為非限制性的例子，本文所述的以VIDEA為基礎(chǔ)的方法可使用直徑為60mm的聚苯乙烯培養(yǎng)皿和4ml溶于PBS中的0.6%瓊脂糖。以HIDEA為基礎(chǔ)的方法可使用6ml相同的溶液。溶液固定過(guò)夜，例如在4°C。如此包被的裝置可儲(chǔ)存，例如在4°C潮濕的容器內(nèi)，最多達(dá)4個(gè)月。具有如本文所述的包被表面的裝置可作為診斷試劑盒的全部或部分用于檢測(cè)抗PRRSV抗體。因此，本發(fā)明還提供了檢測(cè)抗PRRS病毒的抗體的方法，該方法包括a)采集對(duì)象的血樣或血清樣品；b)使所述樣品與本文所述的包被裝置的可通透屏障接觸；c)孵育所述樣品使分子如抗體擴(kuò)散通過(guò)可通透屏障與包被裝置的蛋白/抗原結(jié)合;d)去掉可通透屏障并任選洗滌裝置以去除未結(jié)合的抗體;e)檢測(cè)抗體與蛋白/抗原結(jié)合而形成的復(fù)合物。關(guān)于步驟b)中的裝置，一個(gè)非限制性的例子是裝置為平皿試驗(yàn)板(dishtestplate)，其中包括(l)具有平坦支持表面的平皿；(2)PRRSV蛋白/抗原包被吸附到所述表面上；以及(3)瓊脂層覆蓋所述的包被。關(guān)于步驟e)，方法可通過(guò)使用能與形成的復(fù)合物結(jié)合的檢測(cè)劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。一個(gè)非限制性的例子是使用第二抗體，其中第二抗體可與樣品中存在的抗體結(jié)合。這種第二抗體的非限制性例子包括來(lái)自于特殊動(dòng)物，例如，小鼠、大鼠、山羊、兔等，的那些抗體，第二抗體可識(shí)別被測(cè)樣品中的抗體的Fc部分。第二抗體可以連接標(biāo)記物以便于其檢測(cè)。連接通過(guò)將另一個(gè)基序連接到抗體上來(lái)修飾抗體?；騼?yōu)選可檢測(cè)標(biāo)記，其中包括可直接檢測(cè)的標(biāo)記，如放射性同位素、熒光標(biāo)記(非限制性的例子有Cy3和Cy5)或顆粒標(biāo)記。顆粒標(biāo)記的非限制性例子包括乳膠顆粒、金屬液膠以及膠體金顆粒。另外，標(biāo)記也可用于間接檢測(cè)。非限制性的例子包括酶，例如而不限于，過(guò)氧化物酶、熒光素酶、堿性磷酸酶以及辣根過(guò)氧化物酶。其他非限制性的例子包括可被另一種分子結(jié)合的分子，例如而不限于生物素、親和肽或純化標(biāo)記。標(biāo)記優(yōu)選共價(jià)連接。在某些實(shí)施方式中，第二抗體是酶偶聯(lián)的豬免疫球蛋白，它可以在約30到約60分鐘內(nèi)結(jié)合復(fù)合物內(nèi)的抗體。結(jié)合以后，通過(guò)一次或多次可選的洗滌去除未結(jié)合的第二抗體。酶可以是任何合適的酶，例如用于酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)中的酶，其中包括過(guò)氧化物酶。過(guò)氧化物酶與氨基水楊酸和過(guò)氧化氫，或者對(duì)苯二胺和過(guò)氧化氫反應(yīng)時(shí)可產(chǎn)生紫色。堿性磷酸酶與二硝基磷酸苯酯反應(yīng)時(shí)可產(chǎn)生黃色。e半乳糖苷酶與O-硝基苯基-日-D-半乳糖基吡喃糖苷反應(yīng)可產(chǎn)生紫色。作為酶聯(lián)二抗的另一個(gè)非限制性例子，通過(guò)檢測(cè)結(jié)合的二抗來(lái)檢測(cè)復(fù)合物可通過(guò)覆蓋包含底物的瓊脂溶液來(lái)介導(dǎo)，其中底物與酶反應(yīng)后可產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，例如，生成顏色就是一個(gè)非限制性的例子。在某些實(shí)施方式中，可檢測(cè)信號(hào)是可見(jiàn)的，例如通過(guò)肉眼觀察。