專利名稱：：測(cè)定蛋白質(zhì)的聚合度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及識(shí)別蛋白質(zhì)的聚合度的方法。
背景技術(shù)：
：解析蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)例如在分析蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)或與其它生物分子的相互作用時(shí)、由分子水平開發(fā)疾病診斷或治療方法等時(shí)是極為有用的。特別是，明確目標(biāo)蛋白質(zhì)是單體還是多聚體，以及如果是多聚體則聚合度是怎樣的、即是由幾個(gè)亞基(subunit)構(gòu)成的，這是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的重要且基本的課題。目前，用于解析目標(biāo)蛋白質(zhì)聚合度的方法有數(shù)個(gè)，它們被用在各種
技術(shù)領(lǐng)域：
中。例如，在科學(xué)(Science,Vol243,pp85-88,(1988))中記載了利用X射線結(jié)構(gòu)解析來解析鏈霉親和素是幾聚體的方法。該文獻(xiàn)中，高純度地精制目標(biāo)蛋白質(zhì)，進(jìn)行結(jié)晶化，并使用X射線結(jié)構(gòu)解析裝置等對(duì)其進(jìn)行解析。在該方法中，高度精制蛋白質(zhì)且進(jìn)行結(jié)晶化的步驟是必須的。因此，該方法存在以下問題。第一，樣品的準(zhǔn)備需要很長(zhǎng)的時(shí)間。第二，結(jié)晶化和解析需要非常高水平的技術(shù)。另外，由于想要解析的蛋白質(zhì)存在不能結(jié)晶化的蛋白質(zhì)，因此在為這種不能結(jié)晶化的蛋白質(zhì)時(shí)，無法利用該以往的方法，這是很大的問題。而且，為了將成為試樣的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)晶化，要求大量的蛋白質(zhì)作為試樣。另一個(gè)例子記載于結(jié)構(gòu)(Structure,Vol6,pp223-231,(1998))中。該文獻(xiàn)記載了使用NMR的鈣周邊蛋白(calcydin)的同型二聚體的結(jié)構(gòu)解析。具體地說，記載了在同位素存在下表達(dá)該蛋白質(zhì)，制作含有同位素的蛋白質(zhì)后使用NMR來解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法。該方法中，需要高度精制成為對(duì)象的同位素標(biāo)記了的蛋白質(zhì)，為了這種NMR解析而進(jìn)行充分的精制時(shí)，多聚體所含的亞基間的相互作用暴露在與生物體內(nèi)不同的環(huán)境中。結(jié)果，無法在維持生物體內(nèi)所獲得的活性的情況下分析在所需溶液中與反應(yīng)有關(guān)的蛋白質(zhì)是幾聚體。另外，為了解析通過蛋白質(zhì)解析獲得的NMR數(shù)據(jù)，實(shí)施者要求有高水平的專業(yè)知識(shí)，而且其解析需要很長(zhǎng)的時(shí)間。EMBO期刊(TheEMBOJournal,Vol16，pp3198-3206，(1997))中記載了利用SDS電泳的蛋白質(zhì)解析方法。該文獻(xiàn)與轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合方式的解析有關(guān)。該方法中首先對(duì)于問題蛋白質(zhì)，準(zhǔn)備將該蛋白質(zhì)進(jìn)行固定化處理(即交聯(lián)反應(yīng))而得到的樣品、和未進(jìn)行固定化處理的樣品。接著，將它們進(jìn)行SDS電泳，通過比較其結(jié)果，從而判定該問題蛋白質(zhì)是否是多聚體。如該方法所示，在蛋白質(zhì)聚合度的解析中利用SDS電泳時(shí)，對(duì)象聚合度的大小成為問題。即，在利用SDS電泳進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，當(dāng)聚合度過大時(shí)，例如達(dá)到6聚體、8聚體或更多聚體時(shí)，難以檢測(cè)正確的聚合度。另外。利用SDS電泳時(shí)，需要對(duì)應(yīng)該蛋白質(zhì)的抗體。因此，不能識(shí)別無法準(zhǔn)備抗體的蛋白質(zhì)或未知蛋白質(zhì)的多聚體形成。而且，上述任何以往方法也不能在維持其活性的狀態(tài)下測(cè)定以溶液形式存在的處于生理狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚合度。另外，任何方法在實(shí)施時(shí)，均要花功夫花時(shí)間，且解析也需要大量的必要試樣。非專利文獻(xiàn)1:PatriciaC.Weber著、科學(xué)、Vol243,pp85陽88,(1989)非專利文獻(xiàn)2:MallikaSastry著、結(jié)構(gòu)、Vol16，pp223-231,(1998)非專利文獻(xiàn)3:IgorAntoshechkin著、TheEMBOJournal、Vol16,pp3198-3206，(1997)
