專利名稱：：一種用高效液相色譜法測(cè)定葡萄組織中單體酚含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種色譜檢測(cè)的方法，具體涉及一種用高效液相色譜法測(cè)定葡萄組織中單體酚含量的方法，即一種高效液相色譜切換檢測(cè)波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定葡萄組織中6種單體酚含量的方法。二
背景技術(shù)：
：高效液相色譜法(HPLC)因其檢測(cè)的有效性和準(zhǔn)確性而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留、激素、多酚類物質(zhì)及有機(jī)酸等多個(gè)實(shí)際測(cè)量領(lǐng)域中。通常情況下，利用高效液相色譜法進(jìn)行樣品的測(cè)定時(shí)需要經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的提取和純化程序，且大都是在恒定波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)單組分體系而言，在恒定波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定是行之有效的。但對(duì)多組分體系進(jìn)行測(cè)定時(shí)，由于各組分的最大吸收波長(zhǎng)不盡相同，加之繁瑣的前處理過(guò)程會(huì)使待測(cè)物質(zhì)有一定的損失，因此利用恒定波長(zhǎng)法很難全面檢測(cè)出多組分體系中各組分的真實(shí)含量。為了提高多組分體系檢測(cè)的靈敏度并客觀地反映多組分中被測(cè)組分的真實(shí)含量，應(yīng)該盡可能地簡(jiǎn)化樣品的前處理步驟并在各物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，尤其是對(duì)微量、痕量物質(zhì)。植物多酚(plantpolyphenol)是一類存在于植物的皮、根、莖、葉和果實(shí)中的具有生物活性的天然化合物，被廣泛地應(yīng)用在化工、醫(yī)藥、林業(yè)、食品等領(lǐng)域。眾所周知，葡萄富含多種多酚類物質(zhì)，它是世界上栽培面積最大的水果之一，葡萄多酚已經(jīng)成為生產(chǎn)實(shí)踐所需多酚的一個(gè)非常重要的來(lái)源，能夠真實(shí)準(zhǔn)確地測(cè)定不同葡萄組織中多酚含量具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供了一種用高效液相色譜法測(cè)定葡萄組織中單體酚含量的方法，切換波長(zhǎng)使得所測(cè)物質(zhì)均在其最大吸收波長(zhǎng)下得到檢測(cè)，從而在測(cè)定層面上客觀真實(shí)地反映其含量，測(cè)定準(zhǔn)確，方法簡(jiǎn)單、靈敏、重現(xiàn)性好。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種用高效液相色譜法測(cè)定葡萄組織中單體酚含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟a、采用Z0RBAXSB-C184.6MmX250Wn，5Mm色譜柱；b、以1.3。/。的乙酸水溶液(A)和乙腈(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫程序?yàn)?.000.01min014%B，0.016.50min14%11%B，6.5010.00min11%B，10.0010.01minll%16%B，10.0130.00minl6%30%B，30.0035.00min30%0B;c、流速0.8mL/min，進(jìn)樣量20叱，柱溫30。C;d、利用二極管陣列檢測(cè)器和紫外分光光度計(jì)確定各目標(biāo)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)，進(jìn)而切換檢測(cè)波長(zhǎng)使得所有待測(cè)物質(zhì)均在其最大吸收波長(zhǎng)下得到檢測(cè)e、測(cè)定過(guò)程中切換檢測(cè)波長(zhǎng)，使得所測(cè)物質(zhì)均在其最大吸收波長(zhǎng)下得到檢測(cè)，波長(zhǎng)程序?yàn)?.726.02min272nm，7.177.60min260nm，8.589.18min280nm，12.8213.74min280nm，20.3921.22min275nm，29.5930.4min306nm，其余時(shí)間段的檢測(cè)波長(zhǎng)均為360nm;與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下-1、本發(fā)明測(cè)定準(zhǔn)確，方法簡(jiǎn)單、靈敏、重現(xiàn)性好。2、線性試驗(yàn)及檢測(cè)限試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，6種單體酚的校準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好(r^0.9990);與恒定波長(zhǎng)的檢測(cè)方法相比，在該方法下6種單體酚的檢測(cè)限(L0D，S/N23)均有不同程度的降低，靈敏度得到提高。3、6種單體酚加標(biāo)回收率^89.5%，保留時(shí)間及峰面積在日內(nèi)(n二10)和日間(n二10)實(shí)驗(yàn)中的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別SO.3%、2.9%和0.3%、3.1%。四圖1是混合標(biāo)樣的等高線圖(峰序號(hào)l-沒(méi)食子酸，2-原兒茶酸，3-兒茶素，4-表兒茶素，5-表兒茶素沒(méi)食子酸酯，6-白藜蘆醇。)圖2為兒茶素的光譜圖。圖3是白藜蘆醇(RES)的加標(biāo)定性色譜圖，其中a為加標(biāo)樣，b為不加標(biāo)樣。圖4為韌皮部中6種單體酚在不同色譜條件下的比較圖，其中a為切換檢測(cè)波長(zhǎng)，b為恒定檢測(cè)波長(zhǎng)。五具體實(shí)施例方式本發(fā)明為一種高效液相色譜切換檢測(cè)波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定葡萄組織中6種單體酚含量的方法，具體出峰順序?yàn)闆](méi)食子酸(Gallicacid)、原兒茶酸(Protocatechuicacid)、兒茶素((+)_Catechin)、表兒茶'素((-)-Epicatechin)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯((-)-Epicatechin-3-0-gallate)和白藜蘆醇(Trans-Resveratrol)。