專利名稱：：檢測傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性的腫瘤質(zhì)譜試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新的傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性腫瘤生物樣品中蛋白質(zhì)分析方法的試劑盒。一種通過能與蛋白質(zhì)結(jié)合的基質(zhì)去捕獲生物標志，并用有定量控制的質(zhì)譜分析來檢測傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性腫瘤的生物標志。在此提及的此項發(fā)明涉及蛋白質(zhì)檢測領(lǐng)域，為一種新的非侵入性的體外質(zhì)譜檢測方法。本發(fā)明可以應(yīng)用到己經(jīng)脫離人體的體液中的傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性腫瘤的生物標志組合的檢測方法或試劑盒。本發(fā)明可用于監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、預(yù)后評估、分子分型及個體化診療的試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是一種嚴重威脅人民生命健康的疾病。2005年統(tǒng)計顯示惡性腫瘤己成為城市居民死亡的第一原因。近年來，隨著我國城鄉(xiāng)居民生活水平的提高，部分惡性腫瘤發(fā)病率有上升趨勢。據(jù)有關(guān)部門統(tǒng)計惡性腫瘤死亡率每年遞增1.8%，發(fā)病率每年遞增2.5%。我國惡性腫瘤排名演變?yōu)榉伟?女性為乳腺癌)，肝癌，胃癌，食管癌，結(jié)直腸癌或前列腺癌。雖然近年來對惡性腫瘤的治療取得巨大進展，但仍有相當數(shù)量的惡性腫瘤患者死于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，因此建立一種惡性腫瘤預(yù)后評估體系顯得尤為重要。它將有助于監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，指導(dǎo)臨床治療以及評估療效，以達到降低病死率，提高腫瘤患者生活質(zhì)量的目的。目前臨床上對惡性腫瘤患者預(yù)后評估主要依賴于臨床表現(xiàn)，病理學依據(jù)及傳統(tǒng)血清腫瘤標記物(tumormarker)測定，但腫瘤早期復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時常并無明顯臨床表現(xiàn)，而病理學證據(jù)有時候很難得到且重復(fù)性差。傳統(tǒng)血清腫瘤標記物因其相對敏感性及特異性和較好的可重復(fù)性在惡性腫瘤預(yù)后評估中有重要價值，如原發(fā)性肝癌甲胎蛋白(AFP)的檢測及胃癌、結(jié)直腸癌中癌胚抗原(CEA)的檢測等。但臨床工作中也發(fā)現(xiàn)有相當比例的惡性腫瘤患者上述腫瘤標記物表達陰性，如甲胎蛋白(AFP)在肝癌中的檢出率(陽性表達率)僅為4060%，癌胚抗原(CEA)在結(jié)直腸癌中的檢出率(陽性表達率)為6070%，CYFR21-1在肺癌的檢出率(陽性表達率)為4050%，而對于傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性的惡性腫瘤患者的預(yù)后評估則缺乏有效的早期監(jiān)測手段。蛋白質(zhì)組學作為21世紀現(xiàn)代科技前沿在生物醫(yī)學方面的應(yīng)用越來越廣泛。蛋白質(zhì)組學應(yīng)用于生物醫(yī)學方面的優(yōu)點在于可以高通量的方式篩選和鑒定和疾病相關(guān)的生物標記分子，即可通過尋找差異表達蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)及用于尋找與某些疾病診斷相關(guān)的特異性標志物等。以往蛋白質(zhì)研究多采用色譜分離純化、雙相電泳、光譜定量或定性等分析化學的方法，這些方法所需技術(shù)條件高，步驟繁瑣，耗時，不適于大規(guī)模篩查和臨床檢測。采用蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究腫瘤早期監(jiān)測、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白是當前國內(nèi)外腫瘤學研究的熱點。樣本的選取和所采用的檢測技術(shù)是研究的關(guān)鍵。血液，由于易采集性和對機體的生理狀況的易記錄性，成為研究生物標記物的最好的來源之一。蛋白指紋圖譜(質(zhì)譜)技術(shù)(MALDI-T0F-MS、SELDI-TOF-MS)是近幾年發(fā)展起來的實驗室診斷新技術(shù)，它且具有操作較簡便、多樣本檢測、檢測快速、靈敏性和特異性高等優(yōu)點，是實驗室診斷技術(shù)革命性的進展。蛋白指紋圖譜技術(shù)(proteinfingerprintingtechnology,PFT)在醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用，主要用于多種疾病，特別是腫瘤的早期檢測。蛋白指紋圖譜技術(shù)是一項發(fā)展前景非常好的檢測技術(shù)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。使用蛋白指紋圖譜技術(shù)己經(jīng)成為研究比較蛋白質(zhì)組學和發(fā)現(xiàn)生物標記物可選用的方法，尤其在多肽及低分子量蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的研究中非常有用。但是，將此技術(shù)應(yīng)用于惡性腫瘤預(yù)后評估、分子分型和個體化診療(轉(zhuǎn)歸、藥物及放射敏感性、分期)，尤其是傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性的患者預(yù)后評估及分子分型則尚未見相似報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是建立一種在傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性腫瘤的生物樣品中檢測的方法。該方法為傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性腫瘤的早期檢測提供了新的途徑，并為進一步發(fā)現(xiàn)新的傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性腫瘤的生物標志提供了基礎(chǔ)及將此技術(shù)應(yīng)用于惡性腫瘤預(yù)后評估、分子分型和個體化診療(轉(zhuǎn)歸、藥物及放射敏感性、分期)的方法。本發(fā)明采用質(zhì)譜技術(shù)對臨床上常見且發(fā)病率較高的惡性腫瘤如肝癌，結(jié)直腸癌，乳腺癌，胃癌患者等進行預(yù)后評估。