專利名稱：：壇紫菜種質(zhì)鑒定的指紋圖譜的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種壇紫菜的指紋圖譜，尤其是涉及一種壇紫菜種質(zhì)鑒定的指紋圖譜的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：壇紫菜(尸OA7/^m/^'to^m^)是我國特有的暖溫帶性品種，是福建、浙江和廣東沿海人工養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟紅藻，其產(chǎn)量約占全國紫菜總產(chǎn)量的80%。以往紫菜的分類主要是依靠形態(tài)學(xué)的方法，然而由于大多數(shù)形態(tài)性狀受環(huán)境因數(shù)影響大，可描述的特征有限，已經(jīng)很難滿足紫菜種質(zhì)鑒定和良種選育的要求。分子標記技術(shù)的出現(xiàn)給這一問題的解決帶來了契機，它直接在DNA水平上標記檢測基因組的遺傳變異，不受發(fā)育時期和環(huán)境因素的影響，數(shù)量豐富且多態(tài)性好，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于高等植物的種質(zhì)鑒定中。SRAP——相關(guān)序列擴增多態(tài)性標記是一種新型的分子標記技術(shù)，具有多態(tài)性高，產(chǎn)率中等，重復(fù)性好，操作簡單，在基因組中分布均勻，較易對擴增得到的目標片段進行測序，引物具有通用性，而且其正向引物可以與反向引物兩兩搭配組合，用少量引物即可組配得到多個引物對，從而提高引物的使用效率，降低引物合成成本等諸多優(yōu)點，已經(jīng)廣泛用于植物遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定以及遺傳連鎖圖譜的繪制(參見文獻LiGQuirosCF,Sequence-relatedamplifiedpolymorphism(SRAP)，anewmarkersystembasedonasimplePCRreaction:itsapplicationtomappingandgenetagginginBrassica.TheorApplGenet,2001，103:455-461)，但在海藻中的應(yīng)用至今未見相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種快速、準確的壇紫菜種質(zhì)鑒定的指紋圖譜的構(gòu)建方法及其在實現(xiàn)壇紫菜種質(zhì)鑒定自動化的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是利用一種相關(guān)序列擴增多態(tài)性標記(Sequence-RelatedA即lifiedPolymorphism,SRAP)來標記構(gòu)建壇紫菜的指紋圖譜，并利用所構(gòu)建的指紋圖譜實現(xiàn)壇紫菜種質(zhì)鑒定自動化的方法。本發(fā)明所述的壇紫菜種質(zhì)鑒定的指紋圖譜的構(gòu)建方法包括以下步驟1)收集壇紫菜樣品；2)各樣品基因組dna的提取與純化；3)pcr擴增利用所提取的基因組dna作為模板，以經(jīng)過優(yōu)化的實驗體系進行srap分子標記分析；4)選擇具有代表性的srap多態(tài)性條帶用于構(gòu)建各供試樣品的dna指紋圖譜；5)將構(gòu)建的dna指紋圖譜轉(zhuǎn)化成為計算機可以識別的數(shù)碼指紋，并輸入指紋圖譜識別軟件中，建立壇紫菜種質(zhì)的數(shù)碼指紋庫，用于后續(xù)的壇紫菜種質(zhì)鑒定6)壇紫菜種質(zhì)的自動化鑒定。壇紫菜樣品可收集生產(chǎn)或科學(xué)研究上具有代表性的壇紫菜品系，例如表1所示的部分生產(chǎn)或科學(xué)研究上具有代表性的壇紫菜品系。