專利名稱：：用單一特異性捕獲劑定量檢測(cè)分析物的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說涉及采用一種特異性捕獲劑定量檢測(cè)一種分析物的新方法，適用于各種基于固相表面的檢測(cè)平臺(tái)，包括微孔板、濾膜、樹J茲球，等等。
背景技術(shù)：
：檢測(cè)生物(包括人類)組織樣本中特定蛋白質(zhì)因子的含量，對(duì)于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域的&出研究和應(yīng)用具有非常重要的意義。例如，檢測(cè)病原微生物的特異性蛋白質(zhì)組分是目前診斷傳染病的主要手段；同樣，測(cè)定癌癥和心血管疾病的早期生物標(biāo)記蛋白質(zhì)因子含量的變化對(duì)于這些疾病的早發(fā)現(xiàn)早治療和療效觀察極為重要。隨著醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域的不斷進(jìn)展，對(duì)各種蛋白質(zhì)因子進(jìn)行定量檢測(cè)的需求也越來越大。為滿足這一不斷增長(zhǎng)的要求，近年來各種蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)方法應(yīng)運(yùn)而生，例如各種免疫檢測(cè)技術(shù)、雙向凝膠電泳、質(zhì)譜分析和肽圖譜分析等等。其中最方便、應(yīng)用范圍最廣也是目前使用最多的是免疫檢測(cè)技術(shù)中的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,簡(jiǎn)稱ELISA;參見Engvall和Perlman,1971,I咖unochemistry8:871-4.)。ELISA的具體操作方式有若干種，其中最常用的是夾心法酶聯(lián)免疫吸附檢觀'nsandwichELISA),用于定量檢測(cè)生物樣本中某種蛋白質(zhì)的濃度。夾心法ELISA采用能夠和同一種抗原蛋白質(zhì)的不同抗原決定簇結(jié)合的兩種不同但是互相配合的抗體來完成，一種抗體和抗原的結(jié)合不干擾另一種抗體和同一個(gè)抗原分子的結(jié)合。這種方法的技術(shù)要點(diǎn)是(1)將捕獲抗體(captureantibody)包被在某一固相表面上(最常用的是96-孔微量板的微孔底部平面)；(2)加入待測(cè)生物樣本，讓其中含有的抗原蛋白質(zhì)分子(分析物)與結(jié)合在固相表面上的捕獲抗體特異性結(jié)合'然后洗除未結(jié)合的非特異性物質(zhì)；(3)加入標(biāo)有某種^t艮道分子(酶、生物素、半抗原、熒光基團(tuán)、寡聚核芬酸或其他類型分子)的片全測(cè)抗體(detectionantibody)'4吏之與固相表面上被捕獲的抗原分子特異性結(jié)合，然后洗除未結(jié)合的檢測(cè)抗體；(4)加入使報(bào)道分子產(chǎn)生信號(hào)的相關(guān)試劑(例如酶標(biāo)親和素、^底物等)，然后用96-孔酶標(biāo)儀讀測(cè)信號(hào)強(qiáng)度，或者直接測(cè)定報(bào)道分子(例如熒光強(qiáng)度等)的量，或用實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增寡聚核苷酸后檢測(cè)。根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)度，參照分析物的已知濃度標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線，從而確定樣本中分析物的濃度。雖然夾心法ELISA的特異性和靈敏度都比較高，<旦是該方法的應(yīng)用有一個(gè)重要局限性如果要建立檢測(cè)一種分析物的夾心法ELISA檢測(cè)方法，必須擁有針對(duì)該分析物的兩種不同抗體(捕獲抗體和;f全測(cè)抗體)，而且要求這兩種抗體對(duì)該分析物都擁有高度特異性和高度親合力，同時(shí)它們之間必須互相配合，即捕獲抗體和分析物的結(jié)合不影響檢測(cè)抗體對(duì)同一分析物分子的結(jié)合。這些要求在很大程度上限制了夾心法ELISA的更廣泛應(yīng)用，這是因?yàn)?，在?shí)際工作中往往要經(jīng)過很多努力、很長(zhǎng)時(shí)間才能獲得上述能夠互相配合的針對(duì)同一個(gè)分析物的兩種抗體。許多生物學(xué)上或臨床檢測(cè)上非常重要的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，盡管多年反復(fù)試驗(yàn)仍然無法獲得可以用于夾心法ELISA的配對(duì)抗體。而對(duì)于那些分子量較小或者抗原決定蔟較少并且靠在一起的蛋白質(zhì)，就更難獲得兩種互相配合的抗體。有時(shí)可以獲得一種擁有高特異性高親和力的抗體，但是要找到另一種具有相似優(yōu)點(diǎn)并且能夠互相配對(duì)的另一種抗體卻極為困難。這也是為什么目前市場(chǎng)上約有針對(duì)超過5000種不同蛋白質(zhì)的抗體，但只有約400-500種蛋白質(zhì)可以用夾心法ELISA進(jìn)行定量檢測(cè)。為了克服夾心法ELISA的上述局限，人們提出并實(shí)驗(yàn)了若干種改進(jìn)方法，其中之一是將生物樣本中的所有抗原蛋白質(zhì)預(yù)先用熒光化合物等報(bào)道分子進(jìn)行直接標(biāo)記(Miller等，2003,Proteomics.3:56-63)。然后與固相載體上的抗體結(jié)合，洗除非特異性物質(zhì)后，直接檢測(cè)結(jié)合在固相抗體上被標(biāo)記的分析物。這個(gè)方法的原理目前已經(jīng)被若干家制造商作為檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)用于他們的蛋白質(zhì)芯片產(chǎn)品。此方法雖然簡(jiǎn)單易行，只需要一種抗體(捕獲抗體)就能夠進(jìn)行檢測(cè)，但存在以下缺點(diǎn)第一，生物樣本中常常含有成千上萬種大小分子，其中很多會(huì)直接或間接地干擾對(duì)特異性分析物的標(biāo)記效率，濃度低的蛋白質(zhì)往往更難有效地被標(biāo)記。第二，標(biāo)記過程本身很可能修飾改變分析物分子上的抗原決定簇特征，降低甚至抑制與固相上捕獲抗體的結(jié)合。第三，樣本中占?jí)旱苟鄶?shù)的非特異性物質(zhì)在沒有4皮清除之前就已經(jīng)被有效標(biāo)記，由于分析物未經(jīng)過特異性富集(濃縮)，這些同樣攜帶報(bào)道分子的非特異性物質(zhì)將產(chǎn)生很強(qiáng)的檢測(cè)本底噪音，造成特異性和靈敏度都大大降低，許多以微孔板或者蛋白.質(zhì)微陣作為檢測(cè)平臺(tái)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證明了這一點(diǎn)。EUSA的另外一種形式是所謂"抗原在下(antigen-down)ELISA，，,即用抗原包被微孔板的微孔，然后加入相應(yīng)的抗體。這一形式主要是用來檢測(cè)血清樣本中某一抗體的存在，用于包被的抗原蛋白質(zhì)是經(jīng)過提純的或半提純的，而待測(cè)的血清經(jīng)過適當(dāng)稀釋后加入其內(nèi)，然后再加上酶標(biāo)二級(jí)抗體，就能檢測(cè)到該血清樣本中是否存在針對(duì)該抗原的抗體。這一方法經(jīng)過適當(dāng)修飾后，也可以用來檢測(cè)某一樣本中抗原的存在。具體做法是，用待測(cè)樣本包被微孔，然后加上標(biāo)有信號(hào)分子的特異性抗體，除去未結(jié)合的抗體后，即可以通過報(bào)道分子顯示信號(hào)。