專利名稱：多元連接酶檢測(cè)反應(yīng)等位基因精確分型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因分型的方法，尤其涉及一種多元連接酶檢測(cè)反應(yīng) 等位基因精確分型的方法。
技術(shù)背景在生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)研究中，基因分型已經(jīng)逐漸成為醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)和基 因組學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。在理論研究方面，對(duì)于了解研究對(duì)象的遺傳 背景具有非常重要的作用，在臨床方面，對(duì)于為具有不同遺傳背景患者(或 受檢者)提供適當(dāng)?shù)脑\斷、治療和預(yù)防措施也具有非常重要的意義?；蚍中偷囊罁?jù)是已知的遺傳標(biāo)記——即基因中不同的突變位點(diǎn)。由 于所用遺傳標(biāo)記的不同，應(yīng)用的基因分型方法也不同。迄今已有多種基因分型的方法問(wèn)世，如基因芯片法、ISSR、測(cè)序法等。如何提供一種利用多元連接酶檢測(cè)反應(yīng)對(duì)己知序列的等位基因任何位 點(diǎn)進(jìn)行精確分型是科技技術(shù)人員要解決的問(wèn)題。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種多元連接酶檢測(cè)反應(yīng)等位基 因精確分型的方法，旨在解決上述的問(wèn)題。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的 根據(jù)待測(cè)序列和位點(diǎn)突變情況，設(shè)計(jì)一組"多元核酸引物/探針"，每組 至少包括引物h含該檢測(cè)位點(diǎn)的配對(duì)堿基A，能與待測(cè)位點(diǎn)左端局部配對(duì)(退 火)，并與該待測(cè)位點(diǎn)的野生型完全配對(duì)；引物2:含該檢測(cè)位點(diǎn)的不配對(duì)堿基C，能夠與待測(cè)位點(diǎn)左端局部配對(duì) 或退火，并不與該待測(cè)位點(diǎn)的野生型配對(duì)；1條能夠與待測(cè)位點(diǎn)右端局部配對(duì)或退火，并在5'末端帶有磷酸基，同 時(shí)在3'末端帶有熒光標(biāo)記的AMLR探針；上述一組"多元核酸引物/探針"與待測(cè)脫氧核糖核酸序列混合，進(jìn)行變性和退火，在反應(yīng)體系中就可能形成兩種雜交分子引物1與待測(cè)目標(biāo)脫氧核糖核酸分子左端退火，AMLR探針與其右端 退火；引物2與待測(cè)目標(biāo)脫氧核糖核酸分子左端退火，AMLR探針與其右端 退火；用Taq脫氧核糖核酸連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，則對(duì)于上述2種雜交分子 會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果-由于引物1與待測(cè)目標(biāo)脫氧核糖核酸分子左端和待測(cè)位點(diǎn)均能夠完全 退火，與右端退火的AMLR探針之間不會(huì)形成缺口，能夠完成連接反應(yīng)， 形成連接產(chǎn)物；由于引物2與待測(cè)目標(biāo)脫氧核糖核酸分子的待測(cè)位點(diǎn)不能夠?qū)崿F(xiàn)退火， 與右端退火的AMLR探針之間會(huì)形成單堿基不配對(duì)區(qū)，不能夠完成連接反 應(yīng)，無(wú)法形成連接產(chǎn)物；將反應(yīng)體系進(jìn)行熱變性，只能得到引物l-AMLR探針的有效連接產(chǎn)物；對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增引物l-AMLR探針的量即可供 熒光檢測(cè)或電泳檢測(cè)。對(duì)于突變型待測(cè)樣本得到與上述相反的結(jié)果，即形成引物2-AMLR 探針連接產(chǎn)物；對(duì)于一個(gè)待測(cè)位點(diǎn)只存在兩種等位基因形式的群體樣本，最都可能會(huì) 有三種檢測(cè)結(jié)果即單一的長(zhǎng)擴(kuò)增片段、單一的短擴(kuò)增片段、長(zhǎng)短擴(kuò)增片段；
如果待測(cè)位點(diǎn)具有多個(gè)突變形式，則在設(shè)計(jì)上只需增加相應(yīng)特定引物
的種類，無(wú)須改變AMLR探針；如需要改變檢測(cè)位點(diǎn)，則二者的設(shè)計(jì)都應(yīng)
