專利名稱：：包含骨橋蛋白和癌胚抗原的標(biāo)記物組合在結(jié)腸直腸癌的評估中的用途的制作方法200680048492.5包含骨橋蛋白和癌胚抗原的標(biāo)記物組合在結(jié)腸直腸癌的評估中的用途本發(fā)明涉及幫助評估結(jié)腸直腸癌(=CRC)的方法。公開了包含骨橋蛋白和癌胚抗原的標(biāo)記物組合在結(jié)腸直腸癌的評估中的用途。此外，它特別涉及通過測量樣品中至少標(biāo)記物骨橋蛋白和癌胚抗原來從來自個體的液體樣品評估結(jié)腸直腸癌的方法。包含骨橋蛋白和癌胚抗原的標(biāo)記物組合可以，例如，用于結(jié)腸直腸癌的早期檢測或用于監(jiān)督經(jīng)歷了治療例如手術(shù)的患者。盡管在檢測和治療方面有進(jìn)展，癌癥仍然是主要的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。在各種類型的癌癥中，結(jié)腸直腸癌(=CRC)是西方世界最常見的癌癥之一。結(jié)腸直腸癌最經(jīng)常地從腺瘤(息肉)發(fā)展為惡性癌。CRC的不同階段曾經(jīng)根據(jù)Dukes，階段A到D來分類。癌癥的分期是就程度、發(fā)展和嚴(yán)重度而言的疾病的分類。它將癌癥患者分組，從而關(guān)于預(yù)后和治療選擇可以進(jìn)行普遍化。當(dāng)今，TNM系統(tǒng)是癌癥的解剖學(xué)范圍上最廣泛使用的分類法。它代表了國際公認(rèn)的、統(tǒng)一的分期系統(tǒng)。其中有三種基本變量T(原發(fā)腫瘤的程度)、N(區(qū)域性淋巴結(jié)的狀態(tài))和M(遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的存在或不存在)。由UICC(國際癌癥防治聯(lián)合會)公開了TNM指標(biāo)(Sobin,L.H.andFleming,I.D.,Cancer80(1997)1803-1804)。特別重要的是，CRC的早期診斷轉(zhuǎn)變?yōu)楹玫枚嗟念A(yù)后。大多數(shù)結(jié)腸直腸的惡性腫瘤看起來來自于良性胂瘤，即，來自腺瘤。因而，最好的預(yù)后是在腺瘤階段診斷出的那些患者。在早至階段I^,N0，MO或Tl-3;NO;MO診斷的患者如果適當(dāng)?shù)刂委?，在診斷后有超過90%的5年存活機(jī)會，相比較的，當(dāng)已經(jīng)存在遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移時診斷的僅10%的5年存活率。在本發(fā)明的意義上，CRC的早期診斷是指處于前惡性狀態(tài)(腺瘤)或處于完全沒有轉(zhuǎn)移(既沒有近端也沒有遠(yuǎn)端)的胂瘤階段的診斷結(jié)論，即，存在腺瘤、Tis、NO、M0或Tl-4;NO;MO。丁18表示原位癌。進(jìn)一步優(yōu)選的，當(dāng)完全沒有生長通過腸壁因而既沒有腹膜臟層穿孔也沒有其他器官或結(jié)構(gòu)被侵入時診斷CRC,即，該診斷結(jié)論在階段Tis、N0、M0或Tl-3;NO;M0(=Tis-3;NO;MO)^故出。癌癥被檢測/診斷越早，總體存活率越好。這對于CRC是特別符合的。在腫瘤的發(fā)展階段中的預(yù)后是不良的。在診斷后五年內(nèi)超過三分之一的患者將死于進(jìn)行性疾病，相應(yīng)于約40%的五年存活率。當(dāng)前的治療僅僅治愈一小部分患者，對于在疾病的早期階段診斷的那些患者明顯具有最好的效果。對于作為公眾健康難題的CRC，必須的是開發(fā)對于結(jié)腸直腸癌的更有效的篩選和預(yù)防措施。當(dāng)前對于結(jié)腸直腸癌可用的最早期的檢測過程涉及使用糞便潛隱血或內(nèi)窺鏡操作。然而，在檢測出糞便血液之前一般必須有顯著的腫瘤大小?；谟鷦?chuàng)木脂的糞便潛隱血測試的敏感性是-26%,其意味著具有惡性病變的74%的患者將仍未被測出。(Ahlquist,D.A.,Gastroenterol.Clin.NorthAm.26(1997)41-55)。前癌性和癌性病變的可視化是早期檢測的最好方法，但是結(jié)腸鏡檢查是侵入性的，具有顯著的費(fèi)用、風(fēng)險和并發(fā)癥。(Silvis,S.E.,等人，JAMA235(1976)928-930;Geenen,J.E.，等人，Am.J.Dig.Dis.20(1975)231-235;Anderson,W.F.,等人，J.Natl.CancerInstitute94(2002)1126-1133)。為了具有臨床實用性，作為單一標(biāo)記物的新的診斷標(biāo)記物應(yīng)當(dāng)至少與本領(lǐng)域已知的最好的單一標(biāo)記物一樣好?；蛘?，新的標(biāo)記物應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生診斷敏感性和/或特異性方面的進(jìn)展，如果分別地單獨(dú)使用或與一種或多種其他標(biāo)記物組合使用。測試的診斷敏感性和/或特異性通過它的接受者操作特征來最好地評定，其將在下文詳細(xì)描述。結(jié)腸直腸癌中生物化學(xué)標(biāo)記物的臨床實用性近來已經(jīng)由關(guān)于腫瘤標(biāo)記物的歐洲集團(tuán)(EGTM)(Duffy，M丄，等人，Eur.J.Cancer39(2003)718-727)綜述了。目前，基于腫瘤相關(guān)糖蛋白癌胚抗原(CEA)的檢測的主要診斷性血液測試可以用于幫助CRC領(lǐng)域的診斷。CEA在患有結(jié)腸直腸、胃和胰腺癌以及在大部分乳腺、肺以及頭頸癌癥的患者獲得的95%的組織樣品中提高(Goldenberg，D.M.，等人，J.Natl.CancerInst.(Bethesda)57(1976)11-22)。提高的CEA水平還在患有非惡性疾病的患者中報道，具有新近岸企測的結(jié)腸直腸癌的許多患者具有血清中的正常CEA水平，特別是在疾病的早期階段(Carriquiry,L.A.，和Pineyro，A.，Dis.ColonRectum42(1999)921-929;Herrera,M.A.,等人，Ann.Surg.183(1976)5-9;Wanebo,H.J.,等人，N,Engl.J.Med.299(1978)448-451;Wanebo,H,J.，等人，上文)。在檢測復(fù)發(fā)中從血清或血漿測量的CEA的實用性據(jù)報道是爭議性的，尚未被廣泛地應(yīng)用(Martell，R.E.,等人，Int.J.Biol.Markers13(1998)145-149;Moertel,C.G,,等人，JAMA270(1993)943-947)。根據(jù)可獲得的數(shù)據(jù)，血清CEA測定對于允許它在無癥狀群體中作為結(jié)腸直腸癌的篩選測試既沒有敏感性也沒有特異性(Reynoso,G.,等人，JAMA220(1972)361-365;Sturgeon,C.，ClinicalChemistry48(2002)1151-1159)。全血、血清或血漿是在臨床常規(guī)實驗中最廣泛使用的樣品來源。將幫助可靠的癌癥檢測或提供早期預(yù)后信息的早期CRC腫瘤標(biāo)記物的鑒定可以產(chǎn)生將很大地幫助這種疾病的診斷和管理的診斷性分析.因而，存在著急迫的臨床需求來改善CRC的體外評估。改善CRC的早期診斷是特別重要的，因為與在疾病的發(fā)展期診斷的那些患者相比，早期診斷的患者存活率機(jī)會要高得多.本發(fā)明的任務(wù)是研究是否可以鑒定出可以在評估CRC使用的生物化學(xué)標(biāo)記物。令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)的是，包含骨橋蛋白和癌胚抗原的標(biāo)記物組合可以至少部分地克服本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)已知的難題。發(fā)明概述本發(fā)明涉及體外評估結(jié)腸直腸癌的方法，包括測量樣品中骨橋蛋白的濃度、測量樣品中癌胚抗原的濃度、和任選地測量一種或多種其他結(jié)腸直腸癌標(biāo)記物，并且組合分別對骨橋蛋白、癌胚抗原和任選的一種或多種其他結(jié)腸直腸癌標(biāo)記物所測定的濃度用于評估結(jié)腸直腸癌的步驟。