表1生產(chǎn)或科學(xué)研究上具有代表性的壇紫菜品系<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>各樣品基因組dna的提取與純化的方法可釆用文獻提供的方法(可參見文獻克拉爾克著，顧紅雅譯.植物分子生物學(xué)實驗手冊.北京高等教育出版社，1997)，但將其中的液氮研磨釆用海螺酶酶解替代。各樣品基因組DNA的提取可取新鮮的藻體材料，用消毒海水處理后，在勻漿機中勻漿，后加入酶液，3(TC保溫0.52h。酶解結(jié)束后用無菌水稀釋酶解物，篩絹過濾，濾液經(jīng)30008000r/min，l(TC離心510min，收集細胞，用無菌水懸浮洗滌細胞一次，離心后重新收集細胞，并收集的細胞轉(zhuǎn)入5ml離心管中用CTAB法提取基因組DNA。其中酶液的組成最好為2%海螺酶，2mo1/1葡萄糖。優(yōu)化的實驗體系可采用正交試驗對影響SRAP分子標記分析的各個因素進行優(yōu)化后所得到，優(yōu)化的實驗體系包括反應(yīng)體系、擴增程序及用于PCR擴增的引物對序列三個部分。反應(yīng)體系為25uL的反應(yīng)體系中含2.5yL10XPCRBuffer,5ng模板DNA，2.5mmol/LMg2+，l.OUDNA聚合酶，200nmol/L引物，200nmol/LdNTP。擴增程序為95。C預(yù)變型5min;94°Clmin，35°Clmin，72°C2min，5個循環(huán)；94°Clmin,48°Clmin，72°C2min，35個循環(huán);72°C延伸10min。PCR擴增的引物對序列如表2所示，具體使用時可根據(jù)材料的不同使用其中正向引物及反向引物隨機組合的1對或多對引物。表2PCR擴增所采用的引物編弓及其序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>選擇具有代表性的SRAP多態(tài)性條帶的原則是利用最少對引物，最少條帶，就能將所有供試樣品完全分開(即每個樣品利用所選擇的多態(tài)性條帶構(gòu)建的指紋圖譜都具有唯一性)，且選取的條帶具有穩(wěn)定性和重復(fù)性良好、多態(tài)性高的特點。選擇具有代表性的SRAP多態(tài)性條帶用于構(gòu)建各供試樣品的DNA指紋圖譜的方法是以壇紫菜品系編號為橫坐標，以選擇的具有代表性的SRAP多態(tài)性條帶的編號為縱坐標，在每一縱橫坐標交結(jié)處，有擴增帶用"一"表示，沒有擴增帶不作任何標記，由此即可構(gòu)建出各個壇紫菜樣品的DNA指紋圖譜，且所構(gòu)建的每個壇紫菜樣品的DNA指紋圖譜都具有唯一性。將構(gòu)建的DNA指紋圖譜轉(zhuǎn)化成為計算機可以識別的數(shù)碼指紋，并輸入指紋圖譜識別軟件中，建立壇紫菜種質(zhì)的數(shù)碼指紋庫的方法是在所構(gòu)建的DNA指紋圖譜中，用"1"和"0"分別代表圖譜中擴增帶的有和無，這樣就可以將DNA指紋圖譜轉(zhuǎn)化為由"1"和"0"組成的數(shù)碼指紋，使得每個材料都具有各自特異的由"1"和"0"組成的數(shù)碼指紋，然后即可將各個材料名稱、特征及其對應(yīng)的數(shù)碼指紋輸入指紋圖譜識別軟件中構(gòu)建壇紫菜的數(shù)碼指紋庫，用于后續(xù)的壇紫菜種質(zhì)鑒定。實現(xiàn)壇紫菜種質(zhì)鑒定自動化的應(yīng)用的方法是當需對一批壇紫菜進行種質(zhì)鑒定時，只需對每個樣品進行指定引物的SRAP標記分析，按照構(gòu)建指紋庫時選定的多態(tài)性條帶的有無繪制出壇紫菜各樣品的DNA指紋圖譜，并轉(zhuǎn)化為由"1"和"0"組成的數(shù)碼指紋，再將每個樣品的數(shù)碼指紋輸入配套的指紋圖譜識別軟件中，軟件通過比較計算并可自動給出該樣品屬于已建庫品系中的哪一個，若該樣品不屬于已建庫品系中的任何一個，則軟件會顯示這是一個新材料，并給出該樣品與每個已建庫品系的相似系數(shù)，繼而提示是否將該新材料加入數(shù)據(jù)庫中。