作相應(yīng)改變。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是能夠?qū)σ阎蛄械膯位虻?任意位點(diǎn)進(jìn)行精確基因分型；能夠同時(shí)對(duì)已知序列的多個(gè)基因的任意位點(diǎn) 進(jìn)行精確基因分型；可以用于基因的高通量分型檢測(cè)，或常規(guī)的低通量實(shí) 驗(yàn)室操作。


圖1是本發(fā)明原理示意圖2是兩種等位形式的待測(cè)群體多元連接酶檢測(cè)反應(yīng)單基因精確分型 結(jié)果示意圖3是多基因待測(cè)群體多元連接酶檢測(cè)反應(yīng)基因精確分型結(jié)果示意圖；
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述
由圖l、圖2可見根據(jù)待測(cè)序列和位點(diǎn)突變情況，設(shè)計(jì)一組"多元核
酸引物/探針"，每組至少包括
引物h含該檢測(cè)位點(diǎn)的配對(duì)堿基A，能與待測(cè)位點(diǎn)左端局部配對(duì)(退
火)，并與該待測(cè)位點(diǎn)的野生型(如圖1中堿基T)完全配對(duì)(如圖1
中短引物)；
引物2:含該檢測(cè)位點(diǎn)的不配對(duì)堿基C，能夠與待測(cè)位點(diǎn)左端局部配對(duì) (退火)，并不與該待測(cè)位點(diǎn)的野生型(如圖1中堿基T)配對(duì)(如圖 1中長(zhǎng)引物)；
1條能夠與待測(cè)位點(diǎn)右端局部配對(duì)(退火)，并在5，末端帶有磷酸基(圖 1中P)，同時(shí)在3'末端帶有熒光標(biāo)記(圖1中FAM)的特定探針(如圖1中AMLR探針)；
上述一組"多元核酸引物/探針"與待測(cè)脫氧核糖核酸序列混合，進(jìn)行
變性和退火，在反應(yīng)體系中就可能形成兩種雜交分子
引物1與待測(cè)目標(biāo)脫氧核糖核酸分子左端退火，AMLR探針與其右端 退火；
引物2與待測(cè)目標(biāo)脫氧核糖核酸分子左端退火，AMLR探針與其右端 退火；
用Taq脫氧核糖核酸連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，則對(duì)于上述2種雜交分子 會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果-
由于引物1與待測(cè)目標(biāo)脫氧核糖核酸分子左端和待測(cè)位點(diǎn)均能夠完全 退火，與右端退火的AMLR探針之間不會(huì)形成缺口，能夠完成連接反應(yīng)， 形成連接產(chǎn)物； .
由于引物2與待測(cè)目標(biāo)脫氧核糖核酸分子的待測(cè)位點(diǎn)不能夠?qū)崿F(xiàn)退火， 與右端退火的AMLR探針之間會(huì)形成單堿基不配對(duì)區(qū)，不能夠完成連接反 應(yīng)，無(wú)法形成連接產(chǎn)物；
將反應(yīng)體系進(jìn)行熱變性，只能得到引物l-AMLR探針的有效連接產(chǎn)物;
對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增引物l-AMLR探針的量即可供 熒光檢測(cè)或電泳檢測(cè)；
對(duì)于突變型待測(cè)樣本得到與上述相反的結(jié)果(即形成引物2-AMLR 探針連接產(chǎn)物)；
對(duì)于一個(gè)待測(cè)位點(diǎn)只存在兩種等位基因形式的群體樣本，最都可能會(huì) 有三種檢測(cè)結(jié)果即單一的長(zhǎng)擴(kuò)增片段、單一的短擴(kuò)增片段、長(zhǎng)短擴(kuò)增片 段(參見圖2);
如果待測(cè)位點(diǎn)具有多個(gè)突變形式，則在設(shè)計(jì)上只需增加相應(yīng)特定引物 的種類，無(wú)須改變AMLR探針；如需要改變檢測(cè)位點(diǎn)，則二者的設(shè)計(jì)都應(yīng)作相應(yīng)改變；由圖3可見樣本分析根據(jù)待測(cè)樣本的序列、待測(cè)突變位點(diǎn)的位置 和類型數(shù)設(shè)計(jì)試劑盒中的引物種類和數(shù)量； 合成相應(yīng)引物和AMLR探針； 多元連接反應(yīng)和多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；電泳檢測(cè)和熒光檢測(cè)(可用核酸序列測(cè)定儀等儀器)。 應(yīng)用本發(fā)明生產(chǎn)一類試劑盒，對(duì)特定已知序列等位基因的任意突變位 點(diǎn)進(jìn)行分型。每個(gè)試劑盒的基本組成如下 長(zhǎng)短不一的特定引物2條以上；相應(yīng)的AMLR探針1條； Taq DNA連接酶檢測(cè)體系； 脫氧核糖核酸多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系； 其他輔助試劑。