還公開的是標(biāo)記物組合骨橋蛋白和癌胚抗原在結(jié)腸直腸癌的評估中的用途，以及包含骨橋蛋白、癌胚抗原和一種或多種其他結(jié)腸直腸癌標(biāo)記物的標(biāo)記物組(panel)在結(jié)腸直腸癌的評估中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行評估CRC的方法的試劑盒，其包含特異性地測量骨橋蛋白和癌胚抗原所需的試劑。發(fā)明的詳細(xì)說明在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及體外評估結(jié)腸直腸癌的方法，包括步驟a)測量樣品中骨橋蛋白的濃度，b)測量樣品中癌胚抗原的濃度，和c)任選地測量一種或多種其他結(jié)腸直腸癌標(biāo)記物，以及d)組合在步驟(a)、(b)中測定的濃度，和任選地在步驟(c)中測定的濃度用于評估結(jié)腸直腸癌。骨橋蛋白(OPN):OPN在正常血漿、尿液、奶和膽汁中發(fā)現(xiàn)(US6,414,219;US5,695,761;Denhardt,D.T.andGuo,X.，F(xiàn)ASEBJ.7(1993)1475-1482;Oldberg,A.,等人，PNAS83(1986)8819-8823;Oldberg,A.,等人，J.Biol.Chem.263(1988)19433-19436;Giachelli,C.M.,等人，TrendsCardiovasc.Med.5(1995)88-95)。已經(jīng)分離和測序了人類OPN蛋白質(zhì)和cDNA(KieferM.C.，等人，Nucl.AcidsRes.17(1989)3306)。OPN功能在于細(xì)胞粘附、趨化性、巨噬細(xì)胞指導(dǎo)的白細(xì)胞介素-10(IL-10)抑制、逆境依賴性血管生成、細(xì)胞凋亡的防止、通過調(diào)節(jié)細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的錨依賴性的胂瘤細(xì)胞生長，以及通過與整聯(lián)蛋白和CD44受體結(jié)合的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。雖然OPN的組成型表達(dá)在幾種細(xì)胞類型中存在，已經(jīng)在改型過程例如炎癥、缺血-重灌注、骨吸收和胂瘤發(fā)展中的T淋巴細(xì)胞、表皮細(xì)胞、骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和胂瘤細(xì)胞中檢測到誘導(dǎo)的表達(dá)(由Wai,RY.&KuoP.C.J,Surg.Res.121(2004)228-241綜述)。已知OPN與許多整聯(lián)蛋白受體相互作用。已經(jīng)報道了在許多人類癌癥中檢測到提高的OPN表達(dá)，已經(jīng)鑒定了它的同源受體(av-b3、av-b5和av-bl整聯(lián)蛋白和CD44)。Irby,R.B.,等人，Clin.Exp.Metastasis21(2004)515-523的體外研究表明，內(nèi)源OPN表達(dá)(經(jīng)由穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染)以及外源OPN(添加到培養(yǎng)基)增強(qiáng)了體外的人類結(jié)腸癌細(xì)胞的運(yùn)動性和侵入能力。OPN看起來通過與CD44相互作用調(diào)節(jié)運(yùn)動性。OPN表達(dá)還降低細(xì)胞間(同型的)粘附，其被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞的特征。用OPN穩(wěn)定轉(zhuǎn)染四種不良致瘤性的人類結(jié)腸癌細(xì)胞系也引起了體內(nèi)增加的腫瘤發(fā)生，具有提高的增殖和提高的CD31陽性微血管計數(shù)，與OPN表達(dá)的程度一致。Mor,G.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102(2005)7677-7682報道了根據(jù)OPN和三種其他被分析物的同時定量的上皮卵巢癌的早期診斷的血液(血清)測試。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及通過生物化學(xué)標(biāo)記物體外評估CRC的方法，包括測量樣品中骨橋蛋白的濃度并在CRC的評估中使用測定的濃度。癌胚抗原(CEA):CEA(癌胚抗原)是具有大約45-60%可變碳水化物成分的單體糖蛋白(分子量大約180.000道爾頓)(Gold,P.andFreedman,S.O.,J.ExpMed121(1965)439-462)。CEA,如AFP,屬于胎兒癌性抗原的組，其在胚胎和胎兒時期期間產(chǎn)生。CEA基因家族由屬于兩個亞群的約17種活性基因組成。第一組含有CEA和非特異性交叉反應(yīng)抗原(NCA);第二組含有妊娠特異性糖蛋白(PSG)。CEA主要在胎兒胃腸道和胎兒血清中存在。它還以微小數(shù)量在健康成年人的腸、胰腺、和肝組織中存在。CEA的形成在出生之后被抑制，從而在健康成年人中血清CEA值幾乎不可測量。高的CEA濃度經(jīng)常在結(jié)腸直腸腺癌的情況下發(fā)現(xiàn)。(Fateh-Modhadam,A.等人(eds.),TumormarkerundihrsinnvollerEinsatz,JuergenHartmannVerlagGmbH，Marloffstein-Rathsberg(1993)，ISBN-3-926725-07-9)。輕微到中度的CEA升高(很少>10ng/mL)在20-50%的腸、胰H肝臟和肺部的良性疾病中發(fā)生(例如，肝硬化、慢性肝炎、胰腺炎、潰瘍性結(jié)腸炎、Crohn's病、肺氣胂)(Fateh-Moghadam,A.,等人，上文)。吸煙也可以提高CEA值。CEA測定的主要適應(yīng)癥是患有結(jié)腸直腸癌的患者的治療管理和跟蹤。CEA測定不被建議用于一般人群的癌癥篩選。正常范圍內(nèi)的CEA濃度不能排除惡性疾病的可能存在。在由RocheDiagnostics生產(chǎn)的分析中抗體與CEA(如幾乎所有的CEA檢測方法一樣)并與阿片抗原(NCA2)反應(yīng)。與NCA1的交叉反應(yīng)性是0.7%(Hammarstrom,S.，等人，CancerRes.49(1989)4852-4858;和Bormer,O.P.，TumorBiol.12(1991)9-15)。已經(jīng)根據(jù)廠家的說明書使用Roche產(chǎn)品號碼11731629在Elecsys分析儀上測量的CEA。如在此使用的，在本節(jié)中，以下每一個術(shù)語具有與之相關(guān)的含義。在此使用的冠詞"一個"和"一種"是指冠詞的一個或超過一個(即，至少一個)語法上的目標(biāo)。舉例來說，"一標(biāo)記物"是指一個標(biāo)i己物或超過一個標(biāo)記物。在此使用的術(shù)語"標(biāo)記物"或"生物化學(xué)標(biāo)記物，，是指用作目標(biāo)用于分析患者測試樣品的分子。這些分子目標(biāo)的實例是樣品中存在的蛋白或多肽本身以及抗體。用作本發(fā)明中的標(biāo)記物的蛋白或多肽預(yù)期包括所述蛋白的任何變體以及所述蛋白或所述變體的片段，特別是免疫學(xué)可檢測的片段。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，例如，在炎癥期間由細(xì)胞釋放或存在于變得損壞的細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)可以被降解或裂解成這樣的片段。某些標(biāo)記物以無活性的形式合成，其隨后可以通過蛋白水解作用活化。熟練技術(shù)人員將理解，蛋白或其片段也可以作為復(fù)合物的部分存在。這種復(fù)合物也可以用作本發(fā)明意義上的標(biāo)記物。標(biāo)記物多肽的變體由相同的基因編碼，但在它們的PI或MW,或兩者上(例如，作為選擇性mRNA或前mRNA加工的結(jié)果，例如選擇性剪接或限制的蛋白水解)不同，此外地或可選擇地，可以來自不同的翻譯后修飾(例如，糖基化、?；?或磷酸化)。術(shù)語"評估結(jié)腸直腸癌"被用于表明，例如，根據(jù)本發(fā)明的方法將(單獨(dú)地或與其他方法或參數(shù)如UICC(參見上文)闡述的指標(biāo)一起)幫助醫(yī)師確定或確認(rèn)CRC的不存在或存在，或在預(yù)后、治療效力的監(jiān)碎見(例如，在手術(shù)、化療或放療之后)以及復(fù)發(fā)的4全測(治療后患者的跟蹤)方面幫助醫(yī)師。