專利名稱：：丙型肝炎病毒第一高變區(qū)抗原及其在制備丙型肝炎病毒檢測(cè)試劑中的用途的制作方法丙型肝炎病毒第一高變區(qū)抗原及其在制備丙型肝炎病毒IHI試擁中的用途技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及肝炎病毒的抗原，具體涉及丙型肝炎病毒高變區(qū)抗原，還涉及該抗原在制備檢測(cè)丙型肝炎病毒試劑中的用途。
背景技術(shù)：
：HCV感染弓，起的丙型肝炎是一種十分嚴(yán)重的傳染性肝臟疾病。目前，我國共有患者4000萬，并且隨著賣淫、吸毒、不規(guī)范輸血等社會(huì)問題的出現(xiàn)呈增加趨勢(shì)。由于丙型肝炎多為慢性病毒感染性疾病，治療難度大，又沒有疫苗，故我國主要通過加強(qiáng)血制品的篩査來達(dá)到控制該病蔓延的目的，這使HCV診斷試劑的研究具有十分重要的意義。盡管近幾年HCV的診斷領(lǐng)域獲得長足的發(fā)展，但是，目前的診斷技術(shù)只是停留在HCV病毒感染的確診上，并不具有真正的臨床指導(dǎo)意義。而在丙型肝炎的臨床藥物中，最經(jīng)常使用的千擾素的總有效性僅有25%，大部分患者對(duì)干擾素不敏^(FriedMWandHoofoagleJH.TherapyofhepatitisC，SeminLiverDis，1995;15:82-91)。由于IFN治療的療程長、費(fèi)用高、副作用大，因此，迫切需要發(fā)展一種可用于預(yù)測(cè)IFN療效的診斷試劑。在HCV變異的研究中，位于病毒第二包膜蛋白N端的第一高變區(qū)(HVR1)處于十分重要的地位。研究顯示盡管HVR1僅有27個(gè)氨基酸，但其變異占到整個(gè)病毒基因組變異的80%以上，常以HVR1序列的變化作為衡量病毒變異的標(biāo)準(zhǔn)；HVR1含有HCV唯一的中和性抗原表位，其抗體能阻止病毒吸附敏感細(xì)胞，早期HVR1抗體的出現(xiàn)，有助于疾病的自愈；HVR1的變異的復(fù)雜程度與IFN的治療效果有密切關(guān)系等(修冰水，凌世淦。丙型肝炎病毒第一高變區(qū)的研究進(jìn)展，國外醫(yī)學(xué)病毒學(xué)分冊(cè)，2000，7(5):158-160)。國內(nèi)外十分重視對(duì)HCV病毒變異的檢測(cè)，現(xiàn)在，對(duì)HCV變異的檢測(cè)是建立在"HCV-RNA的提取一逆轉(zhuǎn)錄^PCR"三大環(huán)節(jié)的基礎(chǔ)上。根據(jù)最后PCR產(chǎn)物分析的手段不同分為以下幾種1.序列分析法這是其他所有檢測(cè)變異技術(shù)的基礎(chǔ)。最后通過對(duì)PCR產(chǎn)物的直接克隆測(cè)序，來對(duì)HCV病毒的變異情況進(jìn)行檢測(cè)。由于HCV變異大，有時(shí)甚至同一標(biāo)本的不同克隆序列亦有差異。因此該方法測(cè)序工作量大、重復(fù)性差、周期長，難以進(jìn)行大數(shù)量的研究。2.PCR—限制性長度多態(tài)性法(RFLP)用同一種限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行酶切，根據(jù)酶切圖譜進(jìn)行多態(tài)性分析，檢測(cè)病毒的變異。該方法比序列分析法簡(jiǎn)單快速，能進(jìn)行大批量樣本的處理。但該方法要求被檢測(cè)位點(diǎn)附近的堿基高度保守，多用于HCV的基因分型。3.PCR—單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(SSCP)該方法目前應(yīng)用較廣的HCV變異檢測(cè)技術(shù)。PCR擴(kuò)增靶序列后，變性成單鏈后進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，由于變異單鏈的構(gòu)象不同導(dǎo)致電泳的遷移率不同，最終形成不同的帶型，從而確定病毒的變異與否。SSCP簡(jiǎn)單、易行，但無法確立變異的部位，同時(shí)，只有少于200bp以下的PCR產(chǎn)物才能達(dá)到檢測(cè)病毒變異的敏感性。鑒于此，SSCP通常采用HVR1作為檢測(cè)的靶序列(劉錫光，祁自柏，熊詩松，肝炎實(shí)驗(yàn)診斷指南，人民衛(wèi)生出版社，第一版，2004，175-179)。