切換波長(zhǎng)使得所測(cè)物質(zhì)均在其最大吸收波長(zhǎng)下得到檢測(cè)，從而在測(cè)定層面上客觀真實(shí)地反映其含量。通過(guò)考察不同的試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了大量的反復(fù)比較試驗(yàn)，最終選用了最佳tU色譜條件。與恒定檢測(cè)波長(zhǎng)的方法相比，該方法明顯地降低了被測(cè)物質(zhì)的檢出限，并且在測(cè)定實(shí)際樣品中得到了基線平穩(wěn)、分離效果和峰形皆好的色譜圖。下面以具體實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例一，色譜條件的建立及樣品檢測(cè)儀器LC-2010AHT型配備自動(dòng)進(jìn)樣裝置的高效液相色譜儀，LC-6AD型高效液相色譜儀型配備SPD-10MAvp二極管陣列檢測(cè)器(DAD),所有部件均由島津CLASS-VP6.12工作站控制，UV-1700型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)。試劑沒(méi)食子酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯和白藜戶醇等標(biāo)樣均購(gòu)自Sigma和Fluka公司；甲醇和乙腈為色譜純(美國(guó)TEDIA公司)；乙酸為國(guó)產(chǎn)分析純。采用ZORBAXSB-C184.6nmx250pm，5nm色譜柱；流速O.8mL/min,進(jìn)樣量20pL，柱溫30。C;流動(dòng)相的選擇對(duì)不同酸濃度的甲醇和乙酸水溶液，乙腈和乙酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行考察，經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)以1.3呢的乙酸水溶液(A)和乙腈(B)為流動(dòng)相效果較佳。梯度洗脫程序?yàn)?.000.01min014%B，0.016.50min14%11%B,6.5010.00min11%B，10.0010.01minll%16%B，10.0130.00min16%30%B，30.0035.00min30%0B;檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇利用紫外二極管陣列檢測(cè)器對(duì)6種單體酚混標(biāo)溶液在190800nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描得到各物質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)帶(圖l)，然后用紫外分光光度計(jì)確定各物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)(圖2)。沒(méi)食子酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯及白藜盧醇的最大吸收波長(zhǎng)分別為272nm、260nm、280nm、280nm、275nm及306nm。根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間選擇合適的切換波長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)，其余檢測(cè)時(shí)間段均為恒定波長(zhǎng)360nm(在360nm下可以避免溶劑峰及許多雜質(zhì)峰的出現(xiàn))。機(jī)器運(yùn)行過(guò)程中，在190370nm以內(nèi)任意切換檢測(cè)波長(zhǎng)，波長(zhǎng)的響應(yīng)及穩(wěn)定時(shí)間不超過(guò)0.1秒(此數(shù)據(jù)為儀器的性能參數(shù)，由日本島津公司提供)，本發(fā)明選擇在O.Olmin內(nèi)切換波長(zhǎng)，并得到很好的效果。波長(zhǎng)程序?yàn)?.726.02min272nm，7.177.60min260nm，8.589.18min280nm，12.8213.74min280nm，20.3921.22min275nm,29.5930.4min306nm，其余時(shí)間段的檢測(cè)波長(zhǎng)均為360nm;定性實(shí)驗(yàn)利用相對(duì)保留時(shí)間法及添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)法定性。比對(duì)混標(biāo)溶液和樣品供試液在相同的色譜條件下的色譜圖和相對(duì)保留時(shí)間；在樣品中分別加入適量的各種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，比較相同色譜條件下不加標(biāo)樣品及加標(biāo)樣品的色譜圖。如圖3所示，在樣品中加入標(biāo)樣前后，白藜蘆醇(trans-Resveratrol，縮寫為RES)出峰的位置是一致的。標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)精確稱取6種標(biāo)樣各5mg，用甲醇定容在10mL的棕色容量瓶中，依次稀釋20、40、100、200和400倍，混標(biāo)溶液密封保存于-20'C冰箱中備用。將混合標(biāo)樣溶液按濃度由低到高設(shè)置自動(dòng)進(jìn)樣，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，以各單體酚的平均峰面積(A)對(duì)濃度(C)繪制校準(zhǔn)曲線，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)(見(jiàn)表l)。