專利名稱：：用于測(cè)定殘留動(dòng)物用藥物的提取液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于測(cè)定殘留動(dòng)物用藥物的提取液。更詳細(xì)地說，涉及由特定pH的緩沖液組成、測(cè)定畜水產(chǎn)品中殘留的動(dòng)物用藥物時(shí)所使用的提取液。
背景技術(shù)：
：近年來，為了預(yù)防/治療畜水產(chǎn)動(dòng)物的疾病或促進(jìn)生長(zhǎng)，人們使用了許多種動(dòng)物用藥物。測(cè)定(定量)畜水產(chǎn)品中動(dòng)物用藥物的殘留量對(duì)確保食品安全至關(guān)重要?；诖朔N狀況，日本引入了與畜水產(chǎn)品中殘留的動(dòng)物用藥物相關(guān)的肯定列表制度，同時(shí)規(guī)定了200多種動(dòng)物用藥物殘留量的暫定基準(zhǔn)值，但實(shí)際上用公定方法對(duì)每種動(dòng)物用藥物的殘留進(jìn)行分析，這在時(shí)間與勞動(dòng)力上均難以應(yīng)付。因此希望開發(fā)出一種能同時(shí)且簡(jiǎn)便、迅速地分析多種成分的殘留物質(zhì)的分析方法。在動(dòng)物用藥物中，特別是抗菌物質(zhì)(例如抗生素、合成抗菌藥等)在目前集約化伺養(yǎng)方式下使用的種類和用量均有增加的趨勢(shì)，其在畜水產(chǎn)品中殘留的可能性備受關(guān)注。當(dāng)進(jìn)行多成分同步分析時(shí)，需要從被檢物畜水產(chǎn)品中一次性提取出多種殘留動(dòng)物用藥物。對(duì)可溶于有機(jī)溶劑的動(dòng)物用藥物來講，通過使用有機(jī)溶劑作為提取液，上述問題已得到解決(例如，參考Howdls，L.，Sauer,M.J.,Analyst,126,155~160，2001)。但是，對(duì)難溶于有機(jī)溶劑的藥物來講，因不能使用有機(jī)溶劑，提取工序存在問題。但現(xiàn)在的問題是，即使在食品衛(wèi)生法所規(guī)定的動(dòng)物用藥物中，對(duì)諸如螺旋霉素、替米考星、慶大霉素、大觀霉素、新霉素等抗生素類或喹喔啉甲酸、環(huán)丙馬秦等高極性化合物也未能開發(fā)出多成分同步分析的方法。
發(fā)明內(nèi)容如上所述，對(duì)可溶于有機(jī)溶劑的動(dòng)物用藥物來講，通過使用有機(jī)溶劑作為提取液，問題已得到解決，但期望對(duì)水溶性的動(dòng)物用藥物也能一次性提取的提取液。但問題是在動(dòng)物用藥物中，如抗菌物質(zhì)等各種藥物可穩(wěn)定存在的條件各異，因此要在多種殘留動(dòng)物用藥物不變性的條件下高效地一次性提取是困難的。為解決上述問題，本發(fā)明人等進(jìn)行了各種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過使用具有特定性狀的提取液，可以在多種殘留動(dòng)物用藥物不變性的條件下高效地一次性提取。但是，氨基糖苷類抗生素與被;險(xiǎn)物畜水產(chǎn)品的親和性高，4艮據(jù)畜水產(chǎn)品的性狀，即肉種(例如牛肉、豬肉、魚肉等)的不同、部位(例如腿肉、肩肉等)的不同、脂肪含量的不同等，提取率存在差異，且確認(rèn)到數(shù)據(jù)的不規(guī)則。本發(fā)明為解決上述問題而設(shè)，本發(fā)明人等進(jìn)行了各種研究，結(jié)果明確了使用pH8.010.0的緩沖液作為提取液，可以從畜水產(chǎn)品祐:檢物中有效地提取氨基糖苷類抗生素。推定這種現(xiàn)象不是由于使用pH8.0~10.0的緩沖液而使氨基糖苷類抗生素的溶解性提高，而是通過使用該pH的緩沖液改變了畜水產(chǎn)品被檢物的性狀，使氨基糖苷類抗生素從被檢物中的游離/釋放得到促進(jìn)。