不難看出，上述幾種方法無法離開對(duì)HCV病毒RNA的檢測(cè)，對(duì)人員素質(zhì)、設(shè)備要求高，因此，至今國內(nèi)外對(duì)HCV變異的檢測(cè)僅限于大的科研機(jī)構(gòu)水平，無法進(jìn)行大規(guī)模推廣。尋找一種簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好、易于推廣的HCV變異的檢測(cè)方法，無疑是HCV基礎(chǔ)、臨床研究中亟需解決的問題。為了使HCV變異的檢測(cè)滿足臨床的需要，本發(fā)明通過對(duì)HCV診斷領(lǐng)域的深入研究，提出了一種用于檢測(cè)HCV變異的新方法。本發(fā)明以HVR1作為研究靶點(diǎn)，通過生物信息學(xué)篩選多種HVR1抗原，采用間接酶聯(lián)免疫法，檢測(cè)HCV患者血清中HVR1抗體的異質(zhì)程度，從而建立HCV變異的多耙點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明的目的是提供丙型肝炎病毒第一高變區(qū)抗原及抗原組合。本發(fā)明公開的丙型肝炎病毒第一高變區(qū)抗原，其氨基酸序列分別如序列表中下列序列所示(1)序列表中序列2，(2)序列表中序列4，(3)序列表中序列6，(4)序列表中序列9，(5)序列表中序列l(wèi)l，(6)序列表中序列12，(7)序列表中序列14，(8)序列表中序列15，(9)序列表中序列16，(10)序列表中序列18，(11)序列表中序列19，(12)序列表中序列21，(13)序列表中序列22，(14)序列表中序列23，(15)序列表中序列25，(16)序列表中序列26，或(17)序列表中序列27。本發(fā)明還公開了多個(gè)丙型肝炎病毒第一高變區(qū)抗原的抗原組合，其中丙型肝炎病毒第一高變區(qū)選自上述序列中兩種或兩種以上序列。本發(fā)明還公開了上述丙型肝炎病毒第一高變區(qū)抗原在制備丙型肝炎病毒檢測(cè)試劑中的用途。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)HCV變異的酶聯(lián)免疫技術(shù)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)1.發(fā)明是建立在免疫學(xué)檢測(cè)的原理上目前，HCV的診斷行業(yè)多以血清免疫學(xué)檢測(cè)為主，通過對(duì)血清中的各種抗HCV抗體的檢測(cè)，確定HCV感染。本發(fā)明通過檢測(cè)HCV變異抗體的存在，反映患者體內(nèi)病毒的變異情況，可有效的避開RT-PCR的基因檢測(cè)，使本發(fā)明具有簡(jiǎn)單易操作、重復(fù)性好等特點(diǎn)而得到推廣和應(yīng)用。2.發(fā)明多靶點(diǎn)HVR1抗原的篩選是建立在生物信息學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)上HCV是一種變異性極高的RNA病毒，其變異速度超過HBV等DNA病毒的千倍以上，因此，必須采用多HVR1靶點(diǎn)抗原檢測(cè)。由于HVR1的變異特別大，不可能一一對(duì)其活性做出判斷，所以，本發(fā)明采用生物信息學(xué)技術(shù)，根據(jù)氨基酸序列同源性，對(duì)上千條HVR1序列進(jìn)行篩選。對(duì)篩選的候選序列，進(jìn)行克隆表達(dá)，并根據(jù)ELISA反應(yīng)結(jié)果，篩選出具有一定株特異性靶點(diǎn)抗原，極大提高篩選效率和質(zhì)量。3.本發(fā)明具有一定的臨床意義。本發(fā)明所采用的靶點(diǎn)抗原是由27個(gè)氨基酸組成的第一高變區(qū)(HVR1)，它集中了HCV80M以上的變異，還含有HCV唯一的中和性抗原表位。HVR1抗體具有多種臨床意義，HVR1與臨床研究關(guān)系密切，目前，國內(nèi)外在這方面積累了大量資料。如早期HVR1抗體的出現(xiàn)與有助于患者的自愈，而HVR1的異質(zhì)程度隨著慢性肝炎、肝硬化、肝癌的發(fā)展而不斷增加。而HVR1的變異的復(fù)雜程度與IFN的療效密切相關(guān)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明人從文獻(xiàn)調(diào)研、foternet、基因釣取等方式獲得1683條HVR1變異株序列，利用自編程序進(jìn)行同源性比較，篩選27條候選HVR1抗原序列，其氨基酸序列分別如序列表中序列1一序列27所示?