專利名稱：可溶性人m-csf受體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠結(jié)合M-CSF的人M-CSF受體的自然產(chǎn)生的可溶性片段， 采用該可溶性片段進(jìn)行治療的方法，以及通過(guò)檢測(cè)患者樣品內(nèi)該可溶性片段來(lái) 診斷疾病和癥狀的方法。
背景技術(shù)：
預(yù)計(jì)每年會(huì)發(fā)生140萬(wàn)新癌癥病例，并預(yù)計(jì)每年有60萬(wàn)人死于癌癥。隨 著檢測(cè)和治療的發(fā)展，許多患者能存活很長(zhǎng)時(shí)間。從2002年1月1日起，預(yù) 計(jì)有1010萬(wàn)癌癥存活者，約占總患者的3.4%。在這些癌癥存活者中，最常見(jiàn) 的癌癥部位是乳腺(22%)、前列腺(18°/。)、結(jié)腸直腸(10%)和婦科(10%)。
通常，如果未在發(fā)展早期檢出癌癥則其發(fā)病率和死亡率將顯著上升。治療 方法的確定通常與癌癥被診斷出時(shí)的階段有關(guān)。因此，在治療期間迫切需要靈 敏而精確的方法來(lái)診斷、分級(jí)、預(yù)測(cè)預(yù)后、以及監(jiān)測(cè)癌癥進(jìn)展或消退。
巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF或CSF-1)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞及其前體和破骨細(xì) 胞及其前體的存活、增殖和分化。M-CSF活性通過(guò)調(diào)節(jié)M-CSF及其膜結(jié)合受 體(M-CSFR)基因表達(dá)的機(jī)制以及受體介導(dǎo)的胞吞作用、代謝加工和下游信號(hào) 傳導(dǎo)的抑制作用而受到嚴(yán)格控制。
M-CSF在基質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和其他細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。它還在乳腺、子宮和卵 巢腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。在這些腫瘤中的表達(dá)程度與良好和不良預(yù)后相關(guān)(Kacinski Ann. Med.27: 79-85 (1995); Smith等，Clin. Cancer Res. 1: 313-25 (1995))。 相比管內(nèi)(侵襲前)癌癥，在乳腺癌中，侵襲性腫瘤細(xì)胞普遍表達(dá)M-CSF(Scholl 等，J.Natl. Cancer Inst. 86: 120-6(1994))。此外，M-CSF顯示可促進(jìn)乳房腫瘤 進(jìn)展成惡性腫瘤(Lin等，J. Exp. Med. 93: 727-39(2001))。
人膜結(jié)合M-CSF受體由c-fms原癌基因編碼，它是一種在骨髓和分化的血 液?jiǎn)魏思?xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶跨膜受體(I型膜蛋白)。M-CSF受體屬
于Tyr蛋白激酶家族和CSF-1/PDGF受體亞家族。它包含5個(gè)Ig樣C2型(免疫 球蛋白樣)結(jié)構(gòu)域、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和具有兩個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)中斷的Src相 關(guān)結(jié)構(gòu)域。M-CSF通常與其受體結(jié)合以發(fā)揮其生物效應(yīng)。M-CSF與c-fins結(jié)合 導(dǎo)致受體均二聚化，激活胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而導(dǎo)致其他細(xì)胞蛋白質(zhì)的自磷酸 化和磷酸化。這些事件引發(fā)了包括JAK/STAT、 P13K和ERK途徑在內(nèi)的信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的級(jí)聯(lián)，從而導(dǎo)致各種細(xì)胞反應(yīng)有絲分裂、細(xì)胞因子的分泌、膜褶 皺、以及調(diào)節(jié)M-CSFR的轉(zhuǎn)錄。(Hamilton J.A.， J Leukoc Biol.， 62(2): 145-55 (1997); Hamilton J， A.， I廳uno Today., 18(7): 313-7(1997); Fixe和Praloran， Cytokine 10: 32-37 (1998))。
發(fā)明概述
本發(fā)明的材料和方法滿足的上述需求和本領(lǐng)域的其他相關(guān)需求。在本發(fā)明 的一個(gè)方面中，由于發(fā)現(xiàn)了人M-CSF(CSF-l)受體的自然產(chǎn)生的可溶性片段(缺 乏跨膜結(jié)構(gòu)域)，從而能夠重組產(chǎn)生這種自然產(chǎn)生的片段以用于需要中和 M-CSF活性的治療用途。
在相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含上述多肽和第二種多肽的融合蛋 白，其中上述多肽和第二種多肽相連從而不會(huì)損害上述多肽的正常生物活性。 示例性的融合蛋白包括免疫球蛋白Fc融合體。
在本發(fā)明的還有另一實(shí)施方式中，提供了包含可溶性M-CSF受體的特定 自然產(chǎn)生形式或融合蛋白的藥物組合物，以及用這種藥物組合物治療癌癥或與 破骨細(xì)胞活性升高相關(guān)的代謝性骨病。
另一方面，本發(fā)明提供診斷癌癥的方法，該方法包括以下步驟(a)分析 患者流體樣品中可溶性M-CSF受體的水平，其中，高于某閾值的可溶性M-CSF 受體的水平與存在癌癥相關(guān)，而低于所述閾值的水平表明該患者不太可能患有 癌癥。在本發(fā)明的另一示例性實(shí)施方式中，提供了測(cè)定癌癥患者預(yù)后的方法， 該方法包括以下步驟(a)分析患者流體樣品中可溶性M-CSF受體的水平，其 中，高于某閾值的可溶性M-CSF受體水平表明該患者可能具有不良預(yù)后，而 低于所述閾值的水平表明該患者可能具有良好預(yù)后。再在另一實(shí)施方式中，提 供了監(jiān)測(cè)癌癥患者的癌癥療法的方法，該方法包括以下步驟(a)先分析患者流體樣品中可溶性M-CSF受體的水平，再開始用某癌癥療法進(jìn)行治療；和(b) 開始用該癌癥療法治療后分析所述流體樣品，其中，開始用該癌癥療法治療后 可溶性M-CSF受體的水平降低表明該患者正在接受治療有效劑量的癌癥療法。
本發(fā)明認(rèn)為，可對(duì)任何癌癥實(shí)施任何上述方法，這些方法包括診斷、預(yù) 后或監(jiān)測(cè)癌癥療法。示例性的癌癥包括乳腺癌、肺癌、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、 甲狀腺癌、前列腺癌、腺癌、包括白血病和淋巴瘤在內(nèi)的血細(xì)胞惡性腫瘤；頭 頸癌；胃腸癌，包括食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、腸癌、結(jié)腸直腸癌、直腸癌、胰 腺癌、肝癌、膽管或膽囊的癌癥；雌性生殖道的惡性腫瘤，包括卵巢癌、子宮 內(nèi)膜癌、陰道癌和宮頸癌；膀胱癌；腦癌，包括成神經(jīng)細(xì)胞瘤；肉瘤、骨肉瘤； 以及皮膚癌，包括惡性黑色素瘤或鱗狀上皮細(xì)胞癌。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供了監(jiān)測(cè)雌性月經(jīng)周期的方法，該方法包 括以下步驟(a)分析雌性患者流體樣品中可溶性M-CSF受體的水平，其中， 高于某閾值的可溶性M-CSF受體的水平表明該患者可能受孕，而低于所述閾 值的水平表明該患者可能不會(huì)受孕。在相關(guān)的實(shí)施方式中，提供了包括類似步 驟的檢測(cè)雌性子宮內(nèi)膜增殖的方法，其中，高于某閾值的可溶性M-CSF受體 的水平與子宮內(nèi)膜異常增殖，例如子宮內(nèi)膜異位相關(guān)，而低于該閾值表明該患 者的子宮內(nèi)膜增殖狀態(tài)可能正常。
可用涉及癌癥或子宮內(nèi)膜增殖的任何上述方法分析的示例性流體樣品包 括尿、血漿或血清。
在相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了處理器、計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)器以及某種 例程，該例程儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)器上并適合在處理器上執(zhí)行以進(jìn)行任何上 述方法和/或生成可溶性M-CSF受體的檢測(cè)水平輸出值和認(rèn)為是"正常"的閾 值或閾值水平范圍，因此該"正常"范圍之外的水平與一種或多種上述癥狀相 關(guān)。本發(fā)明還提供了包含執(zhí)行類似功能的程序或例程的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。合適 的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、環(huán)境和/或配置的例子包括個(gè)人計(jì)算機(jī)、服務(wù)器計(jì)算機(jī)、手提式 或膝上型裝置、多處理器系統(tǒng)、微處理器系統(tǒng)、機(jī)頂盒、可編程的消費(fèi)者電子 設(shè)備、網(wǎng)絡(luò)PC、小型計(jì)算機(jī)、大型計(jì)算機(jī)、包括任何上述系統(tǒng)或裝置的分布 式計(jì)算環(huán)境、或本領(lǐng)域已知的任何其他系統(tǒng)。