顯而易見，這種方法只需要一種抗體就可以進(jìn)行檢測(cè)。理想情況下，所產(chǎn)生信號(hào)的強(qiáng)度和樣本中抗原的濃度呈正線性關(guān)系?？墒?，由于生物樣本中通常都含有上千中不同蛋白質(zhì)，待測(cè)的抗原蛋白質(zhì)只占其中很小一部分，用這樣的樣本包被微孔，包被上的物質(zhì)大部分都是非特異蛋白質(zhì)或其他分子。因此，這種方法的靈敏度和特異性很低，不能用來檢測(cè)復(fù)雜樣本中濃度比較低的抗原。夾心法ELISA方法的另外一種改進(jìn)是近來發(fā)M來的免疫-PCR法，其中以DNA寡聚核苷酸來標(biāo)記檢測(cè)抗體，用捕獲抗體將抗原蛋白質(zhì)捕獲到固相后，加入寡聚核苷酸標(biāo)記的檢測(cè)抗體，然后用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timePCR)方法擴(kuò)增并讀取信號(hào)。免疫-PCR方法的靈敏度特別高，檢測(cè)的濃度范圍跨度很大(1000-10000倍范圍)，而且可以進(jìn)行多重性同時(shí)4全測(cè)多種抗原。但是上述夾心法ELISA方法中需要兩個(gè)互相配對(duì)抗體的局限性依然存在。這一方法的其它缺點(diǎn)還包括，需要極為小心的操作步驟以避免PCR反應(yīng)的污染，較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間，以及較高的設(shè)備和試劑成本。已公開的申請(qǐng)?zhí)枮?0051040295(中國(guó))的專利文獻(xiàn)，提出了一種新的檢測(cè)方法，只需采用一種捕獲劑就能靈敏地、筒便地定量^f僉測(cè)一種分析物。這一方法稱為"特異性分才斤物標(biāo)記及再捕獲法"，英文名稱是"SpecificAnalyteLabelingandRecaptureAssay",簡(jiǎn)稱SALRA。其步驟如下首先在"捕獲裝置，，上用特異性捕獲劑(通常為抗體)捕獲分析物；通過清洗而去除非特異性物質(zhì)并富集分析物后，用報(bào)道分子標(biāo)記捕獲劑-分析物復(fù)合物；然后將經(jīng)過標(biāo)記的分析物從復(fù)合物上離解并洗脫下來，經(jīng)過適當(dāng)中和后，與"檢測(cè)裝置"上包被于固相的同一捕獲劑再結(jié)合，通過檢測(cè)報(bào)道分子的標(biāo)記信號(hào)來確定分析物含量。SALRA方法只需要一種抗體就能檢測(cè)一種抗原，適用于各類基于固相表面的檢測(cè)平臺(tái)，例如微孔板、濾膜、蛋白質(zhì)(抗體)芯片、微珠(beads),等等。SALRA方法既可以用來檢測(cè)一種分析物，也可以用于多重性同時(shí)檢測(cè)多種不同的分析物。SALRA雖然主要將用于檢測(cè)抗體與抗原蛋白質(zhì)的結(jié)合，也可以檢測(cè)非免疫關(guān)系的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合或者蛋白質(zhì)與其他類型分子的結(jié)合。雖然SALRA方法已經(jīng)成功用于蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)，尤其是用于多重性同時(shí)檢測(cè)若干種蛋白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)中觀察到，當(dāng)一些待測(cè)樣本中非特異物質(zhì)含量較高或者含有容易和檢測(cè)裝置固相表面結(jié)合的非特異物質(zhì)時(shí)，檢測(cè)特異性和靈敏度會(huì)受到較大的負(fù)面影響。這是因?yàn)?，在上述SALRA方法中，用于標(biāo)記分析物的標(biāo)記分子本身也是直接參與產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)的報(bào)道分子。在標(biāo)記分析物過程中，任何結(jié)合在捕獲裝置固相表面上的蛋白質(zhì)，包括特異性分析物和非特異性物質(zhì)(樣本中的非特異組分、捕獲抗體、以及用于封阻的蛋白質(zhì))都同時(shí)會(huì)被標(biāo)記，這些非特異性物質(zhì)中的相當(dāng)一部分會(huì)凈皮洗脫進(jìn)入液相并進(jìn)入4全測(cè)裝置。一旦和檢測(cè)裝置表面結(jié)合，這些非特異物質(zhì)上攜帶的標(biāo)記分子(報(bào)道分子)將產(chǎn)生本底噪音，而此時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)已經(jīng)沒有能夠區(qū)分報(bào)道分子是來自特異性分析物還是來自非特異性物質(zhì)的步驟(機(jī)制)。
發(fā)明內(nèi)容為了克服夾心法ELISA和上述SALRA方法的不足，本發(fā)明提供了一種新的免疫檢測(cè)方法，采用一種特異性捕獲劑就能靈敏地、簡(jiǎn)便地定量檢測(cè)相應(yīng)的分析物。這一方法稱為"分析物標(biāo)記及倒置再捕獲法"，英文名稱是"AnalyteLabelingandInverseRecaptureAssay",簡(jiǎn)稱ALIRA。本方法主要用來檢測(cè)才羊本中的一種分析物，但是也可以用來多重性同時(shí)檢測(cè)若干種分析物；既可以用于檢測(cè)抗體與抗原蛋白質(zhì)的結(jié)合，也可以4企測(cè)非免疫關(guān)系的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合或者蛋白質(zhì)與其他類型分子的結(jié)合。具體技術(shù)方案是(1)捕獲分析物將特異性捕獲劑包被或者共價(jià)結(jié)合到到固相表面，成為捕獲裝置；加入待測(cè)生物樣本，使捕獲裝置上的特異性捕獲劑與樣本中的分析物結(jié)合，形成捕獲劑-分析物復(fù)合物；(2)標(biāo)記復(fù)合物用標(biāo)記試劑標(biāo)記捕獲劑-分析物復(fù)合物；(3)洗脫分析物將經(jīng)過標(biāo)記的分析物從復(fù)合物上洗脫下來；(4)再捕獲將洗脫液加入檢測(cè)裝置，由檢測(cè)裝置上的第二捕獲劑通過與標(biāo)記分子的結(jié)合而再次捕獲分析物；所說的檢測(cè)裝置是指包被了第二捕獲劑的固才目表面；(5)檢測(cè)加入特異檢測(cè)劑，和分析物結(jié)合，通過檢測(cè)特異檢測(cè)劑上攜帶的報(bào)道分子產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度來確定分析物濃度。步驟(1)中的特異性捕獲劑亦稱為第一捕獲劑，大多數(shù)情況下為抗體，包謬皮或共價(jià)結(jié)合在某一適當(dāng)?shù)墓滔啾砻妫热?6-孔微量板，成為捕獲裝置。加入待測(cè)生物樣本，使捕獲裝置上的特異捕獲劑與樣本中特異性分析物的"特異結(jié)合位點(diǎn)"結(jié)合，形成"第一捕獲劑-分析物"復(fù)合物；然后通過洗去非特異物質(zhì)而富集特異性分析物。所說的特異結(jié)合位點(diǎn)是指分析物分子上與第一捕獲劑結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。步驟(2)標(biāo)記復(fù)合物，加入標(biāo)記試劑標(biāo)記分析物。標(biāo)記試劑為分析物分子提供下一步在檢測(cè)裝置上能夠被"第二捕獲劑"捕獲的標(biāo)記分子基團(tuán)。例如，可以用生物素作為標(biāo)記分子，而相應(yīng)的第二捕獲劑則是親和素蛋白。步驟(3)洗脫分析物，將經(jīng)過標(biāo)記的分析物從復(fù)合物上離解并洗脫下來進(jìn)入液相。