選取傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性患者(肝癌—AFP陰性，胃癌一CEA陰性，結(jié)直腸癌一CEA陰性,乳腺癌一CA153陰性)進行動態(tài)血清蛋白質(zhì)指紋測定及隨訪，并評估相關(guān)蛋白質(zhì)指紋變化與手術(shù)前后以及腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并與傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陽性患者血清蛋白質(zhì)進行對比分析，篩選用于傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性的患者預(yù)后評估的血清蛋白指紋圖譜并評估其應(yīng)用價值，以建立一種新型快速、早期、簡便、準確的惡性腫瘤預(yù)后評估體系。為早期發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，監(jiān)測腫瘤治療效果，減少腫瘤病死率，相關(guān)試劑的開發(fā)及藥物的研制提供理論依據(jù)、新的研究手段與途徑。生物標志(biomarker)的研究分為三個階段發(fā)現(xiàn)生物標志、鑒定生物標志、驗證生物標志。選取經(jīng)病理確診且接受擇期手術(shù)的惡性腫瘤患者，其中正常對照組300名，甲胎蛋白表達陰性原發(fā)性肝癌患者30名，陽性患者30名，CEA表達陰性胃癌及結(jié)直腸癌患者各30名，陽性患者各30名，CA153表達陰性乳腺癌患者30名，陽性患者30名；CYFR21-1表達陰性肺癌患者30名，陽性患者30名；食管癌患者30名。并于術(shù)前排除影響血清蛋白質(zhì)含量的相關(guān)性疾病史。對照組與患病組年齡、性別匹配，患者未經(jīng)放化療，病歷資料齊全，病理診斷明確。收集患者的一般體檢資料、病史、主要臨床癥狀及各種檢查結(jié)果填表并進行隨訪(為期兩年)，記錄患者發(fā)現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移情況。收集其不同發(fā)病時間段的血清標本(術(shù)前，術(shù)后兩周，三個月，半年，一年，兩年)取患者術(shù)前血或健康志愿者外周血。采集后立即于4。C冰箱靜置2小時，4"4000r/min離心10分鐘分離血清，將血清于4。C12000r/min再次離心5分鐘，去除所有殘留細胞碎片和不溶物，在冰上將血清分裝為100u1/管，共5管，保存于-80'C冰箱。避免反復(fù)凍融。建立用質(zhì)譜技術(shù)比較分析傳統(tǒng)腫瘤標記物陰性的惡性腫瘤患者血清蛋白指紋圖譜的方法，并對實驗方法和條件進行完善，如質(zhì)控血清設(shè)定、參數(shù)的設(shè)定、緩沖體系的選擇、基質(zhì)的選擇及處理、基質(zhì)的檢測與數(shù)據(jù)處理方法等。對所建立的蛋白指紋圖譜分析方法進行系統(tǒng)評價，分析方法的特異性、靈敏度、準確度及重復(fù)性。用質(zhì)譜技術(shù)對不同時間點的傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性的惡性腫瘤患者和陽性患者血清蛋白質(zhì)進行對比分析，篩選可用于傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性的惡性腫瘤患者預(yù)后評估的血清蛋白指紋圖譜。篩選與確定可用于的傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性的惡性腫瘤患者預(yù)后評估的新的特異性生物標志，并分析其生化特性(分子量、pl)及臨床應(yīng)用價值，并初步建立預(yù)后評估體系及療效監(jiān)測體系。本發(fā)明涉及一種通過生物標志結(jié)合的基質(zhì)表面，并用定量性質(zhì)譜分析來同時檢測多種生物標志狀態(tài)。本發(fā)明中的生物標志是利用一臺質(zhì)譜儀來發(fā)現(xiàn)的。該設(shè)備的質(zhì)量精確度約為+/-0.1%?；|(zhì)是任何能與生物標志選擇性或特異性結(jié)合的物質(zhì)。舉例說明，WCX陰離子作用、C8/C18疏水作用、抗體(組)基質(zhì)吸附劑，分離生物化學中的這些方法和由這些方法產(chǎn)生的吸附劑具有診斷反面的用途(即陰離子吸附劑捕獲陽離子蛋白質(zhì))。底基洗去未吸附的物質(zhì)。任何適宜的洗液均可使用。生物標志首先能夠被具有能與生物標志物結(jié)合基質(zhì)吸附表面捕獲，非吸附物能從基質(zhì)上洗脫，吸附到底基的生物標志物在質(zhì)譜儀中被檢測。生物標志通過離子發(fā)生源，如激光，被離子化，產(chǎn)生的離子被一個離子感受集合器收集，然后質(zhì)量分析器分析那些通過的離子。之后，檢測器將檢測的離子信息轉(zhuǎn)換為質(zhì)荷比。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控-每次測試前，用質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清，將標準化質(zhì)控血清中用于定量的標準峰6634.0Da強度調(diào)至50%質(zhì)譜信號強度的最大值。生物標志的檢測明顯地將與信號強度的檢測有關(guān)。這樣，生物標志的數(shù)量與質(zhì)量都可以被檢測出來。飛行質(zhì)譜對待分析物的分析生成飛行時間譜。該飛行時間譜的最終分析并不表示離子化能量攻擊一個樣本產(chǎn)生的單獨的脈沖信號，而是一系列脈沖的信號之和。這樣降低了干擾，并增加了動態(tài)范圍。該飛行時間數(shù)據(jù)受數(shù)據(jù)處理軟件的影響。軟件中數(shù)據(jù)處理主要包括轉(zhuǎn)換飛行時間與質(zhì)荷比而產(chǎn)生質(zhì)譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而減輕高頻噪音。通過對生物標志的吸附和檢測而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可利用計算機的數(shù)據(jù)分析程序進行分析。該計算機程序分析這些數(shù)據(jù)以顯示檢測出的生物標志的數(shù)量，并顯示信號的強度和確定被檢測的每個生物標志的分子量。數(shù)據(jù)分析還能包括一系列的確定生物標志的信號強度和矯正數(shù)據(jù)對預(yù)定統(tǒng)計分布狀態(tài)的偏離。例如，通過計算與某些參數(shù)相關(guān)的每個峰值的高度，可規(guī)范觀測到的峰。該參數(shù)可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學成分產(chǎn)生的不重要的干擾，這可以設(shè)置調(diào)零。計算機可以將計算結(jié)果數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成各種形式來表現(xiàn)。其標準譜可以表示，但在一種形式中只有峰高和質(zhì)量信息可以在譜帶中保留，產(chǎn)生一個較清晰的圖，并使具有幾乎相同分子量的生物標志物更易顯現(xiàn)。在另一種形式中，兩個或更多的譜比較，便于突顯獨特的生物標志物和那些高于或低于校準樣本的生物標志物。分析一般包括展示從待分析物得到的信號的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過視圖進行選擇，軟件是可用的，它可自動檢測峰。