專利名稱：利用空間調(diào)制的光學力顯微術檢測細胞變形性的設備和方法
利用空間調(diào)制的光學力顯微術檢測細胞變形性的設備和方法
技術領域：
本發(fā)明要求2005年10月17日提交的美國臨時專利申請第60/726,620號 的優(yōu)先權，該份申請的內(nèi)容全文引用在此作為參考。
背景技術：
疾病的特征常在于其獨特的分子和/或遺傳指紋。然而，對于包括癌癥在 內(nèi)的許多疾病，這取得的成功有限；部分是因為細胞中的分子途徑變成致病性 可能有許多方式，很多還未知。
在美國，雖然致力于癌癥的研究活動己有數(shù)十年，但其依然是頭號殺手。 然而，細胞除了是生物化學和遺傳學實體外，它也是具有諸如彈性等物理特性 的機械實體。包括癌癥在內(nèi)的影響細胞的細胞骨架蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(即，細胞的結 構完整性)的疾病應該自然地產(chǎn)生其機械特性(例如，彈性)發(fā)生變化的細胞。該 研究領域仍處于初級階段，但近年來的研究已能根據(jù)利用光學器件實驗測得有 效細胞彈性從而成功區(qū)分癌細胞和正常細胞(參見參考文獻Guck等)。
如Guck, J等人在"光學變形性作為檢測惡性轉化和轉移能力的固有細 胞特征"(Optical Defo腿bility as an Inherent Cell Marker for Testing Malignant Transformation and Metastatic Competence, Biophysical Journal 88:3689-98， 2005)—文中所述，將作用力施加于細胞的現(xiàn)有方法顯示癌細胞 的變形性增加。已知攜帶動量的光子能對其折射率不同于介質(zhì)的折射率的微觀 物體的質(zhì)心施加凈力(例如，光學鑷子)。以前進行的實驗顯示所產(chǎn)生的表面作 用力可能遠高于凈力，其強度足以使生物學上重要的物體(例如細胞)變形(參 見Guck, J等，"光學延伸器 一種顯微操作細胞的新激光工具"(The Optical Stretcher: A Novel Laser Tool to Micromanipulate Cells), Biophysical Journal 81:767-84, (2001))。 Guck等的光學延伸器(Optical Stretcher)顯示如果施加光 學力，在看起來相同的細胞中癌細胞顯示的變形性明顯較高。
9具體地說，在光學延伸器中，兩條反向傳播的光束每一次捕獲懸浮液中的 一個細胞并將其拉長。用顯微鏡固定的CCD照相機記錄拉長的幅度，經(jīng)拉長 的細胞的長寬比(最長軸與最短軸之比)的測量值產(chǎn)生出一個光學變形性參數(shù)。
與掃描力顯微鏡(scanning force microscope)的直接機械探針不同，測得的變形 性實際上是細胞的機械特性和光學特性的結合(S卩，折射率)，因此基于對光學 特性的了解，從這些測量值推導出了彈性模型(參見Lekka, M.等，"通過掃 描力顯微術研究的正常和癌性人膀胱細胞的彈性"(Elasticity of normal and cancerous human bladder cells studied by scanning force microscopy)， European Biophysics Journal 28:312-6 (1999))。因為對于臨床目的和大多數(shù)科 學目的而言，變形性測量參數(shù)的統(tǒng)計學顯著性和可靠性足夠，并且不需要嚴格 計算彈性模型，所以這不是明顯的障礙。
Guck等人證明測得的變形性與侵襲力充分相關，而光學變形性測量與細 胞的長寬比(最長軸與最短軸之比)有關。
然而，光學延伸器技術的實際局限性是只可檢測懸浮細胞。不幸的是，細 胞處于某種非生理學狀態(tài)，因為它們通常使得細胞-細胞發(fā)生接觸并且具有固 體胞外支持物(即，固體組織)。因為那些不具有任何可供黏附的表面的細胞會 快速喪失其病灶黏著點(focal adhesion point)和相關的應力纖維，因此，與它們 的體內(nèi)特性相比，人工懸浮條件下的細胞的彈性可能有顯著變化。
在測量細胞彈性的其它技術中，己成功地應用了掃描力顯微術來比較處于 一個表面上的正常和癌變細胞的彈性，但該方法有兩個難點1)該技術非常 慢(每天只能測量幾個細胞)，因而難以想像可將其轉換為臨床領域，和2)難以 避免和樣品發(fā)生機械接觸，因此在測量一系列細胞時探針污染是實際的危險。
因此，需要一種能測量處于一個表面上的多個細胞、避免破壞細胞且能使 該技術加速發(fā)展從而在商業(yè)上可行的技術。
發(fā)明概述