信號(hào)可以和使用陽(yáng)性對(duì)照(包含可與包被表面結(jié)合的已知抗PRRSV抗體)所觀察到的和/或使用不包含這種抗PRRSV抗體的陰性對(duì)照所觀察到的生色反應(yīng)比較。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，特別是本文所述的VIDEA中，收集樣品并用于多孔材料(或者通過(guò)多孔材料收集)，例如而不限于濾紙或?yàn)V紙盤(pán)。作為非限制性的例子，在使用濾紙盤(pán)的情況下，濾紙盤(pán)平放到可通透屏障上，以使分子從濾紙盤(pán)擴(kuò)散，通過(guò)屏障到達(dá)包被表面。在表面上，樣品中可結(jié)合本發(fā)明的PRRSV蛋白/抗原的分子(如抗體)與蛋白/抗原形成復(fù)合物。因此，樣品中的分子被固定到包被的表面上。在某些實(shí)施方式中，擴(kuò)散和復(fù)合物形成所需的時(shí)間為約2到3小時(shí)，在室溫(25t:)或約37°C下進(jìn)行。復(fù)合物形成以后，去掉可通透屏障。在某些包含瓊脂或瓊脂糖屏障的實(shí)施方式中，可剝離掉瓊脂或瓊脂糖層，然后任選洗滌。本發(fā)明方法的根據(jù)是復(fù)合物的形成，其中復(fù)合物包含與本文所述的樣品中的抗PRRSV抗體結(jié)合的PRRSV蛋白/抗原?？梢詸z測(cè)抗PRRSV抗體以降低檢測(cè)復(fù)合物的難度。在樣品中檢測(cè)到PRRSV蛋白/抗原與抗PRRSV抗體形成的復(fù)合物說(shuō)明對(duì)象體內(nèi)存在PRRSV感染，其中樣品取自該對(duì)象。本發(fā)明還提供了垂直免疫擴(kuò)散酶分析(VIDEA)方法，所述方法包括a)提供一個(gè)至少一個(gè)表面被本文所述的一種或多種PRRSV蛋白和抗原包被的診斷裝置，所述表面被本文所述的可通透屏障覆蓋；b)使屏障的表面與包含抗體的多孔材料接觸，其中抗體包含在對(duì)象來(lái)源的樣品中；c)孵育所述裝置足夠的時(shí)間以使材料從所述樣品擴(kuò)散到所述一個(gè)或多個(gè)表面，所述的孵育期任選在去除多孔材料之后進(jìn)行；以及d)在去除可通透屏障后檢測(cè)平皿表面是否存在抗體。在某些實(shí)施方式中，多孔材料是紙盤(pán)。本發(fā)明還提供了水平免疫擴(kuò)散酶分析(HIDEA)方法，所述方法包括a)提供一個(gè)至少一個(gè)表面被本文所述的一種或多種PRRSV蛋白和抗原包被的診斷裝置，所述表面被本文所述的可通透屏障覆蓋，其中所述表面上有一個(gè)或多個(gè)缺口用于接納樣品；b)使一個(gè)或多個(gè)缺口與包含抗體的來(lái)源于對(duì)象的樣品接觸；c)孵育所述裝置足夠的時(shí)間以使材料從所述樣品擴(kuò)散到所述一個(gè)或多個(gè)表面；以及d)在去除可通透屏障后檢測(cè)平皿的表面是否存在抗體。在某些實(shí)施方式中，在可通透屏障上打出一個(gè)到一組小孔，形成缺口，用作試驗(yàn)樣品孔?？椎闹睆郊s為l到4mm，穿透瓊脂包被。使用帶7個(gè)3mm園孔的模板在每一個(gè)HIDEA試驗(yàn)平皿的瓊脂上打孔是一個(gè)非限制性的例子。在VIDEA和HIDEA實(shí)施方式中，樣品是血清樣品或全血樣品。方法可用于被PRRSV感染或懷疑被PRRS病毒感染的各種動(dòng)物和/或?qū)ο髞?lái)源的樣品。診斷裝置可以是培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板或培養(yǎng)板的孔。每一組試驗(yàn)樣品都要設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。相同量的對(duì)照血清加到試驗(yàn)裝置的其他孔內(nèi)。