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)而設(shè)，提供對(duì)畜水產(chǎn)品中殘留的動(dòng)物用藥物、特別是氨基糖苷類抗生素的一次性提取有用的提取液。為了解決上述問題而設(shè)的本發(fā)明是由pH8.010.0、優(yōu)選pH8.59.5的緩沖液組成的畜水產(chǎn)品中的殘留動(dòng)物用藥物的提取液。特別適合用于殘留動(dòng)物用藥物為氨基糖苷類抗生素時(shí)的提取，緩沖液優(yōu)選使用Atkins&Pantin緩沖液。附圖簡(jiǎn)述圖1是表示各種抗生素的回收率(％)的pH依存性的圖。實(shí)施發(fā)明的最佳方式如上所述，本發(fā)明的提取液由pH8.010.0的緩沖液組成，優(yōu)選由pH8.5~9.5的緩沖液組成。若pH不足8.0或超過10.0，則提取效率降<氐，不優(yōu)選。作為上述緩沖液，只要對(duì)從畜水產(chǎn)品中提取動(dòng)物用藥物無阻礙作用，可以使用任意的緩沖液，例如Atkins&31^11緩沖液、Tris(三羥曱基氨基甲烷)緩沖液、Bicine(N，N-二(2-羥乙基)甘氨酸)緩沖液、TAPS(N-三(羥曱基)甲基-3-氨基丙磺酸)緩沖液、CHES(N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸)緩沖液、澤倫森(Sorensen)緩沖液、克拉克-魯布斯(Clark-Lubs)緩沖液、Kolthoffs緩沖液、Britton-Robinson緩沖液、米氏(Michaelis)的巴比妥緩沖液或米氏的二曱基甘氨酸緩沖液等。提取液的優(yōu)選方式為pH8.59.5的Atkins&Pantin緩沖液。本發(fā)明的提取液可以廣泛用于畜水產(chǎn)品被檢物中的動(dòng)物用藥物的提取，特別是對(duì)氨基糖苷類抗生素的提取效果顯著。所述氨基糖苷類抗生素例如有新霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、大觀霉素、慶大霉素、潮霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、巴龍霉素、安普霉素等。特別是具有對(duì)利用常規(guī)的提取液難以提取的慶大霉素可以高效率提取的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的提取液根據(jù)需要還可以添加EDTA等螯合物、曱醇等水性有才幾溶劑。本發(fā)明提取液的使用方法可以采用與以往的殘留動(dòng)物用藥物拔_取液相同的方法。例如，向被檢畜水產(chǎn)品中添加本發(fā)明的提取液，均質(zhì)后，利用離心、通過濾紙過濾等常用方法進(jìn)行分離即可得到提取液。提取液相對(duì)于上述被檢物的使用量可調(diào)整到被檢物與提取液之比為1:1~10(W/V比，下同)，優(yōu)選為1:2~8,更優(yōu)選為1:2.55左5右。相對(duì)于l份被檢物，如果添加的提取液不足1份，則可能使提取不充分；如果提取液超過10份，提取方面雖然沒有問題，但由于提取液量增加可能會(huì)使操作變得繁雜。作為^皮^r物的畜水產(chǎn)品包括畜肉(例如牛肉、豬肉、雞肉、兔肉、羊肉等)和水產(chǎn)品(例如竹莢魚(youngyellowtail)、海鯛、河豚、奸、鰻魚、鯉魚等)。如此得到的提取液，經(jīng)過柱純化等常規(guī)方法純化后，利用常規(guī)的測(cè)定裝置可測(cè)定殘留動(dòng)物用藥物。作為純化方法，例如可以使用ds固相提取柱等，此時(shí)，為使所述柱吸附被檢物，也可以在提取液中添加離子對(duì)試劑HFBA或庚磺酸。另夕卜，可以利用高效液相色譜法/質(zhì)量分析法等常規(guī)方法對(duì)殘留動(dòng)物用藥物進(jìn)行測(cè)定。