專利名稱：草酸診斷/測定試劑盒及草酸濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種草酸診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定草酸濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
草酸作為一種最簡單的二元羧酸，普遍存在于植物界中，植物草酸具有重要的生理功能，并且在植物抗逆性中發(fā)揮積極作用。草酸多以鉀鹽或鈣鹽的形式存在，而在秋海棠、芭蕉中卻以游離酸的形式存在，草酸有毒，能溶解于水。草酸是一種重要的化工原料，廣泛用于醫(yī)藥、染料、涂料、稀土金屬的分離和提純以及衣物的漂白。
測定草酸的方法有離子色譜法、電導(dǎo)離子色譜法、HPLC方法。臨床上大多數(shù)結(jié)石屬草酸鈣結(jié)石。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及偶聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定草酸濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的草酸診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進(jìn)行草酸濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明草酸濃度測定方法原理如下 草酸+氧草酸氧化酶二氧化碳+過氧化氫 過氧化氫+輔酶NAD(P)H氧化酶還原型輔酶+氧 這種方法應(yīng)用草酸氧化酶(oxalate oxidase；EC 1.2.3.4)偶聯(lián)NAD(P)H氧化酶(NADPH oxidase；EC 1.6.3.1)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法/終點比色法。草酸氧化酶酶解草酸反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，再通過(偶)聯(lián)合NAD(P)H氧化酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)氧化成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過測量340nm處吸光度上升的程度/速度，可以測算草酸的濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明草酸診斷/測定試劑盒較為理想 緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 輔酶 3mmol/L 草酸氧化酶 10000U/L NAD(P)H氧化酶12000U/L 本發(fā)明的草酸診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、草酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶。
輔酶、草酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、NAD(P)H氧化酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶。
輔酶、草酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定草酸濃度的方法，其輔酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一種。

具體實施例方式 下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實施例一 本實施例的草酸診斷/測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑500mmol/L 輔酶 3mmol/L 草酸氧化酶10000U/L NAD(P)H氧化酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測草酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負(fù)反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出草酸的濃度大小。
實施例二 本實施例的草酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 輔酶3mmol/L 試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑500mmol/L 草酸氧化酶10000U/L NAD(P)H氧化酶12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測草酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為負(fù)反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出草酸的濃度大小。
實施例三 本實施例的草酸診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 輔酶3mmol/L 試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L NAD(P)H氧化酶 12000U/L 試劑3 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 草酸氧化酶 10000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定草酸濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測草酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向為負(fù)反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出草酸的濃度大小。
申請人:經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的草酸濃度測定方法，其方法原理如下
草酸+氧 草酸氧化酶 二氧化碳+過氧化氫
過氧化氫+輔酶 NAD(P)H氧化酶 還原型輔酶+氧
將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，測算出草酸的濃度大小測定結(jié)果。
2.一種草酸診斷/測定試劑盒，主要成分包括
緩沖液 20-500mmol/L
穩(wěn)定劑 1-4000mmol/L
輔酶 1-6mmol/L
草酸氧化酶 1000-80000U/L
NAD(P)H氧化酶 1000-80000U/L
其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述草酸診斷/測定試劑盒，其特征在于
由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、草酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶組成單劑試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述草酸診斷/測定試劑盒，其特征在于
由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、草酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶組成。輔酶、草酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述草酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、草酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、NAD(P)H氧化酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、草酸氧化酶組成。輔酶、草酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述草酸診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑1-4000mmol/L或0.1％-100％體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的草酸診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定草酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、草酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測算出草酸的濃度大小。
文檔編號G01N33/50GK101329332SQ20071002472
公開日2008年12月24日 申請日期2007年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司