專利名稱：提高毛細(xì)管區(qū)帶電泳靈敏度的方法和儀器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
10002本發(fā)明涉及提高毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)靈敏度的新方法和儀 器。本發(fā)明尤其關(guān)注由包括在線溶膠-凝膠柱的通道組成的可以濃縮 毛細(xì)管電泳樣品的儀器，以及使用該儀器提高毛細(xì)管區(qū)帶電泳的靈敏 度。
背景技術(shù)：
00031對(duì)生物分子包括蛋白質(zhì)、多肽和DNA進(jìn)行分析的需求日益增 長。毛細(xì)管電泳(CE)是一種基于分子的大小和電荷進(jìn)行分離的方 法。在毛細(xì)管電泳中，分子進(jìn)入液體填充的毛細(xì)管并受到電場的作用 (見Kemp， G. (1998) "Capillary electrophoresis: a versatile family
of analytical techniques (毛細(xì)管電泳 一類多功能分析技術(shù))，"
Biotechnol. Appl. Biochem. 27:9—17; Wu, D.爭.(1992)。 Schwartz, H等 人對(duì)毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行了綜述("Separation of Proteins and Peptides by Capillary Electrophoresis: Application to Analytical Biotechnology (蛋白和肽的毛細(xì)管電泳分離分析型生物及栓的應(yīng) 用)，"Beckman BioResearch Literature No. 727484)。
高峰容量(即，每單位時(shí)間可分離的峰數(shù))使CZE成為一種分 析各種生物分子的有效方法，包括蛋白質(zhì)和多肽(Kasicka, V. (2004) "Recent Advances In Capillary Electrophoresis And Capillary Electrochromatography Of Peptides (肽的毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管色 語新進(jìn)展),"Electrophoresis 24(22-23):4013-4046; Kasicka, V. (2001) "Recent Advances In Capillary Electrophoresis Of Peptides (肽的 毛細(xì)管電泳新進(jìn)展)，，，Electrophoresis 22(19):4139-4162; Bossuyt, X. (2003) "Separation Of Serum Proteins By Automated Capillary Zone Electrophoresis (自動(dòng)毛細(xì)管區(qū)帶電泳對(duì)血清蛋白的分離)，" Clin Chem Lab Med. 41(6):762-772); Monton, M.R. (2005) "Recent Developments In Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry Of Proteins And Peptides (蛋白和肽的毛細(xì)管電泳質(zhì)語新進(jìn)展)，" Anal Sci. 21(1):5-13);核酸分子(Mitchelson， K.R. (2001) "THE Application Of Capillary Electrophoresis For DNA Polymorphism Analysis (毛細(xì)管電泳分析DNA多形性的應(yīng)用)，" Methods Mol Biol. 162:3-26);藥物(Hilhorst， M.J 等(2001) "CAPILLARY
Electro腿etic Separation Techniques For Profiling Of Drugs And Related Products (藥物及相關(guān)產(chǎn)物圖譜的毛細(xì)管電動(dòng)力學(xué)分 離技術(shù))，，，Electrophoresis 22(12):2542-2564)，農(nóng)業(yè)化合物(Menzinger, F.等(2000) "Analysis Of Agrochemicals By Capillary Electrophoresis (農(nóng)業(yè)化學(xué)品的毛細(xì)管電泳分析),"j Chromatogr A. 891(1):45-67)甚至細(xì)菌和病毒(Kremser, L.等(2004) "capillary Electrophoresis Of Biological Particles: Viruses, Bacteria, And EukaryoticCells (生物學(xué)顆粒的毛細(xì)管電泳分析病毒、細(xì)菌和真 核生物細(xì)胞)，"Electrophoresis 25(14).'2282-2291)。0011|雖然CZE具有許多優(yōu)點(diǎn)，但是CZE基于濃度的檢測限遠(yuǎn)小于 HPLC并且還不足以滿足很多實(shí)際應(yīng)用的要求。CZE的局限性反應(yīng)出 毛細(xì)管筒流動(dòng)室中極短(通常是HPLC流動(dòng)室路徑長度的1%)的毛 細(xì)管內(nèi)路徑長度(即，檢測窗)。較短的路徑長度意味著必須有更高 的分析物濃度才可以被檢測到(Shihabi, Z.K. (2000) "STACKINGIn Capillary Zone Electrophoresis (毛細(xì)管區(qū)帶電泳中的堆疊)，"j Chromatogr A. 902(1): 107-117)。因此，雖然已有之前的這些進(jìn)展但是我們?nèi)匀恍枰梢越鉀Q分 析低濃度樣品中存在的問題并且使CET可應(yīng)用于分析低濃度樣品的 方法和儀器。 發(fā)明概述