一般情況下，該軟件通過鑒定信號具有信噪比高于一個選擇閾值并標記出在峰信號的質(zhì)心處的峰的質(zhì)量這樣的方式操作。在一個有效的程序中，比較許多譜線以認定出現(xiàn)在質(zhì)譜中某一選定范圍內(nèi)同樣的一些峰。該軟件的一個版本聚集所有出現(xiàn)在確定的質(zhì)量范圍內(nèi)的各條光譜的峰，對所有在質(zhì)量(質(zhì)荷比)中值附近的峰指定一個質(zhì)量(質(zhì)荷比)簇。發(fā)明中使用的生物標志是基質(zhì)所捕獲。這些生物標記是進一步通過質(zhì)譜(massspectrometry)測定其不同分子量來知道它們特定的身份。對生物標志的檢測需要將一個樣本放在磁珠、高效液相層析柱子、或毛細管電泳柱子上等基質(zhì)的一個吸附點上，接著進行清洗。電噴霧電離質(zhì)譜(electrosprayionizsationmassspectrometry,ESI-MS)是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相?；|(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,MALDI-T0F-MS)的基本原理是向吸附點上加入SINAPINIC酸分子等并讓其干燥，將分析物分散在SINAPINIC酸分子中并形成晶體，當用激光照射晶體時，由于SINAPINIC酸分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使SINAPINIC酸分子晶體升華，致使連同分析物一起進入氣相。而后，用質(zhì)譜測定法進行分析，而一個顯示了蛋白質(zhì)分子的遺留物圖將生成，這張圖是在蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量-電荷比的基礎(chǔ)上，以彼此分開的峰圖的形式顯示出來的。特異性是指某一物質(zhì)或某種疾病的專一屬性，它是代表某種物質(zhì)或某種疾病的特征。通過某些特征可以識別某種物質(zhì)或某種疾病，從而把它和其他物質(zhì)或疾病區(qū)分開來。對專有特征的識別往往依賴于特殊的檢測方法，例如要了解某種疾病是否存在有特異性抗原就要用有關(guān)特異性抗體來檢測。自蛋白質(zhì)組學研究有新發(fā)展以來，這種傳統(tǒng)意義上特異性檢測和界定方法有了很大的突破。如一個蛋白質(zhì)不同片段變異是不同類型腫瘤的標志。本發(fā)明利用WCX陰離子基質(zhì)、利用C8/C18疏水基質(zhì)磁珠、高效液相層析柱子、或毛細管電泳柱子上的抗體(組)、磁珠上的抗體(組)為例對正常人與傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性腫瘤的血清(漿)進行蛋白質(zhì)對比分析。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清(漿)，將標準化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標準峰6634.0Da強度調(diào)至50%質(zhì)譜信號強度的最大值。檢測傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性的腫瘤質(zhì)譜試劑盒和方法的具體操作步驟以下是用本發(fā)明提供的一個操作方案及檢測傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性的腫瘤質(zhì)譜試劑盒實例。1.樣品處理及標準化質(zhì)控血清(漿)制備將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中，視需要離心澄清樣品。質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清(漿)制備定義符合如下標準供血者10人，5男5女，血型為0型；年齡為18-30歲；民族漢。生化指標正常，包括總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功能檢查、腎功能檢査；無遺傳病家族史；無重大傳染病史。女性不能懷孕，男性為不吸煙者。2.基質(zhì)與腫瘤、標準化質(zhì)控血清(漿)制備、樣品上樣抽取0型血的健康受試者(男女各半)的新鮮血液(a)4X:下待血液凝固后馬上離心，4'C離心5min分離血清。(b)4。C下馬上離心，4。C離心5min分離血漿。標準化質(zhì)控或腫瘤血清(漿)樣品分裝10(^1—小管，于一8(TC儲存；或取混合血清(漿)l:2稀釋于U9緩沖液(9MUrea，2%CHAPS，50mMTris-HCL，pH7.0)—小管，25。C儲存。即成為腫瘤、標準化質(zhì)控血清(漿)試劑盒。將質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清及樣品點樣在有支持物的基質(zhì)[WCX陰離子基質(zhì)、C8/C18疏水基質(zhì)或抗體(組)基質(zhì)]中的一個位點上。支持物用磁珠、高效液相層析柱子、或毛細管電泳柱子等?；|(zhì)是用于標記、結(jié)合血清(漿)的。標記至高效液相層析柱子或毛細管電泳柱子上的基質(zhì)可用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)的標準方法去分析。將質(zhì)譜的標準化質(zhì)控O血清(漿)用于質(zhì)譜儀試劑盒的定量方法。3.洗漆用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。以下步驟用0.05%1%三氟乙酸徹底洗滌整個陣列點，將生物標志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3薩圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5nL吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸制備的飽和標準溶液)。吸能分子可用Sinapinicacid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamicacid等。3.質(zhì)譜的定量控制及測試用激光解吸/離子化飛行時間質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離已洗脫的生物標志后用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)標準方法去分析滯留于各位點的生物標志或蛋白質(zhì)。用計算機分析數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)重疊展示。定量性質(zhì)譜調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清(漿)，將標準化質(zhì)控血清中用于定量的標準峰6634.0Da等強度調(diào)至5(^信號強度的最大值。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清(漿)，將標準化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標準峰6634.0Da強度調(diào)至50%質(zhì)譜信號強度的最大值。