發(fā)明內(nèi)容鑒于上述情況，本發(fā)明的目的在于提供使用微量試樣、可以簡(jiǎn)便地在短時(shí)間內(nèi)以比以往更接近于生物體內(nèi)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)來測(cè)定蛋白質(zhì)聚合度的方法。另外，本發(fā)明的目的還在于提供以高通量進(jìn)行反映生理動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的環(huán)境下的蛋白質(zhì)聚合度解析的方法。本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了用于解決上述目的的方法。艮口，本發(fā)明提供以下所述的方法。(1)測(cè)定蛋白質(zhì)的聚合度的方法，其包括-合成該蛋白質(zhì)，以使得對(duì)于所述蛋白質(zhì)中所含的全部亞基，1分子亞基被1分子熒光色素所標(biāo)記；將所述蛋白質(zhì)分解為至少亞基水平；在該分解前和分解后在微小區(qū)域內(nèi)測(cè)定所述熒光色素的熒光強(qiáng)度；以及根據(jù)通過上述測(cè)定獲得的關(guān)于熒光強(qiáng)度的信息來求得該蛋白質(zhì)的聚合度。(2)上述(1)所述的方法，其中，所述合成通過基于編碼所述蛋白質(zhì)的mRNA的蛋白質(zhì)合成來進(jìn)行。(3)上述(1)或(2)所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)的合成包括將所述mRNA的任意位置的密碼子(codon)置換成與用于標(biāo)記的tRNA的反密碼子相對(duì)應(yīng)的密碼子，從而獲得改變的mRNA;以及在含有所述改變的mRNA、用于標(biāo)記的tRNA、與天然氨基酸對(duì)應(yīng)的tRNA的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系中，在能夠合成蛋白質(zhì)的條件下合成上述蛋白質(zhì)。(4)上述(1)~(3)任一項(xiàng)所述的方法，其中，在合成所述蛋白質(zhì)后還包括精制合成產(chǎn)物。(5)上述(3)或(4)所述的方法，其中，所述反密碼子由3個(gè)堿基以上構(gòu)成。(6)上述(3)(5)任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述任意的密碼子選自琥珀密碼子、赭石密碼子和乳白密碼子。(7)上述(3)~(6)任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述任意的密碼子含有至少1個(gè)第1人工核酸，與其相對(duì)應(yīng)的上述反密碼子含有至少1個(gè)第2人工核酸。(8)上述(3)(7)任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述用于標(biāo)記的tRNA在3，末端上具有熒光標(biāo)記過的氨基酸。(9)上述(1)(8)任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述關(guān)于熒光強(qiáng)度的信息以在任意連續(xù)時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的波動(dòng)的形式獲得，并對(duì)所得信息進(jìn)行分析。(10)上述(1)~(9)任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述分解通過在適當(dāng)條件下使用蛋白質(zhì)分解酶、表面活性劑或還原劑或者它們的組合來進(jìn)行。(11)上述(1)(10)任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述方法利用選自熒光相關(guān)光譜法、熒光互相關(guān)光譜法、熒光強(qiáng)度分布解析法、熒光強(qiáng)度多重分布解析法和熒光偏振解析法中的方法來實(shí)施。(12)上述(1)~(11)任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)為均聚物。通過本發(fā)明，可以提供使用微量試樣、能夠簡(jiǎn)便地在短時(shí)間內(nèi)以比以往更接近生物體內(nèi)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)來測(cè)定蛋白質(zhì)聚合度的方法。另外，通過本發(fā)明，還可以提供以高通量進(jìn)行反映生理動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的環(huán)境下的蛋白質(zhì)聚合度解析的方法。圖說明圖1為表示本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)方式的蛋白質(zhì)合成概念的示意圖圖2為表示成為測(cè)定對(duì)象的蛋白質(zhì)的示意圖。圖3為表示通過以往識(shí)別方法識(shí)別了的蛋白質(zhì)的示意圖。符號(hào)說明1mRNA3、10薩A5熒光標(biāo)記過的氨基！7多肽11氨基酸13核糖體2標(biāo)記用密碼子4反密碼子6麵A8、9密碼子12亞基20、30標(biāo)記化蛋白質(zhì)21、23、25、27、31、33、34、37亞基22、24、26、28、32、35、36、38、39熒光色素分子具體實(shí)施例方式根據(jù)1個(gè)方面，本發(fā)明為測(cè)定蛋白質(zhì)的聚合度的方法，其包括合成該蛋白質(zhì)，以使得對(duì)于所述蛋白質(zhì)中所含的全部亞基，l分子亞基被l分子熒光色素所標(biāo)記；將所述蛋白質(zhì)分解為至少亞基水平；在該分解前和分解后在微小區(qū)域內(nèi)測(cè)定所述熒光色素的熒光強(qiáng)度；以及根據(jù)通過上述測(cè)定獲得的關(guān)于熒光強(qiáng)度的信息來求得該蛋白質(zhì)的聚合度。