洗脫劑的選用將取決于分析物和第一捕獲劑之間結(jié)合特點(diǎn)而定，比如提高或降低pH值、改變離子強(qiáng)度、改變有機(jī)溶劑濃度、改變洗滌劑濃度、改變實(shí)驗(yàn)溫度，等等；同時(shí)，在保證洗脫分析物的同時(shí)，將盡量避免非特異蛋白質(zhì)(包括第一捕獲劑、封阻蛋白質(zhì)、樣本中固相結(jié)合的非特異蛋白質(zhì))進(jìn)入液相。步驟(4)再捕獲分析物，將洗脫液加入檢測(cè)裝置。檢測(cè)裝置是用所說的第二捕獲劑(例如親和素或鏈親和素)包被在固相表面(例如96-孔微量板)制作而成。分析物通過表面攜帶的標(biāo)記分子(通常是生物素)與檢測(cè)裝置上的第二捕獲劑結(jié)合而被再次捕獲于固相。如果洗脫液因?yàn)閜H、離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑濃度、洗滌劑濃度等原因而影響分析物和第二捕獲劑的結(jié)合，在加入才全測(cè)裝置之前需要處理洗脫液，比如采取調(diào)節(jié)溫度、調(diào)節(jié)pH、調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度、調(diào)節(jié)有機(jī)溶劑濃度或洗滌劑濃度等措施，以促進(jìn)分析物和第二捕獲劑的結(jié)合。然后除去未結(jié)合物質(zhì)。這種對(duì)分析物的捕獲稱為"倒置捕獲(InverseRecapturing)",這是因?yàn)楹筒东@裝置上對(duì)分析物的捕獲相比，檢測(cè)裝置上的捕獲是一種"頭朝下"的狀況，從而將步驟(l)中描述的原來在捕獲裝置上與第一捕獲劑結(jié)合的"特異結(jié)合位點(diǎn)"暴露在外。步驟(5)加入特異檢測(cè)物加入能夠與分析物上"特異結(jié)合位點(diǎn)"結(jié)合的特異檢測(cè)物。特異檢測(cè)物一般為標(biāo)記有報(bào)道分子的第一捕獲劑或其衍生物(或類似物)，具有和第一捕獲劑相同的對(duì)分析物的特異性結(jié)合能力和結(jié)合機(jī)制，即能夠識(shí)別并結(jié)合分析物上的同一特異結(jié)合位點(diǎn)。二者的不同之處是，特異檢測(cè)物標(biāo)有報(bào)道分子而第一捕獲劑沒有。如果第一捕獲劑是抗體，特異檢測(cè)物則是標(biāo)有某一報(bào)道分子的同一種抗體，在功能上類似于夾心法ELISA中的檢測(cè)抗體。特異檢測(cè)物和分析物上的特異結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后，洗去未結(jié)合物質(zhì)，然后加入適當(dāng)?shù)脑噭℡吏報(bào)道分子顯示信號(hào)。例如，如果報(bào)道分子是酶(例如辣才艮過氧化物酶，HRP)，則加入該酶的底物，使之產(chǎn)生顏色等信號(hào)，然后讀測(cè)顏色反應(yīng)。最后通過報(bào)道分子的信號(hào)強(qiáng)度來確定分析物含量。本發(fā)明方法中所說的第一捕獲劑可以是抗體，但也可以是抗體的Fab片段、Fab，片段、F(ab)2，片段、Fv片段或scFv片段，或者是非抗體類蛋白質(zhì)、或者是抗體模仿物(antibodymimetics)或具有特異性捕獲功能的肽、寡聚核苷酸或小分子化合物。當(dāng)?shù)谝徊东@劑是抗體時(shí)，所說的抗體最好是單克隆抗體，但也可以是多克隆抗體。本發(fā)明方法中所說的分析物主要指能被所說的第一捕獲劑特異性結(jié)合的非抗體類蛋白質(zhì)，但也可以是抗體、肽、寡聚核苷酸適體(aptamers)、其他生物大分子及其復(fù)合物、非肽類小分子化合物、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，等等。本發(fā)明方法中所說的標(biāo)記試劑是指能夠?qū)⑻厥夥肿踊鶊F(tuán)(標(biāo)記分子)標(biāo)記到分析物上的化合物，該標(biāo)記分子能夠被所說的第二捕獲劑特異性結(jié)合?；罨纳锼?即能夠把生物素標(biāo)記到分析物上的化合物)是常用的標(biāo)記試劑，但是所說的標(biāo)記分子也可以是肽，例如FLAG肽、鏈親和素結(jié)合肽、MYC肽、組氨酸標(biāo)簽肽(HIS-tagpeptide),或者是半抗原，例如地高辛(異羥基洋地黃毒苷Digoxigenin)、熒光染料(例如熒光素)等，或者是寡聚核苷酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或肽核酸(PNA)等。表1列出這些常用標(biāo)記分子及其相對(duì)應(yīng)的特異性結(jié)合分子(即所說的第二捕獲劑)表l、常用標(biāo)記分子及想對(duì)應(yīng)的第二捕獲劑.<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本發(fā)明方法所說的標(biāo)記分子對(duì)分析物的標(biāo)記一般通過與分析物的側(cè)鏈基團(tuán)形成共價(jià)結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。如果分析物是蛋白質(zhì)，可以通過標(biāo)記試劑上的活化基團(tuán)與蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的特定基團(tuán)反應(yīng)而形成共價(jià)結(jié)合。表2列出標(biāo)記試劑上常用的活化基團(tuán)與其相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)側(cè)鏈特定基團(tuán)或其他分析物的關(guān)系。表2、常用活化基團(tuán)與對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)的關(guān)系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本發(fā)明方法所說的第二捕獲劑是能特異性結(jié)合并捕獲標(biāo)記分子(以及與之連4妾的分析物)的物質(zhì)。當(dāng)標(biāo)記分子是生物素或其書于生物時(shí)，所說的第二捕獲劑是親和素或鏈親和素或其衍生物；當(dāng)標(biāo)記分子是代表一種抗原決定蔟的半抗原或肽時(shí)，所說的第二捕獲劑是能夠與該抗原決定蔟特異結(jié)合的抗體，當(dāng)標(biāo)記分子是寡聚核苷酸時(shí)，所說的第二捕獲劑是能夠與之戚基互補(bǔ)的寡聚核苷酸或能特異識(shí)別該寡聚核苷酸(標(biāo)記分子)的抗體或其它蛋白質(zhì)。當(dāng)?shù)诙东@劑是抗體時(shí)，所說的抗體最好是單克隆抗體，但也可以是多克隆抗體。本發(fā)明方法中所說的特異檢測(cè)物，是指在對(duì)分析物的識(shí)別特異性上和第一捕獲劑相同，但標(biāo)有報(bào)道分子的試劑。和特異捕獲劑一樣，特異檢測(cè)物可以是抗體，但也可以是抗體的Fab片段、Fab，片段、F(ab)2，片段、Fv片段或scFv片段，或者是非抗體類蛋白質(zhì)、或者是抗體模仿物(antibodymimetics)或具有特異性捕獲功能的肽、寡聚核苷酸或小分子化合物。當(dāng)?shù)谝徊东@劑是抗體時(shí)，所說的抗體最好是單克隆抗體,但也可以是多克隆抗體。本發(fā)明方法中所說的報(bào)道分子包括但不限于酶(HRP、AP[堿性磷酸酶]或其他酶)、代表一種抗原決定蔟因而可以被次級(jí)抗體識(shí)別的半抗原或肽、熒光化合物、寡聚核苷酸(用作PCR底物顯示檢測(cè)信號(hào))、生物素或其衍生物(當(dāng)分析物上的標(biāo)記分子不是生物素時(shí))、膠體金，等等。當(dāng)所說的報(bào)道分子是代表一種抗原決定蔟的半抗原或肽從而可以被次級(jí)抗體識(shí)別時(shí)，所-沈的次級(jí)抗體連接有次級(jí)報(bào)道分子例如酶或熒光屏物質(zhì)，并且最好是單克隆抗體。