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1)本發(fā)明采用DNA分子標記技術(shù)來構(gòu)建壇紫菜的指紋圖譜，直接從DNA水平標記各壇紫菜種質(zhì)的遺傳差異，不受發(fā)育時期和環(huán)境因素的影響，因此結(jié)果更為準確、可靠；2)本發(fā)明提供了一套簡單有效的提取壇紫菜高質(zhì)量DNA的方法；3)本發(fā)明對PCR擴增的反應(yīng)體系及擴增程序進行了優(yōu)化，避免了試驗過程人為產(chǎn)生的誤差，使結(jié)果更為穩(wěn)定和可靠；4)采用本發(fā)明構(gòu)建的壇紫菜DNA數(shù)碼指紋，可以根據(jù)需要不斷增加，并對指紋進行更新，以滿足發(fā)展的需要；5)利用本發(fā)明所提供的指紋圖譜識別軟件很容易實現(xiàn)壇紫菜種質(zhì)鑒定的自動化；6)本發(fā)明所采用的指紋圖譜構(gòu)建及種質(zhì)鑒定方法，除了可以應(yīng)用于壇紫菜的種質(zhì)鑒定之外，還可以應(yīng)用其它物種的種質(zhì)鑒定。圖1為本發(fā)明所收集的15個壇紫菜品系115的SRAP標記分析電泳圖。在圖1中，橫坐標為本發(fā)明一個實施例中采用的15個壇紫菜品系的編號；縱坐標表示被挑選出來用于構(gòu)建15個壇紫菜品系DNA指紋圖譜的6條多態(tài)性條帶16，M為分子量標記。圖2為本發(fā)明所構(gòu)建的15個壇紫菜品系的DNA指紋圖譜。在圖2中，橫坐標為本發(fā)明一個實施例中采用的15個壇紫菜品系的編號115;縱坐標為構(gòu)建該DNA指紋圖譜所用的6條條帶編號16。具體實施方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例1本實施例采用收集到的15個在生產(chǎn)或研究上具有廣泛代表性的壇紫菜品系的葉狀體作為供試材料，提取基因組總DNA，進行指定引物的SRAP分子標記分析，選擇具有代表性的多態(tài)性條帶，建立他們的DNA指紋圖譜，并將指紋圖譜轉(zhuǎn)化為由"0"和"1"組成的數(shù)碼指紋，輸入指紋圖譜識別軟件建立壇紫菜的DNA數(shù)碼指紋庫，最后將所構(gòu)建的DNA數(shù)碼指紋庫用于壇紫菜的種質(zhì)鑒定中。具體實施方法如下1、選用的實驗材料選用部分生產(chǎn)或研究上廣泛使用的壇紫菜品系，如表1所示，目前己收集的生產(chǎn)或研究上廣泛使用的壇紫菜品系均保存于福建省科技廳批準設(shè)立的福建省壇紫菜種質(zhì)資源庫內(nèi)(目前設(shè)在集美大學(xué))。2、壇紫菜基因組DNA的提取及純化按以下程序提取各個壇紫菜材料的基因組總DNA，并進行純化。(1)取新鮮的藻體材料，用消毒海水處理后在勻漿機中勻漿，后加入3ml酶液(2%海螺酶，2mol/l葡萄糖)，3(TC保溫0.5h。酶解后用無菌水稀釋酶解物，篩絹過濾，濾液經(jīng)5000r/min，1(TC離心5min，收集細胞。用無菌水懸浮洗滌細胞一次，離心后重新收集細胞。(2)將收集的細胞轉(zhuǎn)入5ml離心管中，并加入4ml65'C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液(2%(v/w)CTAB，1.4MNaCL，20mMEDTA，100mMTris國HCL(PH8.0)，2%巰基乙醇)。(3)65。C溫浴2h(中間每10min反轉(zhuǎn)12次)。(4)15000rpm離心8min,將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。