；蚬こ瘫磉_(dá)后，純化上述HVR1候選抗原，用ELISA方法做進(jìn)一歩鑒定，獲得17條具有HVR1變異株的靶點(diǎn)抗原。將上述多靶點(diǎn)變異代表抗原包被到酶聯(lián)板上，建立HCV變異多靶點(diǎn)ELISA檢溯技術(shù)，研究HCV患者血清與各個(gè)靶點(diǎn)抗原的反應(yīng)情況，統(tǒng)計(jì)患者血清中HVR1抗體的異質(zhì)程度，并分析其臨床意義。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的-利用自編VB程序，精選了27條候選HVR1抗原序列，合成基因后，分別重組表達(dá)，然后用ELBA確定其與丙型肝炎患者血清的交叉反應(yīng)性，并從中選擇17條優(yōu)勢(shì)HVR1變異株序列的用于多靶點(diǎn)檢測(cè)抗原制造。為了有利于HVR1基因在五.coli中獲得高效的表達(dá)，選擇大腸桿菌的偏性密碼子設(shè)計(jì)并合成HVR1基因。為了使獲得的抗原具有較好的活性，我們?cè)诘腍VR1基因的上下游分別加上連接臂G-G-G-S和S-G-G-G，；為了便于基因克隆到表達(dá)載體，在連接臂的兩端引入i/和i/兩個(gè)酶切位點(diǎn)，以適合表達(dá)載體pBVILl(參見中國專利ZL00100695.9:表達(dá)載體pBVILl及其構(gòu)建方法和用途)。雙酶切后插入載體pBVILl中，構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒。構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒需用PCR法鑒定，以證明各基因片段已獲正確地插入。各單片段HVR1抗原表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化￡.②//HB101后，通過熱誘導(dǎo)培養(yǎng)，取全菌液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，證明各表達(dá)質(zhì)粒均已獲得了高效的表達(dá)，再經(jīng)離子交換柱及凝膠過濾純化，均可獲得電泳純的HVR1靶點(diǎn)抗原純品(參見中國專利ZL01141879.6:丙型肝炎病毒第一高變區(qū)抗原及其融合抗原)。用ELISA檢測(cè)單個(gè)片段與HCV病人血清的交叉反應(yīng)性，選出其中耙點(diǎn)HVR1抗原序列。采用上述靶點(diǎn)抗原包被酶聯(lián)板,采用間接酶聯(lián)免疫法建立HCV變異檢測(cè)技術(shù)，并檢測(cè)其臨床意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明的HCV所篩選的HVR1靶點(diǎn)抗原與34份血清的交叉范圍在29.4%到38.2%之間，具有一定的株特異性，總覆蓋面達(dá)到91.2%，臨床檢測(cè)顯示慢性患者與高交叉反應(yīng)組的符合率是77.6%，而急性患者與低交叉組符合率為85%,該結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)附圖1純化后的1-9HVR1候選抗原的SDS-PAGE附圖2候選抗原與34份HCV血清的ELISA檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式實(shí)據(jù)倒l候,原表位的選擇我們通過自編VB程序?qū)鴥?nèi)外1，600條HVR1序列進(jìn)行分析，根據(jù)氨基酸序列的同源性，依次分組，篩選出27條候選HVR1序列。其序列分別如序列表中序列1_序列27所示。實(shí)旌例227^flilHVRl抗原的克隆與表達(dá)1.含HVR1單片段抗原表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1.1候選HVR1抗原基因的合成根據(jù)各上述HVR1氨基酸序列，采用大腸桿菌優(yōu)勢(shì)密碼子委托上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成上述序列的基因。1.2候選HVR1抗原表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1.2.1PCR產(chǎn)物及表達(dá)載體pBVILl雙酶切取以上合成基因產(chǎn)物及pBVILl表達(dá)載體各3(Hil分別放于Eeppendorf離心管中，各加入10Xbuffer(H>Ha、Xbal(10u/j^l)和Xhol(12u/|itl)各ljil，加滅菌蒸餾水至40n!