本發(fā)明的一個目的是能將光學力施加于黏附細胞，并且針對所導致的表面 扭曲還能靈敏且定量地測量多個光程鏈路(link)。本發(fā)明的空間調(diào)制光學力顯微鏡(SMOFM)能以干涉靈敏度(亞納米靈敏度) 定量測定因光學施加表面作用力而導致的細胞表面扭曲?；蛘撸衫肧MOFM 定量測定非光學施加表面作用力(即，流體動力學作用力、流體靜力學作用力、 靜電力、磁力、滲透力、機械力或內(nèi)部作用力)導致的細胞表面扭曲。這種定 量測定是這樣進行的利用計算機控制的空間光調(diào)制器對圖像的一系列四(4) 張相移復制品(phase shifted replica)進行成像；并且采用現(xiàn)有算法通過像素光 程長來計算像素?？梢源_定光程長的變化以及由此引起的形狀變化(假定各組 分的折射率未改變)。
在本發(fā)明中，光的空間光調(diào)制涉及多達兩種不同的方法。第一，通過在透 射(成像)中對用低相干光照射的樣品圖像的傅立葉變換進行空間調(diào)制，而在 檢測樣品中的光程長變化的過程中使用空間光調(diào)制。第二，可用獨立的空間光 調(diào)制器來產(chǎn)生激光，所述激光用于以用戶定義的強度對視場中用戶定義的位置 處的物體施加光學作用力(光學施力)。該實施方式中各空間光調(diào)制器調(diào)節(jié)不同 來源的光信號(空間光調(diào)制器(SLM) SLM1:成像源，S卩，低相干二級管， 空間光調(diào)制器(SLM)SLM2:用于光學施力的激光源)。
因此，對于本發(fā)明，利用空間調(diào)制光學力顯微鏡(SMOFM)可以測量任何 類型細胞的光學變形性，因而可以鑒定包括癌細胞在內(nèi)的具有獨特光學變形性 特征的患病細胞。除了用作診斷工具，空間光調(diào)制作用力顯微鏡還可用作研究 工具來了解因特定患病細胞狀態(tài)而導致的光學變形性發(fā)生任何改變的原因。這 種細胞的光學變形性可以與結構蛋白質(zhì)表達水平和模式相關聯(lián)，例如空間調(diào)制 作用力顯微鏡能揭示由疾病導致的細胞粘彈性反應發(fā)生改變的分子起源。
本發(fā)明的設備是基于光學的，因此其優(yōu)點是可作為快速而無菌的測量平 臺。與現(xiàn)有技術相反，在本發(fā)明中，待檢測的物體或細胞可以黏附于一個表面 (即，顯微鏡蓋玻片表面)，因而能維持它們天然存在的黏著斑和應力纖維。
與現(xiàn)有方法相比，本檢測技術(利用空間調(diào)制光學顯微術)是更靈敏的形變 檢測技術，其靈敏度為亞納米水平。本發(fā)明的靈敏度更高有兩個重要的優(yōu)點 1)可以檢測動態(tài)范圍更大的彈性反應，和2)可以以較低的激光功率來實現(xiàn)可 檢測的變形。對并行處理而言，第二個優(yōu)點至關重要。在另一實施方式中，可以檢測正常和患病細胞的光學變形性，所述變形性 與細胞骨架/結構蛋白質(zhì)表達的測量值有關。例如，可通過熒光標記靶蛋白質(zhì)并 收集熒光圖像來測定蛋白質(zhì)表達。
因此，本發(fā)明的光學力顯微術設備是使細胞中的分子和遺傳模式與變形性 的機械測量值相關聯(lián)的有價值工具，從而給癌性表型的表征添加一個新的考量 方面。根據(jù)變形性測量參數(shù)，本發(fā)明還提供了癌癥篩選試驗的基礎。
因此，上文概述了本發(fā)明的一些特征，從而能更好地理解下文的詳述并更 好地知道對現(xiàn)有技術的貢獻。當然，下文將描述本發(fā)明的其它特征，這些特征 構成了隨附權利要求書的主題。
就此而言，在詳細解釋本發(fā)明的至少一個實施方式之前，應該知道本發(fā)明 的應用不限于以下描述所列或附圖所述的構造細節(jié)和組件的配置方式。本發(fā)明 的方法和設備能(有)其它實施方式并能以各種方法實施和執(zhí)行。還應知道本文 所用的措詞和術語以及下文所包括的摘要是出于描述的目的而不應視作限制 性的。
因此，本領域技術人員知道本文所依據(jù)的理念不難用作設計實施本發(fā)明幾 種目的的其它結構、方法和系統(tǒng)的基礎。所以，權利要求應視作包括這些等價 結構是至關重要的，因為這些等價結構未脫離本發(fā)明方法和設備的構思和范 圍。
附圖簡述


圖1顯示了本發(fā)明一個實施方式的光學力測量設備。
圖2顯示了本發(fā)明一個實施方式的示范性全息光肼系統(tǒng)，其是圖1所示設
備的一部分。
圖3顯示了按照本發(fā)明一個實施方式，實施空間光調(diào)制光學力顯微術所需 的光學組件，其是圖l所示設備的一部分。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及能施加光學力并靈敏地檢測在物體，例如細胞中所致變形的光學力檢測裝置，所述物體設置或黏附在一個表面上，而不似以前應用那樣處于 懸浮液中。
