專利名稱：基于化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移原理構(gòu)建生物納米器件的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(chemiluminescence resonanceenergy transfer，CRET)原理構(gòu)建生物納米器件的方法，主要用于生物分子的標(biāo)記檢測和示蹤，進(jìn)行細(xì)胞、組織和活體成像，屬于生物分子納米器件制備的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
熒光量子點(diǎn)(quantum dots，QDs，又稱納米晶體)是一類非常重要的功能納米材料，它是一種由II族-VI族或III族-V族元素組成的無機(jī)納米顆粒。當(dāng)這些半導(dǎo)體納米晶體的直徑小于其玻爾半徑時，由于尺度量子效應(yīng)和介電限域效應(yīng)使它們表現(xiàn)出特殊的光致發(fā)光性質(zhì)。目前，熒光量子點(diǎn)已成功地用于生命科學(xué)中的各個領(lǐng)域，主要包括免疫分析、DNA雜交、活細(xì)胞和固定細(xì)胞成像等。由于熒光量子點(diǎn)優(yōu)異的光學(xué)性能和光化學(xué)穩(wěn)定性，最近它作為能量供體和受體已成功地應(yīng)用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移。量子點(diǎn)作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移的能量供體和受體主要用于分析量子點(diǎn)-蛋白質(zhì)標(biāo)記物結(jié)構(gòu)、量子點(diǎn)-蛋白質(zhì)感應(yīng)組裝、光反應(yīng)變色轉(zhuǎn)換、光動力學(xué)醫(yī)學(xué)治療以及DNA復(fù)制和聚合反應(yīng)的監(jiān)測等方面。
梅耶等人制備了發(fā)光無機(jī)納米粒子(克里斯蒂亞娜·梅耶；馬庫斯·哈澤；維爾納·霍艾澤爾；克斯廷·博曼，適于(F)RET-分析的芯/殼納米粒子，專利公開號；CN1780895，2006年)，這些粒子可用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移生物分析中。王博士等人(Shaopeng Wang，S.P.；Mamedova，N.；Kotov，N.A.；Chen，W.；Studer，J.Antigen/Antibody Immunocomplex from CdTe Nanoparticle Bioconjugates，NanoLett.2002，2，817-822.)將發(fā)射波長為611納米的紅色量子點(diǎn)與牛血清白蛋白(BSA)相連，555納米的綠色量子點(diǎn)與抗牛血清白蛋白抗體(IgG)相連，當(dāng)二者形成免疫復(fù)合物時，紅色量子點(diǎn)熒光增強(qiáng)，綠色量子點(diǎn)熒光相應(yīng)減弱，這是因?yàn)榭乖⒖贵w發(fā)生免疫反應(yīng)時，使兩種量子點(diǎn)靠得足夠近，產(chǎn)生了共振能量轉(zhuǎn)移。除了用于免疫分析和其他特異性結(jié)合分析外，應(yīng)用共振能量轉(zhuǎn)移原理，量子點(diǎn)在生物傳感器方面的研究更是方興未艾。Medintz等人(Medintz，I.L.；Clapp，A.R.；Mattoussi，H.；Goldman，E.R.；Fisher，B.；Mauro，J.M.Self-assemblednanoscale biosensors based on quantum dot FRET donors.Nat.Mater.2003，2(9)630-638.)以硒化鎘量子點(diǎn)為能量供體，應(yīng)用麥芽糖結(jié)合蛋白作為生物識別物質(zhì)，設(shè)計(jì)了濃度型麥芽糖傳感器。
由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移分析系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，儀器價格昂貴，同時生物體內(nèi)自身熒光會產(chǎn)生的干擾，其應(yīng)用受到一定的限制。另外目前生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光的波長位于可見光譜區(qū)(一般450-560納米)，由于動物組織的吸收，難以透過動物組織。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移原理構(gòu)建生物納米器件的方法，制備的這種生物納米器件具有良好的水溶性和穩(wěn)定性，不需要外加光源，發(fā)光波長可調(diào)，可用于生物分子的標(biāo)記檢測和示蹤，進(jìn)行細(xì)胞和組織成像。
本發(fā)明構(gòu)建的生物納米器件由辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)和能量受體熒光量子點(diǎn)構(gòu)成。