(5)冷卻至室溫后，輕柔加入等體積氯仿異戊醇(24:1)，輕緩顛倒40min。(6)15000rpm室溫離心10min，去沉淀，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。(7)在上清液加入2/3體積異丙醇，輕緩顛倒混勻，-20°<:放置1.5h以上。(8)離心去上清液(15000rpm，10min)。(9)用2ml75X乙醇洗兩次以去除鹽，無水乙醇一次。(10)倒去乙醇，37。C干燥(20min)，溶于600uL緩沖液，轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中。(11)加入5uLRnaseA(終濃度為50pL/mL)，37。C溫浴lh。(12)用等體積的酚、氯仿和異戊醇溶液對上述步驟(11)產(chǎn)生的溶液抽提2次，按體積比，酚氯仿異戊醇=25:24:1。(13)離心取上清(15000rpm，10min)。(14)加入2倍體積的無水乙醇，-20°<:保溫111(20min翻轉(zhuǎn)一次)。(15)15000rpm離心，-20'C預(yù)冷75%乙醇洗滌2-3次，無水乙醇一次。(16)37。C溫浴干燥乙醇，加入100微升TE緩沖液溶解備用，4'C保存。3、用獲得的基因組DNA為模板，指定引物進行SRAP擴增SRAP擴增的反應(yīng)體系為25uL的反應(yīng)體系中含2.5yL10XPCRBuffer,5ng模板DNA，2.5mmol/LMg2+,l.OUDNA聚合酶'200nmol/L引物，200umol/LdNTP。SRAP擴增的程序為95'C5min;94°Clmin，35°Clmin，72°C2min，5個循環(huán)；94°Clmin，48°Clmin，72°C2rain,35個循環(huán)；72'C10min。引物對組合序列為正向ME1:5'-TAGGTCCAAACCGGATA—3'反向EM9:5'-GACTGCGTACGAATTAAC_3，整個SRAP擴增反應(yīng)在MJResearchPTC-200型擴增儀上完成，擴增結(jié)束后，取擴增產(chǎn)物5uL在8X的聚丙烯酰胺膠上于60W恒功率電泳1.5h，經(jīng)銀染顯色，并用掃描儀記錄結(jié)果。4、選擇有代表型的多態(tài)性SRAP擴增條帶構(gòu)建供試材料的DNA指紋圖譜選擇多態(tài)性條帶的原則是最少引物，最少條帶，能將所有供試樣品完全分開，且選取的條帶具有穩(wěn)定性和重復(fù)性良好、多態(tài)性高的特點。本實施例從上述引物對擴增出來的所有條帶中選擇了具有代表性的6條多態(tài)性條帶，用于構(gòu)建這15個壇紫菜材料的DNA指紋圖譜(見圖1)。在該DNA指紋圖譜中，根據(jù)這6條擴增條帶的有無，繪制除15個供試材料的DNA指紋模式圖(見圖2)。在該指紋圖譜中，每個供試材料都具有其特異的DNA指紋，可以與其它供試材料彼此區(qū)分幵來。5、將所構(gòu)建的DNA指紋圖譜轉(zhuǎn)化為計算機可以識別的數(shù)碼指紋，構(gòu)建壇紫菜的數(shù)碼指紋庫在所構(gòu)建的DNA指紋圖譜中，用"1"和"0"分別代表圖譜中擴增條帶的有和無，這樣就可以將15個供試材料的DNA指紋圖譜轉(zhuǎn)化為由"1"和"0"組成的數(shù)碼指紋(見表3)，然后即可將各個材料名稱、特征及其對應(yīng)的數(shù)碼指紋輸入指紋圖譜識別軟件中構(gòu)建壇紫菜的數(shù)碼指紋庫，用于后續(xù)的壇紫菜種質(zhì)鑒定。