用2746土1Da、5909土1Da、6634土1Da標準峰為質(zhì)譜定性(分子量)質(zhì)控標準。本發(fā)明將蛋白質(zhì)分成了幾大類，即WCX陰離子、C8/C18疏水作用等蛋白。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進行分析及定量。利用C8及C18疏水基質(zhì)的實驗結(jié)果與WCX陰離子基質(zhì)的實驗結(jié)果，通過用Mann-Whitney〃檢驗比較配對樣本的蛋白峰，計算p值。分析幾百種血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述蛋白指紋或質(zhì)譜多肽圖譜可以用于區(qū)分正常與傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性的腫瘤。峰值CV〉3(W或者p〈0.01為有顯著性差異(圖l):正常與腫瘤蛋白指紋或質(zhì)譜多肽圖譜的顯著性差異1008.92019.4l腿,,01087.133273.19499.11266.31101.23398.211682..71573.21285.41296.514691.,21212.82740.211731.,13981.12548.92289.68938.31302.22859.412946,.05345.23322.85269.58687.11392.23224.513761,,4153365912.76706.33935.31414.43272.615867.,01042.92267.712862..44469.21436.83515.421253.,22043.55976.31536.811490..31465.53806.028078..62092.713756.44356.211700..71481.94020.334236.,66566.31338.49714.45080.31503.74417.823511.,57573.110269.36016.85318.21594.45089.55543.29298.31079.216844.913130..81616.25501.97595.11070.53249.136951..738999..41683.36432.33254.51104.24160.36441.439324.,61705.46532.35531.91114.43225.214151..545265,,81750.17722.05549.23893.35643.214042.,845371.,01772.28707.95932.21061.56660.67944.551243..41793.58826.96094.21840.53165.621955,.26562.31817.48938.56133.24656.25820.25957.27752.01885.39192.27776.25892.13964.18159.58968.51906.29269.015122.,26119.24764.921808,.23692.1用篩選出幾個特征蛋白峰1465.50、2740.27、2859.42、3224.55、3272.64、3515.49、3806.09、4020.35、4417.83、5089.50、5501.98、6432.36、7722.01、8707.91、8826.91、8938.50、9192.21、9269.05、11091.08、11682.70、11731.17、12946.08、13761.41、15867.08、21253.29、23511.56、28078.62、34236.68、38999.48、39324.68、45265.82、45371.05、51243.46土30Da，雙盲測試300例正常與180例傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性的腫瘤，試劑盒的敏感性100%，特異性90%。將生物標志群用胰蛋白酶消化，其消化片段(digestionfragments),又稱多肽指紋，的分子量可被用來在數(shù)據(jù)庫中搜索序列，這些序列與胰蛋白酶消化生成的消化片斷的分子量相吻合。最后，用多級質(zhì)譜(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白質(zhì)梯狀排序法(proteinladdersequencing)對胰蛋白酶消化片斷進行排序。蛋白質(zhì)生物標記可用蛋白質(zhì)梯狀排序法(proteinladdersequencing)進行排序。通過將分子碎成碎片并將碎片用酶解作用或其他可按順序從碎片末端除去一個單個氨基酸分子的方法進行處理后，可生成蛋白質(zhì)梯度(proteinladders)。然后，用質(zhì)譜對此梯度進行分析。階梯狀碎片(ladderfragments)在質(zhì)量上的差異可鑒別出從分子末端被除去的氨基酸。鑒別出傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性腫瘤的生物標志群-分子量Pi鑒別出生物標志群1,465.503.92TruncatedFibrinop印tideA2,740.2710.86TruncatedAlpha-2-HS-GlycoproteinChainB2，859.4210.86TruncatedAlpha-2-HS-GlycoproteinChainB3,224.5510.86TruncatedAlpha-2-HS-Glyc叩roteinChainB3,272.646.67TruncatedInter—AlphaInhibitorHeavyChain43,515.4910.86Alpha-2-HS-GlycoproteinChainB3，806.096.93TruncatedSerumAmyloidA2protein4,020.356.93TruncatedSerumAmyloidA2protein4,417.838.51TruncatedSerumAmyloidA2protein5,089.508.51TruncatedSerumAmyloidA2protein5,501.986.98TruncatedSerumAmyloidA2protein6,432.368.2TruncatedApolipoproteinC-I7,722.017.86TruncatedBeta-Thromboglobulin8,707.915.05TruncatedApolipoproteinA—II8,826.915.05ApolipoproteinA—II8,938.509.5C3-an鄰hylatoxinDes-Arg9，192.215.23.H即toglobin-lAlpha-lChain9,269.056.04TruncatedHaptoglobin—211,091.086.8TruncatedSerumAmyloidA2protein11,682.705.89SerumAmyloidAprotein11,731.176.07Beta-2-Microglobulin12，946.085.33TruncatedTransthyretin13,761.415.35Transthyretin15,867.066.81HemoglobinBetaChain21,253.295.66ApolipoproteinM28,078.625.27ApolipoproteinA-I34,236.685.52ApolipoproteinE23,511.564.93Alpha-l-AcidGlycoprotein38,999.485.95Alpha_l_MicroglobulinPrecursor45,265.825.32Alpha_l_Antichymotrypsin39,324.685.43Alpha-2-HS-GlycoproteinPrecursor51，243.465.22VitaminD—BindingProtein45,371.055.28ApolipoproteinA_IV將純化或合成的生物標志群免疫小鼠，制備傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性腫瘤的生物標志群抗體。