再在另一本發(fā)明實(shí)施方式中，提供了試劑盒，其中裝有(a)特異性結(jié)合
可溶性M-CSF受體的第一抗體；和(b) M-CSF受體含量已知的M-CSF受體標(biāo) 準(zhǔn)品。在相關(guān)方面，在上述提供的試劑盒中，第一抗體連接于可檢測(cè)標(biāo)記。在 還有另一方面，所述可檢測(cè)標(biāo)記是酶。再在另一方面，所述試劑盒中還裝有能 釋放可檢測(cè)信號(hào)的所述酶的底物。在另一相關(guān)方面，上述試劑盒中還裝有結(jié)合 可溶性M-CSF受體的第二抗體。再在另一相關(guān)方面，上述試劑盒中還裝有結(jié) 合所述第一抗體的第二抗體。再在另一相關(guān)方面，上述試劑盒中還裝有結(jié)合可 溶性M-CSF受體的第二抗體。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，所述可溶性M-CSF受體水平能檢測(cè)疾病的 存在、預(yù)測(cè)疾病的預(yù)后或嚴(yán)重性、或監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展，所述疾病選自下組與破 骨細(xì)胞活性相對(duì)升高或骨的再建所需的破骨/成骨過(guò)程相關(guān)的溶骨性疾病，包括 代謝性骨病，內(nèi)分泌病(皮質(zhì)醇增多癥、性腺功能減退癥、原發(fā)性或繼發(fā)性甲 狀旁腺功能亢進(jìn)癥、甲狀腺功能亢進(jìn)癥)，高鈣血癥，缺乏狀態(tài)(佝僂病/骨軟化 癥、壞血病、營(yíng)養(yǎng)不良)，慢性病(吸收不良綜合征、慢性腎衰竭(腎性骨營(yíng)養(yǎng)不 良癥)、慢性肝病(肝性骨營(yíng)養(yǎng)不良))，藥物(糖皮質(zhì)激素類(糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨 質(zhì)疏松癥)、肝素、酒精)，以及遺傳性疾病(成骨不全、高胱氨酸尿癥)，癌癥， 骨質(zhì)疏松癥，假體周圍(periprosthetic)骨流失(例如，由于骨或關(guān)節(jié)假體置換術(shù)， 包括整個(gè)髖關(guān)節(jié)成形術(shù)中的外來(lái)植入物)，與關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的 骨炎癥，牙周病，纖維性結(jié)構(gòu)不良，和/或佩吉特病。
附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示了用來(lái)量化可溶性人M-CSF受體濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 圖2顯示了人血清樣品中可溶性人M-CSF受體的檢測(cè)。 圖3顯示了人血清中中人M-CSF與可溶性c-fms的結(jié)合。 圖4顯示了可溶性人M-CSF受體的親和分析。 圖5顯示了可溶性人M-CSF受體的免疫沉淀反應(yīng)(IP)。 圖6顯示了可溶性人M-CSF受體的去糖基化。 圖7顯示了可溶性人M-CSF受體的SDS-PAGE分析。 圖8顯示了用胰蛋白酶消化去糖基化的可溶性人M-CSF受體所得肽的序 列分析(SEQIDNO: 1)。
圖9顯示了人尿樣品中可溶性人M-CSF受體的檢測(cè)。
圖10顯示了月經(jīng)周期期間尿樣品中可溶性人M-CSF受體的水平。
圖11顯示了乳腺癌患者樣品中可溶性人M-CSF受體的水平。
圖12顯示了乳腺癌患者血清樣品中可溶性人M-CSF受體與M-CSF水平
之間的相關(guān)性。
圖13顯示在短尾猴(Cynomulgus)和恒河猴中發(fā)現(xiàn)的可溶性M-CSF受體。 圖14顯示破骨細(xì)胞分化期間可溶性人M-CSF受體的表達(dá)依賴于M-CSF 活性。
圖15顯示可溶性人M-CSF受體的表達(dá)遵循破骨細(xì)胞的TRAP活性。 圖16顯示從培養(yǎng)基中除去M-CSF能剌激分化的破骨細(xì)胞表達(dá)可溶性人 M-CSF受體。
圖17顯示了 Zometa和M-CSF中和抗體對(duì)分化的破骨細(xì)胞中可溶性人 M-CSF受體表達(dá)的影響。
發(fā)明詳述
本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了人M-CSF受體的自然產(chǎn)生的可溶形式，它通常是膜結(jié) 合受體。已顯示該受體的這種可溶形式(shM-CSFR)的濃度與癌癥、破骨細(xì)胞分 化和月經(jīng)周期相關(guān)。已顯示shM-CSFR濃度升高與癌癥和細(xì)胞增生狀態(tài)的嚴(yán)重 性相關(guān)。
因此，本發(fā)明提供了檢測(cè)或監(jiān)測(cè)細(xì)胞增生狀態(tài)，尤其是在癌癥、子宮內(nèi)膜 異位癥、以及雌性能孕期間子宮內(nèi)層增厚中發(fā)現(xiàn)的增生狀態(tài)的方法。該方法包 括，例如在癌癥化療、子宮內(nèi)膜異位癥治療期間和/或之后或在月經(jīng)周期期間對(duì) 這種增生狀態(tài)進(jìn)行診斷、分級(jí)、預(yù)測(cè)預(yù)后或嚴(yán)重性、以及監(jiān)測(cè)進(jìn)展或消退的方 法。
另一方面，本發(fā)明還提供了檢測(cè)或監(jiān)測(cè)破骨細(xì)胞的增生狀態(tài)，尤其是涉及 破骨細(xì)胞分化的增生狀態(tài)的方法。該方法包括在治療期間和/或之后對(duì)代謝性骨 病進(jìn)行診斷、分級(jí)、預(yù)測(cè)預(yù)后或嚴(yán)重性、以及監(jiān)測(cè)進(jìn)展或消退的方法。
另一方面，本發(fā)明還提供了純化的shM-CSFR。所述shM-CSFR按照本領(lǐng) 域已知的方法從人血清或尿中純化并測(cè)序。例如，采用抗c-ftns特異性抗體的親和層析可用于親和純化。可利用本文所述可溶性受體ELISA試驗(yàn)(參見(jiàn)，例 如，實(shí)施例l)中使用的抗體(DuoSet Elisa開發(fā)系統(tǒng)hM-CSF R(Duo Set Elisa development system hM-CSF R)(R&D系統(tǒng)公司(R&D systems)，目錄號(hào) DY329))。作為選擇或除此之外，由于發(fā)現(xiàn)shM-CSFR可被糖基化，故而可采 用凝集素親和層析步驟來(lái)純化糖基化的蛋白質(zhì)。也可采用離子交換層析來(lái)進(jìn)一 步純化shM-CSFR。對(duì)純化的shM-CSFR進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)序之前，可采用本領(lǐng)域 已知和本文描述的方法進(jìn)行去糖基化反應(yīng)(參見(jiàn)，例如，實(shí)施例l)。用N-末端 測(cè)序、肽譜法和質(zhì)譜法的組合方法來(lái)測(cè)定shM-CSFR全長(zhǎng)序列。
任何檢測(cè)患者樣品內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)的方法都可用來(lái)檢測(cè)與任何上述疾病 或癥狀相關(guān)shM-CSFR的存在或相對(duì)量。特別優(yōu)選的方法包括本領(lǐng)域已知的任 何抗體免疫測(cè)定，如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、RIA(放射免疫測(cè)定)、LIA(發(fā) 光免疫測(cè)定)和FIA(熒光免疫測(cè)定)?？贵w(第一抗體或第二抗體)可用本領(lǐng)域已 知的任何標(biāo)記來(lái)標(biāo)記，包括放射性同位素(例如，125I)、熒光染料(例如，F(xiàn)ITC) 或酶(例如，HRP或AP)，它們能催化產(chǎn)生熒光或光的反應(yīng)。
這種方法的步驟包括分析患者流體樣品中shM-CSF受體的存在或相對(duì)水 平，其中，高于某閾值的可溶性M-CSF受體的水平表明該患者可能具有疾病 狀態(tài)或癥狀，而低于所述閾值的水平表明該患者不太可能具有這種疾病狀態(tài)或 癥狀。可將靈敏度和特異性分別設(shè)定在任何所需水平，例如85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或更高。
可采用任何患者樣品，但優(yōu)選流體樣品，如血液(包括全血、血漿或血清)、 尿液、唾液、腦脊液、腹水、胸膜液、吸出物、或任何其他身體滲出液或分泌 物。