產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的提取液，可一次性提取畜水產(chǎn)品中的殘留動(dòng)物用藥物，可以實(shí)現(xiàn)殘留量測(cè)定的迅速化、簡(jiǎn)捷化。特別是對(duì)以往由于畜水產(chǎn)品被檢物的性狀不同而難以均勻提取的氨基糖苷類抗生素具有高的提取效率，可以實(shí)現(xiàn)提高殘留動(dòng)物用藥物的測(cè)定精度。實(shí)施例以下，基于實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不僅限于所列舉的例子。實(shí)施例1被檢物(牛肉)中添加氨基糖苦類抗生素(鏈霉素、雙氫鏈霉素、大觀霉素、慶大霉素)的標(biāo)準(zhǔn)試樣使其濃度分別達(dá)到200ppb，或者未添加的作為對(duì)照被檢物(牛肉)，上述5g被檢物用40mlAtkins&Pantin緩沖液(pH8.5)均質(zhì)后，離心，采取上清，得到提取液。向該提取液中加入曱酸和庚磺酸使其分別達(dá)到0.5%和1%，然后添加到ds固相提取柱(12cc,500mg)上，用10ml水清洗，用10ml水:曱醇(4:l)以及20ml乙腈洗脫。濃縮干燥洗脫液后，用1ml水/甲醇(7:3)再溶解，按以下條件供給LC/MS/MS的分析，求得回收率(％)。在高效液相色譜部分的移動(dòng)床中使用梯度A液(0.3。/。乙酸、10mM乙酸銨)和B液(含20。/。曱醇的乙腈)，通過親水色譜柱，在流速220^1/min的條件下進(jìn)行洗脫。質(zhì)量分析裝置采用AppliedBiosystems公司生產(chǎn)的API2000儀器，離子化才莫式采用正負(fù)ESI，在電噴霧正電壓為5000、渦4侖氣體溫度為550°C的條件下實(shí)施。實(shí)施例2在實(shí)施例1中，除使用Atkins&311^11緩沖液&119.0)作為提取液以外，按照與實(shí)施例l相同的操作、相同的條件供給LC/MS/MS的分析。實(shí)施例3在實(shí)施例1中，除使用Atkins&&1^11緩沖液(119.5)作為提取液以外，按照與實(shí)施例l相同的操作、相同的條件供給LC/MS/MS的分析。比專交例1除使用pH6.0的Mcllvaine溶液作為提取液并進(jìn)行回收以外，按照與實(shí)施例l相同的方法進(jìn)行測(cè)定。以上的試驗(yàn)結(jié)果見表l。如表1所示，就鏈霉素和雙氫鏈霉素而言，本發(fā)明的提取液顯示了比常規(guī)的提取液(比較例l)高的提取率。特別是對(duì)于用常規(guī)的提取液幾乎不能提取的慶大霉素，使用本發(fā)明的提取液達(dá)到了90.8%(實(shí)施例2)的高提取率。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例4對(duì)氨基糖苷類抗生素以外的17種抗生素，同實(shí)施例1一樣，將Atkins&&1^11緩沖液&119.0)用作提取液，進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。結(jié)果見表2。如表2所示，對(duì)氨基糖苷類抗生素以外的抗生素也得到了良好的提取結(jié)果。連同上述表l的結(jié)果，可以確認(rèn)通過使用本發(fā)明的提取液，范圍廣的殘留動(dòng)物用藥物的提取成為可能，即使是抗生素等高極性化合物也可實(shí)施多成分一次性分析。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>被檢物(牛肉)中添加氨基糖苷類抗生素(新霉素、慶大霉素、巴龍霉素、安普霉素、卡那霉素)的標(biāo)準(zhǔn)試樣使其濃度分別達(dá)到500ppb,或者未添加的作為對(duì)照被4企物(牛肉)，上述5g被4企物用80mlMcIlvaine緩沖液(pH5.08.0)均質(zhì)后，離心，采取上清，得到提取液。