0018j詳細(xì)而言，本發(fā)明提供了一種包含由含有色譜吸附顆粒的聚合 烷基硅酸鹽凝膠基質(zhì)塊材料形成的毛細(xì)管筒的通道的溶膠-凝膠濃縮 裝置，該裝置中的凝膠基質(zhì)在允許溶劑蒸發(fā)而不影響該塊材料穩(wěn)定性 的條件下聚合。
10019j本發(fā)明尤其關(guān)注這種溶膠-凝膠濃縮裝置的應(yīng)用，這種裝置中的 通道可以是一種微通道、 一種毛細(xì)管筒或一種柱子等。本發(fā)明尤其關(guān) 注這樣一種裝置的應(yīng)用，其中的凝膠基質(zhì)在毛細(xì)管筒中聚合，該毛細(xì) 管筒與多孔玻璃粘結(jié)并且微通道包埋在碎片或板中。
本發(fā)明尤其關(guān)注這樣一種溶膠-凝膠濃縮裝置的應(yīng)用，其中的分 步、多步溫育包括在適于促進(jìn)硅膠塊材料聚合并不引起溶劑顯著蒸發(fā) 的條件下加熱，然后在足以促進(jìn)溶劑從聚合硅膠塊材料中揮發(fā)的條件
下溫育，然后在足以固化烷基硅酸鹽凝膠基質(zhì)的條件下溫育。本發(fā)明 尤其關(guān)注這樣一種溶膠-凝膠濃縮裝置的應(yīng)用，其中該裝置應(yīng)用于分 析或制備過程以促進(jìn)對(duì)樣品中分析物的濃縮。
10022本發(fā)明還關(guān)注這樣一種溶膠-凝膠濃縮裝置的應(yīng)用，其中的分析 或制備方法選自液相色譜、毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管電 色譜法、反相色譜法、離子交換色譜、吸附色i普和正相色譜。(J023I本發(fā)明尤其關(guān)注這樣一種溶膠-凝膠濃縮裝置的應(yīng)用，其中的分 析或制備方法選自免疫測定法和酶促反應(yīng)，并且/或其中的分析物選 自蛋白質(zhì)、肽、核酸分子、藥物、農(nóng)業(yè)化合物、細(xì)菌和病毒。 |00241本發(fā)明還進(jìn)一 步提供了濃縮分析或制備過程中樣品分析物的方 法，其中該方法包括使用由含有色鐠吸附顆粒的聚合烷基硅酸鹽凝膠 基質(zhì)組成的溶膠-凝膠濃縮裝濃縮分析物，其中所述凝膠基質(zhì)在足以 允許溶劑揮發(fā)而且不顯著影響硅膠塊材料穩(wěn)定性的條件下聚合。
本發(fā)明尤其關(guān)注這樣一些方法的應(yīng)用，其中所述裝置被應(yīng)用于 分析或制備方法中以促進(jìn)對(duì)樣品分析物的濃縮。 100281本發(fā)明還關(guān)注這樣一些方法的應(yīng)用，其中的分析或制備方法選 自液相色譜、毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管電色譜法、反相 色謙法、離子交換色語(CEC)、吸附色譜和正相色譜。
本發(fā)明的組合物和方法也尤其適用于使用微型通道的分析方 法。下列文章中描述了形成和使用微型通道的方法Backhouse, C.J. 等(2003) ("Improved Resolution With Microchip-Based Enhanced Field Inversion Electrophoresis, Electrophoresis 24(11): 1777-1786), Bharadwaj, R.等(2002) ("Design And Optimization Of On-Chip Capillary Electrophoresis, Electrophoresis 23(16):2729-2744), Bromberg, A.等(2004) ("Multichannel Homogeneous Immunoassay For Detection Of 2,4,6-Trinitrotoluene (TNT) Using
A MlCROFABRICATED CAPILLARY ARRAY ELECTROPHORESIS CHIP,
Electrophoresis 25(12): 1895-1900), Chen, G.等(2004) ("Fast And Simple Sample Introduction For Capillary Electrophoresis Microsystems, Analyst 129(6):507-511 (Epub 2004 Apr 20》，Chen, S.H.等(2002) ("Flow-Through Sampling For Electrophoresis-Based Microchips And Their Applications For Protein Analysis, Anal. Chem. 74(19): 5146-5153), Doherty, E.A.等
(2003) ("MICROCHANNEL WALL COATINGS FOR PROTEIN SEPARATIONS