在此使用的術(shù)語"樣品"是指為了體外評估的目的獲得的生物樣品。在本發(fā)明的方法中，樣品或患者樣品優(yōu)選地可以包含任何體液。優(yōu)選的測試樣品包括血液、血清、血漿、尿液、唾液和滑液。優(yōu)選的樣品是全血、血清、血漿或滑液，血漿或血清是最優(yōu)選的。熟練技術(shù)人員將理解，任何測量和相應(yīng)的評定是在體外進(jìn)行的?；颊邩悠泛髞肀粊G棄?；颊邩悠穯为?dú)地用于本發(fā)明的體外診斷方法，患者樣品的材料不轉(zhuǎn)移回患者體內(nèi)。一般地，所述樣品是液體樣品，例如全血、血清或血漿。診斷的理想情況將是一種情況，其中單獨(dú)的事件或過程將引起相應(yīng)的疾病，例如在傳染性疾病中。在所有其他情況下，正確的診斷結(jié)論將是非常困難的，特別是當(dāng)疾病的病因不被完全理解時，如CRC的情況。熟練的技術(shù)人員將理解，沒有生物化學(xué)標(biāo)記物，例如在CRC的情況中，是具有100%特異性同時具有100%敏感性的診斷性的。然而生物化學(xué)標(biāo)記物，例如，被用于以某些可能性或預(yù)測價值來評估疾病的存在或不存在。因而在常規(guī)臨床診斷中，一^殳地各種臨床癥狀和生物標(biāo)志物在原發(fā)疾病的診斷、治療和管理中一起考慮。生物化學(xué)標(biāo)記物可以分別地測定，或在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，它們可以使用基于芯片或珠子的陣列技術(shù)同時地測定。然后為每個標(biāo)記物使用單獨(dú)的截止值(cut-off)獨(dú)立地打斷生物標(biāo)記物的濃度，或組合它們用于解釋。優(yōu)選的，對CEA和骨橋蛋白測量的值使用數(shù)學(xué)的或統(tǒng)計學(xué)的函數(shù)組合。在本發(fā)明中公開的包含骨橋蛋白和CEA的標(biāo)記物組合可以改善CRC的評估。包含骨橋蛋白和CEA的標(biāo)記物組合在一個或多個以下方面可能是特別有用的篩選；診斷幫助；預(yù)后；治療和跟蹤的監(jiān)視。篩選CRC是發(fā)達(dá)國家男性和女性的第二常見的惡性腫瘤。由于它的高發(fā)病率、它的長無癥狀階段和前惡性病變的存在，CRC滿足了篩選的許多指標(biāo)。明顯地，與FOB測試或內(nèi)窺鏡檢查相比，具有可接受的敏感性和特異性的血清腫瘤標(biāo)記物將更適合于篩選。如在實施例小節(jié)中給出的數(shù)據(jù)展現(xiàn)了單獨(dú)的標(biāo)記物OPN和單獨(dú)的標(biāo)記物CEA都不足以容許例如CRC的風(fēng)險群體的一般性篩選。對于這兩種標(biāo)記物，在篩選所需的特異性水平下，敏感性不夠高。然而，本發(fā)明中確定的數(shù)據(jù)表明，標(biāo)記物OPN和CEA的組合將形成適合于篩選目的的標(biāo)記物組的整體部分。因而本發(fā)明涉及使用OPN和CEA作為CRC標(biāo)記物組的核心用于CRC篩選目的。當(dāng)前的數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，這兩種標(biāo)記物與一種或多種其他標(biāo)記物的某些組合將在CRC的篩選中是有益的。詞而，本發(fā)明還涉及使用包含OPN、CEA和NSE的標(biāo)記物組，或包含OPN、CEA和NNMT的標(biāo)記物組，例如，用于篩選CRC的目的。診斷幫助外科手術(shù)前的CEA值具有有限的鑒定價值。盡管如此，胂瘤標(biāo)記物歐洲委員會(ECTM)建議，CEA應(yīng)當(dāng)在手術(shù)前測量以建立基準(zhǔn)值和用于評估預(yù)后。根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)記物組合預(yù)計優(yōu)于單獨(dú)的標(biāo)記物CEA。因而預(yù)期的和代表本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式的是，包含OPN和CEA的標(biāo)記物組合被用于診斷幫助。一旦在手術(shù)之前確定了基準(zhǔn)值，標(biāo)記物組合可以有特別好的診斷幫助。因而本發(fā)明還涉及使用標(biāo)記物組合OPN和CEA用于在CRC手術(shù)之前確定基準(zhǔn)值。預(yù)后在CRC患者中用于確定預(yù)后的金標(biāo)準(zhǔn)是Dukes，、TNM或其他分階段系統(tǒng)所定義的疾病的擴(kuò)展。如果標(biāo)記物如CEA將用于預(yù)測結(jié)局，它必需提供比現(xiàn)有分階段系統(tǒng)提供的更強(qiáng)壯的預(yù)后信息，提供獨(dú)立于現(xiàn)有系統(tǒng)的信息，或提供由現(xiàn)有制備定義的特定亞群，例如在Dukes'B或淋巴結(jié)陰性患者中的預(yù)后數(shù)據(jù)。近來，美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)共識會議建議，CEA應(yīng)當(dāng)被加入用于結(jié)腸直腸癌的TNM分階段系統(tǒng)。CEA水平應(yīng)當(dāng)如下指定CX,不能評估CEA;CO,CEA沒有提高(<5μg/l);或CEA1，CEA提高(>5μg/l)(Compton，C.,等人，Cancer88(2000)1739-1757)。在優(yōu)選的實施方式中，標(biāo)記物組合CEA和OPN被用于預(yù)測患有CRC的患者的疾病進(jìn)程。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式中，如AJCC對于CEA所建議的，OPN和CEA的外科手術(shù)前水平與用于CRC和/或TNM分階段系統(tǒng)的一種或多種其他標(biāo)記物組合，并用于患有CRC的患者的疾病結(jié)局的預(yù)測?；煹谋O(jiān)視許多報導(dǎo)已經(jīng)描述了在監(jiān)視患有高級CRC的患者的治療中使用CEA(forreview,seeDuffy,M丄，Clin.Chem.47(2001)625-630;Fletcher,R.H.,Ann.Int.Med.104(1986)66-73;Anonymous,J.Clin.Oncol.14(1996)2843-2877)。大多數(shù)這些研究是回顧性的、非隨機(jī)的，并含有少量的患者。這些研究表明a)與CEA水平未能降低的那些患者相比，具有CEA水平的降低的患者當(dāng)接受化學(xué)治療時一般具有更好的結(jié)局，和(b)對于幾乎所有的患者，CEA水平的提高與疾病進(jìn)展相關(guān)。由于在實施例小節(jié)中顯示的數(shù)據(jù)，必需預(yù)計的是，如果用于化療的監(jiān)視，包含OPN和CEA的標(biāo)記物組合將優(yōu)于單獨(dú)的CEA。因而本發(fā)明還涉及在化療的CRC患者的監(jiān)視中使用包含OPN和CEA的標(biāo)記物組合。跟蹤經(jīng)歷了目的在于治愈的外科切除術(shù)的大約50%的患者，以后發(fā)展出復(fù)發(fā)性的或轉(zhuǎn)移性的疾病(Berman,J.M.,等人，Lancet355(2000)395-399)。大多數(shù)這些復(fù)發(fā)發(fā)生在診斷的前2-3年內(nèi)，通常限于肝臟、肺或本地區(qū)域。因為復(fù)發(fā)性/轉(zhuǎn)移性疾病總是致死的，相當(dāng)多的研究已經(jīng)集中于它在早期并因而是潛在可治療階段時的鑒定。因此，這些患者中的許多經(jīng)歷了手術(shù)后的監(jiān)視計劃，其經(jīng)常包括CEA的常規(guī)監(jiān)視。已經(jīng)顯示了CEA的連續(xù)監(jiān)視以大約80%的敏感性和大約70%的特異性檢測復(fù)發(fā)性/轉(zhuǎn)移性疾病，并提供了5個月的平均提前時間(綜述參見Duffy,M丄，等人，上文，和Fletcher,R.H.,上文)。此外，CEA是無癥狀患者中復(fù)發(fā)的最常見指標(biāo)(Pietm,N.,等人，Dis.ColonRectum41(1998)1127-1133;和Graham,R.A.