本發(fā)明所述的熒光量子點(diǎn)結(jié)構(gòu)特征所述的作為能量受體的納米粒子為水相合成不同尺寸的巰基化合物修飾的水溶性碲化鎘(CdTe)，硒化鎘(CdSe)和碲化汞鎘(CdHgTe)，其發(fā)射波長位于500-900納米，量子產(chǎn)率大于20％，其表面修飾有多個羧基(-COOH)或氨基，用于與蛋白質(zhì)如辣根過氧化物酶共價連接。
本發(fā)明的方法具體包括如下步驟第一步，碲(硒)氫化鈉的制備將碲(硒)粉、硼氫化鈉和超純水放在燒瓶中反應(yīng)。其中，碲(硒)粉和硼氫化鈉的摩爾比為1∶4至4∶1。經(jīng)過5-12小時的反應(yīng)，黑色的碲(硒)粉逐漸消失，燒瓶底部出現(xiàn)白色的硼酸鈉沉淀。小心的將燒瓶中的上層清液轉(zhuǎn)移至裝有已經(jīng)除過氣的超純水中的燒瓶中，制備得到碲(硒)氫化鈉溶液。
第二步，采用水相合成法制備一定量不同尺寸的水溶性碲(硒)化鎘量子點(diǎn)或碲化汞鎘量子點(diǎn)。
(1)將0.00001-0.1摩爾/升氯化鎘和水溶性巰基化合物混合配成溶液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0-10.0，通氮?dú)獬跞昼姾?，在劇烈的攪拌并在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，注入碲(硒)氫化鈉溶液，形成碲(硒)化鎘單體溶液。加入的二價鎘離子∶碲(硒)氫化鈉∶水溶性巰基化合物的摩爾比為2∶1∶4至2∶1∶8，控制反應(yīng)溫度70-140℃，反應(yīng)時間0.5-20小時，得到發(fā)光范圍在500到730納米的一系列碲化鎘量子點(diǎn)水溶液或發(fā)光范圍在460到550納米的一系列硒化鎘量子點(diǎn)水溶液。
(2)以水為溶劑，將濃度為0.00001-0.1摩爾/升水溶性鎘鹽和汞鹽與水溶性巰基化合物混合，調(diào)節(jié)pH為7.0-12.0，其中鎘鹽與汞鹽的摩爾比為1∶50至1∶5，鎘鹽和汞鹽總量與水溶性巰基化合物的摩爾比為1∶5至2∶1。然后，注入按步驟1方法配制好的碲氫化鈉溶液，鎘鹽和汞鹽的總量與碲氫化鈉的摩爾比為10∶1至1∶4，得到CdHgTe單體。取CdHgTe單體放入微波反應(yīng)器，通過調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度80-140℃和反應(yīng)時間5分鐘-10小時，得到發(fā)光位置在600-900納米的碲化汞鎘量子點(diǎn)水溶液。
第三步，將水溶性碲(硒)化鎘量子點(diǎn)或碲化汞鎘量子點(diǎn)與過氧化物酶以共價連接，得到生物納米器件。
將0.001-5毫克/毫升水溶性碲(硒)化鎘量子點(diǎn)或碲化汞鎘量子點(diǎn)，過氧化物酶和乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)于緩沖液中混合均勻，所述緩沖液為0.01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液，pH值為7.0。水溶性碲(硒)化鎘量子點(diǎn)或碲化汞鎘量子點(diǎn)、乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽和過氧化物酶摩爾比為1∶1000∶0.1至1∶1000∶5，混合溶液于常溫下避光反應(yīng)2-4小時，得到所需的生物納米器件。
本發(fā)明建立一種基于化學(xué)發(fā)光物質(zhì)為能量供體和熒光量子點(diǎn)為能量受體的新型共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，即化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移，它與生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移較為相似?；瘜W(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移是指基于反應(yīng)底物氧化后的化學(xué)發(fā)光試劑供體和適合的受體間的非輻射共振能量轉(zhuǎn)移。它與熒光共振能量轉(zhuǎn)移之間的區(qū)別主要在于熒光共振能量轉(zhuǎn)移過程需要外加的光源，而化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移基于反應(yīng)底物(如魯米諾，luminol)氧化而產(chǎn)生，不需要外加光源，背景干擾小，具有高的靈敏度。
本發(fā)明的方法成本低，操作簡便，條件溫和。制備的生物納米器件水溶性和穩(wěn)定性好，具有化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，發(fā)光效率高，發(fā)光范圍可調(diào)等特點(diǎn)，主要用于生物分子的標(biāo)記檢測和示蹤，進(jìn)行細(xì)胞和組織成像。


圖1.基于化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移原理發(fā)光的生物納米器件示意圖。
圖2.分別用不同尺寸的碲化鎘量子點(diǎn)為能量受體的免疫納米器件化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移譜圖，所用量子點(diǎn)發(fā)光波長分別為557納米，587納米，622納米和657納米。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖并通過幾個具體的實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。