文中，術(shù)語(yǔ)"診斷"表示檢測(cè)某疾病或病癥或者確定某疾病或病癥的階段或 程度。術(shù)語(yǔ)"診斷"還包括檢測(cè)某疾病或病癥的傾向，確定某種藥物療法的療效， 或預(yù)測(cè)某種藥物療法的作用模式。本發(fā)明的診斷方法可單獨(dú)使用，或者可與醫(yī) 學(xué)領(lǐng)域已知的某種特定疾病或病癥的其他診斷和/或分級(jí)方法聯(lián)合使用。因此， 在一個(gè)實(shí)施方式中，進(jìn)行所述診斷方法時(shí)可采用本文所述的任何一種方法檢測(cè) 患者中本發(fā)明所述SM-CSFR的濃度并確定該患者是否具有異常濃度的該蛋 白質(zhì)。在示例性的實(shí)施方式中，給由于疾病的其他臨床征兆或癥狀而懷疑具有
所述疾病或癥狀的一小組患者施用所述診斷方法。
"預(yù)后"是對(duì)攻擊或疾病的可能結(jié)果做出的預(yù)報(bào)，和/或?qū)募膊≈谢謴?fù)的預(yù) 期，這種恢復(fù)由疾病的特性或癥狀表明。舉例來(lái)說(shuō)，不良預(yù)后預(yù)示不太可能康 復(fù)并可能死亡，而良好預(yù)后預(yù)示可能康復(fù)并有可能完全恢復(fù)健康。
術(shù)語(yǔ)"閾值"表示在與存在或不存在某癥狀相關(guān)的規(guī)定條件下，已知物質(zhì)(例 如，分子、化合物，等等)的定量或定性度量(例如，濃度、水平、活性，等等)。 此時(shí)，可將不同條件下己知物質(zhì)的度量與閾值度量進(jìn)行比較以幫助確定患者是 否患有該癥狀。
術(shù)語(yǔ)"標(biāo)準(zhǔn)"指規(guī)定條件下，已知物質(zhì)(例如，M-CSFR)的特定度量(例如， 濃度)設(shè)定范圍。
術(shù)語(yǔ)"分析"指檢測(cè)或測(cè)量復(fù)雜物質(zhì)(例如，諸如血清等的流體)中的某種組 分。"監(jiān)測(cè)"是周期性觀察或檢測(cè)某方法(例如，某種治療癌癥患者的方法)效果 的過(guò)程。"分級(jí)"指通過(guò)分析經(jīng)由可接受的醫(yī)學(xué)實(shí)踐測(cè)定的臨床階段相關(guān)標(biāo)記物 水平來(lái)預(yù)測(cè)癌癥或其他疾病的臨床階段(例如，早期階段或發(fā)展階段)。
"腫瘤"在文中指所有贅生細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖(無(wú)論是惡性或良性)以及所有癌 前和癌性細(xì)胞和組織。
術(shù)語(yǔ)"癌癥"和"癌性"是指或描述哺乳動(dòng)物中通常以不受調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長(zhǎng)為 特征的生理狀況。癌癥的例子包括但不限于癌；淋巴瘤，母細(xì)胞瘤，肉瘤和 白血病。這種癌癥的更具體的例子包括乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、鱗狀上
皮細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮 頸癌、卵巢癌、肝臟癌癥、膀胱癌、肝癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺 癌、腎癌、肝臟癌癥、肛門癌、甲狀腺癌、肝癌和各種類型的頭頸癌。
"治療"是以防止疾病的發(fā)生或改變疾病病狀為意圖而進(jìn)行的干預(yù)。因此， "治療"同時(shí)指治療性治療和預(yù)防性或防御性措施。需要治療的對(duì)象包括已患病 的對(duì)象以及需要預(yù)防疾病的對(duì)象。在腫瘤(例如，癌癥)治療中，治療劑可直接 減輕腫瘤細(xì)胞的病狀，或使腫瘤細(xì)胞對(duì)其他治療劑如放療和/或化療的治療更敏 感。治療具有疾病(如骨質(zhì)溶解)的臨床、生化、放射或主觀癥狀的患者可包括
緩解這些癥狀中的一些或全部或降低對(duì)該疾病的傾向性。癌癥的"病狀"包括損 害患者健康的所有現(xiàn)象。這包括，但不限于，異?；虿豢煽刂频募?xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)
移、干擾相鄰細(xì)胞的正常功能、以異常水平釋放細(xì)胞因子或其他分泌產(chǎn)物、抑 制或加重炎癥或免疫反應(yīng)，等等。因此，治療后的改善可表現(xiàn)為腫瘤尺寸縮小、 腫瘤生長(zhǎng)速率減緩、現(xiàn)有腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)移性細(xì)胞被破壞、和/或轉(zhuǎn)移的大小或數(shù) 量減小。
就治療目的而言，"哺乳動(dòng)物"指歸類為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人，家
養(yǎng)和農(nóng)用動(dòng)物，以及動(dòng)物園動(dòng)物(zooanimal)、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物(sports animal)和寵物， 如狗、馬、貓、母牛等。優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物是人。
文中，短語(yǔ)"轉(zhuǎn)移性癌癥"被定義為有可能擴(kuò)散到身體其他區(qū)域、尤其是骨 骼中的癌癥。許多癌癥都可轉(zhuǎn)移到骨骼中，但最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移性癌癥是乳腺癌、 肺癌、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、甲狀腺癌和前列腺癌。舉例來(lái)說(shuō)，其他有可能轉(zhuǎn) 移到骨骼中的癌癥包括但不限于腺癌，血細(xì)胞惡性腫瘤，包括白血病和淋巴
瘤；頭頸癌；胃腸癌，包括食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、腸癌、結(jié)腸直腸癌、直腸 癌、胰腺癌、肝癌、膽管或膽囊的癌癥；雌性生殖道的惡性腫瘤，包括卵巢癌、 子宮內(nèi)膜癌、陰道癌和宮頸癌；膀胱癌；腦癌，包括成神經(jīng)細(xì)胞瘤；肉瘤，骨 肉瘤；以及皮膚癌，包括惡性黑色素瘤和鱗狀上皮細(xì)胞癌。本發(fā)明尤其包括預(yù) 防和治療腫瘤誘導(dǎo)的溶骨性骨損傷。
文中，短語(yǔ)"治療有效量"的含義是指當(dāng)按照所需治療方案給藥時(shí)將引起所 需治療或預(yù)防效果或反應(yīng)的適合本發(fā)明實(shí)施方式的M-CSF受體可溶性片段的 治療或預(yù)防用量。
人"M-CSF"在文中指具有與以下文獻(xiàn)所述成熟的人M-CSFa 、 M-CSF(3或 M-CSPy多肽基本相同的氨基酸序列的人多肽Kawasaki等，Science 230: 291 (1985)， Cerretti等，Molecular Immunology, 25: 761 (1988)，或Ladner等， EMBO Journal 6: 2693 (1987)，各文獻(xiàn)通過(guò)引用納入本文。如上所述，該術(shù)語(yǔ) 反映出，這三種成熟的M-CSF具有不同氨基酸序列，且M-CSF的活性形式是 二硫鍵連接的二聚體；因此，當(dāng)術(shù)語(yǔ)"M-CSF'表示生物活性形式時(shí)是指二聚體 形式。"M-CSF 二聚體"指己經(jīng)二聚化的兩個(gè)M-CSF多肽單體，并同時(shí)包括同 型二聚體(由兩個(gè)相同類型的M-CSF單體構(gòu)成)和雜二聚體(由兩種不同單體構(gòu) 成)。如美國(guó)專利4,929,700所述，可在體外將M-CSF單體轉(zhuǎn)變成M-CSF 二聚 體，該專利通過(guò)引用納入本文。
"可溶性人M-CSF受體"(shM-CSFR)表示與SEQ ID NO: 2所示的M-CSFR 的胞外部分具有基本相同氨基酸序列的多肽。 抗-shM-CSFR抗體
單克隆或多克隆抗體可用于本發(fā)明的檢測(cè)方法，但由于單克隆抗體的一致 性和特異性而優(yōu)選使用。嚙齒類抗體如鼠科單克隆抗體適合用于診斷方法。修 飾語(yǔ)"單克隆"表示該抗體的特征為獲自基本均質(zhì)的抗體群體，且不能解釋為要 求通過(guò)任何特定方法產(chǎn)生抗體。
用來(lái)產(chǎn)生抗體的抗原可以是，例如，完整的shM-CSFR或保留所需表位的 shM-CSFR的片段，該片段可任選融合于另一多肽從而能展示天然構(gòu)象的所述 表位?；蛘?，可采用表達(dá)shM-CSFR的細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生抗體?？赊D(zhuǎn)化這種細(xì)胞以表 達(dá)M-CSF，或者這種細(xì)胞可以是表達(dá)shM-CSFR的其他自然產(chǎn)生的細(xì)胞。用 于產(chǎn)生抗體的shM-CSFR的其他形式是精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的。
為重組產(chǎn)生shM-CSFR，如本領(lǐng)域所熟知的，可將編碼其的核酸分離并插 入可復(fù)制載體以進(jìn)一步克隆(擴(kuò)增DNA)或表達(dá)。采用常規(guī)方法(例如，采用能 夠特異性結(jié)合抗體重鏈和輕鏈編碼基因的寡核苷酸探針)容易分離和測(cè)序編碼 單克隆抗體的DNA?？刹捎迷S多載體。載體的組成通常包括但不限于以下一 種或多種信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、 一種或多種選擇性標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、 啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。