，等人，Ann.Surg.228(1998)59-63)并且比用于潛在可治療的復(fù)發(fā)疾病檢測的放射學(xué)更為經(jīng)濟(jì)。關(guān)于再發(fā)生/轉(zhuǎn)移的位點(diǎn)，CEA對于肝臟轉(zhuǎn)移的檢測是最敏感的(幾乎100%)。另一方面，CEA對于診斷本地復(fù)發(fā)是不太可靠的，敏感性僅約60%(Moertel,C.G.,等人，Jama270(1993)943-947)。作為患者方便性、費(fèi)用和疾病才僉測的效力之中的權(quán)衡，EGTM組如ASCO組(Anonymous,J.Clin.Oncol.14(1996)2843-2877)建議了在最初的診斷之后至少3年每2-3個月進(jìn)行CEA測試。在3年之后，測試可以較不經(jīng)常地進(jìn)行，例如，每6個月。然而，不存在證據(jù)支持這種測試頻率。如本領(lǐng)域技術(shù)的以上討論所顯示的，手術(shù)后CRC患者的跟蹤是利用合適的生物化學(xué)標(biāo)記物或合適的標(biāo)記物組合的最重要的領(lǐng)域。由于標(biāo)記物組合OPN和CEA在所研究的CRC患者中的高度敏感性，預(yù)計的是，單獨(dú)的或與一種或多種其他標(biāo)記物組合的這種標(biāo)記物組合將在CRC患者的跟蹤、特別是手術(shù)后的CRC患者中具有4艮大幫助。包含OPN和CEA以及任選的一種或多種其他CRC標(biāo)記物的標(biāo)記物組在CRC患者的跟蹤方面的使用代表了本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式。本發(fā)明公開了，以及因而在優(yōu)選的實施方式中涉及了分別在CRC的i貪斷領(lǐng)域或在CRC的評估中標(biāo)記物OPN和CEA的用途。在又進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明涉及包含與一種或多種結(jié)腸直腸癌標(biāo)記分子組合的OPN和CEA的標(biāo)記物組才艮據(jù)從個體獲得的液體樣品在結(jié)腸直腸癌的評估中的用途。就此來說，"一種或多種，，的表述表示1到20種、優(yōu)選的1到10種、優(yōu)選的1到5種、更優(yōu)選的3或4種。OPN和CEA和一種或多種其他標(biāo)記物形成了CRC標(biāo)記物組。這樣，本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式是與一種或多種結(jié)腸直腸癌標(biāo)記分子組合的OPN和CEA的標(biāo)記物組合根據(jù)從個體獲得的液體樣品在結(jié)腸直腸癌的評估中的用途。OPN和CEA測量可以與之組合的優(yōu)先選擇的其他CRC標(biāo)記物是NSE、ASC、麗MT、CA19國9、MASP、CYFRA21-1、FREE和/或CA72-4。再進(jìn)一步優(yōu)選的，在CRC的評估中使用的標(biāo)記物組包含OPN和CEA以及選自NSE和NNMT的至少一種其他的標(biāo)記分子。以下更詳細(xì)地分別討論了與OPN和CEA組合的、或形成包含OPN和CEA的CRC標(biāo)記物組的部分的優(yōu)選的一種或多種其他標(biāo)記物。NSE:NSE(神經(jīng)元特異性烯醇酶)也稱為糖酵解酶烯醇酶(2-磷酸-D-甘油酸水解酶，EC4.2.1.11，分子量大約80kD)以各種二聚同種型存在，包含稱為α、β和γ的三種免疫學(xué)上不同的亞單位。烯醇酶的α-亞單位在哺乳動物中以很多類型存在，而β-亞單位主要在心臟和橫紋肌組織中存在。烯醇酶同種型αγ和γγ,其被稱為神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)或γ-烯醇酶，主要在神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中以及在從它們發(fā)源的腫瘤中以高濃度可檢測。(LamerzR.，NSE(Neuronen-spezifischeEnolase),y-Enolase,In:ClinicalLaboratoryDiagnosis,Thomas,L.(ed.)，TH曙Books,Frankfurt,1stEnglishedition(1998),pp.979-981,5.deutscheAuflage(1998)pp.1000-1003)。NSE凈皮描述為監(jiān)視小細(xì)胞支氣管肺癌(Lamerz,R.,NSE(Neuronen-spezifischeEnolase),y-Enolase，上文)的首選標(biāo)記物,而對于非小細(xì)胞支氣管肺癌CYFRA21-1優(yōu)于NSE(Ebert,W.,等人，Eur.J.Clin.Chem.Clin,Biochem.32(1994)189-199).60-81%的小細(xì)胞支氣管肺癌情況中發(fā)現(xiàn)提高的NSE濃度。對于NSE,對于轉(zhuǎn)移的部位或?qū)τ谀X部轉(zhuǎn)移沒有相關(guān)性，蛋兒對于臨床階段，即疾病的程度有很好的相關(guān)性。響應(yīng)于化療，作為腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞溶解的結(jié)果，在第一次治療周期后24-72小時NSE水平上有短暫提高。在一周之內(nèi)或到第一次治療周期結(jié)束時這跟隨這血清值的快速降低(其在治療之前是提高的)。相反，對于治療的非應(yīng)答者顯示了恒定地提高的或未能降低到參考范圍的水平。在癥狀緩解期間，80-96%的患者具有正常值。提高的NSE值在復(fù)發(fā)的情況下發(fā)現(xiàn)。在某些情況下升高以l-4個月的潛伏期發(fā)生，通常是指數(shù)性的(10-94天的倍增時間)并與存活時期相關(guān)。NSE在小細(xì)胞支氣管肺癌疾病的治療和過程的監(jiān)視期間作為單一的預(yù)后因子和活性標(biāo)記物是有用的診斷敏感性93%、陽性預(yù)測價值92%(Lamerz,R.,NSE(Neuronen-spezifischeEnolase),y-Enolase,上文)。在成神經(jīng)細(xì)胞瘤中，30ng/ml以上的NSE血清值在62%的患病兒童中發(fā)現(xiàn)。中值根據(jù)疾病的階段提高。在病理性NSE值的數(shù)量或頻率以及疾病的階l爻之間存在顯著的相關(guān)性；與無疾病存活存在著負(fù)相關(guān)性。患有精原細(xì)胞瘤的68-73%的患者具有臨床上顯著的NSE提高((Lamerz,R.,NSE(Neuronen-spezifischeEnolase),y-Enolase，上文)。存在著與疾病的臨床進(jìn)程之間的可利用的相關(guān)性。NSE還在其他肺瘤中測量到非肺部惡性疾病在22%的病例中顯示了超過25ng/ml的值(所有階段的癌癥中)。腦肺瘤例如膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、纖維神經(jīng)瘤和神經(jīng)鞘瘤僅僅是偶爾地伴隨有提高的血清NSE值。在原發(fā)腦肺瘤或腦轉(zhuǎn)移中和在惡性黑色素瘤和嗜鉻細(xì)胞瘤中，提高的NSE值可能在CSF(腦脊液)中發(fā)生。對于14%的器官限制的和46%的轉(zhuǎn)移性腎臟癌癥中報告了提高的NSE濃度，具有作為獨(dú)立的預(yù)后因子級別的相關(guān)性。在良性疾病中，提高的血清NSE濃度(〉12ng/ml)已經(jīng)在患有良性肺部疾病和腦部疾病的患者中發(fā)現(xiàn)。主要在體液中提高的值以及在腦血管腦膜炎、散布腦炎、脊髓小腦退化、大腦局部缺血、腦梗死、腦內(nèi)血腫、蛛網(wǎng)膜下出血、頭部損傷、炎癥性的腦疾病、器質(zhì)性癲癇、精神分裂癥和Jakob-Creutzfeld病中發(fā)現(xiàn)(Lamerz,R.,NSE(Neuronen-spezifischeEnolase),"Enolase,上文)。可以根據(jù)廠家的說明書使用Roche產(chǎn)品號碼12133113在Elecsys⑧分析儀上測量的NSE。NNMT:蛋白質(zhì)煙酰胺N-曱基轉(zhuǎn)移酶(NNMT;Swiss-PROT:P40261)具有29.6kDa的表觀分子量和5.56的等電點(diǎn)。NNMT催化煙酰胺和其他吡啶的N-甲基化。這種活性對于許多藥物和生物體內(nèi)異物化合物的生物轉(zhuǎn)化是重要的。