具體地說，在一個實施方式中，本發(fā)明采用，例如全息光肼技術將光學力 同時引導至潛在的許多感興趣區(qū)域，從而將物體中的變形檢測為所施加的光學 力的函數(shù)。
在另一實施方式中，本發(fā)明采用定量相差顯微技術，例如空間調(diào)制的光學
力顯微術(SMOFM)檢測物體中的變形。
在一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明采用空間調(diào)制的光學力顯微鏡(SMOFM) 產(chǎn)生探針光束(probe beam)作為作用力探針(force probe)來干擾黏附或置于某 表面上的物體，因而隨后可以檢測所述物體的變形，所述顯微鏡具有單光束光 學力檢測能力或裝有能進行多光束光學力檢測并與顯微鏡物鏡耦合的全息光 肼系統(tǒng)。
與現(xiàn)有技術相反，本發(fā)明能檢測不處于懸浮液中的物體。事實上，本發(fā)明 所檢測的物體可以是任何類型的黏附細胞，采用光學技術測定細胞是正常細胞 還是癌細胞。通過光學變形性還可檢測和/或表征其它細胞類型(例如，干細胞) 或細胞狀態(tài)(例如，疾病狀態(tài))，只要耙細胞類型或細胞狀態(tài)對光學作用力探針 具有特征性的彈性或粘彈性反應。
光子在穿越折射率不同的介質(zhì)時因其動量守恒導致光學產(chǎn)生的表面作用 力，從而產(chǎn)生感興趣的細胞扭曲。當折射率為m的介質(zhì)l中的光子穿入折射率 為ri2的介質(zhì)2時，該光子的動量從iME/c改變?yōu)閞i2(l-R)E/c，其中E是光 子能量，R是由菲涅耳公式所得的反射率(R約為1(T3)。此外，反射分量 的光子動量是rnRE/c。由于動量守恒，表面獲得的動量是Ap。
所以，表面經(jīng)受的作用力是F:Ap./At。這樣，表面作用力使表面偏離較 稠密的介質(zhì)，從而增加了該較稠密的介質(zhì)沿入射軸的光程長。通過檢測不同樣 品的光程長變化，可以比較它們的光學變形性。
因此，物體的表面扭曲(S卩，應力)程度是該物質(zhì)的粘彈性特性的函數(shù)。在 相等的照射條件下比較光學特征相同的兩(2)物體的反應能比較它們的粘彈性 反應。在本發(fā)明中，通過對物體圖像的一系列相移復制品進行成像并采用某算法
通過像素光程長計算像素，來定量測定因光學施加的表面作用力而導致的物體 表面扭曲以實施測量。可觀察的光學變形性包含某給定的入射強度(和光束分 布)時的形狀改變(例如，光程長的分數(shù)改變)。將光程長定義為光束所穿越物體
的真實物理長度L乘以其折射率n(即光程長=nL)。因此，通過檢測物體，例 如癌細胞的光程長變化，將其與其它物體(即，非癌細胞)的作比較，可以測得 光學變形性并診斷惡性腫瘤。
具體地說，本發(fā)明技術可檢測口腔鱗狀細胞癌(OSCC)。得到的癌性上皮
細胞(黏附性的)遠比源自基質(zhì)細胞，例如成纖維細胞的癌癥(S卩，肉瘤)更常見， 這些上皮細胞是采用能查詢這種細胞的本發(fā)明技術檢測惡性腫瘤的主要候選 對象。
然而，本發(fā)明技術還能應用于測試任何惡性腫瘤類型(即，源自任何器官， 例如乳腺、前列腺等的任何類型上皮細胞的癌癥)的任何細胞。
具體地說，在本發(fā)明中，物體(例如，患者的或培養(yǎng)的細胞系的細胞)在基 板的表面形成單層，當將光施加于所述物體時，光子會穿越折射率為iM(細胞 介質(zhì))、n2(細胞)和ri3 (基板)的物質(zhì)。應該知道n^n3，否則細胞會因表面作 用力而離開表面(即，否則毗鄰基板的細胞表面會被推離基板而導致解離)。
普通基板，例如玻璃或塑料不滿足此關系，但折射率與水相當或較低并且 透明的一類特殊的無定形氟聚合物(即，Teflon AF，杜邦公司)滿足此關系。 此類無定形氟聚合物(化學惰性的)基板上該范圍的細胞不會因施加于細胞上的 光學表面作用力而離開表面。
如果細胞不能直接附著在氟聚合物基板表面上，可以用各種蛋白質(zhì)，例如 層粘連蛋白-5、膠原I或纖連蛋白中的一種包被該表面以使細胞附著。可以檢 測細胞是正常還是癌性(即，OSCC， 口腔鐮狀細胞癌)上皮細胞。
在一個實施方式中，細胞的光學變形性(細胞彈性/粘彈性的量度)與細胞骨 架蛋白質(zhì)表達的測量值(例如，熒光)相關，還與侵襲力的測量值相關，從而能 測定是否存在惡性腫瘤。
具體地說，在本發(fā)明的一個實施方式中，圖1顯示了采用全息光肼技術對黏附細胞實施空間調(diào)制的光學力顯微術(SMOFM)的設備100的示意圖。
然而，本領域普通技術人員知道可以采用空間調(diào)制的光學力顯微術而不采 用全息光肼技術，或不用光學施加的作用力而對黏附細胞實施本發(fā)明?；蛘?， 如果采用全息光肼技術來施加光學作用力，可不用本文概述的傅立葉相位技 術，而采用其它定量相位顯微技術(quantitative phase microscopy techniques) 實施本發(fā)明。