培養(yǎng)板孵育以后，剝?nèi)キ傊z層，洗滌培養(yǎng)板，例如用洗滌緩沖液洗滌，溶于磷酸鹽緩沖液中的吐溫20是洗滌緩沖液的一個(gè)非限制性例子。培養(yǎng)板可以用蒸餾水或自來(lái)水而非洗滌緩沖液洗滌。洗滌可去除未結(jié)合的抗體(非特異性的)以及其他污染物。VIDEA和HIDEA方法包括利用抗原-抗體反應(yīng)形成復(fù)合物，利用可與復(fù)合物結(jié)合的檢測(cè)劑，例如，第二抗體，檢測(cè)復(fù)合物，例如通過(guò)結(jié)合復(fù)合物的抗體部分。檢測(cè)劑在室溫下與復(fù)合物保持接觸約30分鐘到約2小時(shí)。然后洗滌培養(yǎng)板以去除未結(jié)合的連接物，例如，用緩沖液洗滌就是一個(gè)非限制性例子。洗滌液可用注射器或移液管從試驗(yàn)培養(yǎng)板的邊上緩慢加入和移出。這個(gè)過(guò)程可任選重復(fù)3次或多次。在孵育檢測(cè)劑的同時(shí)制備瓊脂或瓊脂糖包被。作為非限制性的例子，優(yōu)選溶于磷酸鹽緩沖液中的1%瓊脂溶液，瓊脂融化后加入結(jié)合酶的底物。在某些實(shí)施方式中，需要加入催化劑。作為非限制性的例子，如果酶是過(guò)氧化物酶，1%瓊脂溶液可以包含約0.05%到1.0%的5-氨基水楊酸作為底物，以及約0.002%到0.01%的過(guò)氧化氫作為催化劑。也可以使用約0.08%的底物和約0.005%的催化劑。瓊脂傾注到經(jīng)洗滌的表面上，使其固定。第二抗體的酶之間的生色反應(yīng)可在瓊脂支持層內(nèi)發(fā)生。通過(guò)酶-底物反應(yīng)可使反應(yīng)產(chǎn)生可視化的結(jié)果。通過(guò)測(cè)定HIDEA中的深紫色圓形帶的直徑以及VIDEA中是否存在顏色或顏色的密度可以確定抗體的量。在HIDEA中，產(chǎn)生的顏色形成圓形帶或環(huán)的形式。在底物反應(yīng)的約5到30分鐘內(nèi)，環(huán)的顏色就深到足以測(cè)定的程度。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，環(huán)的顏色變得更深，但是不會(huì)擴(kuò)大。所形成的環(huán)的直徑與血液中存在的特異性抗體的量有關(guān)(即，病毒中和滴度)。測(cè)量深色圓形帶的直徑，并與標(biāo)準(zhǔn)病毒中和試驗(yàn)抗體值相關(guān)聯(lián)。所確定的值與試驗(yàn)培養(yǎng)板上樣品孔的直徑以及所使用的樣品的大小有關(guān)。本發(fā)明的每一個(gè)裝置或本發(fā)明的每一個(gè)試劑盒都帶有一個(gè)數(shù)值表和/或代表性環(huán)的說(shuō)明書(shū)。檢測(cè)VIDEA和HIDEA裝置內(nèi)的表面上存在的抗體意味著檢測(cè)與表面上PRRSV蛋白/抗原結(jié)合的抗體。檢測(cè)可利用本文描述的任何方法完成，其中包括利用標(biāo)記的第二抗體。其他非限制性的方法包括通過(guò)酶-底物反應(yīng)顯示抗原-抗體反應(yīng)，如果存在生色反應(yīng)則說(shuō)明存在抗PRRSV抗體(定性的)，或者通過(guò)測(cè)定反應(yīng)所產(chǎn)生的顏色密度來(lái)確定抗-PRRSV抗體的量(定量或半定量的)。PRRSV蛋白/抗原以及包含蛋白/抗原的組合物、方法和裝置適用于按照大家熟知的方法制備試劑盒。因此，本發(fā)明提供了包含如本文所述的PRRSV蛋白/抗原的試劑盒，或者包含PRRSV蛋白/抗原的組合物或裝置，這些都可用于本文所述的一種或多種方法中。這種試劑盒還可任選包含鑒定說(shuō)明書(shū)或標(biāo)記物或與其如何用于本發(fā)明的方法中有關(guān)的說(shuō)明書(shū)。這種試劑盒可包含容器，每一個(gè)容器都包含方法所使用的一種或多種試劑(一般是濃縮的形式)或裝置。