該蛋白質(zhì)已經(jīng)被報道主要在肝臟中表達(dá)并位于細(xì)胞質(zhì)中。NNMT已經(jīng)從來自人類肝臟的cDNA中克隆，并含有編碼具有29.6kDa計算的分子量的264氨基酸蛋白質(zhì)的792核苷酸開放閱讀框(Aksoy,S.，等人，J.Biol.Chem.269(1994)14835-14840)。關(guān)于這個酶在人類癌癥中的潛在作用在文獻(xiàn)中知道的;[艮少。在一篇論文中，提高的肝臟NNMT酶活性被報道作為小鼠中癌癥惡病體質(zhì)的標(biāo)記物(Okamum，A.,等人，Jpn.J.CancerRes.89(1998)649-656)。在新近的報告中，展現(xiàn)了NNMT基因在放射敏感性細(xì)胞系中相應(yīng)于放射的減量調(diào)節(jié)(Kassem,H.，等人，Int.J.Cancer101(2002)454-460)。近來發(fā)現(xiàn)(WO2004/057336)的是，NNMT在CRC的評估中是感興趣的。在WO2004/057336中描述的免疫分析已經(jīng)被用于測量當(dāng)前研究的樣品(CRC，健康對照和非惡性結(jié)腸疾病)。CA19-9:測量的CA19-9(碳水化合物抗原19-9)值通過使用單克隆抗體1116-NS-19-9來定義。血清中的1116-NS-19-9反應(yīng)性決定簇主要在含有高數(shù)量的CA19-9表位的粘蛋白樣蛋白質(zhì)上表達(dá)(Magnani,J丄.，Arch.Biochem.Biophys.426(2004)122-131)。3-7%的群體具有Lewisa-陰性/b-陰性血型結(jié)構(gòu)，并且不能表達(dá)具有反應(yīng)性決定簇CA19-9的粘蛋白。當(dāng)解釋發(fā)現(xiàn)時必需考慮這一點(diǎn)。含有CA19-9的粘蛋白在胎兒胃、腸和胰腺上皮細(xì)胞中表達(dá)。在成年人組織中在肝臟、肺和胰腺中也可以發(fā)現(xiàn)低的濃度(Fateh誦Moghadam,A,,等人,上文；Herlyn,M.，等人.,J.Clin.Immunol.2(1982)135-140)。CA19-9分析值可以幫助患有胰腺癌的患者的區(qū)分診斷和監(jiān)視(敏感性70-78%)(Ritts，R.E.，Jr.,等人，Int.J.Cancer33(1984)339-345)。在腫瘤質(zhì)量和CA19-9分析值之間沒有相關(guān)性。然而，具有高于10,000U/mL的CA19-9血清水平的患者幾乎總是具有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。CA19-9的測定不能用于胰腺癌的早期檢測(Steinberg,W.M.,等人，Gastroenterology90(1986)343-349)。在肝膽癌中，CA19-9值提供了50-75%的敏感性。在胃癌的情況中建議了CA72-3和CEA的伴隨性測定。在結(jié)腸直腸癌中，單獨(dú)的CEA測定是足夠的；僅在有限數(shù)量的CEA陰性病例中，CA19-9可能是有用的。由于粘蛋白由肝臟專門地分泌，在某些情況下甚至輕微的膽汁郁積可以引起明顯提高的CA19-9血清水平。還在胃腸道和肝臟的許多良性和炎癥性疾病中以及在嚢性纖維化中發(fā)現(xiàn)提高的CA19-9值。已經(jīng)根據(jù)廠家的說明書使用Roche產(chǎn)品號碼11776193在Elecsys⑧分析儀上測量的CA19-9。ASC:"含有半胱氨酸蛋白酶相關(guān)的募集結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白質(zhì)"(ASC)也被稱為"甲基化誘導(dǎo)的沉默的目標(biāo)1"(TMS1)(Swiss-PROT:Q9ULZ3)。ASC具有21,627Da的理論分子量和pH6.29的理論等電點(diǎn)。半胱氨酸蛋白酶相關(guān)募集結(jié)構(gòu)域(CARDS)介導(dǎo)接頭蛋白質(zhì)例如APAF1(細(xì)i包凋亡蛋白酶活化因子1)和參與細(xì)胞凋亡的半胱氨酸蛋白酶的前體形式(例如，CASP9)之間的相互作用。ASC是含CARD接頭蛋白質(zhì)家族的成員。通過免疫篩選早幼粒細(xì)胞系，Masumoto等人分離了編碼ASC的cDNA。推斷的195氨基酸蛋白質(zhì)含有N-末端pyrin樣結(jié)構(gòu)域(PYD)和87殘基C-末端CARD。Western印跡分析顯示了22kDa蛋白質(zhì)的表達(dá)，并且表明了ASC可能通過提高白血病細(xì)胞系對抗癌藥的細(xì)胞凋亡刺激的易感性來具有促細(xì)胞凋亡活性(Masumoto,J.,等人，J.Biol.Chem.274(1999)33835-33838)。Conway等人的甲基化敏感限制PCR和曱基化特異性PCR(MSP)分析表明，ASC的沉默與圍繞外顯子1的CpG島的超甲基化相關(guān)，DNMT1(DNA胞嘧啶-5-曱基轉(zhuǎn)移酶-l)的過量表達(dá)促進(jìn)了超甲基化和ASC的沉默。乳腺癌細(xì)胞系，而不是正常的乳腺組織，展現(xiàn)了ASC的完全甲基化，并且不表達(dá)ASC信息。在乳腺癌細(xì)胞系中ASC的表達(dá)抑制生長并降低幸存克隆的數(shù)量。Conway等人斷定，ASC功能在于促進(jìn)半胱氨酸蛋白酶依賴性細(xì)胞凋亡，以及ASC的過量表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(Conway,K.E.,等人，CancerResearch60(2000)6236-6242)。McConnell和Vertino顯示了，ASC的可誘導(dǎo)表達(dá)抑制了細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)了可以被半胱氨酸蛋白酶抑制物阻斷的DNA段裂。免疫熒光顯微術(shù)表現(xiàn)了，細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)引起了從彌散的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)向球形核周聚集物的CARD依賴性轉(zhuǎn)移(McConnell,B.B.,andVertino，P.M.,CancerResearch60(2000)6243-6247)。Moriani等人觀察到ASC基因的曱基化不僅在乳腺癌細(xì)胞中，而且在胃癌中。他們提出在涉及促細(xì)胞凋亡ASC基因的減量調(diào)節(jié)的乳腺癌和胃癌的進(jìn)展中ASC基因的異常曱基化的指導(dǎo)作用(Moriani，R.,等人，AnticancerResearch22(2002)4163-4168)。Conway等人檢查了原始乳腺組織的TMS1甲基化，并將結(jié)果與健康組織中的曱基化相比較(ConwayK.E.,等人，CancerResearch60(2000)6236-6242)。Levine等人發(fā)現(xiàn)，ASC沉默不與特定CpG位點(diǎn)的曱基化相關(guān)，而是與ASCCpG島的密集甲基化相關(guān)聯(lián)。含有專門地甲基化的ASC拷貝的乳腺腫瘤細(xì)胞系不表達(dá)ASC,而在部分曱基化的細(xì)胞系中，ASC表達(dá)的水平與細(xì)胞群體中存在的曱基化的ASC等位基因的百分比直接相關(guān)(Levine,JJ，等人，Oncogene22(2003)3475-3488)。Virmani等人檢查了肺癌和乳腺癌組織中的ASC的甲基化狀態(tài)。他們發(fā)現(xiàn)，ASC的異常曱基化在46%的乳腺癌細(xì)胞系和32%的乳腺胂瘤組織中存在。曱基化在非惡性乳腺組織中是稀有的(7%)(Virmani,A.,等人，IntJ.Cancer106(2003)198-204)。Shiohara等人發(fā)現(xiàn)，ASC的增量調(diào)節(jié)與人類嗜中性細(xì)胞中的炎癥和細(xì)胞凋亡緊密相關(guān)(Shiohara,M.，等人，Blood98(2001)229a)。Masumoto等人觀察到，高水平的ASC在上皮細(xì)胞和白細(xì)胞中豐富地表達(dá)(Masumoto，J.,等人，JournalHistochem.Cytochem.49(2001)1269-1275)。已經(jīng)為ASC的測量開發(fā)了自有的夾心免疫分析。