，置37t:水浴酶切過夜。酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳純化和回收PCR產(chǎn)物及載體pBVILl經(jīng)雙酶切后，用12%瓊脂糖凝膠進(jìn)行純化，具體方法按《分子克隆》(科學(xué)出版社，第二版)的方法進(jìn)行。純化基因再用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的小量膠回收試劑盒回收即在紫外燈下分別切下含質(zhì)粒和目的基因的瓊脂糖，放于E印pendorf離心管中，各加入Sl液，置55。C水浴10分鐘使膠溶解，加入等量異丙醇，混勻，55t:溫浴1分鐘，然后分別移入吸附柱后，按試劑盒說明書進(jìn)行純化。1.2.2連接于滅菌EeppraiikHf離心管中加入上述酶切后的載體及目的基因各1mul、10XT4DNALigasebuffer1^1、T4DNALigase(12u/ul)lpJ，加滅菌蒸餾水至10pl，置16"C過夜。1.2.3轉(zhuǎn)化在超凈工作臺(tái)中，用無菌吸頭取IOOmI感受態(tài)細(xì)胞(感受態(tài)細(xì)胞按《分子克隆》(科學(xué)出版社，第二版)的方法進(jìn)行)懸液于Eppendorf中，加入上述連接物5nl，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30分。立即轉(zhuǎn)移到421C水浴中放置2分鐘，每管加入0.5mlLB培養(yǎng)基(不加抗生素)，WC水浴搖床培養(yǎng)60分鐘后，各取0.2ml分別涂于LB瓊脂培養(yǎng)基平皿上(含抗生素)，室溫晾干后，置37t:恒溫箱倒置培養(yǎng)過夜。挑選數(shù)個(gè)菌落，分別接種于LB中(5ml/管)，培養(yǎng)過夜，次日各取O.lml轉(zhuǎn)移到LB中(2ml/管)，32。C培養(yǎng)3小時(shí)，42°C水浴搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，收菌，用SDS-PAGE鑒定，選擇目的基因獲得高表達(dá)菌株，并測(cè)序鑒定。2.抗原的表達(dá)與純化2.1表達(dá)菌株的培養(yǎng)取-70t:保存的表達(dá)菌株20Pl接種于LB培養(yǎng)基中(100mlLB/500ml三角瓶)，30°C空氣搖床培養(yǎng)過夜，次日按5%的比例轉(zhuǎn)種于LB培養(yǎng)基(同上)，30°C空氣搖床培養(yǎng)約3小時(shí)，當(dāng)OD600值達(dá)到0.7時(shí)，立即將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)到42°C水浴搖床中，誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)。將菌液合并，6000ipm離心20分鐘，棄上清，收集沉淀部分。2.2提取包涵體將沉淀稱濕重，用IO倍體積的20mmol/LpH8.0TE緩沖液將沉淀懸起，加入溶菌酶(lmg/ml懸液)，在室溫下磁力攪拌10分鐘。在冰浴中超聲波破碎菌，每次超30秒鐘，間隔30秒鐘，共超10次。8°C,1，2000rpm，離心20分鐘，棄上清，沉淀用lmol/LNaCl(用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8.0TE配制)溶解，加1%P-巰基乙醇。再于20"C，l，2000ipm，離心10分鐘，去沉淀取上清。2.3純化將上述溶解的包涵體溶液過OSepharoseFF陰離子交換柱，用平衡液(p戰(zhàn).0，20mmol/LTE含6mol/L脲，0.1%3-巰基乙醇)清洗后，用不同濃度的NaCl(用平衡液配制)洗脫，收集各洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，收集0.05鵬l/LNaCl洗脫峰。再過SephardexG-50凝膠過濾柱，收集第一洗脫峰。各種純化重組表位抗原均用SDS-PAGE鑒定。3.候選HVR1抗原活性鑒定將純化的候選抗原用pH7.2的磷酸鹽緩沖液稀釋到2.0ng/ml，包被ELISA測(cè)定板，經(jīng)封閉后，對(duì)本室保存的國內(nèi)31份HCV陽性血清，進(jìn)行了測(cè)定。