專利名稱：一種利用畢赤酵母生產(chǎn)皮蠅素c的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及皮蠅素c，具體的是一種利用 畢赤酵母生產(chǎn)皮蠅素c的方法。
背景技術：
皮蠅蛆病 (//;^0&，^&)是由雙翅目、皮蠅科、皮蠅屬的牛皮蠅 (7fy/wcferm 6ov&)和紋皮蠅(/fy/wcferm //"eWwm)的幼蟲寄生于牛的背 部皮下組織引起的人畜共患寄生蟲病，該病給畜牧業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損 失，在歐洲、北美、亞洲等地廣泛流行，在我國甘肅、西藏、新疆、青 海、內(nèi)蒙古等五大牧區(qū)流行甚為嚴重。皮蠅主要寄生在?？啤⒙箍坪枉?科動物體內(nèi)。每年皮蠅蛆病都給畜牧業(yè)和皮革業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟 損失。
對于皮蠅蛆病的診斷除了臨床診斷以外最常用的就是ELISA，包被 抗原采用的是皮蠅一期幼蟲的可溶性抗原，這種抗原的主要成分是皮蠅 素A、 B和C， ELISA方法中主要針對的就是皮蠅素C的抗體。皮蠅素C 只在一期幼蟲中表達，能在牛背上形成瘤包的二期和三期幼蟲不表達， 有很高的抗原性和特異性。用HC做抗原、以ELISA為基礎的免疫學診 斷方法對評價歐洲皮蠅蛆病的流行情況及檢測包括法國、希臘、摩洛哥、 波蘭、葡萄牙、西班牙和英國等在內(nèi)的許多國家對該病的控制是具有重 要意義的。
隨著皮蠅蛆病控制工作的開展，獲得天然可溶性抗原越來越困難， 評價皮蠅蛆病的感染和復發(fā)越來越困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用畢赤酵母生產(chǎn)皮蠅素C的方法，所述的方法要解決現(xiàn)有技術中的皮蠅素C難以獲得的技術問題。
本發(fā)明一種利用畢赤酵母生產(chǎn)皮蠅素C的方法，包括如下步驟
(1) 根據(jù)皮蠅素C基因全長cDNA序列，設計含EcoR I和Not I酶切 位點的特異性引物，用PCR擴增出如SEQ ID N0:1所示HC基因，用 EcoR I和Not I分別酶切重組載體和片段HC，并用連接酶將其連接， 形成含有HC的重組質(zhì)粒，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌，酶切、PCR鑒定、 測序確認；
(2) 將含有HC的重組質(zhì)粒以Sal I進行酶切，線性化后的重組質(zhì)粒通 過電擊轉(zhuǎn)化入制備好的酵母感受態(tài)細胞中進行培養(yǎng)，篩選出多拷貝質(zhì)粒 菌株；
(3) 對篩選出的細胞進行培養(yǎng)，待菌液OD600值達2_6時離心收集 細胞，然后進行誘導表達；
(4) 將收集的上清液濃縮后，于緩沖液中透析、過濾，用陰離子交換 層析柱純化透析蛋白，收集含目的蛋白的洗脫液。
進一步的，所述的重組載體pPIC9k。 進一步的，所述的酵母感受態(tài)細胞GS115。
進一步的，在步驟3中采用BMGY培養(yǎng)基對篩選出的GS115細胞進 行培養(yǎng)。
進一步的，在步驟3中，用含1.0%甲醇的BMMY培養(yǎng)基在3(TC對 GS115細胞進行誘導表達，每天添加甲醇至1.0%，甘油至O. 25%， 60小 時后收集上清。
進一步的，在步驟4中，將收集的上清液濃縮后，于緩沖液中透析， 2—5小時換液一次，透析過液，濾膜過濾，然后用陰離子交換層析柱純 化透析蛋白，收集含目的蛋白的洗脫液。
進一步的，在用陰離子交換層析柱純化透析蛋白的過程中，洗脫程序為5CV洗脫液洗脫雜蛋白，進樣量2ml，梯度洗脫采取7XB液洗 雜蛋白，17XB液洗脫目的蛋白，流速1.0ml/min.， 280nmUV檢測。
進一步的，陰離子交換層析柱采用MonoQHR5/5。
本發(fā)明的目的還在于提供皮蠅素C在制備用于皮蠅蛆病的免疫診 斷的藥物或者試劑中的應用。
本發(fā)明的目的還在于提供一種含有如SEQIDNO: 2所示的序列的 畢赤酵母表達載體pPIC9k- HC。
本發(fā)明的目的還在于提供一種含有如SEQIDNO: 2所示的序列的 畢赤酵母畢赤酵母菌株GS115/pPIC9k- HC。
本發(fā)明由于HC基因是插入到畢赤酵母基因組DNA中去得，所以 能夠在高密度連續(xù)培養(yǎng)的情況下穩(wěn)定表達。酵母表達所使用的培養(yǎng)基由 酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、甘油等低廉原料組成，成本低。60 h為 一個培養(yǎng)周期，每升可獲得約121mg蛋白。陰離子交換層析分離純化 HC蛋白操作簡單，易用推廣應用。