本發(fā)明的激光耦合空間調(diào)制光學力顯微鏡(SMOFM)設備100利用，例如 的翻轉式Nikon TE200顯微鏡101，其裝有溫控樣品臺102作為平臺。例如， 可將生長在無定形氟聚合物-包被蓋玻片或載玻片104，或上述包被有蛋白質(zhì)的 無定形氟聚合物包被蓋玻片或載玻片104上的物體(即，黏附細胞)103置于樣 品臺102上(例如，控制至37。C)。
在一個實施方式中，利用瓦數(shù)足夠的燈105照射顯微鏡載玻片105上的物 體，從而足以通過顯微鏡101的目鏡106和成像裝置，例如照相機(CCD 107) 觀察物體103。如果需要可以取消利用燈105進行的這種照射。
可利用低相干光源，例如超發(fā)光二級管108來成像(即，中心波長為820 nm，帶寬為14nm的OLSLD-820-HP1，激光2000)。為檢測視場中的光程長 差異，超發(fā)光二級管108可對載玻片104上的物體103提供寬視場照射，因而 特別適合于空間光調(diào)制的作用力顯微技術。
然而，對于任何定量相位顯微技術，包括空間光調(diào)制的作用力顯微術，還 可使用除超發(fā)光二級管108以外的其它相干光源，例如合適的激光。利用物鏡 111將超發(fā)光二級管108的光適當?shù)貙饰锲矫妫瑥亩沟霉馐闹睆匠錆M觀 察區(qū)域。
對于只有一條探針光束的空間調(diào)制光學力顯微鏡101，通過具有自由空間 光束或光纖光耦合光束的二色鏡113，將光學作用力激光(即，1064 nm，V106C， Spectra-Physics)109耦合到物鏡111中。使該光束聚焦到物鏡111的后方孔徑 平面，從而自物鏡lll產(chǎn)生準直光束。通過置于激光109的輸出孔徑處的、經(jīng) 校驗的計算機控制的激光衰減器119(即，OZ Optics),來控制激光109的輸出 功率，從而能控制施加于物體103的光學作用力的大小。為了提供能并行檢測載玻片104上許多物體103的光程長的裝置，將全息
光肼(HOT)設備110(例如，參見通過引用納入本文的Grier等的美國專利 6,055,106訴作光源。照射物體103的HOT光源是用于施加光學產(chǎn)生的作用力 的激光109(例如，1064 nm, V106C， Spectra-Physics laser)。
對于裝有其數(shù)量可由用戶定義的光肼(tr叩)(可動態(tài)改變)的空間調(diào)制光學 力顯微鏡101，可利用HOT設備110修改光學力激光109的波前，從而能將 多個光點施加于感興趣的位置(例如，視場中的物體103或細胞所處的地方)。
具體地說，HOT設備IIO(見圖2)包括準直激光束201，該激光束通過衍 射光學元件202而定形，經(jīng)(例如)望遠鏡透鏡204、 205傳遞至物鏡203的后方 孔徑，聚焦到由光束208照射的多個光肼207。點B'與B共軛。然而應注意， 如果需要可將望遠鏡透鏡204、 205從設備上除去。
圖1顯示了圖2所示HOT設備110的一些元件。例如，物鏡203是用于 使光束208聚焦從而形成光肼207的顯微鏡物鏡111，所述光肼影響載玻片104 上的物體103。
因此，可利用HOT設備110作為高強度光源(即，用于光學檢測的激光 109)對載玻片104上的物體103(例如，細胞)施壓。該壓力施加于載玻片104 上的各物體103。
此外，為更有效地檢測物體103或細胞的光程長，可采用全息光學技術平 行放置光學力探針。通過利用計算機控制的SLM 115來控制單激光109波前 的相位，可能在視場中同時放置并應用多個光學力探針。
此外，因為空間調(diào)制的光學力顯微技術所用的檢測方法能以像素為單位一 次性檢測整個視場的光程長，所以本發(fā)明不難用于并行檢測許多物體103或細 胞(如果需要，也可以自動進行)。因此，利用單光源(例如，利用HOT IIO)產(chǎn) 生許多探針光束(細光束)可以同時檢測物體樣品104(例如，細胞)內(nèi)的許多物體 或點。
本發(fā)明利用置于燈105前的帶通濾波器114照射物體103，所述帶通濾波 器能使可見光帶從燈105中出來并到達觀察照相機(CCD)107，并排除來自其它 兩種光源(即，激光109和超發(fā)光二級管108)的光。如上所述，用戶利用該可見光帶進行觀察，如果需要可從設備中省去。
來自超發(fā)光二級管108的光是作為未修改的圖像與該圖像的相移版本的