By Capillary And Chip Electrophoresis, Electrophoresis 24(l-2):34-54), Du, Y,等(2005) ("MICROCHIP CAPILLARY Electrophoresis With Solid-State Electrochemiluminescence Detector, Anal. Chem. 77(24):7993-7997), Futterer, C.等(2004) ("Injection And Flow Control System For Microchannels, Lab Chip. 4(4):351-356 (Epub 2004 May 11》，Griffiths, S.K.等(2002) ("Design And Analysis Of Folded Channels For Chip-Based Separations, Anal. Chem. 74(13):2960-2967)， Hong, J.W.等(2001)
("MlCROFABRICATED POLYMER CHIP FOR CAPILLARY GEL
Electrophoresis, Biotechnol. Prog. 17(5):958匿962), Jung, B.等(2006)("On-Chip Mill腿fold Sample Stacking Using Transient ISOTACHOPHORESIS, Anal. Chem. 78(7):2319-2327)， Lee, G.B.等(2005) ("On The Surface Modification Of Microchannels For Microcapillary Electrophoresis Chips, Electrophoresis 26(24):4616-4624), Li, H.F.等(2004) ("A COMPACTLY INTEGRATED Laser-Induced Fluorescence Detector For Microchip Electrophoresis, Electrophoresis 25(12): 1907-1915)， Li, M.W.等 (2006) ("Design And Characterization Of Poly(Dmethylsiloxane)-Based Valves For Interfacing Continuous-Flow Sampling To Microchip Electrophoresis, Anal Chem. 78(4):1042-1051), Lichtenberg, J.等(2002) ("AMiCROCHiP Electrophoresis System With Integrated In-Plane Electrodes For Contactless Conductivity Detection, Electrophoresis 23(21):3769-3780), Liu, J.等(2004) ("Surface-Modified
Microchips For Protein And Peptide Analysis, Anal. Chem. 76(23):6948-6955), Liu, Y.等(2005) ("Stacking Due To Ionic Transport Number Mismatch During Sample Sweeping On Microchips, Lab Chip 5(4):457-465 (Epub 2005 Mar 7》，Pallandre, A. 等(2006) ("Surface Treatment And Characterization: Perspectives To Electrophoresis And Lab-On-Chips, Electrophoresis 27(3):584-610), Petsev, D.N.等(2005) ("MICROCHANNEL PROTEIN Separation By Electric Field Gradient Focusing, Lab Chip 5(6):587-597 (Epub 2005 Apr 15》，Richards, P.等(2002) ("FUNCTIONAL Proteomics Using MicroChannel Plate Detectors," Proteomics, 2(3):256-261), Rossier,丄等(2002) ("POLYMER MICROFLUIDIC CHIPS For Electrochemical And Biochemical Analyses, Electrophoresis 23(6):858-867), Scherer,丄R.等(2001) ("High-Pressure Gel Loader
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For Gapillary Array Electrophoresis MicroChannel Plates, Biotechniques31(5):1150畫1152, 1154), Wang, K.等(2006) C'Microchannel-Electrode Alignment And Separation Parameters Comparison In Microchip Capillary Electrophoresis By Scanning Electrochemical Microscopy, J. Chromatogr. A. 1110(l-2):222-226 (Epub 2006 Feb 3》，and Xuan, X.等(2005) ("Accelerated Particle Electrophoretic Motion And Separation In Converging-Diverging Microchannels, Anal. Chem. 77(14):4323-4328)。