本發(fā)明和已有技術相比，利用畢赤酵母表達皮蠅素C，并用陰離子 交換層析柱分離純化HC。這是一種低廉且高產(chǎn)的表達HC的方法，為 產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎。并且畢赤酵母可快速利用培養(yǎng)基中的碳源，穩(wěn) 定復制基因組中的DNA，采用高密度連續(xù)培養(yǎng)，蛋白產(chǎn)量高，它除含 有真核表達系統(tǒng)共有的翻譯后修飾功能等優(yōu)點外，同時也具有原核表達 系統(tǒng)操作簡單、成本低廉等優(yōu)點。


圖l為本發(fā)明pPIC9k-HC構建示意圖。
圖2為本發(fā)明重組PCR和酶切鑒定圖(其中M為3000bp DNA marker, 1為pPIC9k-HC經(jīng)EcoR I和Not I酶切產(chǎn)物，2為PCR重組 質(zhì)粒pPIC9k-HC擴增產(chǎn)物，3為PCR陰性對照)。圖3為本發(fā)明細胞培養(yǎng)上清液SDS — PAGE電泳圖(M為蛋白 Maker, 1-4為經(jīng)TCA濃縮后重組菌上清，5為空載體陰性對照，6為法 國農(nóng)科院饋贈的HC陽性對照)。
圖4為本發(fā)明純化后皮蠅素C SDS-PAGE電泳圖(1為純化后的HC， 2為純化前HC細胞培養(yǎng)上清液，M為蛋白Marker)。
圖5為本發(fā)明純化蛋白Western-blot圖(M為蛋白Maker, 1為 HC陽性對照，2，4為空載體陰性對照，3為重組菌表達上清5為純化 的HC)。
圖6為本發(fā)明純化蛋白明膠電泳圖(1為純化后HC， 2為未純化的 表達上清，3為空載體對照)。 具體賣施方式
下面通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明是如何實現(xiàn)的 實施例1 重組質(zhì)粒的構建 1. 1皮蠅素C基因的擴增
如圖1所示，根據(jù)已報道的HC序列(Moire， N 1994， GeneBank ID: X74306如SEQ ID NO: 1所示)，設計一對含EcoR I和Not I酶切位點 的引物
hp 1: GC AGAATTC ATAATC AATGGATACGAAG hp2: GCAAGCGGCCGCTTAAAATATTATACCAG
按常規(guī)方法進行PCR擴增pGEM—T/HC上的HC基因。PCR參數(shù) 94°C 5min， 94°C 45s， 50°C 45s， 72°C lmin，共30個循環(huán)；72°C延 伸10min。將PCR產(chǎn)物通過TA克隆連接到pMD18-T Vector上，PCR 鑒定正確后測序。 1.2 pPIC9k-HC的構建
用EcoRI和Notl (購自TaKaRa)分別酶切重組載體pMD18-T/HC 和表達載體pPIC9k(上海農(nóng)科院生物技術中心提供)，37。C水浴過夜后終止反應，用DNA膠回收試劑盒(購自上海申能博采公司)回收HC相 應片段和pPIC9k， T4連接酶16。C連接過夜。 1.3重組質(zhì)粒的鑒定
將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5 a (本實驗室保存)中，挑 取氨芐抗性克隆(100mg/ml)，接種于LB培養(yǎng)基，37"C振蕩培養(yǎng)過夜， 提取重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切和PCR鑒定正確后測序。
如圖2所示，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及酶切均證實了片段的正確插入， 測序結果(如SEQIDNO: 2所示)表明未有發(fā)生堿基移碼、丟失和增 加。''
實施例2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選 2.1重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
重組質(zhì)粒經(jīng)SalI酶切(37°C 5h)使之線性化，1.5kv，200KQ,25uF 電擊轉(zhuǎn)化入制備好的感受態(tài)酵母細胞GS115(上海農(nóng)科院生物技術中心 提供)中。
2.2多拷貝重組質(zhì)粒的篩選