包含本發(fā)明的裝置的試劑盒還可以包含裝置所使用的一種或多種其他試劑或設(shè)備配件，其中的裝置是本發(fā)明的方法所使用的。試劑盒所包含的其他材料的非限制性例子有樣品稀釋溶液、稀釋劑瓶和用于轉(zhuǎn)移樣品的滴管。其他非限制性的例子包括用于VIDEA裝置的多孔材料和第二抗體?，F(xiàn)在己經(jīng)一般性地描述了本發(fā)明，通過(guò)參考下面的實(shí)施例可以更容易地理解本發(fā)明，下面的實(shí)施例是通過(guò)說(shuō)明的方式提供的，并不意味著對(duì)本發(fā)明的限制，除非特別說(shuō)明。實(shí)施例實(shí)施例l:PRRSV蛋白和平皿的制備PRRSV蛋白可通過(guò)如下過(guò)程制備利用PRRSV株接種體外或體內(nèi)的易感細(xì)胞，在最佳的時(shí)間收獲被感染的細(xì)胞用于制備與細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的病毒組分。在體外方法中，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或通過(guò)使用重組技術(shù)制備抗原。另外，在用PRRSV口鼻接種并洗滌肺(肺灌洗)后可以獲得PRRSV感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)。通過(guò)離心使細(xì)胞成團(tuán)，去掉或棄去上清。細(xì)胞團(tuán)還可以經(jīng)過(guò)洗滌。將細(xì)胞團(tuán)重懸到0.05M三(羥甲基)氨基甲垸0.025MEDTA緩沖液中，其中包含0.5%曲通X-IOO，緩沖液的體積為濃集細(xì)胞的5-10倍?；旌衔镌?'C攪拌2-15小時(shí)，10,000g離心1小時(shí)。上清用作PRRSV抗原?？乖欠歉腥拘缘?，用途廣泛而沒(méi)有導(dǎo)致病毒傳播的風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)比較試驗(yàn)預(yù)先確定用約pH9.6的0.06M碳酸鹽緩沖液稀釋PRRSV蛋白航原。通過(guò)在4'C吸附72小時(shí)將抗原包被到聚苯乙烯培養(yǎng)皿(直徑60mm)上。倒掉未吸附的抗原，培養(yǎng)皿與溶于磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2)中的封閉劑(例如，1%牛血清白蛋白，BSA)在37'C共孵育1小時(shí)。去掉BSA以后將6ml(對(duì)于HIDEA來(lái)說(shuō))和4ml(對(duì)于VIDEA來(lái)說(shuō)訴PBS溶解的0.6%瓊脂糖覆蓋到培養(yǎng)皿上。瓊脂在4'C固定過(guò)夜。在HIDEA中，用包含7個(gè)3mm圓形孔的模具在每個(gè)試驗(yàn)培養(yǎng)皿的瓊脂上打孔。在VIDEA中，使用不帶孔的培養(yǎng)皿。所有試驗(yàn)皿在4'C的潮濕容器內(nèi)最多都可儲(chǔ)存4個(gè)月。實(shí)施例2:VIDEA試驗(yàn)板通過(guò)如下過(guò)程制備將病毒抗原包被到培養(yǎng)皿的底部，然后再用上述瓊脂凝膠覆蓋。在使用過(guò)程中，濾紙盤(pán)用豬的試驗(yàn)血清浸濕，然后放到試驗(yàn)板的瓊脂上。平坦的濾紙盤(pán)提供了一個(gè)近乎二維的起始區(qū)，這樣樣品如血清內(nèi)的物質(zhì)一般以一個(gè)方向移動(dòng)通過(guò)瓊脂并到達(dá)包被表面。孵育一段時(shí)間之后剝?nèi)ツz，培養(yǎng)皿用5-8ml洗滌溶液(包含0.05%吐溫-20(Tween-20^々PBS)洗滌3次。然后加入3ml用PBS稀釋的商品化的過(guò)氧化物酶連接的兔抗豬IgG(l-2pg/ml)，在25'C孵育45分鐘。