ALIRA方法適用于各種基于固相表面的檢測(cè)平臺(tái)，包括微孔板、濾膜、微磁球，等等。ALIRA方法主要用來檢測(cè)樣本中的一種分析物，但是也可以用來多重性同時(shí)檢測(cè)若干種分析物；既可以用于檢測(cè)抗體與抗原蛋白質(zhì)的結(jié)合，也可以檢測(cè)非免疫關(guān)系的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合或者蛋白質(zhì)與其他類型分子的結(jié)合。以下用一種抗體作為第一捕獲劑，其相應(yīng)的抗原蛋白質(zhì)為分析物，NHS-生物素為標(biāo)記試劑，鏈親和素為第二捕獲劑，來進(jìn)一步說明通過"分析物標(biāo)記及倒置再捕獲法(ALIRA)"定量檢測(cè)特異性抗原的方法(1)制作捕獲裝置將能夠特異性結(jié)合待測(cè)抗原的單克隆抗體(第一捕獲劑)包被到固相表面，最常用的是微孔板表面，但也可以是尼龍(或其它介質(zhì))濾膜表面、微珠表面，等等；該固相表面的作用是捕獲樣本中的特異性抗原，所以稱為"捕獲裝置"。根據(jù)檢測(cè)系統(tǒng)、檢測(cè)目標(biāo)和樣本特點(diǎn)的不同，捕獲裝置上包被的抗體或者是一種，或者是多種混合在一起(用于同時(shí)檢測(cè)多種抗原)。包凈皮完成后，用過量的非特異性蛋白質(zhì)(例如脫脂奶粉或小牛血清蛋白)或者非蛋白質(zhì)封阻液(例如美國(guó)PIRECE公司的ProteinFreeBlockingReagent)封阻固相表面上未結(jié)合的平面空間，然后再洗去未結(jié)合的封阻液。(2)捕獲抗原加入待測(cè)生物樣本，放置一定時(shí)間，例如l-2小時(shí)，讓捕獲裝置上的抗體結(jié)合并"捕獲'，樣本中的特異性抗原(分析物)，形成緊密結(jié)合的抗體-抗原復(fù)合體；然后洗去未與抗體結(jié)合的非特異性蛋白質(zhì)和其他組成成分。這一過程的作用是富集抗原并去除樣本中絕大部分非特異物質(zhì)。(3)標(biāo)記抗原用標(biāo)記試劑標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物。由于生物素與親和素(或其類似物例如鏈親和素[Streptavidin])結(jié)合的高度特異性和高度親和力，絕大多數(shù)情況下采用生物素作為標(biāo)記分子，而用親和素作為^r測(cè)裝置上的第二捕獲劑(見下l殳)。例如，N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，簡(jiǎn)稱NHS)-生物素(NHS-Biotin)能夠?qū)⑸锼毓矁r(jià)結(jié)合在蛋白質(zhì)賴氨酸的伯胺基團(tuán)(primaryamine)上。由于賴氨酸幾乎普遍存在于所有蛋白質(zhì)中，因此NHS-生物素能夠標(biāo)記幾乎所有的蛋白質(zhì)。同時(shí)，復(fù)合物中抗原和抗體的緊密結(jié)合使抗原分子上的特異結(jié)合位點(diǎn)(特異性抗原決定簇)受到保護(hù)而不被NHS-生物素修飾，仍然保持對(duì)該抗體的結(jié)合能力。因此，當(dāng)抗體-抗原復(fù)合物解離分開后，該抗原分子能夠和檢測(cè)抗體結(jié)合形成新的復(fù)合物。除了NHS,也可以用能夠共價(jià)連接蛋白質(zhì)其它基團(tuán)(如巰基、羧基或羥基)的活性分子將生物素標(biāo)記到抗原上。如杲由于某種原因生物素不能作為標(biāo)記分子，也可以用某種半抗原或者小肽分子等作為標(biāo)記分子，同時(shí)相應(yīng)地用針對(duì)該標(biāo)記分子的抗體作為第二捕獲劑。(4)洗脫抗原用含有過量伯胺基團(tuán)的溶液(例如Tris-鹽酸緩沖液或Tris-甘氨酸緩沖液)淬滅并洗去游離的NHS-生物素。如果標(biāo)記試劑采用NHS之外的其它活化基團(tuán)，則將才艮據(jù)具體情況采用相應(yīng)的溶液淬滅并洗去未反應(yīng)的標(biāo)記試劑，例如，如果標(biāo)記試劑是吲咮乙酰-LC-生物素，則加入過量的半胱氨酸淬滅之。然后加入抗原洗脫液，讓標(biāo)記過的抗原蛋白質(zhì)乂人抗體-抗原復(fù)合物上離解出來。抗原洗脫液含有破壞分析物和第一捕獲劑結(jié)合的成分，對(duì)于抗體-抗原復(fù)合物，可以采用低pH溶液，例如0.1M檸檬酸(pH2..8),或者使用目前市場(chǎng)銷售的抗原洗脫液(例如美國(guó)PIERCE公司的I隨unoPure洗脫液)；也可以采用高pH溶液，例如0.1M三乙胺(Triethylamine),將捕獲裝置上的蛋白質(zhì)洗脫下來進(jìn)入液相。然后將含有抗原蛋白質(zhì)的洗脫液移出，加入適當(dāng)?shù)闹泻途彌_液(含有非特異性蛋白質(zhì)如脫脂奶粉等)中和。或者在移出抗原洗脫液將之前直接將中和緩沖液加入到捕獲裝置上。加入中和緩沖液的目的是使pH值回復(fù)到接近中性，并在一定程度上降低離子強(qiáng)度，使直不再影響下一步在檢測(cè)裝置上第二捕獲劑和抗原蛋白質(zhì)上的標(biāo)記分子的結(jié)合。(5)再次捕獲抗原將中和后的洗脫液立即加入到"檢測(cè)裝置"。檢測(cè)裝置通常由微孔板制備，但是也可以由濾膜、玻璃或塑料平面薄片、微珠(磁球)等固體表面承載。檢測(cè)裝置固相表面包被有第二捕獲劑，并且已經(jīng)經(jīng)過非特異性蛋白質(zhì)的封阻。本例中采用鏈親和素(或親和素)作為第二捕獲劑。親和素和生物素之間的高度親和力保證了迅速有效地捕獲攜帶有標(biāo)記分子生物素的抗原以及非特異蛋白質(zhì)。檢測(cè)裝置上親和素的包被和封阻應(yīng)該提前進(jìn)行，以便當(dāng)上述第"4"步驟完成，也就是被標(biāo)記的抗原從捕獲裝置上洗脫下來后，能夠立即轉(zhuǎn)移至檢測(cè)裝置。(6)加入檢測(cè)試劑，例如檢測(cè)抗體在檢測(cè)裝置上，抗原通過其攜帶的標(biāo)記分子(生物素)和親和素結(jié)合而被捕獲于固相，從而將特異結(jié)合位點(diǎn)(抗原決定蔟)翻轉(zhuǎn)暴露在外。洗去未結(jié)合的非特異蛋白質(zhì)后，加入^r測(cè)抗體(特異檢測(cè)物)。檢測(cè)抗體由捕獲抗體(第一捕獲劑)連接報(bào)道分子制作而成，能夠識(shí)別并結(jié)合抗原上的特異結(jié)合位點(diǎn)。如果捕獲裝置上的捕獲劑不是抗體而是其他類型分子，則特異檢測(cè)物是同樣的分子連接報(bào)道分子而成。(7)讀測(cè)信號(hào)洗去未結(jié)合的檢測(cè)抗體后，加入使檢測(cè)抗體上報(bào)道分子顯示信號(hào)的試劑。根據(jù)報(bào)道分子的性質(zhì)，信號(hào)產(chǎn)生及其檢測(cè)方法包括但不限于以下幾種(a)酶(例如HRP、AP等)直接作為報(bào)道分子加入該酶的底物，使之產(chǎn)生顏色、熒光或發(fā)光等信號(hào)，即可通過讀測(cè)信號(hào)強(qiáng)度鑒定酶的活性。(b)半抗原小分子化合物或小肽作為報(bào)道分子這類報(bào)道分子的作用是提供了特異性抗原決定蔟，可以加入針對(duì)該半抗原或小肽的抗體(次級(jí)抗體)，，次級(jí)抗體上攜帶次級(jí)標(biāo)記信號(hào)，例如，酶、熒光染料分子等，再加入相應(yīng)的酶底物或直接讀測(cè)熒光強(qiáng)度以鑒定活性。(c)熒光基團(tuán)作為報(bào)道分子，竭過直接測(cè)讀或掃描熒光強(qiáng)度來確定信號(hào)強(qiáng)度；或者利用一些熒光基團(tuán)的半抗原特性，加入針對(duì)熒光基團(tuán)的酶標(biāo)抗體，按照上述方法檢測(cè)酶的活性。