用抗生物標志群抗體與質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用驗證被分析物。質(zhì)譜與抗體分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用艮卩為免疫組質(zhì)譜(I匪nomicmassspectrometry,IMS)。免疫組質(zhì)譜檢測(Immunomicmassspectrometryanalysis,IMSA)為一組多種(類)抗體與質(zhì)譜聯(lián)合來精確地鑒別變異或修飾生物標志群的方法。在一個抗體組基質(zhì)上同時捕獲多個生物標志，并對捕獲的變異的或修飾的生物標志進行質(zhì)譜精確分析。可以同時檢測多個生物標志群(biomarkers)?？贵w組基質(zhì)可放在高效液相層析柱子、或毛細管電泳柱子中。目前ELISA等技術(shù)主要依靠間接的化學或放射測定法，因而無法直接鑒定抗原的變異，而用免疫組質(zhì)譜技術(shù)能測定抗原變異片段的分子量。另外，還可以將多種疾病的特異性抗原的抗體同時標在一個基質(zhì)點上。即用質(zhì)譜同時可檢測多種疾病特異性抗原的分子量(如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒)，及進行窗口期檢査，而ELISA技術(shù)及免疫熒光技術(shù)無法做到。由于每種特異性抗體所捕獲生物抗原的分子量是不同的，故免疫組與質(zhì)譜聯(lián)合應(yīng)用時，質(zhì)譜儀就非常容易地將這四種抗原同時分開了。用三種以上抗體組標在磁珠上、高效液相層析柱子中、或毛細管電泳柱子中與質(zhì)譜聯(lián)合，可同時檢測出多種(三種以上)的生物標志及一種或一種以上變異的或修飾的生物標志。這樣產(chǎn)生了一種新型可用質(zhì)譜儀直接進行分析多種(三種以上)生物標志及一種或一種以上變異或修飾生物標志的方法。三色免疫熒光法可以同時分析三種生物標志，但無法達到三種以上的生物標志的分析或像免疫組質(zhì)譜檢測來精確地、高效地確定一種變異的或修飾的被分析物(抗原或生物標志)。這些生物標志組合可以用于同時鑒別正常人及不同種類疾病的檢測方法。本發(fā)明可以用于疾病的檢測的金標準。舉例講，如果用抗HIVgP120基質(zhì)去捕獲血清HIVgP120，質(zhì)譜圖顯示一個120kDa蛋白，我們可以檢測HIV;如果出現(xiàn)一個100kDa蛋白，則可能是HIVgP120降解產(chǎn)物；如果出現(xiàn)一個140kDa蛋白，則可能是非特異性蛋白。這時就可以用免疫組質(zhì)譜檢測來做氨基酸序列鑒定即最精確鑒別(金標準)。將腫瘤患者按照轉(zhuǎn)移情況分組，然后進行組間兩兩比較，各組間有顯著性差異的蛋白質(zhì)峰數(shù)量種類不盡相同，其中3692Da等蛋白指紋在臟器轉(zhuǎn)移組中顯著增高，可監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移(圖2)。對腫瘤患者在根治性根除后14天再次進行檢測，蛋白指紋3398Da等在根治性切除后，血清中的濃度顯著下降，基本接近于正常人，可用于監(jiān)測腫瘤預(yù)后評估、分子分型及個體化診療(圖3)。本發(fā)明可用于體外細胞和非侵入性的體外腫瘤質(zhì)譜檢測方法的定量控制，如離體體液的傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性腫瘤的試劑盒用于臨床質(zhì)譜的腫瘤檢測方法?？梢詸z測多個腫瘤生物標志群及質(zhì)譜多肽圖譜。本發(fā)明中的試劑盒及方法與其他非侵入性的體外檢測方法比較，具有以下的特點(1)準確質(zhì)譜直接分析有很強的精確性，一般誤差率只有O.1Da。因為蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，而氨基酸的平均質(zhì)量是已知的，如果知道了抗原或生物標志的總分子量，那么抗原的變異(指氨基酸變化)就很容易被推測出來。(2)方便本方法將蛋白質(zhì)分成了幾大類，即陰離子、疏水作用蛋白。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進行分析。磁珠支持基質(zhì)的方法所用吸附劑的支持物是磁性微?；虼胖椤Ｓ么判苑蛛x器分離磁珠及樣品，無需離心樣品。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進行分析。(3)快捷用本發(fā)明提供的免疫組質(zhì)譜檢測進行疾病診斷時，無需對蛋白質(zhì)進行測序?？贵w組基質(zhì)可放在高效液相層析柱子、或毛細管電泳柱子中。本發(fā)明采用了計算機"條碼格式"，信號強度沿著線性軸以暗度強度值顯示。此強度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動分析對比強弱，從而有助于臨床復(fù)雜的診斷，如可用此"免疫組質(zhì)譜蛋白指紋"或條碼格式進行醫(yī)學分析。說明書附1正常人與傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性的腫瘤蛋白指紋及質(zhì)譜多肽譜的一個表示圖圖2蛋白指紋3692Da在腫瘤臟器轉(zhuǎn)移組中顯著增高圖3蛋白指紋3398Da在腫瘤根治性切除后下降具體實施方式本發(fā)明將結(jié)合具體實施例作進一步說明，這些實例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實施例1正常與傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性的腫瘤生物標志發(fā)現(xiàn)及質(zhì)譜的試劑盒制備(1)實驗方法一、材料標本來源質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清(漿)制備定義符合如下標準，供血者男女各半，血型為0型；年齡為18-30歲；民族，漢。生化指標正常，包括總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功能檢查、腎功能檢查；無遺傳病家族史；無重大傳染病史。女性無懷孕，男性無吸煙史者。抽取10位0型血的健康受試者(男女各半)的新鮮血液，4。C下待血液凝固后馬上離心，10,000rpm，4。C離心5min;樣品的處理和儲存。取混合血清(漿)10pl，用20plU9緩沖液(9MUrea，2%CHAPS，50mMTris-HCL，pH7.0)稀釋，而后，將以上標本冰浴振蕩30min。