根據(jù)本發(fā)明，測(cè)定該蛋白質(zhì)聚合度的方法經(jīng)過以下兩個(gè)階段首先，在對(duì)成為測(cè)定對(duì)象的蛋白質(zhì)賦予標(biāo)記的同時(shí)將其合成；接著，將所得的標(biāo)記化蛋白質(zhì)進(jìn)行分解，并根據(jù)對(duì)每個(gè)亞基所賦予的標(biāo)記來求得該蛋白質(zhì)的聚合度。1.蛋白質(zhì)的合成和利用熒光色素進(jìn)行的標(biāo)記根據(jù)本發(fā)明，本方法首先在對(duì)成為測(cè)定對(duì)象的蛋白質(zhì)賦予標(biāo)記的同時(shí)將其合成。即，合成該蛋白質(zhì)時(shí)，完成利用熒光色素進(jìn)行的標(biāo)記。使用圖1說明本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)方式的蛋白質(zhì)合成的概念。參照?qǐng)D1(A)。根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)合成中，預(yù)先準(zhǔn)備改變的mRNAl(圖l(A))。根據(jù)本發(fā)明的改變的mRNAl是將編碼成為測(cè)定對(duì)象的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的天然mRNA的堿基序列的一部分改變而獲得的。即，該堿基序列中所需位置的1個(gè)密碼子被置換為與用于進(jìn)行熒光標(biāo)記的tRNA3的反密碼子4對(duì)應(yīng)的標(biāo)記用密碼子2(圖l(A))。該例子中，如圖l(A)所示，該反密碼子4為具有"CCCG"的氨基酸序列的4個(gè)堿基。用于標(biāo)記的tRNA3為了進(jìn)行所需的標(biāo)記，除了該反密碼子4之外，還在3'末端具有熒光標(biāo)記過的氨基酸5。換而言之，在原本由3個(gè)堿基構(gòu)成的反密碼子所存在的位置上含有由4個(gè)堿基構(gòu)成的標(biāo)記用反密碼子，在原本對(duì)應(yīng)反密碼子的堿基序列而分配的天然氨基酸所存在的3'末端上具有作為非天然氨基酸的熒光標(biāo)記過的氨基酸5(圖l(A))。參照?qǐng)D1(B)。根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)合成在該mRNAl、用于該標(biāo)記的tRNA3、和與含有tRNA6和10的天然氨基酸對(duì)應(yīng)的tRNA存在的環(huán)境下且在能夠合成蛋白質(zhì)的條件下進(jìn)行(圖1(B))。圖1(B)為示意地表示在該條件下進(jìn)行的蛋白質(zhì)合成的一部分的圖。該蛋白質(zhì)合成中，根據(jù)mRNAl的堿基序列形成多肽7。此時(shí)，在所需位置的標(biāo)記用密碼子2上結(jié)合用于該標(biāo)記的tRNA3的反密碼子4。如上所述，用于該標(biāo)記的tRNA3替代通常的20種類的氨基酸，具有作為非天然氨基酸的經(jīng)熒光標(biāo)記的氨基酸5。另外，如具有氨基酸11的tRNA10所示，具有天然氨基酸的tRNA與存在于mRNAl的標(biāo)記用密碼子2以外的位置上的各密碼子對(duì)應(yīng)。因此，如圖KC)所示，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成結(jié)束時(shí)，可以獲得僅含有1分子熒光色素分子5的亞基12(圖1(C))。在以適當(dāng)濃度使如此獲得的亞基存在于接近生理?xiàng)l件的水溶液中時(shí)，則發(fā)生適當(dāng)?shù)木酆?，從而獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)。成為根據(jù)本發(fā)明所得的測(cè)定對(duì)象的蛋白質(zhì)認(rèn)為在接近生理?xiàng)l件的水溶液中處于圖2(A)所示的狀態(tài)。參照?qǐng)D2(A)的示意圖。作為l個(gè)例子，表示了4聚體的標(biāo)記化蛋白質(zhì)20。如上合成的測(cè)定對(duì)象的蛋白質(zhì)的每1分子亞基被1分子熒光色素所標(biāo)記。即，亞基21具有熒光色素分子22、亞基23具有熒光色素分子24、亞基25具有熒光色素分子26、亞基27具有熒光色素分子28(圖2(A))。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的方法中，同時(shí)完成了所需蛋白質(zhì)的合成和熒光標(biāo)記。以下，說明根據(jù)本發(fā)明的方法中所包括的蛋白質(zhì)的合成和利用熒光色素進(jìn)行的標(biāo)記。本發(fā)明中，成為測(cè)定對(duì)象的蛋白質(zhì)無論其氨基酸序列的起源為何，可以是天然和/或合成蛋白質(zhì)等任何蛋白質(zhì)來源的蛋白質(zhì)。另外，成為本發(fā)明對(duì)象的蛋白質(zhì)可以是單體和多聚體(即聚合物)的任意蛋白質(zhì)，本發(fā)明中測(cè)定的優(yōu)選蛋白質(zhì)為由l種單體構(gòu)成的均聚物。