這種分析以微量滴定板形式進(jìn)行。使用鏈霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板。針對ASC的生物素化的多克隆抗體用作捕獲抗體，針對ASC的地高辛化的多克隆抗體被用作這個夾心分析中的第二特異性結(jié)合配偶體。形成的夾心復(fù)合物最終通過抗毛地黃毒苷辣根過氧化酶輒合物和合適的過氧物酶底物來顯現(xiàn)。MASP:蛋白質(zhì)MASP(maspin前體；Swiss-PROT:P36952)是42kDa蛋白質(zhì)，其與蛋白酶抑制物的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin)超家族具有同源性。免疫染色研究展現(xiàn)了，maspin在細(xì)胞外基質(zhì)中和在質(zhì)膜上存在(Zou,Z.,等人，Science263(1994)526-529)。人類MASP基因(PI5的SERPINB5)最初通過減法雜交在它的mRNA水平表達(dá)的基礎(chǔ)上分離自正常乳腺的上皮細(xì)胞(Zou等人，上文)。Maspin在正常的乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，但在大多數(shù)乳腺癌細(xì)胞系中不表達(dá)。Zou等人(上文)顯示了它的表達(dá)降低了轉(zhuǎn)化的細(xì)胞誘導(dǎo)肺瘤形成和轉(zhuǎn)移的能力，表明maspin基因編碼胂瘤抑制物。Bass,R.等人(J.Biol.Chem.277(2002)46845-46848)表征了真核的maspin并發(fā)現(xiàn)它對于所測試的任何蛋白水解系統(tǒng)沒有蛋白酶抑制效果。然而，它確實抑制肺瘤和血管平滑肌細(xì)胞的遷移。Song,S.Y.等人(DigestiveDiseasesandSciences47(2002)1831-1835)通過來自腺瘤、腺癌和轉(zhuǎn)移性腺癌的組織切片的免疫組織化學(xué)染色研究了maspin在結(jié)腸癌中的表達(dá)。Song等人(上文)發(fā)現(xiàn)的maspin的免疫反應(yīng)性是細(xì)胞質(zhì)的，具有某些核染色。超過90%的腺瘤、75%的腺癌和47%的轉(zhuǎn)移癌組織切片對于maspin是染色陽性。這項研究具有的局限性是沒有使用定量分析系統(tǒng)，例如Western印跡分析。沒有評估與鄰近的正常結(jié)腸組織相比的表達(dá)水平。FERR:鐵蛋白(FERR)是含有約20%的鐵的蛋白質(zhì)，在腸、肝臟和脾中發(fā)現(xiàn)。它是鐵在體內(nèi)保存的主要形式之一。身體鐵保存已經(jīng)被報道提高結(jié)腸直腸贅生物的風(fēng)險。在Scholefield,J.H.等人(Dis.ColonRectum41(1998)1029-1032)使用來自148位患者(50位患者具有證明的結(jié)腸直腸癌，49位患者沒有結(jié)腸疾病，患者具有結(jié)腸的腺瘤)的研究中，分析的血清鐵蛋白。在三個組的任何之中在血清鐵蛋白水平方面沒有顯著差異。CYFRA21-1:"CYFRA21-1"的分析特異性地測量在循環(huán)中存在的cytokeratin19的可溶性片段。CYFRA21-1的測量一般基于兩種單克隆抗體(Bodenmueller,H.,等人，Int.J.Biol.Markers9(1994)75-81)。在來自RocheDiagnostics,Germany的CYFRA21-1分析中，使用了兩種特異性單克隆抗體(KS19.1和BM19.21),測量具有約30,000道爾頓分子量的cytokeratin19的可溶性片段。Cytokeratins是形成上皮中間細(xì)絲的亞單位的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。迄今為止鑒定了二十種不同的cytokeratin多肽。由于它們的特定分布才莫式，它們特別適用于作為肺瘤病理中的區(qū)分標(biāo)記物。完整的cytokeratin多肽是難溶的，但是可以在血清中檢出可溶的片段(Bodenmueller,H.,等人，上文)。CYFRA21-1是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的公認(rèn)的標(biāo)記物。CYFRA21-1的主要適應(yīng)癥是監(jiān)碎見非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的進(jìn)程(Sturgeon,C.,ClinicalChemistry48(2002)1151-1159)。在初步診斷中，在患有非小細(xì)胞肺癌的患者中，高CYFRA21-1血清水平表明高級的腫瘤階段和不良預(yù)后(vanderGaast,A..,等人，Br.J.Cancer69(1994)525-528),等人正常的或僅僅輕微提高的值不能排除肺瘤的存在。CYFRA21-1血清水平向正常范圍的快速下降記錄了成功的治療。穩(wěn)定的CYFRA21-1值或在CYFRA21-1值方面輕微的或僅緩慢的降低表明腫瘤的不完全消除，或具有相應(yīng)的治療和預(yù)后結(jié)論的多個腫瘤的存在。疾病的進(jìn)展通常由提高的CYFRA21-1值相比臨床癥狀和成傳4喿作更早地顯示。公認(rèn)的是，肺癌的初步診斷結(jié)論應(yīng)當(dāng)在臨床癥狀、成像或內(nèi)窺鏡操作和手術(shù)中發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行。肺部內(nèi)不清晰的圓形病灶與CYFRA21-1值〉30ng/mL—起表明存在原發(fā)支氣管肺癌的高可能性。CYFRA21-1也適合于膀胱的肌浸性癌癥的進(jìn)程監(jiān)視。對于良性的肺部疾病(肺炎、結(jié)節(jié)病、肺結(jié)核、慢性支氣管炎、支氣管哮喘、肺氣腫)CYFRA21-1顯示了良好的特異性。輕微提高的值(直至10ng/mL)很少在顯著的良性肝臟疾病和腎衰竭中發(fā)現(xiàn)。與性別、年齡或吸煙沒有相關(guān)性。CYFRA21-1的值還不受妊娠的影響。近來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CYFRA還在乳腺癌領(lǐng)域中檢測疾病復(fù)發(fā)和評估治療效力方面有用。(Nakata,B.,等人，BritishJ.ofCancer(2004)1-6)。優(yōu)選的，已經(jīng)根據(jù)廠家的說明書使用Roche產(chǎn)品號碼11820966在Elecsys⑧分析儀上測量的CYFRA21-1。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，存在著許多方法來使用兩種或多種標(biāo)記物的測量值以改善在研究中的診斷問題。在十分簡單的、但盡管如此常常有效的方法中，如果樣品對于研究的至少一種標(biāo)記物是陽性的，假定陽性結(jié)果。例如，當(dāng)診斷傳染性疾病如AIDS時，這是一種情況。然而，經(jīng)常地，評估標(biāo)記物的組合。優(yōu)選的，對標(biāo)記物組的標(biāo)記物測量的單獨(dú)的值被組合，組合值與基礎(chǔ)的診斷問題相關(guān)聯(lián)。在本發(fā)明中，標(biāo)記物OPN和CEA的組合凈皮用于CRC的評估。可以通過任何適合的本領(lǐng)域的數(shù)學(xué)方法組合標(biāo)記物值。將標(biāo)記物組合與疾病相關(guān)聯(lián)的公知的數(shù)學(xué)方法采用了一些方法，如，辨別分析(DA)(即，線性的、二次的、調(diào)整的DA)、Kernel方法(即，SVM)、非參數(shù)方法(即，k-最近鄰分類者)、PLS(部分最小二乘方)、基于樹的方法(即，邏輯回歸，CART,隨才幾森林法，Boosting/Bagging方法)、一般化的線性模型(即，邏輯回歸)、基于主分量的方法(即，SIMCA)、一般化的加法模型、基于模糊邏輯的方法、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和基于遺傳算法合方面將沒有困難。優(yōu)選的，在將本發(fā)明的標(biāo)記物組合與例如CRC的不存在或存在相關(guān)聯(lián)中使用的方法選自DA(即，線性的、二次的、調(diào)整的DA)、Kernel方法(即，SVM)、非參數(shù)方法(即，k-最近鄰分類者)、PLS(部分最小二乘方)、基于樹的方法(即，邏輯回歸，CART，隨機(jī)森林法，Boosting/Bagging方法)或一般化的線性模型(即，邏輯回歸)。