培養(yǎng)皿再用洗滌溶液洗滌3次，然后用5ml溶于PBS中的1%瓊脂覆蓋培養(yǎng)皿，其中分別包含0.08%的底物(5-氨基水楊酸)和0.005%的H202。記錄VIDEA試驗(yàn)是否產(chǎn)生顏色以及顏色的密度。在一個(gè)試驗(yàn)中，剝?nèi)キ傊笤?5或37匸孵育2到3小時(shí)。約5到10分鐘后根據(jù)發(fā)生顏色反應(yīng)的陽(yáng)性樣品來(lái)確定過(guò)氧化物酶反應(yīng)的結(jié)果。具有已知ELISAS/P比例或PRRS病毒感染歷史的各種血清樣品與天然動(dòng)物來(lái)源的樣品一起檢測(cè)。比較VIDEA與ELISA的敏感性和特異性。下面的表1總結(jié)了各種豬血清的VIDEA結(jié)果和相應(yīng)的ELISAS/P比例的結(jié)果。分析結(jié)果之間的百分一致性顯示在括號(hào)內(nèi)。對(duì)于ELISA試驗(yàn)中表現(xiàn)為陰性的豬血清來(lái)說(shuō)，VIDEA也表現(xiàn)出了100%的特異性。在25°C孵育約3小時(shí)后，與ELISA比較時(shí)所有樣品都表現(xiàn)出了100%的一致性。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>抗原-抗體反應(yīng)持續(xù)2小時(shí)以?xún)?nèi)，但是，在抗體滴度較低的情況下更長(zhǎng)的時(shí)間似乎是有益的，這可從短時(shí)間孵育時(shí)出現(xiàn)的假陰性結(jié)果中看出。VIDEA與ELISAS/Prations的高度相關(guān)性說(shuō)明VIDEA作為一個(gè)分析方法能夠用于檢測(cè)抗PRRS病毒抗體。與<0.4的ELISAS/P比例的相關(guān)性說(shuō)明VIDEA的敏感性與ELISA相似，<0,4這個(gè)數(shù)值是標(biāo)準(zhǔn)閾值。實(shí)施例2:HIDEA可使用具有包被表面和可通透屏障的本發(fā)明的裝置，其中屏障材料可加以改造，在屏障表面上形成一個(gè)或多個(gè)缺口。以瓊脂糖作為非限制性的例子，可在瓊脂糖上鉆出一個(gè)或多個(gè)孔。每一個(gè)孔內(nèi)加入0.015ml試驗(yàn)血清。裝置在室溫(25T:)下孵育約12到約24小時(shí)使抗體擴(kuò)散，抗原抗體發(fā)生反應(yīng)。該裝置用于其他試驗(yàn)時(shí)可孵育24小時(shí)。孵育后剝?nèi)ツz，培養(yǎng)皿用5到8ml洗滌溶液(包含0.05%吐溫-20的PBS)洗滌3次。然后加入3ml用PBS稀釋的商品化的過(guò)氧化物酶連接的兔抗豬IgG(l-2嗎/ml)，在25。C孵育45分鐘。培養(yǎng)皿再用洗滌溶液洗滌3次，然后用5ml溶于PBS中的1%瓊脂覆蓋培養(yǎng)皿，其中分別包含0.08%的底物(5-氨基水楊酸)和0.005%的H202。對(duì)于HIDEA來(lái)說(shuō)，反應(yīng)進(jìn)行5到30分鐘后測(cè)定深紫色圓形帶的直徑，單位為mm。表2和表3列出了不同條件下的14個(gè)被測(cè)血清的不同直徑。在HIDEA中，<7mm的直徑被認(rèn)為是陰性的。某些ELISA陰性血清在HIDEA中表現(xiàn)為陽(yáng)性結(jié)果說(shuō)明HIDEA的敏感性更高。表3的結(jié)果說(shuō)明HIDEA有較高的重復(fù)性。表2.在室溫(25t:)下孵育不同時(shí)間時(shí)具有不同ELISAS/P比例的豬血清的HIDEA直徑孵育時(shí)間被測(cè)血清15小時(shí)18小時(shí)20小時(shí)24小時(shí)1無(wú)PRRS3承642無(wú)PRRS46453ELISAS/P比例**0.0678994ELISAS/P比例0.2181010105ELISAS/P比例0.7381111116ELISAS/P比例1.96111314147ELISAS/P比例2.8312141515*HIDEA中的直徑；大于7mm為陽(yáng)性**ELISAS/P比例大于0.4為陽(yáng)性表3.