將30[al上述變性后標本加入360(al相應(yīng)的結(jié)合緩沖液，待用。所有樣本均進行雙份檢測以減少實驗誤差。簡要操作步驟將20(^1結(jié)合緩沖液(50mMNaAC,pH4.04.5)加至已裝好WCX陰離子磁珠小管中，置振蕩器(MS1Minishaker)400-600rpm，震蕩5min，用磁性分離器分離磁珠及樣品。重復(fù)上述操作兩次。用0.05。/。淺三氟乙酸徹底洗滌整個WCX陰離子磁珠陣列點，將生物標志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然千燥金屬片，加0.5吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸制備的飽和標準溶液)。然后用質(zhì)譜分析閱讀。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清(漿)，將標準化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標準峰6634.0Da強度調(diào)至50%質(zhì)譜信號強度的最大值。數(shù)據(jù)收集在每次實驗數(shù)據(jù)收集前，用All-in-one蛋白校正儀器，使蛋白質(zhì)分子量誤差〈0.1%。數(shù)據(jù)分析用統(tǒng)計學方法，分析所得數(shù)據(jù)的形式是用計算機讀取的條碼格式或峰，蛋白指紋顯示為沿著線性軸的暗度強度值信號，此強度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動分析對比強弱。所有的圖譜都進行了標準化，統(tǒng)一到它們自己全部的離子總數(shù)(峰面積的總和)。將標準化質(zhì)控血清中用于定量的標準峰6634.0Da強度調(diào)至50%信號強度的最大值，并且用6634.0Da的峰進行了校正，而后又進行了"減少基線"，定義蛋白峰(s/n>5)。分析了所有70060000Da之間的蛋白峰，并且仔細檢査了每個相應(yīng)的峰，計算出峰的平均數(shù)，標準差(SD)和變異系數(shù)(CV%)。利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠的實驗結(jié)果與WCX陰離子基質(zhì)磁珠的實驗結(jié)果，通過分析幾百種血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述蛋白指紋可以用于區(qū)分正常與傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性的腫瘤。峰值CV〉30X或者p〈0.01為有顯著性差異(圖1、表1):表1正常與腫瘤蛋白指紋的顯著性差異(疏水基質(zhì)與WCX陰離子基質(zhì)總和)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實施例2試劑盒的雙盲測試用從實施例1中篩選出幾個特征蛋白峰1465.50、2740.27、2859.42、3224.55、3272.64、3515.49、3806.09、4020.35、4417.83、5089.50、5501.98、6432.36、7722.01、8707.91、8826.9K8938.50、9192.21、9269.05、11091.08、11682.70、11731.17、12946.08、13761.41、15867.08、21253.29、23511.56、28078.62、34236.68、38999.48、39324.68、45265.82、45371.05、51243.46土30Da，雙盲測試300例正常與180例傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性的腫瘤(表2)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>敏感性100%特異性90%結(jié)論用本方法的試劑盒可鑒別正常人與傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性的腫瘤，敏感性100%，特異性90%。實施例3腫瘤生物標志群的排序鑒定將生物標志群用胰蛋白酶消化，其消化片段(digestionfragments),又稱多肽指紋，的分子量可被用來在數(shù)據(jù)庫中搜索序列，這些序列與胰蛋白酶消化生成的消化片斷的分子量相吻合。最后，用多級質(zhì)譜(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白質(zhì)梯狀排序法(proteinladdersequencing)對胰蛋白酶消化片斷進行排序。蛋白質(zhì)生物標記可用蛋白質(zhì)梯狀排序法(proteinladdersequencing)進行排序。通過將分子碎成碎片并將碎片用酶解作用或其他可按順序從碎片末端除去一個單個氨基酸分子的方法進行處理后，可生成蛋白質(zhì)梯度(proteinladders)。然后，用質(zhì)譜對此梯度進行分析。階梯狀碎片(ladderfragments)在質(zhì)量上的差異可鑒別出從分子末端被除去的氨基酸。鑒別出生物標志群實驗結(jié)果表3<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>4,417.838.51TruncatedSerumAmyloidA2protein5，089.508.515,501.986.986,432.368.27,722.017.868,707.915.058,826.915.058,938.509.59,192.215.239,269.056.0411,091.086.811,682.705.8911,731.176.0712,946.13,761.15，867.08410633358121,253.295.6628,078.625.2734,236.685.5223,511.564.9338,999.485.95TruncatedSerumAmyloidA2proteinTruncatedSerumAmyloidA2proteinTruncatedApolipoproteinC-ITruncatedBeta-ThromboglobulinTruncatedApolipoproteinA-IIApolipoproteinA-IIC3—an即hylatoxinDes-ArgH即toglobin-lAlpha—1ChainTruncatedHaptoglobin—2TruncatedSerumAmyloidA2proteinSerumAmyloidAproteinBeta—2—MicroglobulinTruncatedTransthyretinTransthyretinHemoglobinBetaChainApolipoproteinMApolipoproteinA_IApolipoproteinEAlpha—l-AcidGlycoproteinAlpha—l-MicroglobulinPrecursor45,265.825.32Alpha—l-Antichymotrypsin39,324.685.43Alpha-2-HS-GlycoproteinPrecursor51,243.465.22VitaminD-BindingProtein45,371.055.28ApolipoproteinA-IV實施例4生物標志群抗體的制備將純化或合成的生物標志群免疫小鼠，待免疫反應(yīng)出現(xiàn)后，從外周血中分離B細胞。