本發(fā)明中使用的"聚合度"是指構(gòu)成目標(biāo)蛋白質(zhì)的亞基的數(shù)量、即為表示目標(biāo)蛋白質(zhì)為幾聚體的值。根據(jù)本發(fā)明，該蛋白質(zhì)合成可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何無細(xì)胞體系中進(jìn)行。例如，可以利用在能夠合成大腸桿菌、小麥胚芽、昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞或兔網(wǎng)織紅細(xì)胞等來源的蛋白質(zhì)的環(huán)境下進(jìn)行的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成。這種環(huán)境可以含有蛋白質(zhì)合成所必需的要素、例如核糖體、氨基酸、蛋白質(zhì)性的翻譯因子組、ATP、GTP、酶類等mRNA以外的必要物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)合成例如可以利用商業(yè)上可獲得的任何試劑盒。這種無細(xì)胞試劑盒例如可以從島津制作所、東洋紡、Roche和Promega以及丸文株式會(huì)社等獲得。根據(jù)本發(fā)明的改變的mRNA可以通過其本身公知的制作mRNA的任何方法獲得。例如，在其本身公知的能夠合成無細(xì)胞蛋白質(zhì)的條件下，可以在該蛋白質(zhì)合成前使其表達(dá)。此時(shí)，例如可以使用聚合酶鏈反應(yīng)(以下稱為PCR)等來準(zhǔn)備所需的人工插入有一部分變異的基因，將其插入質(zhì)粒載體后制備質(zhì)粒，然后將其添加到該無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的環(huán)境中。該方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。而且，本發(fā)明中，還可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法來制備所需的改變的mRNA。根據(jù)本發(fā)明使用的熒光色素可以是能夠結(jié)合在tRNA的3'末端上的本身公知的任何熒光色素。這種色素的例子有TAMRA(羧基甲基羅丹明)、TMR(四甲基羅丹明)、羅丹明綠、Alexafluor(注冊(cè)商標(biāo))488、YOYOl、EVOblue(注冊(cè)商標(biāo))和Alexafluor(注冊(cè)商標(biāo))647等。但是，本發(fā)明所用的熒光色素并非局限于這些。這里所用的"用于標(biāo)記的tRNA"是指為了將該蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記而使用的tRNA，其可以是具有熒光色素分子的tRNA。根據(jù)本發(fā)明的具有熒光色素分子的tRNA的制備例如可以如下完成使用PCR等人工合成核酸的方法來合成該tRNA，之后利用公知的核酸修飾方法，將熒光標(biāo)記過的氨基酸結(jié)合于該tRNA上。但是，本發(fā)明并非局限于此，還可以通過其它任何公知的方法來制備具有熒光標(biāo)記過的氨基酸的tRNA。這里所用的"熒光標(biāo)記過的氨基酸"是指通過其本身公知的任一種方法而賦予了1分子熒光色素分子的氨基酸。本發(fā)明所用的接近生理?xiàng)l件的水溶液的例子可以是包括磷酸緩沖液、Tris緩沖液、HEPES緩沖液等任何公知的緩沖液。上述方式中示出了用于標(biāo)記的tRNA的反密碼子為4個(gè)堿基的例子。但是，本發(fā)明中使用的用于標(biāo)記的tRNA的反密碼子并非局限于此，只要是能夠識(shí)別編碼天然氨基酸的密碼子，則可以使用由3個(gè)堿基構(gòu)成的密碼子、也可以使用由5個(gè)堿基以上的堿基構(gòu)成的密碼子。例如，使用由3個(gè)堿基構(gòu)成的密碼子時(shí)，可以利用終止密碼子，即琥珀密碼子(即"UAG")、赭石密碼子(即"UAA")和乳白密碼子(即"UGA")的任一種，優(yōu)選使用"UAG"的由3個(gè)堿基構(gòu)成的琥珀密碼子。另外，還可以在該由3個(gè)堿基、4個(gè)堿基或5個(gè)堿基以上構(gòu)成的密碼子中使用自然界中不存在的對(duì)應(yīng)的l對(duì)以上的核酸(即人工核酸)。為了方便起見，將該對(duì)應(yīng)的核酸的1對(duì)設(shè)為X和Y時(shí)，將作為第1核酸的X置換為mRNA的所需位置的1個(gè)堿基、使作為第2核酸的Y含有在用于標(biāo)記的tRNA的反密碼子中。由此，可以合成本發(fā)明的包含在上述所需位置上含有熒光色素的亞基的蛋白質(zhì)。這里所用的"對(duì)應(yīng)"是指選擇性且特異性地結(jié)合。本發(fā)明所用人工核酸可以使用其本身公知的任何人工核酸?；蛘撸诒景l(fā)明還可以利用例如日本特開2005-110595所記載的方法、Schultz等人的方法(Schultzetal.(1989)Science,244，182-188)和Chambarlin等人的方法(Chambarlin,etal,(1989)J.Am.Chem，Soc.,111,8013-8014)等。這些文獻(xiàn)通過引用而編入本說明書中。如上所述，本發(fā)明使用的用于標(biāo)記的tRNA的反密碼子只要是由3個(gè)堿基以上構(gòu)成的反密碼子即可。但是，為了充分地獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)的量，本發(fā)明使用的用于進(jìn)行熒光標(biāo)記的tRNA的反密碼子優(yōu)選為由3個(gè)堿基或4個(gè)堿基構(gòu)成的反密碼子。