疊加產(chǎn)物而被成像的，這可通過空間光調(diào)制器(SLM)115(也稱為可編程相位調(diào) 制器(PPM))(即，X8267濱松光子公司(HamamatsuPhotonics), K.K.)來實施， 該調(diào)制器是圖3所示SMOFM 300的一部分。所傳遞的光通過帶通濾波器118， 從而只有超發(fā)光二級管108的光在成像裝置或CCD 116上成像而阻斷激光109 到達該CCD 116。
計算機控制接口 117整合了SLM 115、 CCD 116圖像獲取、HOT 110和 激光衰減器109控制(即，OZ Optics的)及位置依賴性光程長計算所需的圖像 處理，該接口具有以圖形編程語言編寫的軟件。
本發(fā)明采用空間調(diào)制的光學力顯微術(SMOFM)檢測物體103的光學變形。 如上所述，SMOFM能定量檢測由HOT 110施加的光學力導致的光程長變化。
本發(fā)明技術包括引入第二光源(即，低相干超發(fā)光二級管108)，該光源是 從單模光纖(確?？臻g相干性)出現(xiàn)后經(jīng)準直的光纖。超發(fā)光二級管108用空間
相干的光對物體103進行平面波照射，二級管108的光因時間相干性低而防止 檢測期間出現(xiàn)有問題的反射偽像。像場的傅立葉變換被投影到SLM 115的表 面上。然后使該圖像反向變換從而在CCD 116上形成物體的真實圖像。無需 在SLM 115上進行任何調(diào)制，即可在CCD 116上重建原始圖像。通過只調(diào)制 SLM115的k:0分量(以像素計假定在中心點處)，可不依賴于空間可變的分 量115而調(diào)制圖像DC水平的相位。
本發(fā)明技術包括使圖像DC分量的相位通過四(4)次相移(各Tl/2)而步進； 并逐個像素地捕獲四(4)個CCD圖像，它們用于存儲圖像的DC場和空間變化 場的干擾。
利用獲得的四(4)個圖像，采用現(xiàn)有算法(參見以下方程式[1]到[4])逐個像 素地獲得DC場和空間變化場之間的相位差。該相移等于光在該像素位置處的 光程長的變化。
通過上述數(shù)學關系，四(4)個相移圖像的信息可以表示為E場的相位分布。 通過比較施加光學力前后的相位分布，可以獲得以像素計的所需光程長變化信息。例如，圖像平面中的電場是E = EQ+EP總場E分成空間未變場(DC分 量)E。和空間變化分量Ep在CCD 116上檢測到的四(4)次相移(11 = 0、 1、 2、 3)各自的強度為<formula>formula see original document page 18</formula> [1]Acp(x，y)是像素位置(x，y)處E。和E"x，y)之間的相位差，其為<formula>formula see original document page 18</formula>[2] E場的相位分布cp(x，y)為<formula>formula see original document page 18</formula>， [3]和<formula>formula see original document page 18</formula>[4]其中7=1/4陽0|2。借助這些現(xiàn)有的數(shù)學關系(參見Popescu, G.等，"研究生物學結構和動 力學的傅立葉相位顯微術"(Fourier phase microscopy for investigation of biological structures and dynamics), Optics Letters 29(21):2503-5 (2004)),四 (4)個相移圖像的信息可以表示為E場的相位分布。通過比較施加光學力前后的 相位分布，可以獲得以像素計的所需光程長變化信息。因此，本發(fā)明首先將校正透鏡(CL) 307(參見圖3)置于圖像的焦平面處來修 改超發(fā)光二級管108的圖像信號(可選擇CL 307，從而使得焦距等于圖像平 面(IP) 306/虛擬點源(virtual point source) (VPS) 308長度)。隨后利用傅立葉 透鏡302(例如，焦距為50cm)，采用標準4-f幾何方法將該圖像經(jīng)傅立葉變換 到SLM或PPM301(圖1中的SLM 115)的表面上。空間光調(diào)制器SLM 115(即，可編程相位調(diào)制器(PPM)(即，X8267濱松光 子公司，&乂))可以是單獨可尋址的2-維液晶陣列，其設計成具有0-2兀之間的 獨立相位控制，各像素至少具有8比特的分辨率。插入起偏器P 304來選擇入 射光的偏振作用使之與液晶分子軸的方向匹配，因而這種相位控制是可能的。SLM 301反射出的相位調(diào)制圖像通過在CCD 116上的分束器(BS)反射而在 CCD照相機305(圖1中的CCD 116)上成像。因此，檢測各物體103包括1)在沒有光學力存在時檢測物體103的光程 長(產(chǎn)生光程長L)，和2)施加光學力后檢測物體103的光程長(產(chǎn)生光程長L')。 