部分結(jié)果如圖1所示。實(shí)施例3多靶點(diǎn)HVR1抗原的篩選根據(jù)圖1實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選出17條具有一定株特異性的HVR1靶點(diǎn)抗原2，4，6，9，11，12，14,15,16，18，19,21，22,23，25,26，27#(其氨基酸序列分別如序列表中序列2，4，6,9，11，12，14，15，16，18，19，21，22，23，25，26，27所示)。該17條HVR1靶點(diǎn)抗原的綜合覆蓋率為91.2%。將上述抗原包被酶聯(lián)板，即可建立HCV變異多靶點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)。實(shí)施例4HCV變異的多靶點(diǎn)檢翻及臨床意義利用間接ELISA法，檢測(cè)28份急性患者血清(北京紅十字血液中心)和41份慢性患者血清(解放軍302醫(yī)院)的反應(yīng)情況，并根據(jù)反應(yīng)結(jié)果分為2組，與超過9條(含9條)靶點(diǎn)抗原的反應(yīng)的血清設(shè)定為高交叉反應(yīng)組；而小于8條(含8條)靶點(diǎn)抗原反應(yīng)的血清設(shè)定為低交叉反應(yīng)組。反應(yīng)結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明的HCV所篩選的HVR1靶點(diǎn)抗原與34份血清的交叉范圍在29.4%到38.2%之間，具有一定的株特異性，總覆蓋面達(dá)到91.2%，臨床檢測(cè)顯示慢性患者與高交叉反應(yīng)組的符合率是77.6%,而急性患者與低交叉組符合率為85%，該結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)。見表l表lHVR1多靶點(diǎn)檢測(cè)的臨床應(yīng)用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1.丙型肝炎病毒第一高變區(qū)抗原，其氨基酸序列分別如序列表中下列序列所示(1)序列表中序列2，(2)序列表中序列4，(3)序列表中序列6，(4)序列表中序列9，(5)序列表中序列11，(6)序列表中序列12，(7)序列表中序列14，(8)序列表中序列15，(9)序列表中序列16，(10)序列表中序列18，(11)序列表中序列19，(12)序列表中序列21，(13)序列表中序列22，(14)序列表中序列23，(15)序列表中序列25，(16)序列表中序列26，或(17)序列表中序列27。2.含多個(gè)丙型肝炎病毒第一高變區(qū)抗原的抗原組合，其特征在于所說的丙型肝炎病毒第一高變區(qū)選自權(quán)利要求1抗原中的兩種或兩種以上序列。3.權(quán)利要求1所述抗原在制備丙型肝炎病毒變異檢測(cè)試劑中的用途。全文摘要本發(fā)明公開了本發(fā)明提供丙型肝炎病毒(HCV)第一高變區(qū)抗原，還公開了該抗原在制備丙型肝炎病毒檢測(cè)試劑中的用途。本發(fā)明采用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)現(xiàn)有丙型肝炎病毒第一高變區(qū)序列分析，篩選出17條具有變異株特異性HVR1多靶點(diǎn)抗原，采用間接酶聯(lián)免疫法檢測(cè)患者血清與上述17條HVR1抗原的反應(yīng)情況，根據(jù)HVR1抗體的異質(zhì)程度判斷病毒的變異情況，通過對(duì)丙型肝炎病毒第一高變區(qū)(HVR1)抗體異質(zhì)性檢測(cè)，達(dá)到對(duì)HCV變異檢測(cè)的目的，通過本發(fā)明抗原的應(yīng)用，可研究HCV疾病的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后、干擾素療效的預(yù)測(cè)等問題，具有一定的臨床應(yīng)用前景。文檔編號(hào)G01N33/569GK101230097SQ20071000262公開日2008年7月30日申請(qǐng)日期2007年1月25日優(yōu)先權(quán)日2007年1月25日發(fā)明者修冰水,凌世淦,宋曉國,張賀秋,昭李,王國華,閻瑾琦申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所