專利名稱：：一種檢測糖尿病腎病血清標(biāo)本中差異表達的蛋白質(zhì)譜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物學(xué)和醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，涉及糖尿病腎病患者體液標(biāo)記物的檢測方法，具體涉及2型糖尿病腎病血清標(biāo)本中差異表達的蛋白質(zhì)譜的方法。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有技術(shù)表明，生物功能的主要體現(xiàn)者是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)表達譜比mRNA表達譜更能真實地反映生物體的功能機制。表面加強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)是當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中比較理想的技術(shù)平臺，主要由蛋白質(zhì)芯片、飛行質(zhì)譜和分析軟件3部分組成。蛋白質(zhì)芯片是核心部分，根據(jù)芯片性質(zhì)不同，可分為化學(xué)表面芯片和生物表面芯片。蛋白質(zhì)芯片的問世為臨床診斷及藥物發(fā)現(xiàn)等提供了一個大規(guī)模、高通量的分析平臺。糖尿病腎病(diabeticnephropa-thy，DN)是糖尿病最嚴(yán)重和最常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，可累及15-25%的1型糖尿病及30-40%的2型糖尿病病人。鑒于糖尿病腎病的發(fā)病機制的多元性和異質(zhì)性，篩選新的糖尿病腎病患者體液標(biāo)記物，尤其是診斷標(biāo)記物的聯(lián)合應(yīng)用可能有助于DN的更早期診斷。SELDI的出現(xiàn)及迅猛發(fā)展，使得快速、高效、高通量地分析臨床標(biāo)本成為可能。它能夠提供尿液、血液、腦脊液等粗樣本的快速蛋白表達圖譜。鑒別樣品間蛋白表達譜的差異，正越來越多地在癌癥、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染性疾病的臨床研究和診斷方面得到應(yīng)用。利用體液標(biāo)本尋找差異蛋白，建立疾病的指紋圖譜并結(jié)合計算機技術(shù)可以提高多種疾病的鑒別率。有關(guān)SELDI-T0F-MS技術(shù)在糖尿病的研究中應(yīng)用極為有限，尚未見對2型糖尿病腎病病人血液進行大樣本研究并提出分析模型的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測糖尿病腎病血清標(biāo)本中差異表達的蛋白質(zhì)譜的方法。尤其是2型糖尿病腎病血清標(biāo)本中差異表達的蛋白質(zhì)譜的檢測方法。本發(fā)明采用表面加強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF-MS)篩選糖尿病慢性并發(fā)癥(糖尿病腎病，DN)血清樣本的全蛋白指紋圖譜，用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)篩選DN的生物標(biāo)記物，建立DN血清蛋白質(zhì)組分析決策樹模型，經(jīng)盲法驗證及擴大樣本驗證模型，結(jié)果顯示2型糖尿病腎病病人存在血清蛋白質(zhì)指紋圖譜的差異。本發(fā)明在I-TOF-MS技術(shù)平臺基礎(chǔ)上，將某樣本的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜與正常人或某種疾病的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜相對照，可了解其是存有某種尚未明了的新的特異蛋白生物標(biāo)志物。本發(fā)明可進一步用于指導(dǎo)藥物開發(fā)和療效分析。本發(fā)明采用的表面加強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)和分子標(biāo)志物模式軟件建立樹狀分析模式，檢測分析血清標(biāo)本中蛋白質(zhì)譜的差異表達，其中，蛋白質(zhì)芯片制備包括(1)生物原始樣品制備。