用溶血噬菌斑分析法選擇并分離出能分泌所需抗體的單個淋巴細胞。將單個細胞擴增至1X10'個以上，用QuickmRNAPurificationKit提取mRNA。以提取的mRNA為模板，合成cDNA鏈。以此cDNA為模板，加入鼠抗體重鏈可變區(qū)(VH)通用引物，輕鏈可變區(qū)(V,)通用引物，進行聚合酶鏈反應(yīng)，獲得擴增的Vh基因片段和V,基因片段。將擴增產(chǎn)物在15g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定和分離。用glassmilk回收擴增的Vh基因片段和W基因片段。與等摩爾嘗試的LimkerPrimerMix混合，進行聚合酶鏈反應(yīng)，逢接Vh和V,。擴增產(chǎn)物分離純化后，獲得特異性單鏈抗體(ScFV)。此ScFV可用于制備檢測所需DNA片。將此擴增產(chǎn)物兩端加限制性酶切位點，純化定量后，連接到P"'9載體上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感染大腸桿菌T0P10。經(jīng)藍白斑篩選及酶切鑒定，篩選出重組質(zhì)粒。在96孔板形成單克隆抗體。用ELISA法篩選出效價最高的單克隆抗體株，大量制備，并從培養(yǎng)上清中提取所需抗體。此抗體可用于制備檢測所需試劑盒。實施例5抗生物標志群的抗體驗證生物標志群用Carbodiimide方法(CarbodiimideMethod)將帶有羧酸基團標記的基質(zhì)與抗生物標志群的排序鑒定抗體的氨基基團結(jié)合(GunnDL,etal.PreparationofsensitiveandstableerythrocytesbythecarbodiimidemethodforthedetectionofprimaryandsecondaryIgMandIgGantibody.JImmunolMethods.1972;1(4):381-389.)。將樣品點樣在一個抗生物標志群抗體基質(zhì)的位點上。用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。用1%三氟乙酸徹底洗滌整個陣列點，將生物標志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5pLSinapinicacid吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的制備的標準溶液)。用質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列去分析各位點的生物標志或蛋白質(zhì)。用計算機分析數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)重疊展示。(2)實驗結(jié)果用抗生物標志群抗體基質(zhì)與質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用驗證被分析物與實施例3—致-表4抗生物標志群抗體TruncatedFibrinop印tideATruncatedAlpha—2-HS-GlycoproteinChainBTruncatedAlpha—2—HS—GlycoproteinChainBTruncatedAlpha-2-HS-GlycoproteinChainBTruncatedInter—AlphaInhibitorHeavyChain4Alpha—2-HS-GlycoproteinChainBTruncatedSerumAmyloidA2proteinTruncatedSerumAmyloidA2proteinTruncatedSerumAmyloidA2proteinTruncatedSerumAmyloidA2proteinTruncatedSerumAmyloidA2proteinTruncatedApolipoproteinC-ITruncatedBeta—ThromboglobulinApolipoproteinA_IIApolipoproteinA-IIC3_anaphylatoxinDes-Arg被分析物分子]1,465.502,740.2,859.3,224.3,272.3,515.3,806.4，020.4,417.5,089.5,501.6'432.7,722.8,707.8,826.8,938.274255644909358350983601919150H邵toglobin-lAlpha—1ChainTruncatedHaptoglobin—2TruncatedSerumAmyloidA2proteinSerumAmyloidAproteinBeta-2-MicroglobulinTruncatedtransthyretinTransthyretinHemoglobinBetaChainApolipoproteinMApolipoproteinA-IApolipoproteinEAlpha—l-AcidGlycoproteinAlpha-l—MicroglobulinPrecursorAlpha—l-AntichymotrypsinAlpha—2—HS—GlycoproteinPrecursorVitaminD-BindingProteinApolipoproteinA-IV9,192.219,269.0511,091.0811,682.7011，731.1712，946.0813'761.4115,867.0621,253.2928,078.6234,236.6823,511.5638,999.4845,265.8239,324.6851,243.4645,371.05實施例5中抗生物標志群的抗體驗證疾病生物標志群，即抗體及質(zhì)譜聯(lián)合，可省去生物標志群的排序鑒定。實施例6監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白指紋篩選將結(jié)直腸癌患者按照轉(zhuǎn)移情況分組，然后進行組間兩兩比較，各組間有顯著性差異的蛋白質(zhì)峰數(shù)量種類不盡相詞，其中3692Da蛋白指紋在臟器轉(zhuǎn)移組中顯著增高(圖2)。實施例7監(jiān)測腫瘤預(yù)后評估、分子分型及個體化診療對結(jié)直腸癌病人在根治性根除后14天再次進行檢測，發(fā)現(xiàn)蛋白指紋3398Da在根治性切除后，血清中的濃度顯著下降，基本接近于正常人，3398Da信號強度術(shù)前14.5術(shù)后4.6(圖3)。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改并應(yīng)用于對心血管疾病或感染性疾病等其他疾病的檢測，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種用磁珠、高效液相層析柱子、或毛細管電泳柱子等支持基質(zhì)的方法捕獲生物樣品中腫瘤蛋白質(zhì)組的試劑盒和方法，其特征是采用蛋白指紋法對傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性腫瘤中蛋白質(zhì)組或質(zhì)譜多肽圖譜進行鑒別檢測和對腫瘤預(yù)后評估。用標準化質(zhì)控血清(漿)控制下的定量性質(zhì)譜分析來檢測。