專利名稱：：Hla-b27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)療器械領(lǐng)域，具體地是涉及一種HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：強(qiáng)直性脊椎炎(ankylosingspondylitis,AS)是一種結(jié)締組織疾病，在人群中的患病率為0.2%-0.4%，發(fā)病年齡大多在30歲以內(nèi)，占65%。平均病程4-6年。主要癥狀是腰、骶及下肢關(guān)節(jié)疼痛。常伴有晨僵、夜間重、活動后輕等特點(diǎn)。與成年人的AS不同，青少年AS在發(fā)病初期引起骨骼病變的癥狀出現(xiàn)較少，可能有24%的兒童主訴四肢關(guān)節(jié)痛或只有足跟痛，但末梢關(guān)節(jié)病變表現(xiàn)已很明顯。AS主要表現(xiàn)為椎間盤纖維環(huán)和纖維環(huán)附近結(jié)締組織的骨化、椎間關(guān)節(jié)和四肢關(guān)節(jié)滑膜的炎癥和增生。晚期患者脊柱僵硬呈板狀，活動受限。晚期致殘率高。因而早期診斷、治療具有重要意義。人類白細(xì)胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)是白細(xì)胞膜上的一種同種抗原，依不同的位點(diǎn)編碼，具有重要的生理功能。早在1973年，Brewerton等報道了HLA—B27與強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosingspondylitis,AS)強(qiáng)相關(guān)。在AS患者中，88%—96%的患者具有HLA-B27抗原，而正常對照組中具有827抗原者僅為4%-8%。相對危險率達(dá)90%。盡管HLA~~B27與強(qiáng)直性脊柱炎有很強(qiáng)的相關(guān)性，但査出HLA—B27陽性并不能確診為強(qiáng)直性脊柱炎，HLA—B27是強(qiáng)直性脊柱炎的一個易發(fā)病的因素。HLA-B27檢測不能作為血清學(xué)陰性脊柱關(guān)節(jié)病的確診指標(biāo)，但在以下幾個方面將有助于診斷1如果癥狀和體征提示脊柱關(guān)節(jié)病變發(fā)生的可能性超過50%，那么B27抗原陽性顯著增加正確診斷的機(jī)會。2背痛及強(qiáng)直的患者，B27抗原陰性強(qiáng)烈提示患有其他疾病。在不伴有牛皮癬及炎癥性小腸病變時，B27抗原陰性可排除AS診斷。3患有炎癥性關(guān)節(jié)病變的青少年，B27抗原陽性可提示，可能會發(fā)生血清學(xué)陰性脊柱關(guān)節(jié)病變。4預(yù)測AS患者家庭成員發(fā)生AS的可能性。如果某成員攜帶有與AS相關(guān)的單倍型，尤其是男性，則預(yù)示其發(fā)病的可能性較大，為20%-30%，不帶有該單倍型者，發(fā)病的可能性極小，幾乎為0。早期檢測HLA-B27抗原的方法是微量淋巴細(xì)胞毒試驗(microlymphocytotoxicitytest，MLCT)。該方法費(fèi)時費(fèi)力，現(xiàn)已逐漸被流式(flowcytometry,FC)所取代。但FC價格昂貴，操作復(fù)雜。最近，又發(fā)展了以PCR為基礎(chǔ)的方法，雖然該方法準(zhǔn)確性高，但不適合做大樣本快速篩查。酶標(biāo)免疫磁性抗體分離檢測技術(shù)(MagneticAnti—bodyImmunoAssayMAIA)是一項高靈敏度的酶免技術(shù)，其檢測靈敏度可達(dá)到放射免疫法的水平。它將免疫磁性微珠分離技術(shù)引入酶聯(lián)免疫測定領(lǐng)域。磁性微珠連接的單克隆抗體與相應(yīng)的標(biāo)本抗原結(jié)合后，在磁力的作用下，特異性結(jié)合的抗原與其它物質(zhì)分離，再通過酶聯(lián)免疫顯色反應(yīng)，測定其含量。迄今為止，還未有人將該技術(shù)應(yīng)用到HLA-B27抗原檢測。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之一是提供一種HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒建立在磁性免疫分離和酶檢測原理上，具有快速、簡單、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。