而且，考慮到與具有相對(duì)于密碼子己經(jīng)有所分配的天然氨基酸的反密碼子的競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，更優(yōu)選該反密碼子由4個(gè)堿基構(gòu)成。但是，如后所述，根據(jù)本發(fā)明，即便使用例如由3個(gè)堿基、5個(gè)堿基(例如參見Hohsaka等的文獻(xiàn)、NucleicAcidsResearch.2001，vol.29,pp.3646-3651)以上構(gòu)成的反密碼子來合成目標(biāo)蛋白質(zhì)時(shí)、和/或所得蛋白量為以往無法檢測(cè)的程度的少量時(shí)，對(duì)于本發(fā)明的檢測(cè)來說也是充分的量(上述文獻(xiàn)通過引用而編入本說明書中)。S卩，在為以往的利用X射線、NMR和SDS電泳的方法時(shí)，在X射線和NMR中需要約mg級(jí)程度的蛋白質(zhì)、在SDS中需要昭級(jí)程度的蛋白質(zhì)。但是，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，只要是nM級(jí)(容量50pL)程度的蛋白質(zhì)即可高精度地測(cè)定聚合度。nM級(jí)程度的蛋白質(zhì)量與上述以往技術(shù)中所需要的蛋白質(zhì)量相比，為非常少的量。3.求得蛋白質(zhì)的聚合度在根據(jù)本發(fā)明的測(cè)定蛋白質(zhì)聚合度的方法中，對(duì)如上合成的該蛋白質(zhì)進(jìn)一步求得其聚合度。使用圖2的標(biāo)記化4聚體蛋白質(zhì)的例子來說明其原理。參照?qǐng)D2。如上所述，根據(jù)本發(fā)明，要測(cè)定的蛋白質(zhì)如圖2(A)所示，在每1個(gè)亞基上帶有1個(gè)熒光色素分子(圖2(A))。將其分解為至少亞基水平，并檢測(cè)熒光色素分子的數(shù)量時(shí)，可知其中存在多少個(gè)亞基(圖2(B))。換而言之，圖2(A)中為標(biāo)記化4聚體蛋白質(zhì)以l分子存在的狀態(tài)，通過分解其結(jié)構(gòu)，該蛋白質(zhì)所含的亞基解離，產(chǎn)生4分子的亞基(圖2(B))。因此，通過比較圖2(A)所示的分解前的分子數(shù)量與圖2(B)所示的分解后的分子數(shù)量，可以求得目標(biāo)蛋白質(zhì)的聚合度。根據(jù)本發(fā)明，為了比較分解前后的分子數(shù)量，在該分解前和分解后在通過共聚焦光學(xué)體系制作的微小區(qū)域內(nèi)對(duì)該熒光色素的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定即可。根據(jù)本發(fā)明，例如可以利用金城政孝的熒光相關(guān)光譜法(fluorescencecorrelationspectroscopy)(蛋白質(zhì)核酸酶voI.44,1431-1438(1999))。利用該方法時(shí)，可以測(cè)定在任意連續(xù)的時(shí)間內(nèi)熒光色素分子所發(fā)出的熒光強(qiáng)度的波動(dòng)，通過所得信息的自身相關(guān)，計(jì)算存在于微小區(qū)域內(nèi)的熒光色素分子的數(shù)量。這里，"任意連續(xù)的時(shí)間"只要是進(jìn)行熒光相關(guān)光譜法時(shí)可以測(cè)定熒光強(qiáng)度的波動(dòng)的充分的時(shí)間即可。另外，根據(jù)本發(fā)明，作為用于通過該熒光相關(guān)光譜法來測(cè)定分子數(shù)量的裝置，可以使用1分子熒光分析系統(tǒng)MF20(奧林巴斯公司制)。根據(jù)本發(fā)明的用于分解該蛋白質(zhì)所使用的方法可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的用于分解蛋白質(zhì)的任意方法。并非局限于此，根據(jù)本發(fā)明，例如可以是后述的利用物理作用和/或化學(xué)作用進(jìn)行的改性，還可以使用下述分解劑鹽酸胍和尿素等改性劑、蛋白酶K、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等蛋白質(zhì)分解酶、SDS、包括TritonX(注冊(cè)商標(biāo))-100等的TritonX以及含有Tween(注冊(cè)商標(biāo))20等的Tween等表面活性劑、二硫蘇糖醇(DTT)或2-巰基乙醇等還原劑等。另外，根據(jù)本發(fā)明的利用物理作用進(jìn)行改性的例子包括利用加熱、冷凍和溶解、超聲波、紫外線、X射線等進(jìn)行的處理，利用化學(xué)作用的改性劑的例子為產(chǎn)生極端的pH變動(dòng)的物質(zhì)、產(chǎn)生濃縮鹽溶液的物質(zhì)、有機(jī)溶劑、金屬鹽、表面活性劑和離液劑等，離液劑的例子為尿素、胍鹽等。根據(jù)本發(fā)明，可以將包括上述分解劑的使用和物理改性的分解方法的任一種單獨(dú)使用或并用2種以上。本發(fā)明中，將上述蛋白質(zhì)"分解至至少亞基水平"包含通過上述分解方法在維持亞基結(jié)構(gòu)的狀態(tài)下將該蛋白質(zhì)解離、和通過亞基結(jié)構(gòu)也分解而將該蛋白質(zhì)分解的兩種含義。如圖2(A)所示，根據(jù)本發(fā)明，構(gòu)成標(biāo)記化蛋白質(zhì)20的各亞基分別具有每1分子的熒光色素分子。