該方法通過以下步驟實現(xiàn)(1)樣品處理及質(zhì)譜標準化質(zhì)控血清(漿)制備；(2)基質(zhì)與血清(漿)結(jié)合試劑盒制備、樣品上樣；(3)洗滌；(4)質(zhì)譜的定量控制及質(zhì)譜檢測；其中所述步驟(1)將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中。用O型血，男女相等，混合制備質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清(漿)；所述步驟(2)將質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清(漿)及樣品點樣在有支持物的基質(zhì)中的一個位點上。支持物用磁珠、高效液相層析柱子、或毛細管電泳柱子。基質(zhì)是用WCX陰離子基質(zhì)、C8/C18疏水基質(zhì)或抗體(組)基質(zhì)與血清(漿)選擇性結(jié)合；所述步驟(3)用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。用三氟乙酸徹底洗滌整個陣列點，將生物標志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片或位點上。所述步驟(4)加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制備的飽和標準溶液)用質(zhì)譜儀去分析滯留與各位點的生物標志或用電噴霧電離已洗脫的生物標志后用質(zhì)譜儀去分析。對血液進行蛋白質(zhì)對比分析，用計算機分析血液中質(zhì)荷比數(shù)據(jù)。本試劑盒依據(jù)幾個特征性腫瘤相關(guān)蛋白指紋1465.50、2740.27、2859.42、3224.55、3272.64、3515.49、3806.09、4020.35、4417.83、5089.50、5501.98、6432.36、7722.01、8707.91、8826.91、8938.50、9192.21、9269.05、11091.08、11682.70、11731.17、12946.08、13761.41、15867.08、21253.29、23511.56、28078.62、34236.68、38999.48、39324.68、45265.82、45371.05、51243.46±30Da，雙盲測試正常人與傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性腫瘤的敏感性100％，特異性90％。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清(漿)，將標準化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標準峰6634±1Da強度調(diào)至50％質(zhì)譜信號強度的最大值。用2746±1Da、5909±1Da、6634±1Da標準峰為質(zhì)譜定性(分子量)質(zhì)控標準。2.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)分析方法，所用的基質(zhì)包括陰離子作用、疏水作用、或抗體(組)作用吸附劑。3.權(quán)利要求2中支持基質(zhì)的方法所用吸附劑的支持物是磁珠、高效液相層析柱子、或毛細管電泳柱子等。4.一種權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，它包括一容器以及裝于容器中的權(quán)利要求1所述的生物樣品。將生物樣品分裝10(^1—小管，于一8(TC儲存或取生物樣品1:2稀釋于一小管U9緩沖液(9MUrea，2%CHAPS，50mMTris-HCL)，25。C儲存。5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征于，所述的生物樣品為血清或血漿。6.權(quán)利要求1所述的特征性腫瘤相關(guān)蛋白指紋的生物標志群為truncatedfibrinopeptideA、truncatedalpha-2-HS-glycoproteinchainB、alpha-2-HS-glycoproteinchainB、truncatedinter-alphainhibitorheavychain4、truncatedserumamyloidA2protein、truncatedapolipoproteinC-I、truncatedbeta-thromboglobulin、truncatedapolipoproteinA-II、apolipoproteinA-II、C3-an即hylatoxinDes-Arg、haptoglobin-1alpha-lchain、truncatedhaptoglobin-2、serumamyloidA2protein、beta_2-microglobulin、truncatedtransthyretin、transthyretin、hemoglobinbetachain、apolipoproteinM、apolipoproteinA-I、apolipoproteinE、alpha-l-microglobulinprecursorsalpha-l-antichymotrypsin、alpha-2_HS-glycoproteinprecursor、vit柳inD-bindingprotein、apolipoproteinA-IV。7.—種權(quán)利要求6所述的生物標志群在免疫組質(zhì)譜(IMS)檢測的用途，其特征在于,用于制備檢測傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性的腫瘤其生物標志的抗體及試劑盒。8.—種權(quán)利要求7所述的檢測傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性腫瘤的試劑盒，其特征在于，它包括一容器以及裝于容器中的權(quán)利要求8所述的檢測傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性腫瘤的生物標志抗體(組)。9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征于，所述的抗體(組)為單克隆抗體(組)或多克隆抗體(組)。10.權(quán)利要求1用于監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、分子分型及個體化診療的試劑盒和方法。全文摘要本發(fā)明涉及一種用磁珠、高效液相層析柱子、或毛細管電泳柱子等支持基質(zhì)的方法捕獲生物樣品中腫瘤蛋白質(zhì)組，用磁性分離器或高效液相層析柱子、或毛細管電泳柱子分離樣品，無需離心樣品。然后用質(zhì)譜法進行分析的蛋白指紋法(PFT)。本發(fā)明的方法可用于正常人與傳統(tǒng)腫瘤標記物表達陰性腫瘤的蛋白指紋、質(zhì)譜多肽圖譜、或免疫組質(zhì)譜(IMS)檢測的試劑盒。本發(fā)明可用于監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、預(yù)后評估、分子分型及個體化診療的試劑盒和方法。本方法準確、方便且快捷。文檔編號G01N30/00GK101231294SQ20071000116公開日2008年7月30日申請日期2007年1月22日優(yōu)先權(quán)日2007年1月22日發(fā)明者洋許申請人:洋許