解決上述技術(shù)問題的技術(shù)內(nèi)容為一種HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒，主要包括酶稀釋液，酶結(jié)合物，還包括有包被有與HLA-B27抗體共價耦聯(lián)免疫磁性微珠的微孔板板條。優(yōu)選地，所述酶結(jié)合物為耦聯(lián)有抗CD45抗體的HRP，即抗CD45酶結(jié)合物。HLA-B27抗體與抗CD45酶結(jié)合物的稀釋度為1:50。該試劑盒還包括有，HRP耦聯(lián)HLA—B27抗體分子的陽性對照。酶稀釋液優(yōu)選為加有1%BSA(小牛血清白蛋白)、0.1%Proclin300的0.01MPBS緩沖液。本發(fā)明所述HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒用于檢測EDTA-K3(乙二胺四乙酸三鉀)作為抗凝劑的全血標(biāo)本。本發(fā)明的另一需要解決的技術(shù)問題是提供上述HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法。一種HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，主要包括以下歩驟(A)共價耦聯(lián)免疫磁性微珠和HLA-B27抗體PBS緩沖液(NaCl137mmol/L，KC12.7mmol/L，Na2HP044.3mmol/L，KH2P041.4mmol/L)，pH6.5-7.5洗滌lml免疫磁性微珠1-5次，加入抗體8-12mg/ml，共lml，混勻后，加入雙功能耦聯(lián)劑BS3(Bis[sulfosuccinimidyl]suberate)，使其終濃度為0.8-1.2mM，室溫孵育20-40min，加入終止液0.7-1.2MTris緩沖液，pH6.5.—7.5，室溫孵育7—13min，用PBS洗滌2—5次，恢復(fù)體積lml;(B)酶結(jié)合物的制備；(C)包被微孔板將與HLA-B27抗體共價耦聯(lián)免疫磁性微珠2—4ul/孔加入到微孔板中。加入到微孔板中的HLA-B27抗體共價耦聯(lián)免疫磁性微珠優(yōu)選為3ul/孔。優(yōu)選地，共價耦聯(lián)免疫磁性微珠和HLA-B27抗體包括PBS,pH7.0洗滌lml免疫磁性微珠3次，加入抗體10mg/ml，共lml?；靹蚝?，加入雙功能耦聯(lián)劑BS3，使其終濃度為lmM，室溫孵育，30min，加入終止液lMTris緩沖液，pH7.0，室溫孵育10min，用PBS洗滌3次，恢復(fù)體積lml。然后加入1XBSA作為穩(wěn)定劑，0.1^NaN3作為防腐劑。酶結(jié)合物的制備包括準(zhǔn)確稱取10mgHRP(辣根過氧化物酶)置于干凈容器中，加入0.2mol/LpH為5.6的醋酸鹽緩沖液，待酶溶解后，加入0.06mol/LNaIO4溶液室溫反應(yīng)20分鐘；加入0.16mol/L乙二醇-10。/。氯化鈉溶液，于室溫下反應(yīng)20分鐘后；將上述酶液裝入透析袋中，用0.001mol/LpH為4.0的醋酸鹽緩沖液透析過夜；加入2mol/LpH為9.6的碳酸鹽緩沖液，加入待標(biāo)記的抗CD45抗體10mg后，4'C攪拌反應(yīng)2小時。然后加入新配制的NaBH4溶液(濃度為5mg/ml)，4'C攪拌反應(yīng)2小時；滴加飽和的(NH4)2S04溶液，4'C攪拌放置30分鐘，3500轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，棄上清，將沉淀溶于0.02mol/LpH為7.4的磷酸鹽緩沖液；用0.02mol/LpH為7.4的磷酸鹽緩沖液透析24小時，取出透析液，加入等體積酶保護(hù)液后，再加入等體積甘油，混勻后-2(TC保存。該試劑盒還可以包括酶聯(lián)免疫試劑盒常用的底物液A、底物液B、終止液、20倍濃縮洗液、陰性對照。病人全血樣本(EDTA—K3抗凝)與HRP標(biāo)記的抗細(xì)胞抗體都加入到含有HLA-B27抗體免疫磁性微珠的微孔板微孔中，若樣本中的白細(xì)胞上有HLA--B27抗原，經(jīng)短時孵育，免疫磁性微珠與白細(xì)胞結(jié)合，此時HRP標(biāo)記的抗細(xì)胞抗體連接到細(xì)胞上。