專利名稱：結(jié)核分枝桿菌快速藥敏試驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)核分枝桿菌快速藥敏試驗(yàn)方法，特別是ATP生物發(fā)光技術(shù)快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌中ATP濃度的方法，屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(簡(jiǎn)稱結(jié)核桿菌)主要經(jīng)呼吸道傳播引起的全身慢性傳染病。全球目前約有20億人感染結(jié)核桿菌，其中500多萬人感染耐藥結(jié)核桿菌，3％的結(jié)核新病例與HIV感染有關(guān)，現(xiàn)有患者2000多萬例，其中95％發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。中國(guó)是22個(gè)結(jié)核高發(fā)國(guó)家之一，結(jié)核病患者的人數(shù)占世界結(jié)核病人數(shù)的1/4。而我國(guó)結(jié)核病人中具有耐藥菌株的患者高達(dá)28％-41％，遠(yuǎn)高于其他國(guó)家。耐藥結(jié)核菌株的增加給結(jié)核病的防治帶來了極大的困難。臨床上已經(jīng)證實(shí)耐藥菌株的形成是由于不合理的治療所致，因此合理地進(jìn)行臨床治療非常重要。準(zhǔn)確的藥敏試驗(yàn)結(jié)果是指導(dǎo)臨床合理使用抗結(jié)核藥物的前提，所以藥敏試驗(yàn)在結(jié)核病的防治工作中起著關(guān)鍵作用。
傳統(tǒng)的結(jié)核藥敏試驗(yàn)是將抗結(jié)核藥物按一定的稀釋度加入到羅氏固體培養(yǎng)基中，然后將分離培養(yǎng)出的結(jié)核桿菌接種于含有藥物的培養(yǎng)基中，觀察結(jié)核桿菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況進(jìn)行判斷。由于結(jié)核桿菌生長(zhǎng)緩慢，這種傳統(tǒng)的方法通常需要4-6周的時(shí)間才能報(bào)告藥敏試驗(yàn)結(jié)果，所以無法及時(shí)為臨床合理用藥提供指導(dǎo)。因此縮短結(jié)核藥敏試驗(yàn)的時(shí)間已成為一個(gè)迫切需要解決的問題，而快速、靈敏的結(jié)核藥敏試驗(yàn)則是控制結(jié)核病的首要條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種結(jié)核分枝桿菌快速藥敏試驗(yàn)方法，該方法快速、敏感，試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告時(shí)間通常不超過10天，以解決現(xiàn)有技術(shù)的不足。
本發(fā)明的技術(shù)方案該方法是將分離培養(yǎng)出的結(jié)核分枝桿菌接種至含有不同抗結(jié)核分枝桿菌藥物劑量的培養(yǎng)基中，然后分別在接種后的不同時(shí)間，取適量樣品加入三磷酸腺苷裂解劑或者三磷酸腺苷裂解劑與熒光素-熒光素酶溶液混合物，通過熒光素-熒光素酶生物發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌中的三磷酸腺苷量來判斷結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)情況，與不含抗結(jié)核分枝桿菌藥物的參考株進(jìn)行對(duì)比，以此來判斷結(jié)核分枝桿菌對(duì)藥物的反應(yīng)。
所述的接種后的不同時(shí)間分別為接種后的第1、3、5、7、10天。
所述的三磷酸腺苷裂解劑中含有三氯醋酸和乙二胺四乙酸，可以破壞結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁，從而釋放結(jié)核分枝桿菌內(nèi)的三磷酸腺苷。
加入的三磷酸腺苷裂解劑與所取樣品等體積或者是等體積的三磷酸腺苷裂解劑與熒光素-熒光素酶溶液混合物。
所述的三磷酸腺苷裂解劑與熒光素-熒光素酶溶液混合物為三磷酸腺苷裂解劑與熒光素-熒光素酶溶液等體積混合而成。
所述的熒光素-熒光素酶生物發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)三磷酸腺苷，是通過高靈敏度檢測(cè)儀測(cè)定光的強(qiáng)度。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，由于本發(fā)明將快速、敏感的ATP生物發(fā)光技術(shù)用于監(jiān)測(cè)結(jié)核桿菌的生長(zhǎng)情況，使其具有快速、靈敏度高等特點(diǎn)，全部試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告時(shí)間不超過10天，可用于判斷臨床所分離出的結(jié)核桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物是敏感還是耐藥，從而指導(dǎo)臨床合理用藥。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的實(shí)施例11樣品采集將肺結(jié)核病人痰液等樣品中分離培養(yǎng)出的結(jié)核桿菌接種到含有不同劑量(濃度)抗結(jié)核藥物(異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇等)的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
2.結(jié)核桿菌ATP抽提和ATP檢測(cè)分別在接種后的第1、3、5、7、10天取上述液體培養(yǎng)基(50-500μl)至試管或微孔板中，然后加入等體積ATP裂解劑，ATP裂解劑中所含的三氯醋酸和乙二胺四乙酸，可以破壞結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁，從而釋放結(jié)核分枝桿菌內(nèi)的ATP；反應(yīng)數(shù)秒后加入熒光素-熒光素酶溶液，隨后立刻采用高靈敏度發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定光的強(qiáng)度進(jìn)行分析測(cè)定，測(cè)定出的數(shù)值以相對(duì)光單位(RLU)表示。