(d)寡聚核苷酸作為報(bào)道分子，將該寡聚核苷酸洗脫后作為底物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)以檢測(cè)其含量；用寡聚核普酸作為報(bào)道分子進(jìn)行免疫-PCR，不僅可以提高檢測(cè)靈敏度，而且能夠進(jìn)行多重性同時(shí)檢測(cè)樣本中的若干種抗原。本發(fā)明所公開的ALIRA檢測(cè)方法各步驟中涉及到的具體操作技術(shù)，例如用捕獲劑包被微孔板的技術(shù)、捕獲劑和分析物結(jié)合的技術(shù)、用NHS-生物素等標(biāo)記分子標(biāo)記蛋白質(zhì)的技術(shù)、將報(bào)道分子連接到檢測(cè)抗體的技術(shù)、顯示并測(cè)定報(bào)道分子信號(hào)強(qiáng)度的技術(shù)等，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。很顯然，本發(fā)明公開的"分析物標(biāo)記及倒置再捕獲法"定量檢測(cè)分析物的方法，只需要單一特異性捕獲劑就能定量檢測(cè)一種分析物，能夠應(yīng)用在疾病臨床診斷、疾病生物標(biāo)記(biomarkers)答定分析、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究分析、蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析、新藥乾位鑒定分析、臨床藥物動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)分析等各個(gè)領(lǐng)域。4艮據(jù)這一方法的原理，能夠開發(fā)、生產(chǎn)、調(diào)配和包裝各種檢測(cè)產(chǎn)品，包括完整試劑盒和試劑盒的組成部分，例如捕獲裝置、檢測(cè)裝置、各種相關(guān)試劑，等等。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比其有益效果是提供了一種新的只需要單一特異性捕獲劑就能定量檢測(cè)特異性分析物的工藝流程。這種新流程在關(guān)鍵步驟上不同于傳統(tǒng)的夾心法ELISA和SALRA方法。見圖1。1、和傳統(tǒng)夾心法ELISA的比較和目前國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的夾心法ELISA方法相比，本發(fā)明所提出的ALIRA檢測(cè)方法的主要優(yōu)點(diǎn)如下(l)ALIRA方法的最重要優(yōu)點(diǎn)是，只需使用一種特異性捕獲劑就能定量4全測(cè)分析物，也就是說，只要一種抗體就能檢測(cè)一種抗原蛋白質(zhì)，而夾心法ELISA需要兩種互相配對(duì)的抗體。顯而易見，獲得一個(gè)高度特異性高度親和力單克隆抗體比獲得兩個(gè)高度特異性高度親和力并且互相配對(duì)的單克隆抗體要容易得多。對(duì)于很多蛋白質(zhì)來說，由于這樣或那樣的原因，獲得ELISA配對(duì)抗體非常困難。因此，對(duì)于那些目前沒有配對(duì)抗體進(jìn)行夾心法ELI.SA檢測(cè)的抗原蛋白質(zhì)，只要存在一種特異性強(qiáng)親和力高的抗體，就能夠利用ALIRA方法迅速建立起檢測(cè)方法。這特別適用于4企測(cè)只擁有一個(gè)或幾個(gè)相鄰很近抗原決定簇的蛋白質(zhì)分子或分子結(jié)構(gòu)域，比如分子量很小的蛋白質(zhì)、抗原決定簇互相距離靠的很近的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)、蛋白質(zhì)的重要功能域及其活化狀態(tài)，等等。和SALRA方法一樣，ALIRA方法為那些在臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究中非常重要但是至今尚無理想檢測(cè)手段的各類蛋白質(zhì)提供了簡(jiǎn)便快捷的定量檢測(cè)途徑。這不僅僅大大縮短了建立檢測(cè)方法的時(shí)間，而且為檢測(cè)領(lǐng)域提供了新思路技術(shù)人員不必再花大量人力物力和時(shí)間去進(jìn)行抗體間的配對(duì)試驗(yàn)，可以把精力集中在篩選高特異性、高親和力、包-欲性能好的單一抗體。由于只需要一種抗體就能夠進(jìn)行檢測(cè)，因此ALIRA方法的適用范圍非常廣泛，將有力促進(jìn)疾病診斷、新藥研制、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究、蛋白質(zhì)組學(xué)研究應(yīng)用、食品及農(nóng)產(chǎn)品衛(wèi)生檢查和化合物殘留檢測(cè)、環(huán)境保護(hù)等等各個(gè)領(lǐng)域的工作。(2)ALIRA的原理和方法既適用于利用抗體來檢測(cè)樣本中抗原的存在，也適用于利用非抗體-抗原關(guān)系的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間或者蛋白質(zhì)和其它分子之間的互作關(guān)系，來檢測(cè)某一蛋白質(zhì)因子。這些互作和結(jié)合對(duì)于揭示生命奧秘、研究細(xì)胞過程、診斷疾病進(jìn)程，研制新型藥物都非常重要。例如，為了筌定生物樣本中某個(gè)蛋白質(zhì)因子X的含量，可以用能夠和蛋白質(zhì)X結(jié)合的另一種蛋白質(zhì)Y作為第一捕獲劑包被在捕獲裝置的固相表面，采用ALIRA的原理，加入待測(cè)樣本，形成蛋白質(zhì)X-蛋白質(zhì)Y復(fù)合物；然后用生物素標(biāo)記復(fù)合物，洗脫后，由檢測(cè)裝置上的親和素捕獲攜帶生物素的蛋白質(zhì)X，然后加入酶標(biāo)的蛋白質(zhì)Y，即可對(duì)蛋白質(zhì)X進(jìn)行定量檢測(cè)。除了蛋白質(zhì)，還可以用其他物質(zhì)作為捕獲劑，比如肽、核酸、多糖、脂類、半抗原小分子，等等，來檢測(cè)與其特異性結(jié)合的各類分析物，例如蛋白質(zhì)、肽、核酸適體(aptamer)，等等。(3)檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高。ALIRA方法有兩個(gè)步驟確保檢測(cè)的特異性和降4氐^r測(cè)噪音第一，捕獲裝置只捕獲樣本中的特異性分析物。進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，絕大多數(shù)非特異性物質(zhì)已經(jīng)被洗去，分析物被高度富集。第二，在檢測(cè)裝置上，標(biāo)記有報(bào)道分子的檢測(cè)抗體與被重新捕獲的分析物的特異結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而顯示信號(hào)。由于只需要一種特異捕獲劑就能夠進(jìn)行檢測(cè)，在選擇抗體作為捕獲劑時(shí)，不必受限于兩個(gè)抗體是否配對(duì)的考慮，可以側(cè)貢選用那些特異性高、親和力高、包被性能好的抗體，從而提高檢測(cè)特異性和靈敏度。此外，由于捕獲裝置和檢測(cè)裝置是分開的，可以把來自捕獲裝置的分析物適當(dāng)濃縮后加入到檢測(cè)裝置，從而放大檢測(cè)信號(hào)。例如，可以采用面積比較大的或者表面粗糙的微孔作為捕獲裝置的栽體，增加捕獲固相的表面積，同時(shí)縮小檢測(cè)裝置的平面面積，以提高檢測(cè)裝置上分析物的濃度。2、與SALRA方法比較本發(fā)明所提出的ALIRA檢測(cè)方法和先前描述的SALRA方法一樣，都只需要一種特異性捕獲劑就能定量檢測(cè)相應(yīng)的分析物，但如圖1所示，二者在以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟有所不同。(1)最主要的區(qū)別是檢測(cè)裝置上對(duì)被標(biāo)記的分析物的再捕獲機(jī)制不同。