因此，分解后無論是維持了亞基的結(jié)構(gòu)、還是未維持，所得聚合度均相同。根據(jù)本發(fā)明的方法，在求得"l.蛋白質(zhì)的合成和利用熒光色素進(jìn)行的標(biāo)記"中合成的蛋白質(zhì)的聚合度之前，可以進(jìn)行簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)精制。這種精制例如可以如下實(shí)施在該蛋白質(zhì)的C末端上形成組氨酸標(biāo)簽，利用鎳柱進(jìn)行回收，利用稀咪唑緩沖液除去多余的蛋白質(zhì)等后，用高濃度的咪唑緩沖液洗滌該柱。精制后的蛋白質(zhì)例如溶解在磷酸緩沖液(以下記載為PBS)等緩沖液中，進(jìn)行分解操作和熒光強(qiáng)度的檢測(cè)，從而求得聚合度。另外，根據(jù)本發(fā)明，通過熒光相關(guān)光譜法以外的方法，即通過在用共聚焦光學(xué)體系制作的微小區(qū)域內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定熒光色素分子所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，并基于所得信息的自身相關(guān)解析，由此獲得與熒光色素分子1:1對(duì)應(yīng)的亞基信息，例如分子大小、數(shù)量或與亮度有關(guān)的信息，從而也可以測(cè)定目標(biāo)蛋白質(zhì)的聚合度。這種測(cè)定中可以利用熒光互相關(guān)光譜法(即，F(xiàn)luorescencecrosscorrelationspectroscopy)、熒光虧雖度分布角早豐斤法(艮卩，F(xiàn)luorescenceIntensityDistributionAnalysis)、熒光弓雖度多重分布分豐斤法(艮卩，F(xiàn)luorescenceIntensityMultipleDistributionAnalysis)禾口熒光偏振角軍析法(艮卩，F(xiàn)luorescenceIntensityDistributionAnalysis-polarization)。無論使用任何方法，均可將作為本發(fā)明的1個(gè)特征的所需樣品量減少至nM級(jí)。4.比較例將通過上述本發(fā)明方法之外的例如利用化學(xué)反應(yīng)的以往標(biāo)記方法來標(biāo)記蛋白質(zhì)時(shí)的例子示于圖3。參照?qǐng)D3。圖3(A)中表示了通過以往標(biāo)記方法熒光標(biāo)記過的4聚體的標(biāo)記化蛋白質(zhì)30。通過化學(xué)反應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)30賦予的熒光色素分子與亞基的存在無關(guān)地、隨機(jī)地結(jié)合在標(biāo)記化蛋白質(zhì)上。此例中，亞基31上結(jié)合有熒光色素分子32，亞基33上沒有結(jié)合熒光色素分子，亞基34上結(jié)合有熒光色素分子35和36的2個(gè)分子，亞基37上結(jié)合有熒光色素分子38和39的2個(gè)分子(圖3(A))。因此，將其分解時(shí)，盡管亞基存在4個(gè)分子，但由熒光色素分子來源的信息可知存在3個(gè)分子(圖3(B))。實(shí)施例1準(zhǔn)備單體蛋白質(zhì)的駱駝來源的單鏈抗體(以下記載為CA)、4聚體蛋白質(zhì)的鏈霉親和素(以下記載為SA)的基因，將各個(gè)基因插入至熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)表達(dá)用質(zhì)粒載體pROX-FL(奧林巴斯)的多克隆位點(diǎn)中。該質(zhì)粒載體的一部分對(duì)序列表中記載的肽序列進(jìn)行編碼。之后，以大腸桿菌DH5ot作為宿主來制備質(zhì)粒。使用該質(zhì)粒、對(duì)應(yīng)于4堿基密碼子的TAMRA-tRNA(奧林巴斯)、RTS100E.coliHYkit(Roche)，在目標(biāo)蛋白質(zhì)的特定位置上以相對(duì)于1分子亞基為1分子的比例標(biāo)記作為熒光色素的TAMRA。通過利用組氨酸標(biāo)簽的精制方法，將其精制。將這些標(biāo)記化蛋白質(zhì)稀釋于溶液中進(jìn)行制備，以達(dá)到最終濃度為nM級(jí)。作為使該標(biāo)記化蛋白質(zhì)分解的處理，使用了利用蛋白酶進(jìn)行的分解反應(yīng)。蛋白酶使用蛋白酶K(Promega)，反應(yīng)條件是最終濃度為100pig/mL、37°C、1小時(shí)以上，作為緩沖液，使用了PBS+0.05%Tween20。樣品分解前后的熒光分子數(shù)量如下測(cè)定在通過共聚焦光學(xué)體系制作的微小區(qū)域內(nèi)測(cè)定熒光分子所發(fā)出的熒光的波動(dòng)，使用奧林巴斯制1分子熒光分析系統(tǒng)MF20、利用熒光強(qiáng)度分布解析(即，F(xiàn)luorescenceIntensityDistributionAnalysis,以下記作FIDA)測(cè)量經(jīng)熒光標(biāo)記的分子的數(shù)量。所用光源為543nmHe-Ne激光，測(cè)定為進(jìn)行5次5秒鐘的測(cè)定。結(jié)果如下所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>單體蛋白質(zhì)的CA中，分子數(shù)量的增加率為1.29。因此，將SA所得的4.94除以該值1.29而校正后的值用于評(píng)價(jià)。