在室溫(25t:)下孵育不同時(shí)間時(shí)具有不同ELISAS/P比例的7份豬血清的<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*HIDEA中的直徑；大于7mm為陽(yáng)性**ELISAS/P比例大于0.4為陽(yáng)性文中引用的所有參考文獻(xiàn)都通過(guò)引用全文納入本文，無(wú)論是否特地納入本文。在本文中，術(shù)語(yǔ)"一個(gè)"、"一種"和"任何"都包含單數(shù)或復(fù)數(shù)形式?，F(xiàn)在已經(jīng)全面描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚的是，只要不偏離本發(fā)明的精神和范圍，無(wú)需過(guò)多的試驗(yàn)就可以在一個(gè)較寬范圍的等價(jià)參數(shù)、濃度和條件下得到相同的結(jié)果。雖然通過(guò)聯(lián)系本發(fā)明的特殊實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做了描述，但是，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明可作進(jìn)一步修改。根據(jù)本發(fā)明的總體原則，本申請(qǐng)有意涵蓋本發(fā)明的所有變化、用途或應(yīng)用，其中包括進(jìn)入本發(fā)明所述領(lǐng)域已知的或慣常的實(shí)踐中的本公開(kāi)的這種偏差，這些也適用于上文所描述的基本特征。權(quán)利要求1.一種從PRRS病毒感染細(xì)胞中制備PRRS病毒蛋白和抗原的方法，該方法包括a)提供一群被PRRS病毒感染的細(xì)胞；b)將無(wú)細(xì)胞PRRS病毒與所述感染細(xì)胞分離以形成包含與細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的PRRS病毒蛋白和抗原的細(xì)胞；以及c)利用含去污劑的溶液從步驟b)分離的細(xì)胞中提取或洗脫P(yáng)RRS病毒蛋白和抗原。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞群已用PRRS病毒感染足夠時(shí)間以使上清中產(chǎn)生的病毒量達(dá)到低于10^組織培養(yǎng)感染量(TCID)5o/ml。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞群已用PRRS病毒感染足夠時(shí)間以觀察早期CPE。4.如權(quán)利要求1或2之一所述的方法，其特征在于，所述包含去污劑的溶液含有0.5。/。曲通X-100。5.如權(quán)利要求l、2、3或4所述的方法，其特征在于，所述提取或洗脫在4'C進(jìn)行約2至lj15小時(shí)。6.如權(quán)利要求l、2、3、4或5所述的方法，其特征在于，所述蛋白和抗原包括PRRS病毒包膜蛋白或N蛋白。7.通過(guò)權(quán)利要求l、2、3、4、5或6所述方法制備的PRRS病毒蛋白和抗原。8.—種診斷裝置，其包含至少一個(gè)被權(quán)利要求7所述的一種或多種PRRS病毒蛋白和抗原包被的表面。9.一種診斷裝置，其包含至少一個(gè)被一種或多種PRRS病毒蛋白和抗原包被的表面，所述蛋白和抗原用包含去污劑的溶液從PRRS病毒感染的細(xì)胞中提取或洗脫。10.如權(quán)利要求8或9所述的裝置，其特征在于，所述一種或多種PRRSV蛋白和抗原包含PRRS病毒編碼的核殼蛋白和/或包膜蛋白。