本發(fā)明制備的生物納米器件結(jié)構(gòu)如圖1所示，由過氧化物酶和能量受體熒光量子點(diǎn)組成。在圖1中，催化劑過氧化物酶與碲化鎘量子點(diǎn)連接，而魯米諾-化學(xué)發(fā)光供體不是直接與碲化鎘量子點(diǎn)連接。過氧化物酶能連續(xù)地催化魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光反應(yīng)時，激發(fā)態(tài)的魯米諾將能量轉(zhuǎn)移給基態(tài)的碲化鎘量子點(diǎn)，使碲化鎘量子點(diǎn)發(fā)出長波長的光。
實(shí)施例1(1)碲氫化鈉的制備將80毫克碲粉、80毫克硼氫化鈉和2毫升水放在一個10毫升的小燒瓶中，反應(yīng)的小燒瓶口立即用橡皮塞密封，在室溫下反應(yīng)8小時。小心的將燒瓶中的上層清液轉(zhuǎn)移至裝有已經(jīng)除過氣的超純水中的100毫升燒瓶中，制備得到0.00625摩爾/升的碲氫化鈉溶液。
(2)微波水相巰基丙酸輔助合成碲化鎘量子點(diǎn)將0.00125摩爾/升氯化鎘和0.003摩爾/升巰基丙酸混合配成溶液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，通氮?dú)獬跞昼姾?，在劇烈的攪拌并在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，注入碲氫化鈉溶液，形成碲化鎘單體溶液。加入的二價鎘離子∶碲氫化鈉∶巰基丙酸摩爾比為2∶1∶4.8。將已經(jīng)得到的前驅(qū)體溶液放入微波消解罐，通過微波輻射加熱?？刂品磻?yīng)時間0.5-2小時，得到水溶性碲化鎘量子點(diǎn)量子產(chǎn)率為40-60％，發(fā)射波長為500-730納米。
(3)制備碲化鎘量子點(diǎn)-過氧化物酶生物納米器件將2×10-7摩爾/升含巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點(diǎn)，2×10-4摩爾/升乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽和5×10-7摩爾/升過氧化物酶加入到0.01摩爾/升pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液中混合均勻，混合溶液于常溫下避光反應(yīng)2-4小時。采用超濾法純化量子點(diǎn)生物標(biāo)記物，得到碲化鎘量子點(diǎn)-過氧化物酶生物納米器件。最后至4攝氏度冰箱處保存，用于化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移分析。分析結(jié)果如圖2所示。在圖2中，采用四種不同尺寸發(fā)射波長為557，587，622和657納米的碲化鎘量子點(diǎn)分別用作能量受體。圖2中第一個峰為魯米諾發(fā)光峰(左)，后面四個的峰為量子點(diǎn)發(fā)光峰。像熒光共振能量轉(zhuǎn)移一樣，能觀察到魯米諾供體和碲化鎘量子點(diǎn)生物標(biāo)記物受體之間的共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。
實(shí)施例2(1)碲氫化鈉的制備如實(shí)例1所述。
(2)谷胱甘肽修飾的碲化鎘量子點(diǎn)的水相合成以水為溶劑，將濃度為0.00125摩爾/升的氯化鎘與0.0025毫摩爾/升谷胱甘肽混合，調(diào)節(jié)溶液的pH值至9.0，然后注入0.00625摩爾/升碲氫化鈉，在25攝氏度的溫度下攪拌10分鐘，得到碲化鎘前體溶液。將碲化鎘前體溶液在80攝氏度下加熱1-20小時得到發(fā)光范圍在480-650納米的不同量子點(diǎn)。
(3)谷胱甘肽修飾的碲化鎘量子點(diǎn)-過氧化物酶生物納米器件的制備將含2×10-6摩爾/升谷胱甘肽修飾的碲化鎘量子點(diǎn)，1×10-3摩爾/升乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽和1×10-6摩爾/升過氧化物酶加入到0.01摩爾/升pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液中混合均勻，混合溶液于常溫下避光反應(yīng)2-4小時。采用超濾法純化量子點(diǎn)生物標(biāo)記物，得到碲化鎘量子點(diǎn)-過氧化物酶生物納米器件。最后至4攝氏度冰箱處保存，用于化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移分析。
實(shí)施例3(1)碲氫化鈉的制備如實(shí)例1所述。
(2)碲化汞鎘量子點(diǎn)的水相合成將0.00125摩爾/升氯化鎘和0.0025摩爾/升氯化汞溶于90毫升超純水中，加入0.00625摩爾/升巰基丙酸并調(diào)節(jié)pH值至10.0，注入配好的0.00625摩爾/升的碲氫化鈉溶液10毫升，這時得到碲化汞鎘前體溶液，溶液呈橙黃色。將此溶液放入微波反應(yīng)器反應(yīng)，在130℃下加熱30分鐘，得到熒光發(fā)射峰在800納米，量子產(chǎn)率20％的近紅外碲化汞鎘量子點(diǎn)。