電擊轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于組氨酸缺陷培養(yǎng)基MD平板，30°C培養(yǎng)， 2 5天后出現(xiàn)菌落。長出的各個菌落連續(xù)通過3塊96孔細胞培養(yǎng)板培 養(yǎng)使菌液具有相同的細胞密度，將菌液分別滴加于含lmg/mlG418的 YPD平板上，30°C培養(yǎng)，待菌落生長后用PCR鑒定。
實施例3 細胞培養(yǎng)與蛋白誘導分泌
將篩選得到的含多拷貝pPIC9k- HC質(zhì)粒的GS115用以甘油為碳源 的BMGY培養(yǎng)基3(TC培養(yǎng)，當OD600值為2—6時，4000rpm離心10min 收集細胞沉淀，改用含1.0%甲醇的BMMY培養(yǎng)基30°C誘導表達，每 天添加甲醇至1.0%，甘油至0.25%， 60h后收集上清。如圖3所示，誘導表達后蛋白電泳表明，分泌蛋白中含有28KD蛋
白
實施例4 分離純化
將收集的上清液濃縮至1/5體積后，于25mM Tris-HCl pH8.0緩沖 液中透析，2小時換液一次，透析過液，0.22ixm濾膜過濾。用陰離子 交換層析柱純化透析蛋白，洗脫液為2M NaCl 25mM Tris-HCl pH8.0， 洗脫程序為5CV洗脫液洗脫雜蛋白，進樣量2ml，梯度洗脫采取7% B液洗雜蛋白，17XB液洗脫目的蛋白，流速1.0ml/min.， 280nmUV檢 測，收集含目的蛋白的洗脫液。
實施例5 表達產(chǎn)物的生物特性鑒定 5.1分子量測定
將收集的上清及收集到的蛋白峰進行SDS-PAGE電泳.分離膠和積 層膠的濃度分別為12%和5%，加樣20uL，電壓條件分別為130V和 80V，以低分子量標準蛋白作對照，考馬斯亮蘭染色。如圖4所示，蛋 白質(zhì)的大小為28KD。
5.2抗原性檢測
將收集的蛋白進行SDS-PAGE電泳后，100V lh轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素 膜(NC)上，1%明膠封閉液中溫育1.5小時；與l: 500兔抗HC血清 作用lh， PBST洗脫三次，每次5min;再與羊抗兔IgG-HRP (購自華 美生物工程公司)1:2000室溫作用lh， PBST洗滌三次后，置于底物溶 液中顯色。如圖5所示，Western-blot顯示了此峰蛋白能與兔抗HC血清 特異性結合。5.3酶活性檢測
除在分離膠中含0.1%明膠外其他與SDS-PAGE膠相同，樣品不經(jīng) 變性處理。電泳后用2.5%TritonX-100溶液4。C洗滌，在0.1 mM Tris-HCl pH7.5， 1 mMCaCV溶液中37。C溫浴60min，考馬斯亮蘭染色。如圖6 所示，明膠電泳顯示目的蛋白對明膠有水解作用，具有水解酶活性。<formula>formula see original document page 11</formula><210> 2
<211> 693
<212> DNA
<213>重組后皮蠅素C
<400> 2
ataatcaatg gatacgaagc ctatactggt ctatttcctt accaagctgg tctagacatt 60
acactacaag atcagagaag ggtatggtgc ggtggttcct tgatcgacaa taaatggatt 120
ttgactgctg cccactgtgt acatgatgca gtttcggttg ttgtttactt aggttctgcc 180
gtccaatatg agggtgaagc cgttgtgaac tcagaaagga tcatctctca ttccatgttt 240
aatccagaca c ttacttgaa tgatgttgcc ttgatcaaaa ttcctcacgt cgaatacacc 300
gacaatatcc aacctataag attaccttcc ggagaagaat taaataacaa atttgaaaat 3 GO
atttgggcta cagtttctgg ttggggtcaa tgcaatactg ataccgtgat tttgcaatat 420
acttataatc tcgtcatcga taacgatcga tgtgcacaag aatatcctcc gggtattatc '480
gtcgagtcta caatatgcgg tgacactagt gatggcaaat caccctgctt cggagattct 540