11.如權(quán)利要求8或9所述的裝置，其特征在于，所述一種或多種PRRSV蛋白和抗原包含PRRS病毒編碼的糖蛋白。12.如權(quán)利要求9所述的裝置，其特征在于，所述溶液含有0.5。/。曲通X-100。13.—種垂直免疫擴(kuò)散酶分析(VIDEA)方法，所述方法包括a)提供一個(gè)至少一個(gè)表面被權(quán)利要求7所述的一種或多種PRRS病毒蛋白和抗原包被的診斷裝置，在所述至少一個(gè)表面上所述表面已被一層瓊脂或瓊脂糖覆蓋；b)使瓊脂或瓊脂糖表面與包含抗體的多孔材料接觸，其中所述抗體包含在對(duì)象來(lái)源的樣品中；C)孵育所述裝置足夠時(shí)間以使材料從所述樣品擴(kuò)散到所述一個(gè)或多個(gè)表面，所述孵育期任選在去除多孔材料之后進(jìn)行；以及d)在去除瓊脂或瓊脂糖后檢測(cè)培養(yǎng)皿表面是否存在抗體。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述樣品是血清樣品或全血樣品。15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述多孔材料是紙盤(pán)。16.如權(quán)利要求13、14或15所述的方法，其特征在于，所述對(duì)象被懷疑感染了PRRS病毒。17.—種水平免疫擴(kuò)散酶分析(HIDEA)方法，所述方法包括a)提供一個(gè)至少一個(gè)表面被權(quán)利要求7所述的一種或多種PRRS病毒蛋白和抗原包被的診斷裝置，在所述至少一個(gè)表面上所述表面已被一層包括一個(gè)或多個(gè)容納樣品的缺口的瓊脂或瓊脂糖覆蓋；b)使一個(gè)或多個(gè)缺口與對(duì)象來(lái)源的包含抗體的樣品接觸；c)孵育所述裝置足夠時(shí)間以使材料從所述樣品擴(kuò)散到所述一個(gè)或多個(gè)表面；以及d)在去除瓊脂或瓊脂糖后檢測(cè)培養(yǎng)皿表面是否存在抗體。18.如權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述裝置是培養(yǎng)皿。19.一種用病毒蛋白和抗原包被表面的方法，所述方法包括a)提供包含權(quán)利要求7所述的一種或多種PRRS病毒蛋白和抗原的溶液；以及b)使所述溶液與表面接觸一段時(shí)間以使所述蛋白和抗原吸附到所述培養(yǎng)皿的表面上。20.—種用病毒蛋白和抗原包被表面的方法，所述方法包括a)提供包含PRRS病毒感染細(xì)胞來(lái)源的一種或多種PRRS病毒蛋白和抗原的溶液，所述蛋白和抗原是利用包含去污劑的溶液從所述細(xì)胞中提取或洗脫的；以及b)使所述溶液與表面接觸一段時(shí)間以使所述蛋白和抗原吸附到所述培養(yǎng)皿的表面上。21.如權(quán)利要求19或20所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)皿是用聚苯乙烯制成的。全文摘要本發(fā)明提供了用于檢測(cè)能識(shí)別豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的一種或多種蛋白質(zhì)和/或抗原的抗體的試劑盒、裝置和方法。所述抗體可存在于被PRRSV感染或有被PRRSV感染的風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象的生物液內(nèi)。本發(fā)明優(yōu)選用于PRRSV感染的診斷和預(yù)防。文檔編號(hào)G01N33/569GK101253261SQ200680029448公開(kāi)日2008年8月27日申請(qǐng)日期2006年6月30日優(yōu)先權(quán)日2005年7月5日發(fā)明者E·P·門(mén)德,H·-S·朱申請(qǐng)人:明尼蘇達(dá)大學(xué)董事會(huì)