本發(fā)明的實(shí)施例21樣品采集將肺結(jié)核病人痰液等樣品中分離培養(yǎng)出的結(jié)核桿菌接種到含有不同劑量(濃度)抗結(jié)核藥物(異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇等)的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
2.結(jié)核桿菌ATP抽提和ATP檢測(cè)分別在接種后的第1、3、5、7、10天取上述液體培養(yǎng)基(50-500μl)至試管或微孔板中，然后加入ATP裂解劑和熒光素-熒光素酶，隨后(5分鐘內(nèi))采用高靈敏度發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定光的強(qiáng)度進(jìn)行分析測(cè)定，測(cè)定出的數(shù)值可以相對(duì)光單位(RLU)表示。
將測(cè)定出的ATP數(shù)值(RLU)與在不含抗結(jié)核藥物培養(yǎng)基中培養(yǎng)的結(jié)核桿菌參考株進(jìn)行對(duì)比，如ATP含量降低，表明為敏感株；反之為耐藥株，從而指導(dǎo)正確用藥。其中熒光素-熒光素酶生物發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)ATP的檢測(cè)原理反應(yīng)中熒光素被氧化并發(fā)出熒光，該光的強(qiáng)度與被測(cè)樣品中的ATP含量成正比，通過高靈敏度檢測(cè)儀測(cè)定光的強(qiáng)度進(jìn)行定量分析即可。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)核分枝桿菌快速藥敏試驗(yàn)方法，其特征在于該方法是將分離培養(yǎng)出的結(jié)核分枝桿菌接種至含有不同抗結(jié)核分枝桿菌藥物劑量的培養(yǎng)基中，然后分別在接種后的不同時(shí)間，取適量樣品加入三磷酸腺苷裂解劑或者三磷酸腺苷裂解劑與熒光素-熒光素酶溶液混合物，通過熒光素-熒光素酶生物發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌中的三磷酸腺苷量來判斷結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)情況，與不含抗結(jié)核分枝桿菌藥物的參考株進(jìn)行對(duì)比，以此來判斷結(jié)核分枝桿菌對(duì)藥物的反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌快速藥敏試驗(yàn)方法，其特征在于所述的接種后的不同時(shí)間分別為接種后的第1、3、5、7、10天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌快速藥敏試驗(yàn)方法，其特征在于所述的三磷酸腺苷裂解劑中含有三氯醋酸和乙二胺四乙酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌快速藥敏試驗(yàn)方法，其特征在于加入的三磷酸腺苷裂解劑量與所取樣品等體積，或者是加入等體積的三磷酸腺苷裂解劑與熒光素-熒光素酶溶液混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的結(jié)核分枝桿菌快速藥敏試驗(yàn)方法，其特征在于所述的三磷酸腺苷裂解劑與熒光素-熒光素酶溶液混合物為三磷酸腺苷裂解劑與熒光素-熒光素酶溶液的等體積混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌快速藥敏試驗(yàn)方法，其特征在于所述的熒光素-熒光素酶生物發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)三磷酸腺苷，是通過高靈敏度檢測(cè)儀測(cè)定光的強(qiáng)度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)核分枝桿菌快速藥敏試驗(yàn)方法，該方法是將分離培養(yǎng)出的結(jié)核分枝桿菌接種至含有不同抗結(jié)核分枝桿菌藥物的培養(yǎng)基中，然后分別在接種后的不同時(shí)間，取適量樣品加入三磷酸腺苷裂解劑或者三磷酸腺苷裂解劑與熒光素－熒光素酶溶液混合物，通過熒光素－熒光素酶生物發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌中的三磷酸腺苷量來判斷結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)情況，與不含抗結(jié)核分枝桿菌藥物的參考株進(jìn)行對(duì)比，以此來判斷結(jié)核分枝桿菌對(duì)藥物的反應(yīng)。本發(fā)明具有快速、靈敏度高等特點(diǎn)，全部試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告時(shí)間不超過10天，可用于判斷臨床所分離出的結(jié)核桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物是敏感還是耐藥，從而指導(dǎo)臨床合理用藥。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101067147SQ20071004118
公開日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2007年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月24日
發(fā)明者彭志剛, 陳國(guó)治 申請(qǐng)人:益思美詮生物科技(上海)有限公司