在SALRA方法中，檢測(cè)裝置上的捕獲劑和捕獲裝置上的捕獲劑是同一種分子'(通常是同一抗體)或具備同一種捕獲機(jī)制，二者對(duì)分析物的捕獲是通過結(jié)合分析物上的同一個(gè)位點(diǎn)(特異結(jié)合位點(diǎn))而實(shí)現(xiàn)；而在本發(fā)明所描述的ALIRA方法中，檢測(cè)裝置上的捕獲劑(即第二捕獲劑)完全不同于捕獲裝置上的捕獲劑(即第一捕獲劑)。這里，第二捕獲劑是通過識(shí)別并結(jié)合分析物上的標(biāo)記分子而達(dá)到將分析物結(jié)合到固相的目的(即倒置捕獲)。這一差別造成了檢測(cè)流程的其它步驟也有相應(yīng)的差異(見下)。(2)SALRA方法中，用來標(biāo)記捕獲裝置上分析物-捕獲劑復(fù)合物的標(biāo)記分子起到的是報(bào)道分子的作用，該標(biāo)記分子要么本身就是信號(hào)分子(例如熒光素)，要么直接介導(dǎo)參與信號(hào)的產(chǎn)生(例如生物素-酶標(biāo)親和素信號(hào)系統(tǒng))。而在ALIRA方法中，對(duì)分析物進(jìn)行標(biāo)記，是為了提供能夠被檢測(cè)裝置上第二捕獲劑結(jié)合的位點(diǎn)，標(biāo)記分子不再用作報(bào)道分子，因此不必?fù)碛兄苯踊蚪閷?dǎo)產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)的功能。AURA方法的信號(hào)報(bào)道機(jī)制由下一步驟的特異檢測(cè)物完成。(3)SALRA方法中，分析物和檢測(cè)裝置上捕獲劑結(jié)合后，其攜帶的報(bào)道分子直接介導(dǎo)檢測(cè)信號(hào)的產(chǎn)生，任何標(biāo)記了報(bào)道分子的非特異性結(jié)合物都會(huì)產(chǎn)生噪音信號(hào)。由于標(biāo)記了才艮道分子的非特異物質(zhì)可能包括捕獲裝置中的捕獲劑、封阻蛋白質(zhì)或者待測(cè)樣本中的某些非特異組分，成分復(fù)雜，并且都有曾經(jīng)與捕獲裝置非特異結(jié)合的歷史，因此在檢測(cè)裝置上再次被非特異結(jié)合的可能性比較大。一旦結(jié)合，因?yàn)镾ALRA方法沒有進(jìn)一步識(shí)別分析物的后續(xù)步驟，這些非特異物質(zhì)上攜帶的報(bào)道分子就會(huì)直接產(chǎn)生檢測(cè)噪音。而在ALIRA方法中，檢測(cè)裝置上第二捕獲劑對(duì)分析物的再捕獲是針對(duì)標(biāo)記分子而不是分析物本身。如果用生物素作為標(biāo)記分子，親和素作為第二捕獲劑，二者的高度親和力保證了最大限度地將樣本中的分析物捕獲，然后再加入檢測(cè)抗體，識(shí)別并結(jié)合曾經(jīng)在捕獲裝置上被第一捕獲劑結(jié)合的特異結(jié)合位點(diǎn)，再由檢測(cè)抗體上攜帶的報(bào)道分子產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。雖然任何攜帶標(biāo)記分子的非特異物質(zhì)都會(huì)被捕獲到檢測(cè)裝置上，但由于檢測(cè)抗體只識(shí)別分析物的特異結(jié)合位點(diǎn)，不識(shí)別非特異物質(zhì)，因此基本上不產(chǎn)生檢測(cè)噪音。換句話i兌，ALIRA方法擁有最后的"安全檢查"機(jī)制，從而降低來自于非特異性物質(zhì)的本底噪音。因此ALIRA方法在靈敏度和特異性兩方面都比SALRA方法要高。尤其適合檢測(cè)那些分析物含量低、非特異性成分復(fù)雜的生物樣本。(4)SALRA方法中，特異性捕獲劑的作用是包被捕獲裝置和檢測(cè)裝置。而在SALIRA方法中，特異性捕獲劑一方面作為第一捕獲劑用于包被捕獲裝置，不要進(jìn)行標(biāo)記；另一方面是用作特異檢測(cè)物(檢測(cè)抗體)，則需要標(biāo)記有報(bào)道分子。4全測(cè)抗體的標(biāo)記可以預(yù)先制備。(5)SALRA方法中，檢測(cè)裝置對(duì)于分析物的再捕獲是基于對(duì)分析物本身的特異性結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的，因此在進(jìn)行多重性檢測(cè)時(shí)，將多種捕獲抗體混合后包被捕獲裝置，而在檢測(cè)裝置上捕獲抗體單獨(dú)包被，不同抗體的特定地理位置決定了相應(yīng)的不同分析物再次被捕獲的地理位置，因此可以用熒光分子作為報(bào)道分子，在蛋白質(zhì)芯片等微陣排列上直接進(jìn)行多重性檢測(cè)多種分析物。而在ALIRA方法中，檢測(cè)裝置對(duì)于分析物的再捕獲是基于對(duì)標(biāo)記物的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)，由于標(biāo)記分子是相同的，因此無法在檢測(cè)裝置上將不同的分析物固相結(jié)合在不同的地理位置。總的來說，SALRA方法可以用于單一檢測(cè)，也可以用于多重性檢測(cè)，包括采用蛋白質(zhì)芯片等微陣排列作為承載表面的多重性檢測(cè)；而SALIRA更適合于對(duì)一種分析物進(jìn)行單一檢測(cè)。不過，AURA方法也可以用于進(jìn)行多重性;險(xiǎn)測(cè)多種分析物，其原理和步驟是事先采用不同的報(bào)道分子標(biāo)記不同的特異4企測(cè)物，將針對(duì)不同分析物的第一捕獲劑混合后包被捕獲裝置；加入待測(cè)樣本，將相應(yīng)的分析物捕獲于固相；用標(biāo)記分子標(biāo)記分析物并洗脫之，加入到檢測(cè)裝置，然后將標(biāo)有不同才艮道分子的特異檢測(cè)物混合后加入，經(jīng)過請(qǐng)洗，然后根據(jù)報(bào)道分子的性質(zhì)，顯示并讀測(cè)信號(hào)。如果報(bào)道分子是熒光化合物，可以4艮據(jù)不同熒光化合物的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)特點(diǎn)，分別進(jìn)行讀測(cè)；如果報(bào)道分子是不同的酶，可以將特異檢測(cè)物洗脫，中和后，分成若千份，分別加入到含有不同酶底物的微孔中，然后檢測(cè)酶的反應(yīng)信號(hào)；如果報(bào)道分子是寡聚核苷酸，可以用洗脫液(例如0.1M三乙胺)洗脫特異檢測(cè)物，中和后，用針對(duì)不同寡聚核苷酸的PCR前導(dǎo)物對(duì)(primerpairs),進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR,然后才艮據(jù)樣本和標(biāo)準(zhǔn)濃度的CT值計(jì)算分析物的濃度。圖l是本發(fā)明方法的流程示意圖及與ELISA和SALRA方法的對(duì)比圖；圖2是實(shí)施例1的^r測(cè)結(jié)果圖。圖3是實(shí)施例2的;f全測(cè)結(jié)果圖。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合圖1中SALIRA方法的步驟來進(jìn)一步闡述本發(fā)明方法。實(shí)施例1:用HRP作為報(bào)道分子檢測(cè)人p53蛋白質(zhì)在本實(shí)施例子中，待測(cè)抗原蛋白質(zhì)為具有肺瘤抑制功能、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的人體p53蛋白質(zhì)，捕獲裝置和檢測(cè)裝置都是96-孔微量板。捕獲裝置的微孔包被抗p53單克隆抗體，檢測(cè)裝置包被鏈親和素。檢測(cè)抗體是標(biāo)記有熒光素的同一種抗p53單克隆抗體，這里報(bào)道分子是熒光素。