表16種單體酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸分析<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>加標(biāo)回收率、精密度、準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱取葡萄果實(shí)和冬芽進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，分別在樣品中加入高、中、低3個(gè)水平的混合標(biāo)樣，每組重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其回收率，并計(jì)算含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD);對(duì)一定濃度的混標(biāo)溶液進(jìn)行日內(nèi)和日間實(shí)驗(yàn)，日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣10次，日間每隔1d進(jìn)樣1次并持續(xù)10d,計(jì)算每一種單體酚的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD(見(jiàn)表2)。表26種單體酚的加標(biāo)回收率，方法的精密度和準(zhǔn)確度<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>樣品中含量的測(cè)定稱取12g樣品，用液氮研磨至粉末狀，加入15mL95%甲醇攪勻(料液比為1:10)，迅速轉(zhuǎn)移至套有黑紙的離心管中，于4。C下在超聲波機(jī)中密封提取15min，10000r/min離心10min(4°C)。重復(fù)提取三次，合并提取液，減壓濃縮至15mL即為待測(cè)液，過(guò)0.45Mm濾頭后進(jìn)入HPLC檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表3表3葡萄組織中6種單體酚的平均含量(mg/kg)單體酚葡萄果實(shí)冬芽韌皮部木質(zhì)部沒(méi)食子酸15.11±0.186.63±0.0541.49±0.4912.41±0.09原兒茶酸13.02±0.081&72±0.12162.30±0.825&24±0.11兒茶素215.42±0.69220.36±0.34387.88±0.16128.57±0.48表兒茶素116.42±0.34669.33±0.25521.78±0.03169.15±0.11表兒茶素沒(méi)食子酸酯15.87±0.2672.77土0.0227.27±0.0183.32±0.09白藜蘆醇10.38±0.02307.38±0.44324.28±0.032005.08±0.08實(shí)施例二切換檢測(cè)波長(zhǎng)與恒定檢測(cè)波長(zhǎng)的比較實(shí)驗(yàn)儀器同實(shí)施例一試劑同實(shí)施例一色譜條件兩種方法的色譜條件除波長(zhǎng)設(shè)置程序不同外，恒定檢測(cè)波長(zhǎng)方法的檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，其他參數(shù)均同實(shí)施例一色譜圖和最低檢出限(LOD)的比較兩種方法下分析相同的樣品，以信噪比(S/N)大于3時(shí)所檢測(cè)出各種物質(zhì)的量為最低檢出限，色譜圖見(jiàn)圖4，檢出限見(jiàn)表4表4兩種條件下6種單體酚的檢出限對(duì)照品恒定波長(zhǎng)下的檢出限切換波長(zhǎng)下的檢出限沒(méi)食子酸0.540.27原兒茶酸0.660.33兒茶素0.610.62表兒茶素0.930.93表兒茶素沒(méi)食子酸酸酯0.790.76白藜蘆醇0.430.2權(quán)利要求1、一種用高效液相色譜法測(cè)定葡萄組織中單體酚含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟a、采用ZORBAXSB-C184.6μm×250μm，5μm色譜柱；b、以1.3％的乙酸水溶液(A)和乙腈(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫程序?yàn)?.00～0.01min0～14％B，0.01～6.50min14％～11％B，6.50～10.00min11％B，10.00～10.01min11％～16％B，10.01～30.00min16％～30％B，30.00～35.00min30％～0B；c、流速0.8mL/min，進(jìn)樣量20μL，柱溫30℃；d、測(cè)定過(guò)程中切換檢測(cè)波長(zhǎng)，使得所測(cè)物質(zhì)均在其最大吸收波長(zhǎng)下得到檢測(cè)，波長(zhǎng)程序?yàn)?.72～6.02min272nm，7.17～7.60min260nm，8.58～9.18min280nm，12.82～13.74min280nm，20.39～21.22min275nm，29.59～30.4min306nm，其余時(shí)間段的檢測(cè)波長(zhǎng)均為360nm；2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用高效液相色譜法測(cè)定葡萄組織中單體酚含量的方法，其特征在于采用二極管陣列檢測(cè)器及紫外分光光度計(jì)確定各待測(cè)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)。全文摘要本發(fā)明涉及一種用高效液相色譜法測(cè)定葡萄組織中單體酚含量的方法，其切換波長(zhǎng)使得所測(cè)物質(zhì)均在其最大吸收波長(zhǎng)下得到檢測(cè)，從而在測(cè)定層面上客觀真實(shí)地反映其含量，測(cè)定準(zhǔn)確，方法簡(jiǎn)單、靈敏、重現(xiàn)性好。本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括以下步驟a.采用ZORBAXSB-C184.6μm×250μm，5μm色譜柱；b.以1.3％的乙酸水溶液(A)和乙腈(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；c.流速0.8ml/min，進(jìn)樣量20μl，柱溫30℃；d.確定各目標(biāo)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)，進(jìn)而切換檢測(cè)波長(zhǎng)使得所有待測(cè)物質(zhì)均在其最大吸收波長(zhǎng)下得到檢測(cè)；e.測(cè)定過(guò)程中切換檢測(cè)波長(zhǎng)，使得所測(cè)物質(zhì)均在其最大吸收波長(zhǎng)下得到檢測(cè)。文檔編號(hào)G01N30/74GK101173915SQ20071001874公開(kāi)日2008年5月7日申請(qǐng)日期2007年9月25日優(yōu)先權(quán)日2007年9月25日發(fā)明者昂張,房玉林,華王,陳書霞申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)