本發(fā)明的技術能獲得光學變形性的測量值(S卩，應力，(L，-L)/L)，將該測量值與 其它物體的光學變形性比較從而確定細胞的彈性是否能確診癌癥。因此，所施 加的光學力的持續(xù)時間和量級將確定是否引發(fā)了物體103的彈性和/或粘彈性 反應，以及彈性和/或粘彈性反應的量級是否表明了癌癥。在另一實施方式中，可以檢測物體或細胞的光學變形性，并與細胞骨架/ 結構蛋白質(zhì)表達的測量值相關聯(lián)(通過細胞的熒光顯微術)。例如，本領域已知 許多方法可利用熒光成像和采用免疫定位(參見Imai， K.等，"人口腔鱗狀細 胞癌中橋粒核心糖蛋白和中間絲的免疫定位"(Immunolocalization of desmoglein and intermediate filaments in human oral squamous cell carcinomas), Head Neck 17:204-12 (1995))來定量測定蛋白質(zhì)表達。此外，癌性口腔上皮細胞已顯示能表達波形蛋白。也有報道提示甚至在腫 瘤細胞表現(xiàn)出間充質(zhì)細胞形態(tài)之前就可檢測波形蛋白表達，從而使得細胞變形 形中假定的波形蛋白介導的改變成為潛在的理想診斷標記。為通過免疫定位與蛋白質(zhì)表達相關聯(lián)，可用特異性抗體(即，抗-波形蛋白) 培育細胞，洗滌細胞，然后用熒光標記的第二抗體，例如艾力克薩熒光 594(Alexa Fluor 594)第二抗體培育細胞，洗滌，最后制備用于熒光圖像分析與 SMOFM聯(lián)用的細胞。可以相似方式采用本發(fā)明技術使任何理想的蛋白質(zhì)表達標記與細胞的光 學變形性相關聯(lián)。因此，例如本發(fā)明設備能將光學力施加于黏附細胞，并且可以靈敏而定量 地檢測它們的合力表面扭曲。本發(fā)明的空間調(diào)制光學力顯微術組件能以干涉靈 敏度(亞納米靈敏度)定量測定光學施加的表面作用力所致的細胞表面扭曲?？?以測定光程長的改變以及隨之的形狀改變，因此可以鑒定具有獨特光學變形性 特征的患病細胞，包括癌細胞。因此，本發(fā)明的光學力顯微術設備是使顯示變形性的機械檢測結果的細胞 中的分子和遺傳模式相關聯(lián)，加入新維度來表征癌性表型的有價值工具。本發(fā) 明還為根據(jù)變形性檢測參數(shù)進行癌癥篩選試驗提供了基礎。應該強調(diào)的是，本發(fā)明的上述實施方式只是為明確理解本發(fā)明主旨而列出 的可能實施例。可對本發(fā)明的上述實施方式作出改變和改進而不脫離本發(fā)明的 構思和主旨。所有這種改進和改變應包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)并受到以下權利要 求書的保護。
權利要求
1. 一種檢測多個物體的變形情況的設備，包括 提供物體的寬視場照射的低相干光源；和 對各物體的相移形式進行成像的空間調(diào)制光學力顯微術裝置； 其中所述空間調(diào)制光學力顯微術裝置檢測各物體的光程長差異；和 其中所述光程長差異表明這些物體的變形情況。
2. 如權利要求l所述的設備，其特征在于，還包括 全息光肼裝置，包括將光學產(chǎn)生的作用力施加于物體的激光。
3. 如權利要求l所述的設備，其特征在于，所述物體是黏附細胞。
4. 如權利要求l所述的設備，其特征在于，還包括 照射物體的燈；使可見光波帶中的光自所述燈出現(xiàn)從而照射物體的第一帶通濾波器；和 觀察由所述燈照射的物體的成像裝置。
5. 如權利要求2所述的設備，其特征在于，所述空間調(diào)制光學力顯微術裝置包括至少一個空間光調(diào)制器；物鏡；和 顯微鏡。
6. 如權利要求3所述的設備，其特征在于，所述細胞生長在無定形氟 聚合物包被的蓋玻片上。
7. 如權利要求6所述的設備，其特征在于，所述蓋玻片包被有蛋白質(zhì)。
8. 如權利要求l所述的設備，其特征在于，所述低相干光源是超發(fā)光 二級管。
9. 如權利要求l所述的設備，其特征在于，所述低相干光源是激光。
10. 如權利要求5所述的設備，其特征在于，使所述激光產(chǎn)生的光束 聚焦在所述物鏡的后方孔徑處。
11. 如權利要求IO所述的設備，其特征在于，還包括 放置于所述激光的輸出孔徑處的計算機控制激光衰減器，其控制所述激光的功率的大小和施加于所述物體的光學力。
12. 如權利要求ll所述的設備，其特征在于，所述全息光肼設備修改 所述激光的波前以將細光束施加于物體從而在這些物體上施加作用力。
13. 如權利要求12所述的設備，其特征在于，通過衍射光學元件使所述細光束成形。
14. 如權利要求12所述的設備，其特征在于，所述細光束用作同時對 多個物體施壓的光學力探針。