可采用本領(lǐng)域已知的任何方法用抗原來(lái)產(chǎn)生單克隆抗體，例如最先由 Kohler等(Nature， 256: 495[1975])描述的雜交瘤方法，或重組DNA法(參見(jiàn)， 例如，美國(guó)專利4,816,567)，或采用Clackson等(Nature， 352: 624628[1991]) 和Marks等(J. Mol. Biol.， 222: 581-597 (1991))描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù) 分離。
在雜交瘤方法中，如本文所述免疫小鼠或其他合適宿主動(dòng)物，如倉(cāng)鼠或獼 猴，從而引發(fā)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生特異性結(jié)合免疫所用蛋白質(zhì)的抗體。或 者可在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后用合適的融合劑如聚乙二醇使淋巴細(xì)胞與骨髓 瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，《單克隆抗體原則和實(shí)踐》(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice),第59-103頁(yè)(學(xué)術(shù)出版社(Academic Press), 1986))。
將如此制備的雜交瘤細(xì)胞接種到合適的培養(yǎng)基上并使其生長(zhǎng)，所述培養(yǎng)基 優(yōu)選含有一種或多種能抑制未融合的親代骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例
如，如果親代骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或 HPRT)，則雜交瘤的培養(yǎng)基通常將包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(HAT 培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)能阻止HGPRT-缺陷型細(xì)胞生長(zhǎng)。
優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些有效融合的、支持選出的抗體產(chǎn)生細(xì)胞以高水平 穩(wěn)定產(chǎn)生抗體的、并對(duì)培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞。用人骨髓瘤和小鼠-人雜骨髓瘤細(xì) 胞系來(lái)產(chǎn)生人單克隆抗體也已見(jiàn)諸描述(Kozbor， J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur等，《單克隆抗體的制造技術(shù)和應(yīng)用》(Monoclonal Antibodies Production Techniques and Applications),第51-63頁(yè)(紐約MD有限公司(Marcel Dekker， Inc., New York), 1987))。示例性鼠科骨髓瘤系包括那些可獲自美國(guó)加州圣地 亞哥市索爾克研究所細(xì)胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego， Calif. USA)的衍生自MOP-21和M.C,ll小鼠腫瘤的細(xì)胞系以及可獲自 美國(guó)馬里蘭州洛克維爾美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection, Rockville， Md. USA)的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞。
檢驗(yàn)生長(zhǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基產(chǎn)生直接抗抗原的單克隆抗體的情況。優(yōu)選 地，通過(guò)免疫沉淀反應(yīng)或通過(guò)體外結(jié)合試驗(yàn)，如放射免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免 疫吸附測(cè)定(ELISA)來(lái)測(cè)定雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性。例如， 可通過(guò)Scatchard分析(Munson等，Anal. Biochem.， 107: 220 (1980))來(lái)測(cè)定單 克隆抗體的結(jié)合親和力。
鑒定出能產(chǎn)生具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后， 可通過(guò)有限稀釋法對(duì)克隆進(jìn)行亞克隆并在通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)(Goding，《單克隆 抗體原則和實(shí)踐》，第59-103頁(yè)(學(xué)術(shù)出版社，1986))。用于該目的的合適培 養(yǎng)基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，可將雜交瘤細(xì)胞作為 腹水腫瘤在動(dòng)物體內(nèi)培養(yǎng)。亞克隆分泌的單克隆抗體適合通過(guò)諸如A蛋白-瓊 脂糖凝膠、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析等常規(guī)免疫球蛋白純化 方法從培養(yǎng)基、腹水液或血清分離。
術(shù)語(yǔ)"抗體"以最廣泛的含義使用，并完全包括裝配的抗體、單克隆抗體、 多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、能結(jié)合抗原的抗體片段(例如，F(xiàn)ab'、 F'(ab)2、 Fv、單鏈抗體、雙特異抗體(diabody))、嵌合抗體、人源化 和人衍生的抗體以及包括上述抗體的重組肽，只要它們具有所需的生物活性。
由于嵌合或人源化抗體在人中的免疫原性低于親代鼠單克隆抗體，因此可 將它們用于人類治療，此時(shí)發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)將大大降低。因此，優(yōu)選將這 些抗體用于涉及人體內(nèi)給藥的治療用途。
可采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生鼠單克隆抗體的可變區(qū)Ig結(jié)構(gòu)域與人 恒定區(qū)Ig結(jié)構(gòu)域融合的嵌合單克隆抗體(參見(jiàn)Morrison, S.L.等，1984，《嵌合 的人抗體分子；小鼠抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域》(Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 ， 6841-6855;以及Boulianne， G.L.等，Nature 312， 643-646.(1984))。盡管已證實(shí)一些嵌合單克隆抗體在人體 中的免疫原性較弱，但小鼠可變區(qū)Ig結(jié)構(gòu)域仍能導(dǎo)致顯著的人抗小鼠反應(yīng)。
人源化抗體可通過(guò)各種方法獲得，例如其中包括(1)將非人互補(bǔ)決定區(qū) (CDR)接枝到人的框架區(qū)和恒定區(qū)上(本領(lǐng)域?qū)⒃摲椒ǚQ為通過(guò)"CDR接枝 (CDR grafting)"進(jìn)行人源化)，或者，(2)移植完整的非-人可變區(qū)結(jié)構(gòu)域，但 通過(guò)置換表面殘基而用人-樣表面"包裹"它們(本領(lǐng)域?qū)⒃摲椒ǚQ為"鑲面 (veneering)")。在本發(fā)明中，人源化抗體將同時(shí)包括"人源化"和"鑲面"抗體。這 些方法描述于，例如，Jones等，Nature 321: 522 525 (1986); Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci.， U.S.A.， 81: 6851 6855 (1984); Morrison和Oi， Adv. Immunol,, 44: 65 92(1988); Verhoeyer等，Science239: 1534 1536(1988); Padlan， Molec. Immun. 28: 489 498 (1991); Padlan， Molec. Immunol. 31(3): 169217 (1994); 和Kettleborough， CA.等，Protein Eng. 4(7): 773 83 (1991)，分別通過(guò)引用將它 們納入本文。