權(quán)利要求
1. 一種多元連接酶檢測(cè)反應(yīng)等位基因精確分型的方法，是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的根據(jù)待測(cè)序列和位點(diǎn)突變情況，設(shè)計(jì)一組“多元核酸引物/探針”，每組至少包括引物1含該檢測(cè)位點(diǎn)的配對(duì)堿基A，能與待測(cè)位點(diǎn)左端局部配對(duì)(退火)，并與該待測(cè)位點(diǎn)的野生型完全配對(duì)；引物2含該檢測(cè)位點(diǎn)的不配對(duì)堿基C，能夠與待測(cè)位點(diǎn)左端局部配對(duì)或退火，并不與該待測(cè)位點(diǎn)的野生型配對(duì)；1條能夠與待測(cè)位點(diǎn)右端局部配對(duì)或退火，并在5’末端帶有磷酸基，同時(shí)在3’末端帶有熒光標(biāo)記的AMLR探針；上述一組“多元核酸引物/探針”與待測(cè)脫氧核糖核酸序列混合，進(jìn)行變性和退火，在反應(yīng)體系中就可能形成兩種雜交分子引物1與待測(cè)目標(biāo)脫氧核糖核酸分子左端退火，AMLR探針與其右端退火；引物2與待測(cè)目標(biāo)脫氧核糖核酸分子左端退火，AMLR探針與其右端退火；用Taq脫氧核糖核酸連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，則對(duì)于上述2種雜交分子會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果由于引物1與待測(cè)目標(biāo)脫氧核糖核酸分子左端和待測(cè)位點(diǎn)均能夠完全退火，與右端退火的AMLR探針之間不會(huì)形成缺口，能夠完成連接反應(yīng)，形成連接產(chǎn)物；由于引物2與待測(cè)目標(biāo)脫氧核糖核酸分子的待測(cè)位點(diǎn)不能夠?qū)崿F(xiàn)退火，與右端退火的AMLR探針之間會(huì)形成單堿基不配對(duì)區(qū)，不能夠完成連接反應(yīng)，無(wú)法形成連接產(chǎn)物；將反應(yīng)體系進(jìn)行熱變性，只能得到引物1-AMLR探針的有效連接產(chǎn)物；對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增引物1-AMLR探針的量即可供熒光檢測(cè)或電泳檢測(cè)。對(duì)于突變型待測(cè)樣本得到與上述相反的結(jié)果，即形成引物2-AMLR探針連接產(chǎn)物；對(duì)于一個(gè)待測(cè)位點(diǎn)只存在兩種等位基因形式的群體樣本，最都可能會(huì)有三種檢測(cè)結(jié)果即單一的長(zhǎng)擴(kuò)增片段、單一的短擴(kuò)增片段、長(zhǎng)短擴(kuò)增片段；如果待測(cè)位點(diǎn)具有多個(gè)突變形式，則在設(shè)計(jì)上只需增加相應(yīng)特定引物的種類，無(wú)須改變AMLR探針；如需要改變檢測(cè)位點(diǎn)，則二者的設(shè)計(jì)都應(yīng)作相應(yīng)改變。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多元連接酶檢測(cè)反應(yīng)等位基因精確分型的方法，是建立在特定探針設(shè)計(jì)、多元連接酶檢測(cè)反應(yīng)、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聯(lián)用的基礎(chǔ)上，對(duì)已知序列的單基因或多基因的任意突變位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行基因精確分型的方法；本發(fā)明的有益效果是能夠?qū)σ阎蛄械膯位虻娜我馕稽c(diǎn)進(jìn)行精確基因分型；能夠同時(shí)對(duì)已知序列的多個(gè)基因的任意位點(diǎn)進(jìn)行精確基因分型；可以用于基因的高通量分型檢測(cè)，或常規(guī)的低通量實(shí)驗(yàn)室操作。
文檔編號(hào)G01N21/00GK101275904SQ200710038808
公開日2008年10月1日 申請(qǐng)日期2007年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
發(fā)明者劉志學(xué), 磊 周, 肖愛軍, 邵永勝 申請(qǐng)人:上海捷瑞生物工程有限公司