15. 如權利要求5所述的設備，其特征在于，通過所述空間光調(diào)制器， 使從所述低相干光源傳遞的光成像為物體的未修改圖像加上物體的所述圖 像的相移形式的疊加。
16. 如權利要求15所述的設備，其特征在于，所述空間光調(diào)制器是可 編程相位調(diào)制器。
17. 如權利要求4所述的設備，其特征在于，還包括 第二成像裝置；和只允許所述低相干光源的光在所述第二成像裝置上成像的第二帶通濾 波器。
18. 如權利要求11所述的設備，其特征在于，還包括 計算機控制的接口，其整合了所述空間光調(diào)制器、所述第二成像裝置、所述全息光肼裝置和所述計算機控制的激光衰減器。
19. 如權利要求18所述的設備，其特征在于，所述空間光調(diào)制顯微術裝 置定量地測量因所述全息光肼裝置施加光學力所導致的所述光程長的所述差 異。
20. 如權利要求15所述的設備，其特征在于，使所述未修改圖像的DC 分量的相位通過四次相移而步進，所得到的四個相移圖像存儲所述相移圖像的 DC場和空間變化場的干涉。
21. 如權利要求20所述的設備，其特征在于，所述相移等于光在像素位置處經(jīng)歷的光程長變化。
22. 如權利要求15所述的設備，其特征在于，還包括置于所述圖像的焦平面處的校正透鏡；和將所述圖像變換到所述空間光調(diào)制器表面上的傅立葉透鏡。
23. 如權利要求5所述的設備，其特征在于，所述空間光調(diào)制器是單 獨可尋址的兩維液晶陣列，其具有0-2;r之間的獨立相位控制，各像素至少具 有8比特的分辨率。
24. 如權利要求23所述的設備，其特征在于，還包括 起偏器；其中使所述液晶陣列上的入射光偏振從而與所述液晶陣列的分子軸的方 向匹配。
25. 如權利要求24所述的設備，其特征在于，還包括 分束器；其中所述空間光調(diào)制器反射出的相位調(diào)制圖像通過在所述分束器上的反 射而被成像在所述第二成像裝置上。
26. 如權利要求1所述的設備，其特征在于，所述光學變形性的測量 包括測量物體的應力。
27. 如權利要求26所述的設備，其特征在于，所述應力定義為L，-L/L， 其中L是沒有光學力存在時各物體的所述光程長的測量值，L'是施加光學 力后各物體的所述光程長的測量值。
28. 如權利要求26所述的設備，其特征在于，將光學變形性的所述測 量值與以前測量過的其它物體的光學變形性進行比較從而確定物體的粘彈性 或彈性的變化是否提供了關于疾病或損傷的判定。
29. 如權利要求28所述的設備，其特征在于，測量所述物體的所述光 學變形性，并使所述光學變形性與細胞骨架/結構蛋白質(zhì)表達的測量值關聯(lián) 起來。
30. 如權利要求29所述的設備，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是波形蛋白。
31. —種檢測多個物體的尺寸的方法，包括利用低相干光源照射基板上的物體；在空間調(diào)制光學力顯微術裝置上對各物體的相移形式進行成像； 確定各物體的光程長的差異；和比較所述差異與其它物體的光程長來確定物體的光學變形性。
32. 如權利要求31所述的方法，其特征在于，還包括 利用全息光肼裝置對物體施加光學產(chǎn)生的作用力。
33. 如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述物體是黏附細胞。
34. 如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述照射步驟包括 利用第一帶通濾波器使得可見光波帶中的光照射物體；和 利用成像裝置觀察照射的物體。
35. 如權利要求33所述的方法，其特征在于，所述物體生長在無定形 氟聚合物包被的蓋玻片上。
36. 如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述蓋玻片包被有蛋白質(zhì)。
37. 如權利要求34所述的方法，其特征在于，由低相干光源提供所述 照射。
38. 如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述低相干光源是超發(fā) 光二極管。
39. 如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述低相干光源是激光。
40. 如權利要求32所述的方法，其特征在于，還包括 將所述激光所產(chǎn)生的光束聚焦到物鏡的后方孔徑處。
41. 如權利要求40所述的方法，其特征在于，還包括 用安置于所述激光的輸出孔徑處的計算機控制的激光衰減器來控制所述激光的功率的大小和施加于所述物體的光學力。
42. 如權利要求41所述的方法，其特征在于，還包括 利用所述全息光肼設備修改所述激光的波前，從而將細光束施加于所述物體，進而將光學力施加于所述物體。