洗滌后，免疫磁性微珠、細(xì)胞和酶被保留下來；若白細(xì)胞上沒有B27抗原，通過洗滌，細(xì)胞和酶均被清洗掉；之后加入酶底物液顯色，450nm讀取光密度值。本發(fā)明所述的HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒具有穩(wěn)定、性能好等優(yōu)點(diǎn)。用本發(fā)明所述HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行310份血樣檢驗。同時做流式HLA-B27試劑用于對照。表l與流式對比統(tǒng)計結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>以流式方法作為金標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒的靈敏度為35/37=94.6%,特異性為265/273=97.1%,準(zhǔn)確性為(35+265)/310二96.8%，說明該試劑盒與流式的結(jié)果符合很好。酶結(jié)合物穩(wěn)定性試驗實驗方法將分裝好的酶結(jié)合物和稀釋液于37T:生化培養(yǎng)箱放置七天，取出平衡室溫后與保存在4。C的酶結(jié)合物和稀釋液同時實驗。實驗結(jié)果_表2抗體-酶結(jié)合物37i:與4'C存放七天后的對比抗CD45酶結(jié)合物OD值37°C4°CHLA-B270.7440.7410.8350.861非HLA-B270.0530.0670.0700.060由表2可知，抗CD45酶結(jié)合物置37"C生化培養(yǎng)箱存放七天后，除OD值稍有所降低外，對其他指標(biāo)并無影響，其穩(wěn)定性良好，完全可用于HLA-B27磁性酶免疫分析。本發(fā)明所述的制備方法得到的HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法還具有快速、簡單、準(zhǔn)確、成本低等優(yōu)點(diǎn)。具體實施例方式一種HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒，包括P/。BSA、0.1%Proclin300的0.01MPBS的酶稀釋液，抗CD45酶結(jié)合物，包被有與HLA-B27抗體共價耦聯(lián)免疫磁性微珠的微孔板板條，HRP耦聯(lián)HLA—B27抗體分子的陽性對照、使用時配備有酶聯(lián)免疫試劑盒常用的底物液A、底物液B、終止液、20倍濃縮洗液，0.2MPBS的陰性對照，其中，使用時，HLA-B27抗體與CD45酶結(jié)合物的稀釋度為1:50。上述HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，主要包括以下步驟(A)共價耦聯(lián)免疫磁性微珠和HLA-B27抗體PBS，pH7.0洗滌lml免疫磁性微珠3次，加入抗體10mg/ml，共lml，混勻后，加入雙功能耦聯(lián)劑BS3(Bis[sulfosuccinimidyl]suberate)，使其終濃度為lmM，室溫孵育30min，加入終止液lMTris緩沖液，Ph7，室溫孵育10min，用PBS洗滌3次，恢復(fù)體積lml。然后加入1XBSA(小牛血清白蛋白)作為穩(wěn)定劑，0.1^NaN3作為防腐劑。(B)酶結(jié)合物的制備準(zhǔn)確稱取10mgHRP(辣根過氧化物酶)置于一干凈容器中，加入0.2mol/LpH為5.6的醋酸鹽緩沖液lml，待HRP溶解后，加入0.06mol/LNalO4溶液lml，室溫反應(yīng)20分鐘；加入0.16mol/L乙二醇-10%氯化鈉溶液lml，于室溫下反應(yīng)20分鐘后；將上述酶液裝入透析袋中，用O.OOlmol/LpH為4.0的醋酸鹽緩沖液透析過夜；加入2mol/LpH為9.6的碳酸鹽緩沖液，加入待標(biāo)記的抗CD45抗體lOmg后，4"攪拌反應(yīng)2小時。然后加入新配制的NaBH4溶液(濃度為5mg/ml)2ml，4'C攪拌反應(yīng)2小時；滴加飽和的(NH4)2S04溶液5ml，4"C攪拌放置30分鐘，3500轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，棄上清，將沉淀溶于0.02mol/LpH為7.4的磷酸鹽緩沖液5ml;用0.02mol/LpH為7.4的磷酸鹽緩沖液透析24小時，取出透析液，加入等體積酶保護(hù)液后，再加入等體積甘油，混勻后-2(TC保存。