表315個供試壇紫菜品系的數(shù)碼指紋序號數(shù)碼指紋序號數(shù)碼指紋序號數(shù)碼指紋11011006111110111100002011011711011112010001001011811111113010000400000090111001401010151000111001011015010100實施例2將本發(fā)明中構(gòu)建的壇紫菜數(shù)碼指紋庫應(yīng)用于壇紫菜的種質(zhì)鑒定假設(shè)要確定一批壇紫菜屬于生產(chǎn)上已大規(guī)模應(yīng)用的哪一個壇紫菜品系，就可以對這批壇紫菜按照如下方法進行鑒定，并最終確定屬于哪個品系。首先對這批壇紫菜按照實施例1中的方法提取基因組DNA，純化后作為模板，以ME1:5'-TAGGTCCAAACCGGATA-3，為正向引物，EM9:5'-GACTGCGTACGAATTAAC-3'為反向引物，應(yīng)用SRAP擴增的實驗體系進行SRAP擴增，擴增產(chǎn)物在8%的聚丙烯酰胺膠上于60W恒功率電泳1.5h，經(jīng)銀染顯色，按照選定的6條多態(tài)性條帶的有無繪制出這批壇紫菜各個樣品的DNA指紋圖譜，并轉(zhuǎn)化為由"1"和"0"組成的DNA數(shù)碼指紋，輸入指紋圖譜識別軟件中同已經(jīng)建庫的各種質(zhì)的數(shù)碼指紋進行對比，就可以知道這批材料屬于已知種質(zhì)中的哪一種。如果這批壇紫菜中某個樣品的數(shù)碼指紋為"100011"，軟件檢測到該指紋與壇紫菜DNA數(shù)碼指紋庫中標號為5的壇紫菜品系的數(shù)碼指紋一致，那么軟件就會顯示該樣品是種質(zhì)庫內(nèi)編號為YSV-①的品系，并給出該品系的特征為生長速度快，藻體寬，不易成熟。而如果某個樣品的數(shù)碼指紋為"101011"，軟件在數(shù)碼指紋庫中未檢測到與其一致的指紋，軟件就會顯示這是一個新品系，以及該樣品與數(shù)碼指紋庫中各壇紫菜品系的相似系數(shù)，并提示是否將該樣品的資料添加到數(shù)據(jù)庫中。實施例3本實施例采用福建省壇紫菜種質(zhì)資源庫內(nèi)的21個壇紫菜品系(YSIYSIV、YSV-①YSV-③、YSVI、YSW-①YSVII-⑤、YSX-①YSX-⑤和YSXIYSXI11)的葉狀體作為供試材料，提取基因組總DNA,進行指定引物的SRAP分子標記分析，選擇具有代表性的多態(tài)性條帶，建立他們的DNA指紋圖譜，并將指紋圖譜轉(zhuǎn)化為由"0"和"1"組成的數(shù)碼指紋，輸入指紋圖譜識別軟件建立壇紫菜的DNA數(shù)碼指紋庫，最后將所構(gòu)建的DNA數(shù)碼指紋庫用于壇紫菜的種質(zhì)鑒定中。具體實施方法如下2、選用的實驗材料采用福建省壇紫菜種質(zhì)資源庫內(nèi)的21個壇紫菜品系(YSIYSIV、YSV-①YSV-③、YSVI、YSW-①YSW-⑤、YSX-①YSX-⑤和YSXIYSXIU)的葉狀體。2、壇紫菜基因組DNA的提取及純化按以下程序提取各個壇紫菜材料的基因組總DNA，并進行純化。(1)取新鮮的藻體材料，用消毒海水處理后在勻漿機中勻漿，后加入3ml酶液(2%海螺酶，2mol/l葡萄糖)，30'C保溫0.5h。酶解后用無菌水稀釋酶解物，篩絹過濾，濾液經(jīng)5000r/min，10'C離心5min,收集細胞。用無菌水懸浮洗滌細胞一次，離心后重新收集細胞。(2)將收集的細胞轉(zhuǎn)入5ml離心管中，并加入4ml65'C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液(2%(v/w)CTAB，1.4MNaCL，20mMEDTA，100mMTris-HCL(PH8.0),2。/。巰基乙醇)。(3)65'C溫浴2h(中間每10min反轉(zhuǎn)12次)。(4)15000rpm離心8min,將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。(5)冷卻至室溫后，輕柔加入等體積氯仿異戊醇(24:1)，輕緩顛倒40min。(6)15000rpm室溫離心10min，去沉淀，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。