檢測(cè)shM-CSFR的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了檢測(cè)生物樣品中的shM-CSFR的方法，該方法包括使樣品接 觸特異性結(jié)合shM-CSFR的抗體并檢測(cè)結(jié)合shM-CSFR的抗體或未結(jié)合的抗 體。所述任一抗體的相對(duì)量與樣品中shM-CSFR的量相關(guān)?？捎每蓹z測(cè)標(biāo)記直 接或間接標(biāo)記該抗體。
合適的可檢測(cè)標(biāo)記包括各種酶、結(jié)合基團(tuán)、熒光材料、發(fā)光材料和放射性
材料。示例性的酶標(biāo)記包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、P-半乳糖苷酶或乙 酰膽堿酯酶;示例性的結(jié)合基團(tuán)復(fù)合物包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物 素蛋白/生物素；示例性的熒光標(biāo)記包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅
丹明、二氯三嗪基胺熒光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹酰氯或藻紅 蛋白；示例性的發(fā)光標(biāo)記包括魯米諾；示例性的放射性標(biāo)記包括125I、 131I、 35S 或3仏
在RIA(放射免疫測(cè)定)中，可利用連接到可檢測(cè)標(biāo)記的shM-CSFR標(biāo)準(zhǔn)品 以及未標(biāo)記的抗-shM-CSFR抗體通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定來(lái)檢測(cè)shM-CSFR。將生 物樣品、標(biāo)記的shM-CSFR標(biāo)準(zhǔn)品以及抗-shM-CSFR抗體混合并測(cè)定結(jié)合到未 標(biāo)記抗體的標(biāo)記的抗-shM-CSFR標(biāo)準(zhǔn)品的量。生物樣品中shM-CSFR的量與結(jié) 合于抗-shM-CSFR抗體的標(biāo)記的shM-CSFR標(biāo)準(zhǔn)品的量成反比。
ELISA測(cè)定首先包括制備shM-CSFR的特異性抗體，優(yōu)選單克隆抗體。此 外，通常制備特異性結(jié)合于shM-CSFR的報(bào)告抗體。所述報(bào)告抗體與可檢測(cè)試 劑，如放射性試劑、熒光試劑或酶試劑，例如辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或堿性磷 酸酶(AP)相連。為進(jìn)行ELISA，將shM-CSFR的特異性抗體與能結(jié)合該抗體的 固體支持物如聚苯乙烯平皿一起培育。然后將平皿與非特異性蛋白質(zhì)如牛血清 白蛋白(BSA)—起培育以覆蓋平皿上的任何游離蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。然后在平皿 內(nèi)培育待分析的樣品，期間shM-CSFR與連接于聚苯乙烯平皿的特異性抗體結(jié) 合。用緩沖液洗去未結(jié)合的樣品。在平皿中加入與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的 shM-CSFR的特異性報(bào)告抗體，從而使得該報(bào)告抗體與任何結(jié)合于shM-CSFR 的單克隆抗體結(jié)合。然后洗去未結(jié)合的報(bào)告抗體。再向平皿中加入過(guò)氧化物酶 活性試劑，包括比色底物。與抗-shM-CSFR抗體連接的固定的過(guò)氧化物酶產(chǎn)生 有色反應(yīng)產(chǎn)物。給定時(shí)期內(nèi)產(chǎn)生的顏色的量與樣品中存在的shM-CSFR蛋白的 量成比比。參考標(biāo)準(zhǔn)曲線通常可獲得定量結(jié)果。
可通過(guò)各種方式進(jìn)行這些常規(guī)測(cè)定，包括下述裝置和試劑盒。
檢測(cè)shM-CSFR的裝置和試劑盒
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，測(cè)定器件是任選包裝在外殼內(nèi)的側(cè)向流動(dòng)試片 (lateral flow test strip)。標(biāo)記的shM-CSFR第一抗體處于溶液中，而shM-CSFR 第二抗體固定在試片上。當(dāng)含有shM-CSFR的患者樣品接觸這兩種抗體時(shí)就形
成了抗體-靶標(biāo)-抗體夾心復(fù)合物，可借助標(biāo)記物檢測(cè)固定在固體支持物上的所 得復(fù)合物。然后將該試片插入讀數(shù)器，測(cè)量復(fù)合物中標(biāo)記物發(fā)出的信號(hào)。結(jié)果
可以為陰性或陽(yáng)性，或定量測(cè)量樣品中shM-CSFR的濃度，該濃度與表示疾病 或病癥的風(fēng)險(xiǎn)或存在的結(jié)果相關(guān)。整個(gè)過(guò)程可以是自動(dòng)的和/或計(jì)算機(jī)控制的。 或者，可將試片與適當(dāng)顏色的可視標(biāo)準(zhǔn)品比較以通過(guò)目測(cè)讀取。該測(cè)試提供了 與shM-CSFRELISA類似的臨床相關(guān)信息，但明顯省時(shí)且無(wú)需照看。
在另一個(gè)示例性實(shí)施方式中，器件是一種用來(lái)快速檢測(cè)shM-CSFR的試 片，其采用免疫測(cè)定法，其中流體樣品中的shM-CSFR與固定的shM-CSFR競(jìng) 爭(zhēng)結(jié)合有限的標(biāo)記的抗體結(jié)合位點(diǎn)。在試驗(yàn)過(guò)程中，體液樣品與標(biāo)記的抗體-染料偶聯(lián)物混合并沿多孔膜遷移。當(dāng)shM-CSFR濃度低于檢出限度時(shí)，未結(jié)合 的抗體-染料偶聯(lián)物結(jié)合固定在膜上的shM-CSFR偶聯(lián)物，從而在"陰性"檢 測(cè)區(qū)產(chǎn)生有色條帶。相反，當(dāng)shM-CSFR水平處于或高出檢出限度時(shí)，游離的 shM-CSFR與固定在膜上的shM-CSFR偶聯(lián)物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體-染料偶聯(lián)物，形成 抗原-抗體復(fù)合物，從而不會(huì)產(chǎn)生有色條帶。無(wú)論樣品中SM-CSFR的水平如 何，各對(duì)照區(qū)都產(chǎn)生有色條帶，從而可用作驗(yàn)證試劑具有化學(xué)活性的質(zhì)控度量。 可采用類似方法根據(jù)顏色強(qiáng)度等級(jí)來(lái)更加定量地測(cè)定shM-CSFR水平。 設(shè)定閾值的方法是本領(lǐng)域熟知的，通過(guò)該閾值可測(cè)定疾病狀態(tài)、預(yù)后等。 舉例來(lái)說(shuō)，可將來(lái)自充足的代表性數(shù)量的正常對(duì)象(例如無(wú)待檢癥狀的健康人 群)的流體樣品中shM-CSFR蛋白水平與來(lái)自充足的代表性數(shù)量的患病對(duì)象(例 如被證實(shí)患有疾病或癥狀的人群)的shM-CSFR蛋白水平進(jìn)行比較分析。確定 的閾值截?cái)嘀祽?yīng)能區(qū)分大多數(shù)正常人群與大多數(shù)患病人群?；蛘?，可根據(jù)數(shù)據(jù) 確定陰性、不確定和陽(yáng)性結(jié)果的有用終點(diǎn)值。例如，可確定正常范圍(代表陰 性結(jié)果)，其中包括大多數(shù)正常人群的shM-CSFR水平但不包括幾乎所有的患 病人群的shM-CSFR水平。相應(yīng)地，可確定表明陽(yáng)性結(jié)果的范圍，其中包括大 多數(shù)患病人群的shM-CSFR水平但不包括幾乎所有正常人群的shM-CSFR水 平。
測(cè)得的shM-CSFR蛋白的水平高于(或低于，根據(jù)需要而定)預(yù)定的閾值表 明shM-CSFR蛋白與疾病關(guān)聯(lián)。為利用閾值，應(yīng)對(duì)獲自正常人群的樣品和獲自 不健康人群的樣品進(jìn)行同樣的處理(即，制備和儲(chǔ)存)。根據(jù)測(cè)得的正常人群樣
品中shM-CSFR蛋白水平的范圍，熟練的技術(shù)人員鑒于測(cè)得的患病人群樣品的 shM-CSFR蛋白水平的范圍能方便地得到合適的閾值水平以及進(jìn)行比較、預(yù)測(cè) 和診斷所需的特異性或靈敏度。
理想地，確定該閾值時(shí)需要考慮醫(yī)學(xué)和流行病學(xué)因素。要考慮的因素包括 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的臨床目的、是否需要得到高陽(yáng)性預(yù)測(cè)值或高陰性預(yù)測(cè)值，以及檢 測(cè)人群中疾病的流行性。
本發(fā)明的范圍還包括試劑盒。典型的試劑盒可裝有任選結(jié)合于可檢測(cè)標(biāo)記 的特異性結(jié)合shM-CSFR的第一抗體，和M-CSFR含量已知的M-CSFR標(biāo)準(zhǔn) 品。其他組分可任選包括進(jìn)行免疫測(cè)定的試劑，如連接于可檢測(cè)標(biāo)記的第二抗 體，所述可檢測(cè)標(biāo)記可結(jié)合shM-CSFR或所述第一抗體；如果所述標(biāo)記是酶， 則該試劑盒還可包括釋放可檢測(cè)信號(hào)的酶底物。