(1)捕獲抗原蛋白質(zhì)a、包被捕獲抗體取兩個(gè)96-孔微量板(平底，對(duì)蛋白質(zhì)高度結(jié)合)，一個(gè)作為捕獲裝置用來捕獲待樣本中的抗原，微孔內(nèi)加入100nl濃度為2嗎/ral(稀釋于包被緩沖液，0.05M碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6)的抗p53單克隆抗體(美國(guó)CalBiochem公司)，加入兩個(gè)縱行共16個(gè)微孔。另一個(gè)微量板作為檢測(cè)裝置用來捕獲并檢測(cè)標(biāo)記的抗原，微孔內(nèi)加入100pl濃度為10嗎/ml(稀釋于PBS緩沖液)的鏈親和素，加入兩個(gè)縱行共16個(gè)微孔。將微量板置于4度過夜。b、封阻非特異性結(jié)合位點(diǎn)移去捕獲裝置和檢測(cè)裝置微孔中的抗體溶液，用PBS+0.05%Tween20(PBST)清洗1次。移去PBST，加入380pl的2%脫脂奶粉(溶于PBS),在室溫下進(jìn)行封阻。捕獲裝置的封阻時(shí)間為1小時(shí)；檢測(cè)裝置的封阻為2小時(shí)。c、捕獲抗原蛋白質(zhì)移去封阻液，在微孔中加入100pl經(jīng)過系列稀釋的不同濃度的提純重組人p53蛋白質(zhì)(從美國(guó)BDBiosciencesPharmingen公司購(gòu)買，以Baculovirus為載體在昆蟲細(xì)胞中重組表達(dá)；稀釋于PBS+1%脫脂奶粉)。室溫下1.5小時(shí)。(2)標(biāo)記抗原蛋白質(zhì)清空微孔，用PBST清洗2次，PBS清洗1次。每一孩吏孔加入1000.02%NHS-生物素(溶于PBS),室溫保持30分鐘。移去NHS-生物素，加入380pl10mM的Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0),淬滅并清洗殘余的NHS-生物素，室溫保持5分鐘。用水清洗1次。(3)洗脫抗原對(duì)準(zhǔn)微孔中部，加入20pl抗原洗脫液(使用美國(guó)PIERCE公司的I咖unoPureElutionBuffer),室溫保持15分鐘(將微量板蓋上以保持濕度)。與此同時(shí)，移去檢測(cè)裝置微孔中的封阻溶液，加入80|ilPBS+1%脫脂奶粉。(4)抗原再捕獲將從捕獲裝置微孔中洗脫的抗原(約20pl)轉(zhuǎn)移至檢測(cè)裝置上，適當(dāng)搖震混勻，室溫保持l小時(shí)。由于檢測(cè)裝置微孔已經(jīng)含有80piPBS+1%脫脂奶粉，抗原洗脫液被中和并稀釋5倍，不會(huì)影響生物素(標(biāo)記分子)和檢測(cè)裝置上鏈親和素(第二捕獲劑)的結(jié)合。(5)檢測(cè)a、加入檢測(cè)抗體移去未結(jié)合物質(zhì)，用PBST清洗2次，PBS清洗1次。加入100pl經(jīng)過焚光素標(biāo)記的同一克隆的抗p53單克隆抗體(美國(guó)CalBiochem公司；用PBS+1%脫脂奶粉稀釋至0.5pg/ml),室溫保持1小時(shí)。b、顯示信號(hào)移去未結(jié)合物質(zhì)，用PBST清洗3次。加入100pl辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗熒光素抗體(美國(guó)Invitrogen公司，用PBS+1%脫脂奶粉稀釋至O.5ng/ml)，室溫保持l小時(shí)。用PBST清洗4次。加入1OOpl過氧化物酶底物溶液(美國(guó)KPLz〉司SureBlueReserveHRP底物反應(yīng)液，TMB為底物)，37度20分鐘。加入50ul2M硫酸，讀測(cè)450nm波長(zhǎng)光吸收。c、檢測(cè)結(jié)果圖2顯示實(shí)施例1的檢測(cè)結(jié)果。供試的p53信號(hào)強(qiáng)度和濃度之間從100ng/ml到1ng/ml都展現(xiàn)很好的線性關(guān)系，證明ALIRA方法能夠在這一濃度范圍檢測(cè)該蛋白質(zhì)，靈敏度(空白對(duì)照平均值加三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)達(dá)到0.6ng/ml。實(shí)施例2:用寡聚核苷酸作為報(bào)道分子檢測(cè)人C-反應(yīng)蛋白質(zhì)在本實(shí)施例子中，待測(cè)抗原蛋白質(zhì)為在免疫反應(yīng)中起重要作用的人體C-反應(yīng)蛋白(C-reactiveprotein,CRP)，捕獲裝置和檢測(cè)裝置都是96-孔微量板。捕獲裝置的微孔包被抗CRP單克隆抗體，檢測(cè)裝置包被鏈親和素。檢測(cè)抗體是標(biāo)記有寡聚核苷酸(60堿基長(zhǎng))的同一種抗CRP單克隆抗體，這里報(bào)道分子是寡聚核香酸。(1)捕獲抗原蛋白質(zhì)a、包被捕獲抗體取兩個(gè)96-孔微量板(平底，對(duì)蛋白質(zhì)高度結(jié)合)，一個(gè)作為捕獲裝置用來捕獲待樣本中的抗原，微孔內(nèi)加入100pi濃度為2pg/ml(稀釋于包被緩沖液，0.05M碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6)的抗CRP單克隆抗體(美國(guó)R&DSystems公司)，加入兩個(gè)縱行共16個(gè)微孔。另一個(gè)微量板作為檢測(cè)裝置用來捕獲并檢測(cè)標(biāo)記的抗原，微孔內(nèi)加入100pi濃度為10ng/ml(稀釋于PBS緩沖液)的鏈親和素，加入兩個(gè)縱行共16個(gè)微孔。將微量板置于4度過夜。b、封阻非特異性結(jié)合位點(diǎn)同實(shí)施例l。c、捕獲抗原蛋白質(zhì)移去封阻液，在微孔中加入100pl經(jīng)過系列稀釋的不同濃度的提純重組人CRP蛋白質(zhì)(從美國(guó)BioCheck公獲得；稀釋于PBS+1%脫脂奶并分)。室溫下1.5小時(shí)。(2)標(biāo)記抗原蛋白質(zhì)同實(shí)施例1。(3)洗脫抗原:對(duì)準(zhǔn)微孔中部，加入20pl抗原洗脫液(0.1M三乙胺)，室溫保持15分鐘(將微量板蓋上以保持濕度)。加入80^含有1%脫脂奶粉和0.1MTris-HC1(pH8.0)的PBST。與此同時(shí)，移去檢測(cè)裝置微孔中的封阻溶液，。(4)抗原再捕獲將從捕獲裝置微孔中洗脫并中和的抗原(約100nl)轉(zhuǎn)移至沖企測(cè)裝置上，適當(dāng)搖震混勻，室溫保持l小時(shí)。由于抗原洗脫液已經(jīng)被中和并稀釋5倍'不會(huì)影響生物素(標(biāo)記分子)和檢測(cè)裝置上鏈親和素(第二捕獲劑)的結(jié)合。(5)檢測(cè)a、加入檢測(cè)抗體移去未結(jié)合物質(zhì)，用PBST清洗2次，PBS清洗1次。加入100pl經(jīng)過寡聚核苷酸標(biāo)記的同一克隆的抗CRP單克隆抗體(美國(guó)R&DSystems公司；用PBS+1%脫脂奶粉稀釋至0.5網(wǎng)/ml),室溫保持30分鐘。b、洗脫報(bào)道分子移去未結(jié)合物質(zhì)，用PBST清洗6次。加入100的0.1M三乙胺，室溫保持20分鐘。加入50nl的1MTris-HCl(pH8,0)，混合后，取5pl作為底物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。c、顯示信號(hào)用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)乂>司(AppliedBiosystems)ABI7000實(shí)時(shí)PCR定量檢測(cè)報(bào)道分子。PCR反應(yīng)條件為55度2分鐘，95度10分鐘，接著為40反應(yīng)周期的95度15秒鐘和60度1分鐘。反應(yīng)引物1mM;熒光標(biāo)記物FAM;信號(hào)產(chǎn)生方法TaqMan方法；反應(yīng)體積40(_U。d、檢測(cè)結(jié)果圖3顯示實(shí)施例2的檢測(cè)結(jié)果。