考慮到游離狀態(tài)的熒光色素混存、和并非全部蛋白質(zhì)形成4聚體的可能性時(shí)，相對(duì)于理論值4，3.83的數(shù)值是妥當(dāng)?shù)?。根?jù)本發(fā)明，可以識(shí)別蛋白質(zhì)形成了幾聚體。因此可知，根據(jù)本發(fā)明的測(cè)定蛋白質(zhì)聚合度的方法可以有效地活用。實(shí)施例2使用奧林巴斯制1分子熒光分析系統(tǒng)MF20、利用熒光相關(guān)光譜法進(jìn)行同樣實(shí)驗(yàn)的測(cè)定，所述1分子熒光分析系統(tǒng)MF20可以在通過共聚焦光學(xué)體系制作的微小區(qū)域內(nèi)測(cè)定熒光分子所發(fā)出的熒光的波動(dòng)，通過所得信息的自身相關(guān)，從而獲得與熒光標(biāo)記過的分子數(shù)量相關(guān)的數(shù)據(jù)。所用光源為543nmHe-Ne激光，測(cè)定為進(jìn)行5次10秒鐘的測(cè)定。結(jié)果如下所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>單體蛋白質(zhì)的CA中，增加率為1.20。因此，將SA所得的4.61除以該值1.20而校正后的值用于評(píng)價(jià)?？紤]到游離狀態(tài)的熒光色素混存、和并非全部蛋白質(zhì)形成4聚體的可能性時(shí)，相對(duì)于理論值4，3.84的數(shù)值是妥當(dāng)?shù)摹８鶕?jù)本發(fā)明，可以識(shí)別目標(biāo)蛋白質(zhì)形成了幾聚體。因此可知，本發(fā)明的測(cè)定蛋白質(zhì)聚合度的方法可以有效地活用。實(shí)施例3進(jìn)行與實(shí)施例1同樣的操作，將駱駝來源的單鏈抗體(以下記載為CA)和鏈霉親和素(以下記載為SA)進(jìn)行TAMRA標(biāo)記。將這些蛋白質(zhì)稀釋于溶液中進(jìn)行制備，以達(dá)到最終濃度為nM級(jí)，作為使多聚體形成分解的處理，進(jìn)行了利用表面活性劑的反應(yīng)。表面活性劑使用SDS，反應(yīng)條件為加入SDS至最終濃度達(dá)到0.1。/()、在95'C下孵育5分鐘。加上蒸發(fā)部分的純水后進(jìn)行測(cè)定。使用奧林巴斯制1分子熒光分析系統(tǒng)MF20、利用熒光強(qiáng)度分布解析來測(cè)定樣品的表面活性劑處理前后的熒光分子數(shù)。所用光源為543nmHe-Ne激光、測(cè)定為進(jìn)行5次5秒鐘的測(cè)定。結(jié)果如下所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>單體蛋白質(zhì)的CA中，增加率為1.12。因此，將SA所得的4.14除以該值1.12而校正后的值用于評(píng)價(jià)?？紤]到游離狀態(tài)的熒光色素混存、和并非全部蛋白質(zhì)形成4聚體的可能性時(shí)，相對(duì)于理論值4，3.71的數(shù)值是妥當(dāng)?shù)?。根?jù)本發(fā)明，可以識(shí)別目標(biāo)蛋白質(zhì)形成了幾聚體。因此可知，本發(fā)明的測(cè)定蛋白質(zhì)聚合度的方法可以有效地活用。以下說明本發(fā)明的其它效果。根據(jù)本發(fā)明，本測(cè)定方法可以高敏感度地測(cè)定熒光分子的大小或數(shù)量的變化，由此可以高敏感度地測(cè)定與多聚體分解導(dǎo)致的熒光標(biāo)記游離所產(chǎn)生的熒光色素?cái)?shù)量有關(guān)的由該分解前至分解后的增加率。本發(fā)明中，通過合成在任意位置上熒光標(biāo)記過的蛋白質(zhì)并對(duì)其進(jìn)行解析，不需要在X射線衍射法中使用的蛋白質(zhì)結(jié)晶化的步驟，結(jié)果可以短時(shí)間且簡(jiǎn)便地測(cè)定蛋白質(zhì)的聚合度。本發(fā)明中，只要可以準(zhǔn)備基因，則可以由其合成熒光標(biāo)記過的蛋白質(zhì)，不必大量準(zhǔn)備蛋白質(zhì)、或進(jìn)行高度精制的步驟。另外，根據(jù)本發(fā)明，幾乎全部的蛋白質(zhì)可以進(jìn)行表達(dá)、和進(jìn)行熒光標(biāo)記，因此也可以適用于由于不能結(jié)晶化而無法測(cè)定蛋白質(zhì)聚合度的物質(zhì)。另外，本發(fā)明的成為對(duì)象的蛋白質(zhì)的聚合度的測(cè)定由于在溶液中進(jìn)行，因此可以保持熒光標(biāo)記過的目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性，或者在正在反應(yīng)的溶液中在接近生理狀態(tài)的狀態(tài)下進(jìn)行解析。本發(fā)明的蛋白質(zhì)聚合度測(cè)定中，其數(shù)據(jù)解析也可以僅通過將該蛋白質(zhì)形成的多聚體進(jìn)行分解的處理、從而確認(rèn)熒光標(biāo)記過的分子數(shù)量增加了幾倍這樣的非常簡(jiǎn)單的方法來進(jìn)行。因此，不需要高水平的專業(yè)知識(shí)，可以在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明的蛋白質(zhì)聚合度的測(cè)定即使在溶液中混有其它物質(zhì)或蛋白質(zhì)的狀態(tài)下也可以進(jìn)行，而且還不需要將蛋白質(zhì)高度精制的工夫，可以簡(jiǎn)單地進(jìn)行測(cè)定。