組合療法
優(yōu)選將兩種或多種M-CSF拮抗劑(例如，shM-CSFR和抗-M-CSF抗體)混 合在一起以提供更加改進(jìn)的抗M-CSF相關(guān)疾病或紊亂(例如，癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移 和/或骨質(zhì)溶解)的功效?？蓪环N或多種M-CSF拮抗劑的組合物施用于患 有、或傾向于患有癌癥轉(zhuǎn)移和/或癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)性骨流失的人或哺乳動(dòng)物。同時(shí) 施用兩種治療劑不要求在相同時(shí)間或通過(guò)相同途徑施用所述藥劑，只要藥劑發(fā) 揮其治療效果的時(shí)期有重疊即可?？赏瑫r(shí)或依次施用，也可在不同天或不同周
施用。也可將shM-CSFR療法與化療或放療組合進(jìn)行。 給藥和制備
用于實(shí)踐本發(fā)明方法的shM-CSFR可被配置成含有適合所需遞送方法的 載體的藥物組合物。合適的載體包括當(dāng)與shM-CSFR混合時(shí)能保持shM-CSFR 的抗腫瘤功能且不與對(duì)象的免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)的任何材料。例子包括，但不限 于，任何標(biāo)準(zhǔn)藥物載體，如無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液、抑菌水，等等?？刹捎酶鞣N 水性載體，如水、緩沖的水、0.4%鹽水、0.3%甘氨酸等，并可包含其他蛋白質(zhì) 以增強(qiáng)穩(wěn)定性(如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等)、進(jìn)行溫和化學(xué)修飾，等等。
將具有所需純度的藥物與任選的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑 (《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington's Pharmaceutical Sciences),第16版，Osol， 八.編(1980))混合可制造出能儲(chǔ)存的藥物治療制劑，所述制劑的形式可以是凍干
制劑或水性溶液?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所用劑量和濃度下對(duì)受者 無(wú)毒，包括緩沖劑如磷酸、檸檬酸和其他有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和 甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯扎氯銨， 苯索氯銨；苯酚，丁醇或芐醇；對(duì)羥基苯甲酸垸基酯類如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或 對(duì)羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分 子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親 水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、 精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精； 螯合劑，如EDTA;糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離 子，如鈉；金屬絡(luò)合物(例如，Zn-蛋白絡(luò)合物)；和/或非離子表面活性劑如 TWEEN 、 PLUROMCStm或聚乙二醇(PEG)。
給予哺乳動(dòng)物的本發(fā)明組合物的用量足以防止或至少部分停止癌癥、癌癥 轉(zhuǎn)移和/或骨質(zhì)溶解的進(jìn)展。足以實(shí)現(xiàn)該目的的用量定義為"治療有效劑量"?？?采用主治醫(yī)師選擇的劑量水平和模式一次或多次施用該組合物。為預(yù)防或治療 疾病，合適的劑量將取決于如上文所定義的待治療疾病的類型、疾病的嚴(yán)重性 和病程(無(wú)論藥物是出于預(yù)防或治療目的而給予)、之前的療法、患者的臨床史 和對(duì)藥物的反應(yīng)、以及主治醫(yī)師的判斷。
非治療用途
本發(fā)明的shM-CSFR也可用作M-CSF的親和純化試劑或用于M-CSF蛋白 的診斷試驗(yàn)，例如檢測(cè)其在特定細(xì)胞、組織或血清中的表達(dá)。shM-CSFR也可 用于體內(nèi)診斷試驗(yàn)。通常，在用于這些目的時(shí)，用放射性核素(如mIn、 "Tc、 14C、 131I、 125I、 3H、 "P或'"S)標(biāo)記shM-CSFR從而可利用免疫閃爍成像定位腫瘤。
本發(fā)明的shM-CSFR可用于任何已知試驗(yàn)方法，如競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)、直接 和間接夾心試驗(yàn)如ELISA、以及免疫沉淀測(cè)定。Zola，《單克隆抗體技術(shù)手 冊(cè)》(Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques),第147-158頁(yè)(CRC出版 社(CRC Press, Inc.), 1987)。
為方便起見(jiàn)，當(dāng)用本發(fā)明的shM-CSFR檢測(cè)M-CSF時(shí)可提供在試劑盒內(nèi)， 即將預(yù)定量的試劑與進(jìn)行診斷試驗(yàn)的說(shuō)明書包裝在一起，并任選裝有含量已知的M-CSF的M-CSF標(biāo)準(zhǔn)品。此夕卜，可包括其他添加物，如穩(wěn)定劑、緩沖液(例 如，封閉緩沖液或裂解緩沖液)等等。各種試劑的相對(duì)量可廣泛變化以使溶液 中的試劑濃度基本能使試驗(yàn)的靈敏度最佳。具體地說(shuō)，試劑可作為干粉提供， 通常是凍干的，其中含有在溶解時(shí)將提供具有合適濃度的試劑溶液的賦形劑。 通過(guò)以下實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，該實(shí)施例不是要以任何方式進(jìn)行限制。
實(shí)施例 實(shí)施例1
該實(shí)施例描述了人M-CSF可溶性受體的鑒定，并顯示該可溶性受體能夠 結(jié)合M-CSF。
I.鑒定血清樣品中的可溶性人M-CSF受體
A. 材料和方法
用PBS配制的100 ng/ml的捕獲抗體(DuoSet Elisa開發(fā)系統(tǒng)hM-CSF R(R&D系統(tǒng)公司，目錄號(hào)DY329))工作溶液以100 pl/孔包被微滴定板(R&D系 統(tǒng)公司，目錄號(hào)CP0011)。將平板密封并于室溫培育過(guò)夜。采用多道分配器/ 洗滌器用洗滌緩沖液(PBS中0.05%吐溫，pH7.2-7.4)將各孔洗滌3次后，平板 用300 pl/孔封閉緩沖液(PBS中1°/。BSA、 5%蔗糖，pH 7.2-7.4)于室溫封閉至少 1小時(shí)。
重復(fù)洗滌步驟之后便可在平板中加入樣品。以100 ^U/孔加入用稀釋劑稀釋 的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品。用粘合劑覆蓋平板并于室溫培育2小時(shí)，然后洗滌3輪。加 入100 pi檢測(cè)抗體(DuoSet Elisa開發(fā)系統(tǒng)hM-CSF R(R&D系統(tǒng)公司，目錄號(hào) DY329))后，覆蓋平板并于室溫培育2小時(shí)，然后洗滌3輪。
然后加入100 pl鏈霉抗生物素蛋白HRP(Streptapvidin HRP) (DuoSet Elisa 開發(fā)系統(tǒng)hM-CSF R (R&D系統(tǒng)公司，目錄號(hào)DY329))工作稀釋液，再在黑暗 中于室溫培育20分鐘。洗滌3輪后在各孔中加入100 底物溶液(試劑A和 B(R&D系統(tǒng)公司，目錄號(hào)DY999)的1:1混合物)并培育(develop)5分鐘，然后 加入50 pl終止液(2N H2S04)，溫和敲打平板以確保充分混合。加入終止液后 立即讀取450-540nm的光密度作為最終讀數(shù)。
B. 結(jié)果 當(dāng)采用ELISA試驗(yàn)測(cè)定血清樣品中是否存在可溶性人M-CSF受體時(shí)檢測(cè) 到人血清樣品中有強(qiáng)烈的陽(yáng)性信號(hào)。該ELISA試驗(yàn)所用的捕獲抗體和檢測(cè)抗 體都對(duì)人M-CSF受體胞外結(jié)構(gòu)域具有特異性。如圖2所示，在人血清樣品中 檢測(cè)到強(qiáng)烈的陽(yáng)性信號(hào)。該信號(hào)取決于人血清的濃度。當(dāng)未采用捕獲抗體時(shí)無(wú) 信號(hào)。