ggtggcccat ttgtcttgag tgataaaaat ttgttaattg gtgtggtttc tttcgtatct 600 ggagccggct gtgaatccgg caagcctgtt ggcttctcac gtgtgaccag ttacatggat 660
tggattcagc aaaatactgg tataatattt taa 69權利要求
1.一種利用畢赤酵母生產(chǎn)皮蠅素C的方法，其特征在于所述的方法包括如下步驟(1)根據(jù)皮蠅素C基因全長cDNA序列，設計含EcoR I和Not I酶切位點的特異性引物，用PCR擴增出如SEQ ID NO1所示的皮蠅素C基因，用EcoR I和Not I分別酶切重組載體和片段皮蠅素C基因，并用連接酶將其連接，形成含有皮蠅素C基因的重組質(zhì)粒，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌，酶切、PCR鑒定、測序確認；(2)將含有皮蠅素C基因的重組質(zhì)粒以Sal I進行酶切，線性化后的重組質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化入制備好的酵母感受態(tài)細胞中進行培養(yǎng)，篩選出多拷貝質(zhì)粒菌株；(3)對篩選出的細胞進行培養(yǎng)，待菌液OD600值達2-6時離心收集細胞，然后進行誘導表達；(4)將收集的上清液濃縮后，于緩沖液中透析、過濾，用陰離子交換層析柱純化透析蛋白，收集含目的蛋白的洗脫液。
2. 如權利要求1所述的利用畢赤酵母生產(chǎn)皮蠅素C的方法，其特征在于， 所述的重組載體pPIC9k。
3. 如權利要求1所述的利用畢赤酵母生產(chǎn)皮蠅素C的方法，其特征在于， 所述的酵母感受態(tài)細胞為GS115。
4. 如權利要求1所述的利用畢赤酵母生產(chǎn)皮蠅素C的方法，其特征在于， 在步驟3中采用BMGY培養(yǎng)基對篩選出的GS115細胞進行培養(yǎng)。
5. 如權利要求1所述的利用畢赤酵母生產(chǎn)皮蠅素C的方法，其特征在于， 在步驟3中，用含1. 0%甲醇的B匿Y培養(yǎng)基在30。C對GS115細胞進行誘導 表達，'每天添加甲醇至1.0%，甘油至0.25%， 60小時后收集上清。
6. 如權利要求1所述的利用畢赤酵母生產(chǎn)皮蠅素C的方法，其特征在于，在步驟4中，將收集的上清液濃縮后，于緩沖液中透析，2—5小時換液一次，透析過液，濾膜過濾，然后用陰離子交換層析柱純化透析蛋白，收 集含目的蛋白的洗脫液。
7. 如權利要求6所述的利用畢赤酵母生產(chǎn)皮蠅素C的方法，其特征在于， 在用陰離子交換層析柱純化透析蛋白的過程中，洗脫程序為5CV洗脫 液洗脫雜蛋白，進樣量2ml，梯度洗脫采取7XB液洗雜蛋白，17XB液 洗脫目的蛋白，流速1.0ml/min.， 280nmUV檢測。
8. 如權利要求1所述的利用畢赤酵母生產(chǎn)皮蠅素C的方法，其特征在于， 陰離子交換層析柱采用Mono Q HR5/5。
9. 皮蠅素C在制備用于皮蠅蛆病的免疫診斷的藥物或者試劑中的應 用。
10. —種含有如SEQ ID NO: 2所示的序列的畢赤酵母表達載體 pPIC9k- HC。
11. 一種含有如SEQIDNO: 2所示的序列的畢赤酵母畢赤酵母菌株 GS115/pPIC9k畫HC。
全文摘要
本發(fā)明公開一種利用畢赤酵母生產(chǎn)皮蠅素C的方法，包括如下步驟首先用PCR擴增HC基因，酶切重組載體和片段HC，用連接酶連接后形成含有HC的重組質(zhì)粒，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌，然后將含有HC的重組質(zhì)粒酶切，線性化后通過電擊轉(zhuǎn)化入制備好的酵母感受態(tài)細胞中進行培養(yǎng)，篩選出多拷貝質(zhì)粒菌株，對篩選出的細胞進行培養(yǎng)，離心收集細胞，進行誘導表達，最后將收集的上清液濃縮后，于緩沖液中透析、過濾，用陰離子交換層析柱純化透析蛋白，收集含目的蛋白的洗脫液。本發(fā)明是一種低廉且產(chǎn)量高的表達HC的方法，畢赤酵母具有原核表達系統(tǒng)快速、簡單、低廉的優(yōu)點，其最大的優(yōu)點是它自身分泌的蛋白很少，有利于純化。
文檔編號G01N33/53GK101294184SQ200710039980
公開日2008年10月29日 申請日期2007年4月25日 優(yōu)先權日2007年4月25日
發(fā)明者何國聲, 程 龐, 徐梅倩, 杰 曹, 朱順海, 李家誠, 趙其平, 敏 郭, 高興春, 燕 黃 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所