|00601本發(fā)明的組合物和方法也可與分析過程(例如，免疫分析等； 參見美國專利5,863,401 )協(xié)同使用，從而達(dá)到對(duì)多種分析物的同時(shí) 分析。同樣的，本發(fā)明的組合物和方法也可用于定量液體中總蛋白的 各蛋白組份濃度(見美國專利號(hào)5,490,909)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的濃縮裝置也可以對(duì)樣品脫鹽。 在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中可以調(diào)節(jié)所述濃縮裝置以同時(shí)達(dá)到對(duì)樣品 分析物的濃縮和被分析樣品的脫鹽。依據(jù)本發(fā)明，可以使用單個(gè)濃縮 裝置或多個(gè)裝置(串聯(lián)或平行排列)。使用下列填柱過程將200 pl四乙基原硅酸鹽短時(shí)渦旋溶解在 156|iil乙醇中。然后加入258 iLin.OM硝酸并旋渦混合直至溶液清澈 均勻。緩慢加入顆粒并仔細(xì)地將顆粒與溶液漩渦混合直至所有的顆粒 都被適當(dāng)潤濕。短時(shí)超聲處理漿狀物質(zhì)去除顆粒周圍夾帶的空氣。通 過Teflon⑧隔膜向裝有漿狀物質(zhì)的管形瓶中插入毛細(xì)管直至毛細(xì)管 的末端沒入漿狀物質(zhì)。使用氮?dú)夤拚{(diào)節(jié)器施加約20 lbs/in2 (psi)的壓力 直至約5-10cm的毛細(xì)管被填充了漿狀物質(zhì)。
|0066]使用下列程序生成硅酸鹽溶膠-凝膠將所有的毛細(xì)管平放在烘 箱內(nèi)的托盤上。在室溫下(25。C)溫育毛細(xì)管1.0小時(shí)，然后根據(jù)下列 溫度程序加熱毛細(xì)管筒400 。C加熱16-18小時(shí)，然后50°C加熱 1.0 hour,然后70。C加熱16-18小時(shí)，然后100°C加熱1小時(shí)，然 后120。C加熱2小時(shí)。
10067j圖2顯示了本發(fā)明的一個(gè)濃縮裝置。圖3顯示了使用本發(fā)明的 一個(gè)濃縮裝置進(jìn)行分析物濃縮、洗脫和分離的過程。如圖3所示，在 含有所需CEZ基質(zhì)的毛細(xì)管筒中安裝了一個(gè)濃縮裝置(濃縮器)。 加入樣品后樣品可以與濃縮裝置的基質(zhì)結(jié)合。用洗脫緩沖液洗脫后可 以得到濃縮的樣品。施加電場后可進(jìn)行電泳并將樣品分析物分離。
圖6顯示了本發(fā)明濃縮裝置分離綿羊細(xì)胞色素C (ShCytc)和豬 細(xì)胞色素C(PcCytc)消化產(chǎn)物的能力，這兩種樣品具有相同的氨基酸 序列。如圖6所示，用本發(fā)明的濃縮裝置進(jìn)行2分鐘的預(yù)濃縮使被分 離的肽片段可以被檢測，在相同的情況下，未經(jīng)預(yù)濃縮的樣品無法被 檢測。圖7顯示了使用本發(fā)明濃縮裝置分離分析物的重現(xiàn)性。所顯示 的為消化之前被還原和烷基化的Hcytc樣品的分離曲線。該75 p的毛 細(xì)管中含有由5pl溶膠-凝膠組成的0.5cm的塞。電泳電壓為167 v/cm, 5 kv。用0.5M的乙酸上樣然后用60%的乙腈(ACN)上樣緩沖液洗脫。 圖8顯示了分析Hcytc消化產(chǎn)物的重現(xiàn)性(7pmole ；運(yùn)行76-91;進(jìn) 樣于25 psi， 0.4 min)。
00721圖9顯示了本發(fā)明的方法和一義器分離酵母己糖激酶肽消化產(chǎn)物 的能力。使用溶膠-凝膠濃縮裝置濃縮酵母己糖激酶(5飛摩爾 (femtomole ) /pl)用于在200nm處檢測吸附。

圖10顯示了多次分析 酵母己糖激酶消化產(chǎn)物的重現(xiàn)性(10納摩爾(nanomole)/iiil;運(yùn)行2-10 進(jìn)樣于25psi， 0.4min)。
00731圖11顯示了使用本發(fā)明裝置可以得到的極高檢測靈敏度。使用 溶膠-凝/!交毛細(xì)管以不同的時(shí)間間隔濃縮牛己糖激酶消化產(chǎn)物(52 kDa MW;50飛摩爾(fentomoles) (fmoles))。曲線A表示進(jìn)樣0.2 picomoles (pmoles)并用1.0 pmoles/pl洗脫得到的電泳圖。曲線B表示 進(jìn)樣6.25pmoles并用89 fmoles/|Lil洗脫得到的電泳圖。曲線C表示 進(jìn)樣1.25fmoles并用17.8 fmoles/pl洗脫得到的電泳圖。 [00741本說明書中提到的出版物和專利在這里的引用相當(dāng)于明確和單
獨(dú)指明將單個(gè)的出版物或?qū)＠麘?yīng)用在本文以文獻(xiàn)形式引用。
[0075J雖然本發(fā)明與特定的實(shí)施方案一起描述，應(yīng)當(dāng)理解的是可以對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行近一步的修改，所以本發(fā)明包括任何變體、應(yīng)用或總體上 根據(jù)本發(fā)明的原理對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的調(diào)整并包括本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域 已知的或常規(guī)的對(duì)本申請(qǐng)公開內(nèi)容的偏離和對(duì)上文中提到的本質(zhì)特 征的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種包含含有色譜吸附顆粒的聚合烷基硅酸鹽凝膠基質(zhì)塊材料柱子形成的通道的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述凝膠基質(zhì)在足以使溶劑蒸發(fā)而基本不影響所述塊材料穩(wěn)定性的條件下聚合而成。