采用充重組人M-CSF受體和人抗體Fc片段融合蛋白作為參比蛋白建立標(biāo) 準(zhǔn)曲線以量化可溶性人M-CSF受體的濃度(圖1)。采用這種ELISA試驗(yàn)，以 c-fins人Fc融合蛋白作為參比計(jì)算人血清中可溶性受體的量。發(fā)現(xiàn)人血清中存 在約0.5 ug/ml可溶性人M-CSF受體(圖2)。
II.可溶性M-CSF受體的ELISA結(jié)合試驗(yàn)
A. 材料和方法
用PBS配制的100 ng/ml的捕獲抗體(DuoSet Elisa開發(fā)系統(tǒng)hM-CSF R (R&D系統(tǒng)公司，目錄號(hào)DY329))工作稀釋液以100 nl/孔包被微滴定板(R&D 系統(tǒng)公司，目錄號(hào)CP0011)。將平板密封并于室溫培育過(guò)夜。采用多道分配器/ 洗滌器用洗滌緩沖液(PBS中0.05%吐溫，pH7,2-7.4)將各孔洗滌3次后，平板 用300 pl/孔封閉緩沖液(PBS中1%BSA、 5%蔗糖，pH 7.2-7.4)于室溫封閉至少 1小時(shí)。
重復(fù)洗滌步驟后便可在平板中加入樣品。以100^1/孔加入用稀釋劑稀釋的 樣品或標(biāo)準(zhǔn)品。用粘合劑覆蓋平板并于室溫培育2小時(shí)，然后洗滌3輪。以l Hg/mL在平板中加入人M-CSF并于室溫培育1小時(shí)。加入100 pl抗人M-CSF 檢測(cè)抗體(HRP-偶聯(lián)的多克隆抗-人M-CSF抗體R&D系統(tǒng)公司，目錄號(hào) DMCOO，零件號(hào)890154)后，覆蓋平板并于室溫培育2小時(shí)，然后洗滌3輪。 在各孔中加入100 nl底物溶液(試劑A和B(R&D系統(tǒng)公司，目錄號(hào)DY999)的 1:1混合物)并培育5分鐘，然后加入50 nl終止液(2NH2S04)，溫和敲打平板以 確保充分混合。加入終止液后立即讀取450-540nm的光密度作為最終讀數(shù)。
B. 結(jié)果
存在于人血清中的可溶性受體能夠結(jié)合M-CSF。如圖3所示，在包被有單 克隆小鼠抗人c-fms抗體的ELISA平板上加入人血清樣品的連續(xù)稀釋液。先加 入l pg/ml外源人M-CSF(方塊)或PBS(菱形)，再用堿性磷酸酶-偶聯(lián)的多克隆
抗-人M-CSF抗體檢測(cè)人M-CSF。發(fā)現(xiàn)有超過(guò)5%的人血清明顯發(fā)生M-CSF結(jié) 合。然而，與重組c-foisFc融合蛋白相比，發(fā)現(xiàn)人血清中的可溶性受體的結(jié)合 親和力較低(圖4)[由于配體誘導(dǎo)的二聚作用，認(rèn)為重組c-fmsFc融合蛋白的結(jié) 合親和力接近天然膜結(jié)合c-fms的結(jié)合親和力]?？扇苄允荏w這種低親和力的一 種解釋是，其配體只含有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，而重組c-fmsFc融合蛋白有兩個(gè)親和 作用結(jié)合位點(diǎn)。
III.血清樣品中人M-CSF受體的免疫沉淀反應(yīng)
A. 材料和方法
在15 ml Falcon管內(nèi)，向10 ml 20。/o人血清(西格瑪公司(Sigma)，目錄號(hào) 7023，預(yù)先冷凍)中加入500 ^鏈霉抗生物素蛋白珠(#20347，皮爾斯公司 (Pierce))， 4'C培育1小時(shí)，期間溫和振蕩。將樣品以400 rpm離心5分鐘并將 上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中。在上清液中加入IO ng抗-hMCSFR抗體(R&D，目 錄號(hào)BAF329)， 4-C培育l小時(shí)，期間溫和振蕩。加入500 pl鏈霉抗生物素蛋 白珠后，將樣品4。C振蕩培育過(guò)夜。將樣品以400卬m離心5分鐘并將上清液 轉(zhuǎn)移到新的試管中，同時(shí)保存上清液。將珠轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中并用lml的 洗滌緩沖液1(0.5 M LiCL2)、 2 (0.5 M LiCL2/0.5% Triton)和3(10 mM TRIS pH 7.4)各自洗滌1次。最后一次離心后，除去大部分洗滌緩沖液(直到珠幾乎干燥)。 然后將珠重懸于500 ^1 PBS。先加入含DTT的5xSDS樣品緩沖液，并將樣品 于IO(TC煮沸2分鐘，再跑凝膠(10% Novex)。
為使免疫沉淀的人M-CSF受體去糖基化，用200 pl PBS以1:1的比例稀 釋上述免疫沉淀過(guò)程中的冷凍珠(約200 pl)。將稀釋樣品在lx變性緩沖液(PNG 酶F， NEB目錄號(hào)P0705S)于IO(TC培育10分鐘。加入G7反應(yīng)緩沖液(PNG 酶F， NEB目錄號(hào)P0705S)至lx終濃度并加入NP40(終濃度為1%)后，將樣品 與5 [il PNG酶F —起于37'C培育1小時(shí)。
B. 結(jié)果
發(fā)現(xiàn)可溶性人M-CSF受體是分子量約為97KD的糖基化蛋白質(zhì)(圖5)。去 糖基化后，可溶性人M-CSF受體的分子量約為60 KD (圖6)。
發(fā)現(xiàn)可溶性人M-CSF受體與人c-fms蛋白(人M-CSF的膜結(jié)合受體)的蛋 白質(zhì)序列至少部分相同。如上圖所示，可溶性人M-CSF受體可被多種抗體識(shí)
別，而這些抗體還識(shí)別人c-fins蛋白。為進(jìn)一步證實(shí)可溶性人M-CSF受體的蛋 白質(zhì)序列，如下進(jìn)行蛋白質(zhì)分析在SDS-PAGE凝膠上鑒別對(duì)應(yīng)于去糖基化后 的可溶性受體的蛋白質(zhì)條帶(圖7中的條帶4)。用胰蛋白酶消化該條帶中的蛋 白質(zhì)。分析這種消化的產(chǎn)物，即肽混合物。發(fā)現(xiàn)一種肽具有與人c-fms蛋白胞 外結(jié)構(gòu)域區(qū)段完全相同的分子量和氨基酸序列(SEQIDNO: 1)(圖8)。該證據(jù) 表明，可溶性人M-CSF受體與人c-fms蛋白(人M-CSF的膜結(jié)合受體)的蛋白 質(zhì)序列相同。
實(shí)施例2
該實(shí)施例顯示，在人尿樣品中發(fā)現(xiàn)可溶性M-CSF受體。該實(shí)施例還顯示， 這種受體存在于正常對(duì)象和乳腺癌患者的血清中，且可溶性M-CSF受體的水 平與M-CSF水平相關(guān)。最后，該實(shí)施例顯示，還在靈長(zhǎng)類中發(fā)現(xiàn)了可溶性 M-CSF受體。
I. 在尿樣品中也發(fā)現(xiàn)了可溶性人M-CSF受體
采用與實(shí)施例1所述相同的ELISA裝置，從健康的人類志愿者收集多份 尿樣品，測(cè)定是否存在可溶性人M-CSF受體。檢測(cè)到成年女性(25-66歲)、成 年男性(35-70歲)和3-9歲兒童的可溶性人M-CSF受體水平不同。以重組c-fms-人Fc融合蛋白作為參比來(lái)量化可溶性人M-CSF受體的濃度(圖9)。
在一名女性對(duì)象的整個(gè)月經(jīng)周期內(nèi)每天收集尿樣品。收集早上的首次排尿 的樣品，2(TC冷藏。在同一日期檢測(cè)所有樣品。如本文所述檢測(cè)可溶性受體。 如圖10所示，尿樣品的可溶性受體水平在月經(jīng)期間上下波動(dòng)。這一發(fā)現(xiàn)使得 可溶性受體成為月經(jīng)周期或用于妊娠檢測(cè)的潛在診斷標(biāo)記物。
II. 乳腺癌患者中可溶性M-CSF受體水平與M-CSF水平的相關(guān)性 如下分析乳腺癌血清樣品中可溶性人M-CSF受體的濃度。如上所述用
ELISA檢測(cè)人血清樣品連續(xù)稀釋液中是否存在可溶性人M-CSF受體。當(dāng)用這 種ELISA模式測(cè)試人血清時(shí)檢測(cè)到強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)(稱為"正常")。作為對(duì)照，除去 捕獲抗體或檢測(cè)抗體能消除該信號(hào)，表明該信號(hào)是這些抗-人c-fms抗體特異性 的。用重組c-fms-人Fc融合蛋白作為參比，可溶性人M-CSF受體的濃度被量 化為0.5 ug/ml。
如圖11所示，患者之間可溶性受體的水平不同。注意，患者樣品中可溶 性受體的濃度遠(yuǎn)低于上述濃度(圖2)，這可能是由于制備和儲(chǔ)存血清樣品時(shí)采
用的方法不同。因此，只有在采用相同方法收集和處理的樣品中比較M-CSF 和M-CSF可溶性受體濃度才有效。圖12顯示乳腺癌患者的M-CSF水平與同 一樣品中M-CSF可溶性受體的濃度線性相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)使得M-CSF可溶性受 體成為癌癥進(jìn)程的潛在生物標(biāo)記物。此外，當(dāng)難以直接測(cè)量M-CSF時(shí)(例如， 當(dāng)用M-CSF中和抗體治療癌癥時(shí))，M-CSF可溶性受體是更有用的生物標(biāo)記物。 III.在其他靈長(zhǎng)類中也發(fā)現(xiàn)了可溶性M-CSF受體
上述對(duì)人M-CSF可溶性受體進(jìn)行的ELISA試驗(yàn)也可用來(lái)檢測(cè)其他動(dòng)物種 類的血清樣品(圖13)。短尾猴和恒河猴的血清樣品顯示出強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)，表明存 在可溶性受體。未得到短尾猴和恒河猴的膜結(jié)合M-CSF受體的蛋白質(zhì)序列。 然而，據(jù)信它們與它們的人對(duì)應(yīng)物的蛋白質(zhì)同源性水平高。因此，用于該ELISA 試驗(yàn)的抗體能識(shí)別人膜結(jié)合M-CSF受體的胞外結(jié)構(gòu)域，也能識(shí)別南美獼猴和 恒河猴的。