(7)在上清液加入2/3體積異丙醇，輕緩顛倒混勻，-2(TC放置1.5h以上。(8)離心去上清液(15000rpm，10min)。(9)用2ml75X乙醇洗兩次以去除鹽，無水乙醇一次。(10)倒去乙醇，37。C干燥(20min)，溶于600uL緩沖液，轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中。(11)加入5liLRnaseA(終濃度為50uL/mL)，37'C溫浴lh。(12)用等體積的酚、氯仿和異戊醇溶液對上述步驟(11)產(chǎn)生的溶液抽提2次，按體積比，酚氯仿異戊醇=25:24:1。(13)離心取上清(15000rpm，10min)。(14)加入2倍體積的無水乙醇，-20°<:保溫111(20min翻轉(zhuǎn)一次)。(15)15000卬m離心，-20°〇預(yù)冷75%乙醇洗滌2-3次，無水乙醇一次。(16)37。C溫浴干燥乙醇，加入100微升TE緩沖液溶解備用，4'C保存。3、用獲得的基因組DNA為模板，指定引物進行SRAP擴增SRAP擴增的反應(yīng)體系為25iiL的反應(yīng)體系中含2.5wL10XPCRBuffer,5ng模板DNA，2.5mmol/LMg2+，l.OUDNA聚合酶，200nmol/L引物，200umol/LdNTP。SRAP擴增的程序為95°C5min;94°Clmin，35°Clmin，72°C2min，5個循環(huán)；94°Clmin,48°Clmin，72°C2min，35個循環(huán)；72°C10min。引物對l組合序列為-正向ME2:5'-TAGGTCCAAACCGGAGC—3'反向EM5:5'-GACTGCGTACGAATTTGC-3，引物對2組合序列為正向ME8:5'—TGAGTCCAAACCGGACT-3'反向EM2:5'-GACTGCGTACGAATTCTG-3'整個SRAP擴增反應(yīng)在MJResearchPTC-200型擴增儀上完成，擴增結(jié)束后，取擴增產(chǎn)物5yL在8X的聚丙烯酰胺膠上于60W恒功率電泳1.5h,經(jīng)銀染顯色，并用掃描儀記錄結(jié)果。4、選擇有代表型的多態(tài)性SRAP擴增條帶構(gòu)建供試材料的DNA指紋圖譜選擇多態(tài)性條帶的原則是最少引物，最少條帶，能將所有供試樣品完全分開，且選取的條帶具有穩(wěn)定性和重復(fù)性良好、多態(tài)性高的特點。本實施例從上述2個引物對擴增出來的所有條帶中選擇了具有代表性的多態(tài)性條帶，用于構(gòu)建這21個壇紫菜材料的DNA指紋圖譜。根據(jù)擴增條帶的有無，繪制除21個供試材料的DNA指紋模式圖。實施例4將本發(fā)明中構(gòu)建的壇紫菜數(shù)碼指紋庫應(yīng)用于壇紫菜的種質(zhì)鑒定假設(shè)要確定一批壇紫菜屬于生產(chǎn)上巳大規(guī)模應(yīng)用的哪一個壇紫菜品系，就可以對這批壇紫菜按照如下方法進行鑒定，并最終確定屬于哪個品系。首先對這批壇紫菜按照實施例3中的方法提取基因組DNA，純化后作為模板，分別以ME2:5，-TAGGTCCAAACCGGAGC-3，為正向引物和EM5:5，-GACTGCGTACGAATTTGC_3，為反向引物以及以ME8:5，-TGAGTCCAAACCGGACT-3'為正向引物和EM2:5，-GACTGCGTACGAATTCTG-3為反向引物，應(yīng)用SRAP擴增的實驗體系進行2次SRAP擴增，擴增產(chǎn)物在8%的聚丙烯酰胺膠上于60W恒功率電泳1.5h，經(jīng)銀染顯色，按照選定的多態(tài)性條帶的有無繪制出這批壇紫菜各個樣品的DNA指紋圖譜，并轉(zhuǎn)化為由"1"和"0"組成的DNA數(shù)碼指紋，輸入指紋圖譜識別軟件中同己經(jīng)建庫的各種質(zhì)的數(shù)碼指紋進行對比，就可以知道這批材料屬于己知種質(zhì)中的哪一種。