(C)包被微孔板按3ul/孔將與HLA-B27抗體共價耦聯(lián)免疫磁性微珠加入到微孔板中，真空封裝。本實施例所用所述底物液A、底物液B、終止液、20倍濃縮洗液購自深圳市安群生物工程有限公司，也可按以下方法制備底物液A的制備在混合容器中加入生產(chǎn)總量0.2MPBS5%;混合容器中按5g/1000ml加入11202.攪拌至完全均勻.加純水至生產(chǎn)總體積，攪拌均勻；分裝。底物液B的制備在混合容器中加入生產(chǎn)總量0.2MPBS5%;混合容器中按3g/1000ml加入TMB.攪拌至完全均勻。加純水至生產(chǎn)總體積,攪拌均勻；分裝。20倍濃縮液的制備在混合容器中加入生產(chǎn)總量0.2MPBS85%;混合容器中按0.5ml/1000ml加入吐溫20，攪拌至完全均勻。加0.2MPBS至生產(chǎn)總體積,攪拌均勻；分裝終止液的制備在混合容器中加入生產(chǎn)總量純水60%;混合容器中按125ml加入濃硫酸.攪拌均勻；加純水至生產(chǎn)總體積,攪拌均勻；分裝。因為人細(xì)胞很難保存，所以將HLA—B27分子耦聯(lián)上HRP，作為本發(fā)明試劑盒的陽性對照，其耦聯(lián)方法與抗白細(xì)胞抗體(抗CD45抗體)耦聯(lián)HRP相同。以上所有試劑都應(yīng)于4'C避光貯藏。經(jīng)過多次實驗的反復(fù)對比測定抗凝劑的影響，在多種抗凝劑(例如檸檬酸鈉，肝素以及EDTA-K3)中，選擇使用EDTA-K3作為本發(fā)明所述試劑盒的測定的血樣的抗凝劑。使用時，可以按以下步驟操作；1.取出所有試劑和血樣，平衡至室溫；2.病人樣本編號，將病人樣本、陽性對照、陰性對照安排到微孔中；3.取出所需微孔板條，其余放回密封袋中封好，放入冰箱；4.用酶稀釋液將HRP標(biāo)記的抗細(xì)胞抗體50倍稀釋；酶稀釋液50uLX(樣本數(shù)+2，陰、陽性對昭)"、、zHRP標(biāo)記的抗細(xì)胞抗體luLX(樣本數(shù)+2，陰、陽性對照)5.充分混勻后，加50ul于每一微孔中，輕拍板架，使免疫磁性微珠分散；6.將抗凝管(EDTA-K3)顛倒混勻數(shù)次，按記錄單中的安排每孔加入50ul血樣。用移液器吹打5-6次，使免疫磁性微珠和全血樣本充分混勻；各加50uL陽性、陰性對照到相應(yīng)微孔中；免疫磁性微珠和全血樣本必須混和均勻；7于室溫下反應(yīng)10分鐘，期間輕拍框架邊緣數(shù)次，使試劑與樣本維持均勻混合；8反應(yīng)時制備洗液，底物液。洗液按每孔1500ul，用去離子水20倍稀釋；9每孔加入250ul洗液。利用加入時的沖擊力使免疫磁性微珠分散，如發(fā)現(xiàn)有聚團(tuán)，用移液器吹散。將板架放于磁板上，2分鐘；10用八道移液器在遠(yuǎn)離磁體的微孔側(cè)壁吸棄上清，留下約10uL,不要吸干，取下并輕拍板架，使免疫磁性微珠分散；11重復(fù)9、10步驟共5—6次；12每孔加入底物A液、B液的混合液100ul，室溫，避光，15分鐘，觀察結(jié)果；13如需測量OD值，每孔加入50ul終止液；14將板架放于磁板上，使免疫磁性微珠吸于板條側(cè)壁；15輕輕取下板架，在波長450nm下，讀取吸光度值(OD)。權(quán)利要求1.一種HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒，主要包括酶稀釋液，酶結(jié)合物，其特征是，還包括有包被有與HLA-B27抗體共價耦聯(lián)免疫磁性微珠的微孔板板條。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，還包括有HRP耦聯(lián)HLA—B27抗體分子的陽性對照。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，酶稀釋液為加有1%BSA、0.1%Proclin300的0.01MPBS。4.根據(jù)權(quán)利要求1一3任一所述的HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所述酶結(jié)合物為與抗CD45抗體耦聯(lián)的HRP。