向該提取液中加入曱酸和庚磺酸使其分別達(dá)到0.5%和1°/。，然后添加到C18固相提取柱(12cc,500mg)上，用10ml水清洗，用10ml水曱醇(4:1)以及20ml乙腈洗脫。濃縮干燥洗脫液后，用1ml水/曱醇(7:3)再溶解，按與實(shí)施例1同樣的條件供給LC/MS/MS的分析。實(shí)施例6除了使用Atkins&Pantin緩沖液(pH8.5~IO.O)代替提取液的Mcllvaine緩沖液并進(jìn)行回收之外，按照實(shí)施例5的方法進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例5和實(shí)施例6的試驗(yàn)結(jié)果如圖l所示。需要說明的是，圖1中，橫軸為pH、縱軸為回收率(％)，此外圖中令標(biāo)記為實(shí)施例5的結(jié)果，網(wǎng)狀正方形標(biāo)記為實(shí)施例6的結(jié)果。由圖l可以明確，試驗(yàn)的新霉素、慶大霉素、巴龍霉素、安普霉素和卡那霉素的提取率依存于pH，特別是使用pH9.0的提取液，可以得到良好的回收率。權(quán)利要求1.畜水產(chǎn)品中殘留動(dòng)物用藥物的提取液，該提取液由pH8.0～10.0的緩沖液組成。2.權(quán)利要求1的畜水產(chǎn)品中殘留動(dòng)物用藥物的提取液，其中pH為8.5~9.5。3.權(quán)利要求1或2的畜水產(chǎn)品中殘留動(dòng)物用藥物的提取液，其中緩沖液為Atkins&Pantin緩沖液、Tris緩沖液、Bicine緩沖液、TAPS緩沖液、CHES緩沖液、澤倫森緩沖液、克拉克-魯布斯緩沖液、Kolthoffs緩沖液、Britton-Robinson緩沖液、米氏的巴比妥緩沖液或米氏的二曱基甘氨酸緩沖液。4.權(quán)利要求3的畜水產(chǎn)品中殘留動(dòng)物用藥物的提取液，其中緩沖液為Atkins&Pantin緩沖液。5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的畜水產(chǎn)品中殘留動(dòng)物用藥物的提取液，其中動(dòng)物用藥物為抗菌物質(zhì)。6.權(quán)利要求5的畜水產(chǎn)品中殘留動(dòng)物用藥物的提取液，其中抗菌物質(zhì)為氨基糖苷類抗生素。7.權(quán)利要求6的畜水產(chǎn)品中殘留動(dòng)物用藥物的提取液，其中氨基糖苷類抗生素為選自新霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、大觀霉素、慶大霉素、潮霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、巴龍霉素和安普霉素中的至少一種。全文摘要本發(fā)明提供一種可以用于提取畜水產(chǎn)品中殘留動(dòng)物用藥物的提取液。本發(fā)明的提取液由pH8.0～10.0、優(yōu)選pH8.5～9.5的緩沖液組成，為可以一次性提取多種動(dòng)物用藥物的提取液。特別適合用于殘留動(dòng)物用藥物為氨基糖苷類抗生素時(shí)的提取。本發(fā)明的提取液，可以在不損害多種動(dòng)物用藥物穩(wěn)定性的情況下，將其有效率地一次性提取，可以實(shí)現(xiàn)畜水產(chǎn)品中殘留動(dòng)物用藥物測(cè)定的迅速化、簡(jiǎn)捷化。文檔編號(hào)G01N30/06GK101331396SQ20068004707公開日2008年12月24日申請(qǐng)日期2006年10月13日優(yōu)先權(quán)日2005年10月19日發(fā)明者北山雅彥,大森丘,小園正樹申請(qǐng)人:日本肉類批發(fā)商株式會(huì)社;學(xué)校法人創(chuàng)志學(xué)園