如果這批壇紫菜中某個樣品的數(shù)碼指紋與壇紫菜DNA數(shù)碼指紋庫中某標號的壇紫菜品系的數(shù)碼指紋一致，那么軟件就會顯示該樣品是種質(zhì)庫內(nèi)編號為該標號的品系，并給出該品系的特征。而如果某個樣品的數(shù)碼指紋在數(shù)碼指紋庫中未檢測到與其一致的指紋，軟件就會顯示這是一個新品系，以及該樣品與數(shù)碼指紋庫中各壇紫菜品系的相似系數(shù)，并提示是否將該樣品的資料添加到數(shù)據(jù)庫中。序列表表2PCR擴增所采用的引物編號及其序列<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權(quán)利要求1.壇紫菜種質(zhì)鑒定的指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟1)收集壇紫菜樣品；2)各樣品基因組DNA的提取與純化；3)PCR擴增利用所提取的基因組DNA作為模板，以經(jīng)過優(yōu)化的實驗體系進行SRAP分子標記分析；4)選擇具有代表性的SRAP多態(tài)性條帶用于構(gòu)建各供試樣品的DNA指紋圖譜；5)將構(gòu)建的DNA指紋圖譜轉(zhuǎn)化成為計算機可以識別的數(shù)碼指紋，并輸入指紋圖譜識別軟件中，建立壇紫菜種質(zhì)的數(shù)碼指紋庫，用于后續(xù)的壇紫菜種質(zhì)鑒定；6)壇紫菜種質(zhì)的自動化鑒定。2、如權(quán)利要求1所述的壇紫菜種質(zhì)鑒定的指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于所述的壇紫菜樣品為收集生產(chǎn)或科學(xué)研究上具有代表性的壇紫菜品系。3、如權(quán)利要求l所述的壇紫菜種質(zhì)鑒定的指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于各樣品基因組DNA的提取是取新鮮的藻體材料，用消毒海水處理后，在勻漿機中勻漿，后加入酶液，3(TC保溫0.52h，酶解結(jié)束后用無菌水稀釋酶解物，篩絹過濾，濾液經(jīng)30008000r/min，l(TC離心510min，收集細胞，用無菌水懸浮洗滌細胞一次，離心后重新收集細胞，并收集的細胞轉(zhuǎn)入5ml離心管中用CTAB法提取基因組DNA。4、如權(quán)利要求3所述的壇紫菜種質(zhì)鑒定的指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于酶液的組成為2%海螺酶，2mo1/1葡萄糖。5、如權(quán)利要求1所述的壇紫菜種質(zhì)鑒定的指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于PCR反應(yīng)體系為25pL的反應(yīng)體系中含2.5^L10xPCRBuffer,5ng模板DNA，2.5mmol/LMg2+，1.0UDNA聚合酶，200nmol/L引物，200pmol/LdNTP。6、如權(quán)利要求1所述的壇紫菜種質(zhì)鑒定的指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于擴增程序為95。C預(yù)變性5min;94°Clmin，35°Clmin，72°C2min，5個循環(huán)；94°Clmin，48°Clmin，72°C2min，35個循環(huán);72°C延伸l(kin。7、如權(quán)利要求1所述的壇紫菜種質(zhì)鑒定的指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于PCR擴增的引物對序列為表2中正向引物及反向引物隨機組合的1對或多對引物。