注意，非靈長(zhǎng)類動(dòng)物血清缺乏陽(yáng)性信號(hào)不表明缺乏M-CSF可溶性受體。 相反，這更可能是由于用來(lái)檢測(cè)可溶性受體存在性的ELISA試驗(yàn)的抗體特異 性。
實(shí)施例3
該實(shí)施例顯示，可溶性人M-CSF受體的表達(dá)與破骨細(xì)胞的分化緊密關(guān)聯(lián)。 該實(shí)施例還顯示，僅分化的破骨細(xì)胞表達(dá)可溶性人M-CSF受體，其水平隨 M-CSF的除去而升高。
A.材料和方法
在體外系統(tǒng)中利用人破骨細(xì)胞研究了 M-CSF可溶性受體的表達(dá)，在該細(xì) 胞中發(fā)現(xiàn)了膜結(jié)合M-CSF受體的表達(dá)。具體地說(shuō)，在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中檢 測(cè)到了可溶性受體的表達(dá)。將原代人破骨細(xì)胞前體(凱布萊克斯生物科技有限 公司(Cambrex Bio Science Walkersville， Inc.),目錄號(hào)2T-110)以10,000細(xì)胞/ 孔和0.2 ml/孔接種于含有30 ng/ml人M-CSF和100 ng/ml RANKL的細(xì)胞培養(yǎng) 基。在細(xì)胞接種的同一天向各孔中加入1 [ig/mL檢測(cè)抗體。在37"C、 5%C02
潮濕空氣中培育細(xì)胞。在第7天通過(guò)相差顯微術(shù)鑒定到破骨細(xì)胞為異常大的多 核細(xì)胞。培養(yǎng)可再繼續(xù)一周，需要補(bǔ)料，期間破骨細(xì)胞的大小將繼續(xù)增加。培 養(yǎng)結(jié)束時(shí)用耐酒石酸的酸性磷酸酶染色細(xì)胞，正染色表明存在破骨細(xì)胞。在光 學(xué)顯微鏡下計(jì)算各孔中破骨細(xì)胞的數(shù)目，在圖中顯示為顯微鏡視野中的破骨細(xì) 胞平均數(shù)。
用SBA科技公司(SBA-Sciences)的BoneTRAP檢測(cè)試劑盒(BoneTRAP Assay kit)(TR201)檢測(cè)破骨細(xì)胞條件培養(yǎng)基中的TRAP活性。BoneTRAP⑧試驗(yàn) (TR201)是一種用于快速而特異地測(cè)定人血清樣品的骨再吸收率的固相免疫固 定酶活性試驗(yàn)?？捎糜谌似乒羌?xì)胞培養(yǎng)物。
B.結(jié)果
如圖14所示，破骨細(xì)胞表達(dá)M-CSF可溶性受體。測(cè)定分化破骨細(xì)胞的條 件培養(yǎng)基中可溶性受體的濃度?？扇苄允荏w的表達(dá)是破骨細(xì)胞特有的。用 M-CSF中和抗體(該例中為Chir-RXl)抑制破骨細(xì)胞分化導(dǎo)致可溶性受體被抑 制。
只有分化的破骨細(xì)胞表達(dá)可溶性受體，破骨細(xì)胞前體不表達(dá)。如圖15a所 示的時(shí)程實(shí)驗(yàn)所示，可溶性受體的表達(dá)在破骨細(xì)胞分化試驗(yàn)的第10天開始， 并在第12天達(dá)到穩(wěn)定。根據(jù)TRAP活性并如圖15b所示，這種表達(dá)模式與破 骨細(xì)胞的分化及其一致。
有趣的是，除去分化的破骨細(xì)胞中的M-CSF可上調(diào)M-CSF可溶性受體的 表達(dá)。圖16顯示了加入IgGl對(duì)照抗體或M-CSF中和抗體Chir-RXl之后24 小時(shí)內(nèi)M-CSF可溶性受體的表達(dá)。數(shù)據(jù)明確顯示，當(dāng)M-CSF活性被中和時(shí)可 溶性受體的表達(dá)升高。表達(dá)的升高開始于第8天并在第12天達(dá)到最高水平， 這表明在分化的破骨細(xì)胞中表達(dá)升高。
破骨細(xì)胞活性抑制劑Zometa對(duì)分化的破骨細(xì)胞中M-CSF可溶性受體的表 達(dá)沒(méi)有影響(圖17)。在相同的實(shí)驗(yàn)中，M-CSF中和抗體而非IgGl對(duì)照能刺激 表達(dá)。
該說(shuō)明書中提及的和/或申請(qǐng)數(shù)據(jù)表中列出的上述所有美國(guó)專利、美國(guó)專利 申請(qǐng)出版物、美國(guó)專利申請(qǐng)、外國(guó)專利、外國(guó)專利申請(qǐng)以及非專利出版物通過(guò) 引用全文納入本文。
通過(guò)以上描述可知，盡管出于舉例的目的已經(jīng)在文中描述了本發(fā)明的具體 實(shí)施方式，但可做出各種修飾而不背離本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1. 一種診斷癌癥的方法，所述方法包括以下步驟(a)分析患者流體樣品中可溶性M-CSF受體的水平，其中，高于某閾值的可溶性M-CSF受體的水平與存在癌癥相關(guān)，而低于所述閾值的水平表明該患者不太可能患有癌癥。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述流體樣品選自尿、血漿或 血清。
3. —種測(cè)定癌癥患者的預(yù)后的方法，所述方法包括以下步驟(a)分析患者流體樣品中可溶性M-CSF受體的水平，其中，高于某閾值的 可溶性M-CSF受體的水平表明該患者可能具有不良預(yù)后，而低于所述閾值的 水平表明該患者可能具有良好預(yù)后。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述流體樣品選自尿、血漿或 血清。
5. —種監(jiān)測(cè)癌癥患者的癌癥療法的方法，所述方法包括以下步驟(a) 先分析患者流體樣品中可溶性M-CSF受體的水平，再開始用某癌癥療 法進(jìn)行治療；和(b) 開始用該癌癥療法治療之后分析所述流體樣品，其中，開始用該癌癥療法治療之后可溶性M-CSF受體的水平降低表明該 患者正在接受治療有效劑量的癌癥療法。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述流體樣品選自尿、血漿或 血清。
7. 如權(quán)利要求l、 3或5所述的方法，其特征在于，所述癌癥選自下組 乳腺癌、肺癌、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、甲狀腺癌、前列腺癌、腺癌、包括白血 病和淋巴瘤在內(nèi)的血細(xì)胞惡性腫瘤；頭頸癌；胃腸癌，包括食管癌、胃癌、結(jié) 腸癌、腸癌、結(jié)腸直腸癌、直腸癌、胰腺癌、肝癌、膽管或膽囊的癌癥；雌性 生殖道的惡性腫瘤，包括卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、陰道癌和宮頸癌；膀胱癌；腦 癌，包括成神經(jīng)細(xì)胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；以及皮膚癌，包括惡性黑色素瘤或鱗 狀上皮細(xì)胞癌。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述癌癥是乳腺癌。
9. 一種監(jiān)測(cè)雌性月經(jīng)周期的方法，該方法包括以下步驟(a)分析雌性患者流體樣品中可溶性M-CSF受體的水平，其中，高于某閾 值的可溶性M-CSF受體的水平表明該患者可能受孕，而低于所述閾值的水平 表明該患者可能不會(huì)受孕。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述流體樣品選自尿、血漿 或血清。
11. 一種試劑盒，其中裝有(a) 特異性結(jié)合shM-CSFR的第一抗體；和(b) M-CSFR含量已知的M-CSFR標(biāo)準(zhǔn)品。
12. 如權(quán)利要求ll所述的試劑盒，其特征在于，所述第一抗體連接于可檢 測(cè)標(biāo)記。
13. 如權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)記是酶。
14. 如權(quán)利要求13所述的試劑盒，所述試劑盒還裝有釋放可檢測(cè)信號(hào)的所 述酶的底物。
15. 如權(quán)利要求11所述的試劑盒，所述試劑盒還裝有結(jié)合shM-CSFR的第 二抗體。
16. 如權(quán)利要求11所述的試劑盒，所述試劑盒還裝有結(jié)合所述第一抗體的 第二抗體。
17. 如權(quán)利要求11所述的試劑盒，所述試劑盒還裝有結(jié)合shM-CSFR的第 二抗體。
全文摘要
提供了可溶性人M-CSF受體，以及含有該受體的藥物組合物，含有該藥物組合物的試劑盒，以及診斷和治療M-CSF相關(guān)疾病和病癥，如溶骨性疾病患者的骨流失的方法。
文檔編號(hào)G01N33/574GK101379400SQ200680051912
公開日2009年3月4日 申請(qǐng)日期2006年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月22日
發(fā)明者C·劉, J·庫(kù)尼奇, M·卡瓦諾, M·多特—萊因哈德 申請(qǐng)人:諾華有限公司;愛(ài)克索馬技術(shù)有限公司