關(guān)于這些統(tǒng)計方法的細(xì)節(jié)在以下參考文獻(xiàn)中找到Ruczinski，I.,etal,J.ofComputationalandGraphicalStatistics,12(2003)475-511;Friedman,J.H.，J.oftheAmericanStatisticalAssociation84(1989)165-175;Hastie,T.,等人，TheElementsofStatisticalLearning,SpringerSeriesinStatistics(2001);Breiman,L.,等人,Classificationandregressiontrees,California,Wadsworth(1984);Breiman，L.,RandomForests,MachineLearning45(2001)5-32;Pepe,M.S.，TheStatisticalEvaluationofMedicalTestsforClassificationandPrediction,OxfordStatisticalScienceSeries,28(2003);和Duda,R.O.,等人,PatternClassification,WileyInterscience,2ndedition(2001)。本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式是使用關(guān)于生物標(biāo)志物的基礎(chǔ)組合的優(yōu)化的多元篩截，和辨別狀態(tài)A與狀態(tài)B,例如患病與健康。在這種類型的分析中，標(biāo)記物不再是獨(dú)立的，而是形成標(biāo)記物組?？梢源_立的是，OPN的測量與CEA的測量顯著地改善了與任一單獨(dú)標(biāo)記物相比的CRC的診斷精確性。顯著地，在約90%的穩(wěn)定和預(yù)設(shè)的特異性下，標(biāo)記物組合OPN和CEA用于診斷CRC的敏感性已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與每個單獨(dú)的標(biāo)記物相比顯著地提南。通過診斷方法的接受者操作特征(ROC)最好地描述了診斷方法的精確性(特別參見Zweig,M.H.,andCampbell,G.,Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC圖表是在所觀察數(shù)據(jù)的整個范圍上連續(xù)改變判定閾值產(chǎn)生的所有的敏感性/特異性配對的標(biāo)繪圖。實驗室測試的臨床性能取決于它的診斷精確性，或正確地將受試者分類到臨床上相關(guān)的亞群中的能力。診斷精確性衡量了所述測試正確地區(qū)分被研究受試者的兩種不同狀況的能力。這些狀況例如健康和患病，或者良性和惡性疾病。在每種情況下，通過在判定閾值的完整范圍上標(biāo)繪出敏感性對比l-特異性，ROC標(biāo)繪圖描繪了兩種分布之間的重疊。在Y軸上是敏感性，或者真陽性部分[定義為(真陽性測試結(jié)果的數(shù)量)/(真陽性的數(shù)量+假陰性測試結(jié)果的數(shù)量)]這也被稱作存在疾病或狀況的確實性。它單獨(dú)地從受影響的亞群中計算。在X軸上是假陽性部分，或1-特異性[定義為(假陽性結(jié)果的數(shù)量)/(真陰性的數(shù)量+假陽性結(jié)果的數(shù)量)]。它是特異性的指數(shù)，完全從未受影響的亞群中計算。因為使用來自兩個不同亞群的測試結(jié)果完全獨(dú)立地計算真陽性和假陽性部分，ROC標(biāo)繪獨(dú)立于樣品中的疾病發(fā)病率。在ROC標(biāo)繪圖上的每個點(diǎn)代表了相應(yīng)于特定的判斷閾值的敏感性/l-特異性配對。具有理想辨別力(在結(jié)果的兩個分布中沒有重疊)的測試具有穿過左上角的ROC標(biāo)繪線，其中真陽性部分是l.O，或100%(理想的敏感性)、假陽性部分是0(理想的特異性)。沒有辨別力的測試的理論標(biāo)繪圖(兩個組的結(jié)果相同的分布)是從左下角到右上角的45°對角線。大多數(shù)標(biāo)繪圖落入這兩個極端之間。(如果ROC標(biāo)繪圖完整落在45°對角線之下，通過將"陽性"的指標(biāo)從"大于"轉(zhuǎn)變成"低于"來容易地補(bǔ)救，反之亦然。)定性地，標(biāo)繪圖約靠近左上角，試驗的總體精確度越高。測定實驗室測試的診斷精確性的一個方便的目標(biāo)是通過單個數(shù)字表示它的性能。例如，這種總體參數(shù)是所謂的“總誤差”，或作為選擇"曲線下面積=AUC"。最常見的全局度量是ROC標(biāo)繪圖下的面積。按照慣例，這個面積永遠(yuǎn)＞0.5(如果不是，人們可以反轉(zhuǎn)判斷規(guī)則使它這樣)。值在1.0(兩個組的測試值的理想分離)和0.5(在測試值的兩個組之間沒有明顯的分布差異)之間。該面積不僅取決于標(biāo)繪圖的特定部分，例如靠近對角線的點(diǎn)或在90%特異性下的敏感性，還取決于整個標(biāo)繪圖。這是ROC標(biāo)繪圖多么接近理想標(biāo)繪圖(面積=1.0)的定量的、描述性的表述。兩種標(biāo)記物OPN和CEA的組合顯著地改善了CRC的診斷準(zhǔn)確性，如提高的曲線下面積所展現(xiàn)的。OPN和CEA與近來發(fā)現(xiàn)的CRC標(biāo)記物如ASC或NNMT、或與已知的肺瘤標(biāo)記物如CYFRA21-1和NSE、或與其他尚待發(fā)現(xiàn)的CRC標(biāo)記物的組合測量，分別地引起或?qū)⒁餋RC評估中的進(jìn)一步改進(jìn)。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及改善相對于健康對照和患有非惡性結(jié)腸疾病的患者的CRC診斷精確度的方法，通過分別測量樣品中至少OPN和CEA的濃度，并且將所測定的值算術(shù)地組合并將所測定的濃度與CRC的存在或不存在相關(guān)聯(lián)，與基于任一單獨(dú)的標(biāo)記物的分類法相比，所述改善使得更多的患者被正確地分類為患有CRC或者健康對照和患有非惡性結(jié)腸疾病的患者。在根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的方法中，分別測定至少生物標(biāo)記物OPN、CEA和NSE的濃度，標(biāo)記物組合用于CRC的評估。在根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的方法中，分別測定至少生物標(biāo)記物OPN、CEA和NNMT的濃度，標(biāo)記物組合用于CRC的評估。提供以下的實施例和附圖來幫助理解本發(fā)明，它們的真實范圍在附隨的權(quán)利要求中闡述。要理解的是，可以在所列的步驟中進(jìn)行修改而不背離本發(fā)明的精神。實施例1:研究群體研究群體在表1中給出。表l:研究群體CRC樣品和相應(yīng)的UICC分類<table><row><column>根據(jù)UICC的階段</column><column>樣品數(shù)</column></row><row><column>UICC0</column><column>8</column></row><row><column>UICCI</column><column>41</column></row><row><column>UICCII</column><column>53</column></row><row><column>UICCIII</column><column>67</column></row><row><column>UICCI-III(未分類的，非IV階段)</column><column>13</column></row><row><column>UICCIV</column><column>61</column></row><row><column>沒有分階段</column><column>11</column></row><row><column>CRC樣品的總數(shù)</column><column>254</column></row><table>研究群體包括來自用CRC診斷的254位患者(參見表l)的血清樣品和391份對照樣本。