表2PCR擴增所采用的引物編號及其序列<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>8、如權(quán)利要求1所述的壇紫菜種質(zhì)鑒定的指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于選擇具有代表性的SRAP多態(tài)性條帶用于構(gòu)建各供試樣品的DNA指紋圖譜的方法是以壇紫菜品系編號為橫坐標，以選擇的具有代表性的SRAP多態(tài)性條帶的編號為縱坐標，在每一縱橫坐標交結(jié)處，有擴增帶用"一"表示，沒有擴增帶不作任何標記，由此構(gòu)建出各個壇紫菜樣品的DNA指紋圖譜，且所構(gòu)建的每個壇紫菜樣品的DNA指紋圖譜都具有唯一性。9、如權(quán)利要求1所述的壇紫菜種質(zhì)鑒定的指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于將構(gòu)建的DNA指紋圖譜轉(zhuǎn)化成為計算機可以識別的數(shù)碼指紋，并輸入指紋圖譜識別軟件中，建立壇紫菜種質(zhì)的數(shù)碼指紋庫的方法是在所構(gòu)建的DNA指紋圖譜中，用"1"和"0"分別代表圖譜中擴增帶的有和無，將DNA指紋圖譜轉(zhuǎn)化為由"1"和"0"組成的數(shù)碼指紋，使得每個材料都具有各自特異的由"1"和"0"組成的數(shù)碼指紋，然后將各個材料名稱、特征及其對應(yīng)的數(shù)碼指紋輸入指紋圖譜識別軟件中構(gòu)建壇紫菜的數(shù)碼指紋庫，用于后續(xù)的壇紫菜種質(zhì)鑒定。10、如權(quán)利要求1所述的壇紫菜種質(zhì)鑒定的指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于實現(xiàn)壇紫菜種質(zhì)鑒定自動化的應(yīng)用的方法是當需對一批壇紫菜進行種質(zhì)鑒定時，只需對每個樣品進行指定引物的SRAP標記分析，按照構(gòu)建指紋庫時選定的多態(tài)性條帶的有無繪制出壇紫菜各樣品的DNA指紋圖譜，并轉(zhuǎn)化為由"1"和"0"組成的數(shù)碼指紋，再將每個樣品的數(shù)碼指紋輸入配套的指紋圖譜識別軟件中，軟件通過比較計算并可自動給出該樣品屬于已建庫品系中的哪一個，若該樣品不屬于己建庫品系中的任何一個，則軟件會顯示這是一個新材料，并給出該樣品與每個已建庫品系的相似系數(shù)，繼而提示是否將該新材料加入數(shù)據(jù)庫中。全文摘要壇紫菜種質(zhì)鑒定的指紋圖譜的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，涉及一種壇紫菜的指紋圖譜，尤其是涉及一種壇紫菜種質(zhì)鑒定的指紋圖譜的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。提供一種快速、準確的壇紫菜種質(zhì)鑒定的指紋圖譜的構(gòu)建方法及其在實現(xiàn)壇紫菜種質(zhì)鑒定自動化的應(yīng)用。收集壇紫菜樣品；各樣品基因組DNA的提取與純化；PCR擴增利用所提取的基因組DNA作為模板，以經(jīng)過優(yōu)化的實驗體系進行SRAP分子標記分析；選擇具有代表性的SRAP多態(tài)性條帶用于構(gòu)建各供試樣品的DNA指紋圖譜；將構(gòu)建的DNA指紋圖譜轉(zhuǎn)化成為計算機可以識別的數(shù)碼指紋，并輸入指紋圖譜識別軟件中，建立壇紫菜種質(zhì)的數(shù)碼指紋庫，用于后續(xù)的壇紫菜種質(zhì)鑒定；壇紫菜種質(zhì)的自動化鑒定。文檔編號G01N1/28GK101126746SQ20071000932公開日2008年2月20日申請日期2007年8月3日優(yōu)先權(quán)日2007年8月3日發(fā)明者燕徐,紀德華,謝潮添,陳昌生申請人:集美大學(xué)