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，HLA-B27抗體與抗CD45酶結(jié)合物的稀釋度為1:50。6.根據(jù)權(quán)利要求1一3任一所述的HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，該試劑盒用于檢測的全血標(biāo)本是以EDTA-K3作為抗凝劑。7.—種制備權(quán)利要求1所述HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒的方法，其特征是，主要包括以下步驟(A)共價耦聯(lián)免疫磁性微珠和HLA-B27抗體PBS，pH6.5-7.5洗滌lml免疫磁性微珠1-5次，加入抗體8-12mg/ml，共lml，混勻后，加入雙功能耦聯(lián)劑BS3，使其終濃度為0.8-1.2mM,室溫孵育20-40min，加入終止液0.7-1.2MTris緩沖液，pH6.5.—7.5，室溫孵育7—13min，用PBS洗滌2—5次，恢復(fù)體積lml;(B)酶結(jié)合物的制備；(C)包被微孔板將與步驟(A)制備的HLA-B27抗體共價耦聯(lián)免疫磁性微珠2—4ul/孔加入到微孔板中。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的上述HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，其特征是所述酶結(jié)合物的制備為稱取10mgHRP置于干凈容器中，加入0.2mol/LpH為5.6的醋酸鹽緩沖液，待酶溶解后，加入0.06mol/LNal04溶液，室溫反應(yīng)10-30分鐘；加入0.16mol/L乙二醇-10%氯化鈉溶液，于室溫下反應(yīng)10-30分鐘后裝入透析袋中，用0.001mol/LpH為4.0的醋酸鹽緩沖液透析過夜；加入2mol/LpH為9.6的碳酸鹽緩沖液，加入待標(biāo)記的抗CD45抗體9-llmg后，4"C攪拌反應(yīng)2小時，然后加入新配制的濃度為5mg/ml的NaBH4溶液，4'C攪拌反應(yīng)1一3小時；滴加飽和的(NH4)2S04溶液，4。C攪拌放置20—40分鐘，離心10—30分鐘，棄上清，將沉淀溶于0.02mol/LpH為7.4的磷酸鹽緩沖液；用0.02mol/LpH為7.4的磷酸鹽緩沖液透析18—30小時，取出透析液，加入等體積酶保護(hù)液后，再加入等體積甘油，混勻。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的上述HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，其特征是步驟(C)加入到微孔板中的HLA-B27抗體共價耦聯(lián)免疫磁性微珠為3ul/孔。10.根據(jù)權(quán)利要求7—9任一所述的上述HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，其特征是共價耦聯(lián)免疫磁性微珠和HLA-B27抗體為PBS，pH7.0洗滌lml免疫磁性微珠3次，加入抗體10mg/ml，共lml，混勻后，加入雙功能耦聯(lián)劑BS3,使其終濃度為lmM，室溫孵育，30min,加入終止液1MTris緩沖液，pH7.0，室溫孵育10min，用PBS洗滌3次，恢復(fù)體積lml，然后加入1XBSA作為穩(wěn)定劑，0.1XNaN3作為防腐劑。全文摘要本發(fā)明公開了一種HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒，它主要包括酶稀釋液，酶結(jié)合物，包被有與HLA-B27抗體共價耦聯(lián)免疫磁性微珠的微孔板板條。該試劑盒制備方法主要包括(A)共價耦聯(lián)免疫磁性微珠和HLA-B27抗體；(B)酶結(jié)合物的制備；(C)包被微孔板。該HLA-B27磁性酶聯(lián)免疫試劑盒具有快速、簡單、準(zhǔn)確、成本低等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號G01N33/535GK101294957SQ20071002782公開日2008年10月29日申請日期2007年4月29日優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日發(fā)明者郭志程申請人:郭志程