2. 權(quán)利要求1的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述裝置的通道為毛細(xì)管筒并被多孔玻璃料粘結(jié)，其中所述裝置的柱子在所述毛細(xì)管筒中 聚合。
3. 權(quán)利要求1的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述烷基硅酸鹽凝膠 基質(zhì)為四乙基原硅酸鹽凝膠基質(zhì)。
4. 權(quán)利要求1的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述色譜吸附顆粒為 十八烷基硅膠顆粒。
5. 權(quán)利要求1的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述溶膠-凝膠通過 分步、多步溫育聚合而成。
6. 權(quán)利要求5的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述分步、多步溫育 包括在適于促進(jìn)塊材料聚合而不會(huì)引起溶劑顯著蒸發(fā)的條件下加熱，固化烷基硅酸鹽凝膠基質(zhì)的條件下溫育。
7. 權(quán)利要求1的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述裝置用于在分析 或制備過程中促進(jìn)對(duì)樣品分析物的濃縮。
8. 權(quán)利要求7的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述分析或制備過程 選自液相色語、毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管電色譜法(CEC)、反相色譜法、離子交4灸色譜、吸附色譜和正相色譜。
9. 權(quán)利要求7的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述分析或制備過程 選自免疫分析法和酶促反應(yīng)。
10. 權(quán)利要求7的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述分析物選自蛋 白質(zhì)、肽、核酸分子、藥物、農(nóng)業(yè)化合物、細(xì)菌和病毒。
11. 權(quán)利要求l的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述裝置的通道為 碎片或薄板型微型通道。
12. —種濃縮分析或制備過程中的樣品中分析物的方法，其中所述方法包括使用溶膠-凝膠濃縮裝置濃縮所述分析物，所述裝置包 含含有色譜吸附顆粒的聚合烷基f圭酸鹽凝膠基質(zhì)塊材料柱子形成的 通道，其中所述凝膠基質(zhì)在足以使i^劑蒸發(fā)而基本不影響所述塊材料 穩(wěn)定性的條件下聚合而成。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述裝置在毛細(xì)管筒中聚合并被 多孔性玻璃粘結(jié)。.
14. 權(quán)利要求12的方法，其中所述烷基硅酸鹽凝膠基質(zhì)為四乙 基原硅酸鹽凝膠基質(zhì)。
15. 權(quán)利要求12的方法，其中所述色語吸附顆粒為十八烷基硅 膠顆粒。
16. 權(quán)利要求12的方法，其中所述溶膠-凝膠基質(zhì)通過分步、 多步溫育聚合而成。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述分步、多步溫育包括在適于 促進(jìn)塊材料聚合而不會(huì)引起溶劑顯著蒸發(fā)的條件下加熱，然后在足以 促進(jìn)溶劑從聚合塊材料中蒸發(fā)的條件下溫育，然后在足以固化烷基硅 酸鹽凝凝膠基質(zhì)的條件下溫育。
18. 權(quán)利要求12的方法，其中所述裝置用于在分析或制備過程 中促進(jìn)對(duì)樣品分析物的濃縮。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述分析或制備過程選自液相色 譜、毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管電色譜法(CEC)、反相 色譜法、離子交換色語、吸附色譜和正相色i普。
20. 權(quán)利要求18的方法，其中所述分析或制備過程選自免疫分 析法和酶促反應(yīng)。
21. 權(quán)利要求18的方法，其中所述分析物選自蛋白質(zhì)、肽、核 酸分子、藥物、農(nóng)業(yè)化合物、細(xì)菌和病毒。
22. 權(quán)利要求12的方法，其中所述裝置的通道為碎片或薄板型 微型通道。
全文摘要
本發(fā)明涉及提高毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)靈敏度的新方法和儀器。本發(fā)明尤其關(guān)注包含含有在線溶膠-凝膠的柱子形成的通道的用于濃縮毛細(xì)管區(qū)帶電泳樣品的裝置和本裝置提高毛細(xì)管區(qū)帶電泳的靈敏度的用途。
文檔編號(hào)G01N30/56GK101341402SQ200680030934
公開日2009年1月7日 申請(qǐng)日期2006年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月23日
發(fā)明者C·K·拉特納亞克, M·P·亨利 申請(qǐng)人:貝克曼·庫爾特公司