43. 如權利要求42所述的方法，其特征在于，由衍射光學元件使所述細光束成形。
44. 如權利要求42所述的方法，其特征在于，還包括通過利用所述細光束作為光學力探針，同時對所述物體施壓。
45. 如權利要求44所述的方法，其特征在于，還包括-通過利用空間光調(diào)制器，使從所述低相干光源傳遞的光成像為所述物體的未修改圖像加上所述物體的所述圖像的相移形式的疊加。
46. 如權利要求45所述的方法，其特征在于，所述空間光調(diào)制器是可 編程相位調(diào)制器。
47. 如權利要求45所述的方法，其特征在于，還包括 利用第二帶通濾波器，使所述低相干光源的光成像在第二成像裝置上。
48. 如權利要求47所述的方法，其特征在于，還包括 利用計算機控制的接口，整合所述空間光調(diào)制器、所述第二成像裝置、所述全息光肼裝置和所述計算機控制的激光衰減器。
49. 如權利要求45所述的方法，其特征在于，還包括 定量測量因所述全息光肼裝置施加光學力所導致的所述光程長的所述差異。
50. 如權利要求45所述的方法，其特征在于，還包括 通過所述未修改圖像的DC分量的相位的四次相移而步進； 其中所得到的四個相移圖像存儲所述相移圖像的DC場和空間變化場的干涉。
51. 如權利要求50所述的方法，其特征在于，還包括 將所述圖像傅立葉變換到所述空間光調(diào)制器的表面上。
52. 如權利要求51所述的方法，其特征在于，所述空間光調(diào)制器是單 獨可尋址的兩維液晶陣列，其具有0-2;t之間的獨立相位控制，各像素至少具 有8比特的分辨率。
53. 如權利要求52所述的方法，其特征在于，還包括 使所述液晶陣列上的入射光偏振，從而與所述液晶陣列的分子軸的方向匹
54. 如權利要求53所述的方法，其特征在于，還包括所述空間光調(diào)制器反射出的相位調(diào)制圖像通過分束器的反射而在所述第 二成像裝置上成像。
55. 如權利要求31所述的方法，其特征在于，還包括測量物體的應力以確定所述光學變形性。
56. 如權利要求55所述的方法，其特征在于，所述應力定義為L'-L/L， 其中L是沒有光學力存在時所述物體的所述光程長的測量值，L'是施加光 學力后所述物體的所述光程長的測量值。
57. 如權利要求56所述的方法，其特征在于，還包括 將光學變形性的所述測量值與其它物體的光學變形性進行比較，從而確定物體的粘彈性或彈性是否提供了關于疾病或損傷的判定。
58. 如權利要求57所述的方法，其特征在于，還包括 測量物體的所述光學變形性并使所述光學變形性與細胞骨架/結構蛋白質(zhì)表達的測量值關聯(lián)起來，從而確定所述表達是否是關于疾病或損傷的 判定。
59. 如權利要求58所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是波形蛋白。
60. 如權利要求1所述的設備，其特征在于，施加于物體以測量變形 性的作用力是非光學的。
61. —種檢測多個細胞的變形性的設備，包括 安置于基板上的多個細胞；將光學力施加于這些細胞上的全息光肼裝置，所述全息光肼裝置包括產(chǎn)生激光束的激光光源；物鏡；和衍射光學元件；其中由所述衍射光學元件調(diào)制所述光束從而形成細光束； 其中所述細光束用作對多個細胞同時施壓的光學力探針；和 其中因施加所述光學力所致的各細胞的光程長的差異表明了細胞的變 形情況。
62. 如權利要求61所述的設備，其特征在于，所述細胞是黏附細胞。
63. 如權利要求62所述的設備，其特征在于，測量所述細胞的所述光 學變形性，并使所述光學變形性與細胞骨架/結構蛋白質(zhì)表達的測量值關聯(lián) 起來。
64. 如權利要求61所述的設備，其特征在于，所述物體的非黏附細胞。
全文摘要
本發(fā)明采用空間調(diào)制的光學力顯微術(SMOFM)產(chǎn)生探針光束作為作用力探針來干擾黏附于或置于某表面上的物體，因而隨后可定量檢測所述物體的變形情況，所述顯微術具有單光束光學力檢測能力或裝有能進行多光束光學力檢測并與顯微鏡物鏡耦合的全息光肼系統(tǒng)。利用計算機控制的空間光調(diào)制器使圖像的一系列四(4)張相移復制品成像并采用現(xiàn)有算法通過像素光程長計算像素來定量測定。如果所述物體是細胞，光程長的變化以及隨后引發(fā)的粘彈性或彈性反應表明損傷或疾病。在另一實施方式中，可檢測細胞的光學變形性，并使之與細胞骨架/結構蛋白質(zhì)表達的測量值相關聯(lián)。
文檔編號G01B9/02GK101313196SQ200680043642
公開日2008年11月26日 申請日期2006年10月17日 優(yōu)先權日2005年10月17日
發(fā)明者O·阿卡基 申請人:阿而利克斯公司