這兩個組都被分為訓(xùn)練集和測試集。分析基于128份CRC樣品和195份對照樣本的訓(xùn)練集。對于對照，16份來自沒有任何胃腸疾病的個體，50份來自患有痔的個體，5份來自患有其他腸疾病的患者；63份對照來自患有腸憩室的個體，61份來自健康獻(xiàn)血者。測試集由126份CRC樣品和196份對照組成。對于對照，20份來自沒有任何胃腸疾病的個體，43份來自患有誇的個體，8份來自患有其他腸疾病的患者；65份對照來自患有腸憩室的個體，60份來自健康獻(xiàn)血者。實施例2:使用的分析過程使用商業(yè)上可獲得的試劑盒(分別為RocheDiagnostics產(chǎn)品號碼11731629、11820966和12133113)分析標(biāo)記物CEA、CYFRA21國1和NSE。在WO2004/057336中描述的免疫分析已經(jīng)用于測量當(dāng)前研究的樣品中的NNMT。簡言之，多余人類血清或血漿中的NNMT檢測，開發(fā)了夾心ELISA。為了抗原的檢測和捕獲，等分量的抗NNMT多克隆抗體與生物素和毛地黃毒苦分別結(jié)合。在10mM磷酸鹽、pH7.4、1%BSA、0.9%NaCl和0.1%吐溫20中，鏈霉抗生物素蛋白包被的96孔微量滴定板與100iul生物素化的10jug/ml抗NNMT多克隆抗體孵育60分鐘。在孵育之后，用0.9%NaCl、0.1%吐溫20洗滌平板三次。然后用重組蛋白質(zhì)的連續(xù)稀釋物作為標(biāo)準(zhǔn)抗原或用來自患者的稀釋的血漿樣品孵育反應(yīng)孔2h。在NNMT的結(jié)合之后，用0.9%NaCl、0.1%吐溫20洗滌平板三次。對于結(jié)合的NNMT的特異性檢測，用100jul地高辛化的抗NNMT多克隆抗體以10jug/ml在10mM磷酸鹽、pH7.4、1%BSA、0.9%NaCl和0.1%吐溫20中孵育60分鐘。此后，洗滌平板三次來除去未結(jié)合的抗體。在接下來的步驟中，反應(yīng)孔在10mM石岸酸鹽、pH7.4、1%BSA、0.9%NaCl和0.1%吐溫20中與20mU/ml抗毛地黃毒苦POD扼合物(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany,目錄號1633716)孵育60分鐘。隨后用相同的緩沖液洗滌平板三次。對于抗原抗體復(fù)合物的檢測，反應(yīng)孔與100ju1ABT溶液(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany,目錄號11685767)孵育，在30-60分鐘后用ELISA讀取器在405nm測量OD。在自有的夾心ELISA中測量OPN。對于抗原的捕獲和檢測，使用兩種不同的抗體。選擇這些抗體以具有非重疊的表位。使用的兩個抗體的表位在骨橋蛋白序列的氨基酸167和羧基末端之間(KieferM.C.,等人，Nucl.AcidsRes.17(1989)3306)。一種抗體被生物素化，用作捕獲抗體。第二抗體被地高辛化。然后通過使用合適的抗DIG二級抗體檢測地高辛化的抗體。分析過程基本上如同以上對于NNMT的檢測而不是對于OPN特異性抗體所描述的。實施例3:產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的數(shù)學(xué)評估分類算法用調(diào)整的辨別分析(RDA)產(chǎn)生，其是常見的辨別分析的全面化,即，二次-和線性辨別分才斤(McLachlan,G.J.,DiscriminantAnalysisandStatisticalPatternRecognition,WileySeriesinprobabilityandmathematicalstatistics,1992)。在RDA中，-使用了對于協(xié)方差矩陣的普通的最大似然率(插入)估計的替代。這些替代的特征在于兩個參數(shù)(人，Y),它們的值通過共同地最小化將來的錯分類風(fēng)險的基于樣品的估計來定制到單獨(dú)的位置(Friedman,J.H.,RegularizedDiscriminantAnalysis,J.oftheAmericanStatisticalAssociation84(1989)165-175)。作為替代性方法，支撐矢量機(jī)算法(Hastie,T.,等人，TheElementsofStatisticalLearning,SpringerSeriesinStatistics,2001)可以提供可比較的分類結(jié)果。從對于分類問題最好的單一標(biāo)記物開始逐步地構(gòu)建標(biāo)記物組，當(dāng)在約90%的特異性水平下敏感性的提高不再顯著地改變時結(jié)束。為了獲得集中的分布，用天然的對數(shù)函數(shù)轉(zhuǎn)化每個單獨(dú)的標(biāo)記物。使用5倍交叉驗證。表2呈現(xiàn)了診斷患有CRC的患者對比包括非惡性結(jié)腸疾病的對照的分類結(jié)果。表2:患有CRC的患者對比健康對照和疾病對照的分類結(jié)果<table>complextableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>如通過RDA測定的，在以上研究群體中OPN的敏感性是大約34%,而對于CEA發(fā)現(xiàn)了約38%的敏感性。具有單獨(dú)的OPN和CEA的標(biāo)記物組發(fā)現(xiàn)展現(xiàn)了敏感性到約46%的顯著提高。從表2可以看出，用訓(xùn)練集確定的數(shù)據(jù)在樣品的測試集中基本上被確認(rèn)了。權(quán)利要求1.一種體外評估結(jié)腸直腸癌的方法，其中所述方法包括步驟a)測量樣品中骨橋蛋白的濃度，b)測量樣品中癌胚抗原的濃度，和c)任選的一種或多種其他結(jié)腸直腸癌標(biāo)記物的濃度，以及d)組合在步驟(a)、(b)中測定的濃度和任選的在步驟(c)中測定的濃度，用于評估結(jié)腸直腸癌。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種其他標(biāo)記物選自NSE、ASC、麗MT、CA19畫9、CA72誦4、MASP、CYFRA21-1和FERR。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述一種或多種其他標(biāo)記物是NSE。4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述一種或多種其他標(biāo)記物是麗MT。5.標(biāo)記物組合骨橋蛋白和癌胚抗原在結(jié)腸直腸癌的評估中的用途。6.包含骨橋蛋白和癌胚抗原以及一種或多種其他結(jié)腸直腸癌標(biāo)記物的標(biāo)記物組在結(jié)腸直腸癌的評估中的用途。7.根據(jù)權(quán)利要求6的標(biāo)記物組的用途，其中所述一種或多種其他標(biāo)記物選自NSE、ASC、NNMT、CA19-9、CA72-4、MASP、CYFRA21-1和FERR。8.根據(jù)權(quán)利要求7的至少包含骨橋蛋白、癌胚抗原和NSE的標(biāo)記物組的用途。9.根據(jù)權(quán)利要求7的至少包含骨橋蛋白、癌胚抗原和NNMT的標(biāo)記物組的用途。10.—種用于進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求1的方法的試劑盒，其包含特異性地測量骨橋蛋白和癌胚抗原所需的試劑。全文摘要本發(fā)明涉及幫助評估結(jié)腸直腸癌(＝CRC)的方法。公開了包含骨橋蛋白和癌胚抗原的標(biāo)記物組合在結(jié)腸直腸癌的評估中的用途。此外，它特別涉及通過測量樣品中至少標(biāo)記物骨橋蛋白和癌胚抗原來從來自個體的液體樣品評估結(jié)腸直腸癌的方法。包含骨橋蛋白和癌胚抗原的標(biāo)記物組合可以，例如，用于結(jié)腸直腸癌的早期檢測或用于監(jiān)督經(jīng)歷了治療例如手術(shù)的患者。文檔編號G01N33/574GK101346628SQ200680048492公開日2009年1月14日申請日期2006年12月19日優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日發(fā)明者J·P·特坎,J·卡爾,M·塔克,N·威爾德,P·斯特格米勒,V·格魯納特申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司