供試的CRP信號(hào)強(qiáng)度和濃度之間從500ng/mi到2ng/ml都展現(xiàn)很好的線性關(guān)系，證明AURA方法能夠在這一濃度范圍檢測(cè)CRP蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)靈敏度(空白對(duì)照平均值加三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)為0.45ng/ral。權(quán)利要求1、一種用單一特異性捕獲劑定量檢測(cè)分析物的方法，其特征在于(1)捕獲分析物將特異性捕獲劑包被到固相表面，成為捕獲裝置；加入待測(cè)生物樣本，使捕獲裝置上的特異性捕獲劑與樣本中的分析物結(jié)合，形成捕獲劑-分析物復(fù)合物；(2)標(biāo)記復(fù)合物用標(biāo)記試劑標(biāo)記捕獲劑-分析物復(fù)合物；(3)洗脫分析物將經(jīng)過標(biāo)記的分析物從復(fù)合物上洗脫下來；(4)再捕獲將洗脫的分析物中和后加入檢測(cè)裝置，由檢測(cè)裝置上的第二捕獲劑通過與標(biāo)記分子的結(jié)合而再次將分析物捕獲。所說的檢測(cè)裝置是指包被了第二捕獲劑的固相表面；(5)檢測(cè)加入特異檢測(cè)劑，和分析物特異性結(jié)合，通過檢測(cè)特異檢測(cè)劑上攜帶的報(bào)道分子產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度來確定分析物濃度。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的定量檢測(cè)方法，其特征在于其中所說的特異捕獲劑是抗體、抗體片段、非抗體類蛋白質(zhì)、肽、寡聚核苷酸或小分子化合物。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)方法，其特征在于其中所說的第二捕獲劑是能夠與所說的標(biāo)記分子結(jié)合的物質(zhì)，包括但不限于親和素或鏈親和素、抗體、或其他蛋白質(zhì)。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)方法，其特征在于其中所說的特異檢測(cè)劑是標(biāo)有報(bào)道分子的特異捕獲劑；特異檢測(cè)劑和特異捕獲劑與分析物的同一個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，二者的不同是前者攜帶報(bào)道分子而后者不攜帶報(bào)道分子。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)方法，其特征在于其中所說的分析物是能與所說的捕獲劑特異性結(jié)合的抗原蛋白質(zhì)、抗體、肽、寡聚核苷酸適體、其他生物大分子及其復(fù)合物、小分子以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)方法，其特征在于，所說的標(biāo)記試劑是能夠?qū)?biāo)記分子標(biāo)記到分析物上的試劑；所說的標(biāo)記分子是最好是生物素；其他可以作為標(biāo)記分子的化合物包括各類半抗原小分子、肽、或寡聚核苷酸。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)方法，其特征在于其中所說的報(bào)道分子是熒光分子、生物素、半抗原小分子、酶、或寡聚核苷酸。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)方法，其特征在于，其中所說的捕獲裝置的固相表面是試管、微量板、濾膜、可以結(jié)合蛋白質(zhì)測(cè)試紙或微珠；所說的檢測(cè)裝置的固相表面為微量板、濾膜、測(cè)試紙、微珠、玻璃或塑料薄片載體。9、權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)方法，在臨床檢測(cè)診斷、生物標(biāo)記鑒定分析、分子生物學(xué)和細(xì)J包生物學(xué)研究、蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析、新藥耙位鑒定分析、臨床藥物動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)分析領(lǐng)域的應(yīng)用。10、一種用于權(quán)利要求1所說的用單一特異性捕獲劑定量檢測(cè)分析物的方法的試劑盒，其特征在于，包括捕獲裝置、檢測(cè)裝置，標(biāo)記試劑、分析物中和液與洗脫液、標(biāo)記有報(bào)道分子的特異檢測(cè)劑、使報(bào)道分子顯示信號(hào)的試劑、分析物標(biāo)準(zhǔn)樣品、用法說明等。11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其特征在于，所說的捕獲裝置是包被著特異性單克隆抗體的96-孔微量板；所說的檢測(cè)裝置是包被著鏈親和素的96-孔微量板；所說的標(biāo)記試劑是能夠?qū)⑸锼剡B接到分析物上的試劑，例如NHS-生物素；所說的標(biāo)記有^t道分子的特異檢測(cè)劑是由用于包#1捕獲裝置的特異性單克隆抗體連接上報(bào)道分子而產(chǎn)生。12、根據(jù)權(quán)利要求10和11所述的試劑盒，其特征在于，所說的報(bào)道分子標(biāo)記的特異檢測(cè)劑是用辣根過氧化物酶標(biāo)記的特異性單克隆抗體，所說的使報(bào)道分子顯示信號(hào)的試劑包括但不限于辣根過氧化物酶底物和反應(yīng)終止溶液。13、根據(jù)權(quán)利要求IO和ll所述的試劑盒，其特征在于，所說的報(bào)道分子標(biāo)記的特異檢測(cè)劑是用一種半抗原小分子或肽標(biāo)記的特異性單克隆抗體；所說的使報(bào)道分子顯示信號(hào)的試劑包括但不限于能夠與所說的半抗原小分子或肽特異性結(jié)合的酶聯(lián)二級(jí)抗體、酶的底物、反應(yīng)終止溶液等。。14、根據(jù)權(quán)利要求10和11所述的試劑盒，其特征在于，所說的報(bào)道分子標(biāo)記的特異檢測(cè)劑是用寡聚核苷酸標(biāo)記的特異性單克隆抗體。15、根據(jù)權(quán)利要求10和11所述的試劑盒，其特征在于，所說的報(bào)道分子標(biāo)記的特異檢測(cè)劑是用熒光化合物標(biāo)記的特異性單克隆抗體。全文摘要本發(fā)明公開了一種用單一特異性捕獲劑定量檢測(cè)生物樣本中分析物的方法，稱為“分析物標(biāo)記及倒置再捕獲法”，簡(jiǎn)稱ALIRA，是基于SALRA原理但采用不同再捕獲手段的改進(jìn)檢測(cè)方法。步驟是，先在捕獲裝置上捕獲分析物，形成捕獲劑-分析物復(fù)合物；再用標(biāo)記試劑標(biāo)記復(fù)合物；將經(jīng)過標(biāo)記的分析物從復(fù)合物上洗脫下來；由檢測(cè)裝置上的第二捕獲劑通過與標(biāo)記分子的結(jié)合而將分析物再次捕獲；然后加入特異檢測(cè)劑，和分析物結(jié)合，通過檢測(cè)特異檢測(cè)劑上攜帶的報(bào)道分子產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度來確定分析物濃度。本發(fā)明的有益效果是采用一種特異性捕獲劑就能靈敏地、簡(jiǎn)便地定量檢測(cè)分析物，在疾病診斷、醫(yī)學(xué)鑒定、新藥研制、蛋白質(zhì)微陣等應(yīng)用和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)G01N33/68GK101358969SQ20071002557公開日2009年2月4日申請(qǐng)日期2007年8月2日優(yōu)先權(quán)日2007年8月2日發(fā)明者孫東旭,斯蒂芬·諾克申請(qǐng)人:孫東旭