另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)聚合度的測(cè)定由于使用熒光標(biāo)記過的蛋白質(zhì)來進(jìn)行，因此不必準(zhǔn)備在一部分以往的方法中所需要的相對(duì)于蛋白質(zhì)的抗體等，因此，即便是無法準(zhǔn)備抗體的蛋白質(zhì)也可測(cè)定聚合度。而且，本發(fā)明的1個(gè)方式的蛋白質(zhì)聚合度的測(cè)定由于是由基因合成熒光標(biāo)記過的蛋白質(zhì)后實(shí)施測(cè)定，因此對(duì)于目前無法精制的未知蛋白質(zhì)也可以測(cè)定其聚合度。權(quán)利要求1.測(cè)定蛋白質(zhì)的聚合度的方法，其包括合成所述蛋白質(zhì)，以使得對(duì)于所述蛋白質(zhì)中所含的全部亞基，1分子亞基被1分子熒光色素所標(biāo)記；將所述蛋白質(zhì)分解為至少亞基水平；在所述分解前和分解后在微小區(qū)域內(nèi)測(cè)定所述熒光色素的熒光強(qiáng)度；以及根據(jù)通過所述測(cè)定獲得的關(guān)于熒光強(qiáng)度的信息來求得所述蛋白質(zhì)的聚合度。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述合成是通過基于編碼所述蛋白質(zhì)的mRNA的蛋白質(zhì)合成來進(jìn)行的。3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)的合成包括將所述mRNA的任意位置的密碼子置換成與用于標(biāo)記的tRNA的反密碼子相對(duì)應(yīng)的密碼子，從而獲得改變的mRNA;和在含有所述改變的mRNA、用于標(biāo)記的tRNA、與天然氨基酸相對(duì)應(yīng)的tRNA的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系中，在能夠合成蛋白質(zhì)的條件下合成所述蛋白質(zhì)。4.權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的方法，其中，在合成所述蛋白質(zhì)后還包括精制合成產(chǎn)物。5.權(quán)利要求3或4任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述反密碼子由3個(gè)堿基以上構(gòu)成。6.權(quán)利要求3~5任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述任意的密碼子選自琥珀密碼子、赭石密碼子和乳白密碼子。7.權(quán)利要求3~6任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述任意的密碼子含有至少1個(gè)第1人工核酸，與其相對(duì)應(yīng)的所述反密碼子含有至少1個(gè)第2人工核酸。8.權(quán)利要求37任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述用于標(biāo)記的tRNA在3'末端上具有熒光標(biāo)記過的氨基酸。9.權(quán)利要求18任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述關(guān)于熒光強(qiáng)度的信息以在任意連續(xù)時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的波動(dòng)的形式獲得，并對(duì)所得信息進(jìn)行解析。10.權(quán)利要求1~9任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述分解通過在適當(dāng)條件下使用蛋白質(zhì)分解酶、表面活性劑或還原劑或者它們的組合來進(jìn)行。11.權(quán)利要求1~10任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述方法利用選自熒光相關(guān)光譜法、熒光互相關(guān)光譜法、熒光強(qiáng)度分布解析法、熒光強(qiáng)度多重分布解析法和熒光偏振解析法中的方法來實(shí)施。12.權(quán)利要求1~11任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)為均聚物。全文摘要本發(fā)明的目的在于提供可以使用微量試樣、簡(jiǎn)便地在短時(shí)間內(nèi)以比以往更接近生物體內(nèi)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)來測(cè)定蛋白質(zhì)的聚合度的方法。本發(fā)明提供測(cè)定蛋白質(zhì)的聚合度的方法，其包括合成所述蛋白質(zhì)，以使得對(duì)于所述蛋白質(zhì)中所含的全部亞基，1分子亞基被1分子熒光色素所標(biāo)記；將所述蛋白質(zhì)分解為至少亞基水平；在所述分解前和分解后在微小區(qū)域內(nèi)測(cè)定所述熒光色素的熒光強(qiáng)度；以及根據(jù)通過所述測(cè)定獲得的關(guān)于熒光強(qiáng)度的信息來求得所述蛋白質(zhì)的聚合度。文檔編號(hào)G01N21/78GK101292029SQ20068003849公開日2008年10月22日申請(qǐng)日期2006年10月19日優(yōu)先權(quán)日2005年10月19日發(fā)明者中田秀孝申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社