(3)制備碲化汞鎘量子點(diǎn)-過氧化物酶生物納米器件將含5×10-5摩爾/升巰基丙酸修飾的碲化汞鎘量子點(diǎn)，2.5×10-3摩爾/升乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽和3×10-6摩爾/升過氧化物酶加入到0.01摩爾/升pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液中混合均勻，混合溶液于常溫下避光反應(yīng)2-4小時。采用超濾法純化量子點(diǎn)生物標(biāo)記物，得到碲化汞鎘量子點(diǎn)-過氧化物酶生物納米器件。最后至4攝氏度冰箱處保存，用于化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移分析。
權(quán)利要求
1.一種基于化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移原理構(gòu)建生物納米器件的方法，其特征在于包括如下步驟1)將碲/硒粉、硼氫化鈉和超純水放在燒瓶中反應(yīng)，其中碲/硒粉和硼氫化鈉的摩爾比為1∶4至4∶1，反應(yīng)5-12小時后，將燒瓶中的上層清液轉(zhuǎn)移至裝有已經(jīng)除過氣的超純水中的燒瓶中，制備得到碲/硒氫化鈉溶液；2)將0.00001-0.1摩爾/升氯化鎘和水溶性巰基化合物混合配成溶液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0-10.0，通氮?dú)獬跞昼姾?，在攪拌并在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，注入碲/硒氫化鈉溶液，形成碲/硒化鎘單體溶液；加入的二價鎘離子∶碲/硒氫化鈉∶水溶性巰基化合物的摩爾比為2∶1∶4至2∶1∶8，控制反應(yīng)溫度70-140℃，反應(yīng)時間0.5-20小時，得到發(fā)光范圍在500到730納米的碲化鎘量子點(diǎn)水溶液或發(fā)光范圍在460到550納米的硒化鎘量子點(diǎn)水溶液；或者，以水為溶劑，將濃度為0.00001-0.1摩爾/升水溶性鎘鹽和汞鹽與水溶性巰基化合物混合，調(diào)節(jié)pH為7.0-12.0，其中鎘鹽與汞鹽的摩爾比為1∶50至1∶5，鎘鹽和汞鹽的總量與水溶性巰基化合物的摩爾比為1∶5至2∶1，然后，注入按步驟1)方法配制的碲氫化鈉溶液，鎘鹽和汞鹽的總量與碲氫化鈉溶液的摩爾比為10∶1至1∶4，得到CdHgTe單體；取CdHgTe單體放入微波反應(yīng)器，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度為80-140℃，反應(yīng)5分鐘-10小時后，得到發(fā)光位置在600-900納米的碲化汞鎘量子點(diǎn)水溶液；3)將0.001-5毫克/毫升水溶性碲/硒化鎘量子點(diǎn)或碲化汞鎘量子點(diǎn)、過氧化物酶和乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽于緩沖液中混合均勻，所述緩沖液為0.01摩爾/升的磷酸鹽緩沖液，pH值為7.0，水溶性碲/硒化鎘量子點(diǎn)或碲化汞鎘量子點(diǎn)、乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽和過氧化物酶的摩爾比為1∶1000∶0.1至1∶1000∶5，混合溶液于常溫下避光反應(yīng)2-4小時，得到所需的生物納米器件。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法制備的生物納米器件，其特征在于所述生物納米器件由過氧化物酶和能量受體熒光量子點(diǎn)組成。
3.一種權(quán)利要求2的生物納米器件的應(yīng)用，其特征在于所述生物納米器件表面含有可連接探針分子的活性官能團(tuán)氨基或羧基，通過官能團(tuán)共價修飾的各種葉酸、抗體、生物素、多肽、或酶的探針分子，可識別和檢測對應(yīng)的生物分子，用于生物分子的標(biāo)記檢測和示蹤，進(jìn)行細(xì)胞和組織成像。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移原理構(gòu)建生物納米器件的方法，這種納米器件由過氧化物酶和能量受體熒光量子點(diǎn)組成。以一種基于化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移原理發(fā)光的碲化鎘(或硒化鎘或碲化汞鎘)熒光量子點(diǎn)為核心，以共價鍵將熒光量子點(diǎn)與過氧化物酶連接而成。這種生物納米器件具有良好的水溶性和穩(wěn)定性，發(fā)射波長可調(diào)。它不需要外加激發(fā)光源，背景干擾小，通過化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生強(qiáng)的光信號。這種生物納米器件的表面含有多個氨基和羧基，易于與各種探針分子共價連接，主要用于生物分子的檢測和示蹤，進(jìn)行細(xì)胞和組織成像。
文檔編號G01N33/48GK101046452SQ20071004000
公開日2007年10月3日 申請日期2007年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月26日
發(fā)明者任吉存, 黃香宜 申請人:上海交通大學(xué)