蛋白質(zhì)經(jīng)親合作用結(jié)合到芯片的化學(xué)或生物位點上。(2)制備清洗的蛋白質(zhì)芯片。用水洗去非特異結(jié)合的蛋白質(zhì)和緩沖液中的雜質(zhì)，以消除干擾。(3)加入能量吸收分子(EnergyAbsorbMolecule,EAM)。芯片干燥后，每個位點上加能量吸收分子，與蛋白質(zhì)結(jié)合為混合晶體，以促進蛋白質(zhì)在SELDI檢測中的解吸附和離子化。SELDI測定包括(1)用激光脈沖輻射將保留在芯片上的蛋白質(zhì)解析成荷電離子。(2)不同質(zhì)荷比的這些離子在儀器的磁場中的飛行時間長短不一，由此可精確地測定出它們的質(zhì)量，分子量大的飛行時間長，分子量小的飛行時間短。系統(tǒng)繪出質(zhì)譜圖，由分析軟件對質(zhì)譜圖進行分析，可直接顯示樣品中各種蛋白質(zhì)含量。本發(fā)明方法包括下述步驟(1)血清標(biāo)本進行蛋白裂解預(yù)處理；(2)血清標(biāo)本弱陽離子芯片處理；(3)芯片經(jīng)上樣、緩沖液平衡后加能量吸收分子SPA;(4)處理后的芯片經(jīng)PBS芯片閱讀儀分析獲得質(zhì)譜(5)通過BiomarkerWizardSoftware3.1比較不同組間血清蛋白質(zhì)譜的差異；(6)利用BiomarkerPatternsSoftware5.0.2建立DN的分析決策樹模型；(7)應(yīng)用樹狀分析模式獲得有差異的蛋白質(zhì)峰。本發(fā)明方法以離體血清標(biāo)本為檢測對象，檢測標(biāo)本中的蛋白質(zhì)的差異表達的組合結(jié)果，了解其中的蛋白質(zhì)其間的相互聯(lián)系的升高或降低的組合。所獲得的組合結(jié)果通過結(jié)合其他診斷指標(biāo)綜合判斷，有可能為進一步的糖尿病腎病的診斷及病理機制提供參考信息，為探討糖尿病腎病形成的分子機制提供研究基礎(chǔ)和新的耙點。說明書附圖圖1是DN分析決策樹模型。具體實施例方式實施例l:2型糖尿病腎病血清蛋白質(zhì)指紋圖譜及DN決策樹模型的建立取2型糖尿病患者及正常人血清標(biāo)本確診2型糖尿病腎病的病人，確診2型糖尿病不伴腎病的病人，正常人，空腹靜脈血5ml(無黃疸、脂血、溶血等情況)，常溫置3小時后，4'C3000rpm離心10min，取上層血清-80。C冰箱保存。Bradford法定量蛋白濃度空白對照lml考馬斯亮藍溶液+100y1去離子水；按表l配制標(biāo)準(zhǔn)曲線；測定樣本濃度；蛋白樣本加相應(yīng)的結(jié)合緩沖液(WCX緩沖液或SAX緩沖液或IMAC緩沖液或H4緩沖液)，稀釋至lmg/ml后上樣到相應(yīng)芯片上。表l配制標(biāo)準(zhǔn)曲線<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>血清樣品的處理-8(TC冰箱中取出血清樣品，置冰上融解；10000rpm，4'C離心2min;取血清3u1，力H入6u1U9緩沖液稀釋(WCX2和SAX2芯片用U9緩沖液1，IMAC3和H4芯片用U9緩沖液2)，冰浴振蕩30min;變性樣品中加入108u1相應(yīng)的結(jié)合緩沖液(WCX緩沖液或SAX緩沖液或IMAC緩沖液或H4緩沖液)，混勻，上樣到相應(yīng)芯片上。溶液配置(OU9緩沖液l:5ml(9MUrea，2%CHAPS，1%DTT，50mMTris-HC1，pH9.0)2.70gUrea(MW60.60)，加入2mlHPLCH20和250u11MTris-HClpH9.0充分溶解，再加入0.lgCHAPS,用HPLCH20定容至4.5ml，調(diào)PH至9.0，加入0.05gDTT，定容至5ml，分裝后-80。C保存。(WCX2和SAX2芯片用)(2)U9緩沖液2:5ml(9MUrea，2%CHAPS，50mMTris-HC1，pH9.0)2.70gUrea(MW60.06)，加入2mlHPLC仏0和250^11MTris-HClpH9.0充分溶解，再加入O.lgCHAPS，用HPLC比0定容至4.5ml，調(diào)pH至9.0，定容至5ml，分裝后-80。C保存。(IMAC3和H4芯片用)(3)U9.5裂解液1:50ml(9.5MUrea,2%CHAPS,1%DTT)30g的Urea加入30mlHPLCH20中，充分溶解，再加入1.Og的CHAPS和0.5g的DTT，定容至50ml，分裝后-8(TC凍存。(WCX2和SAX2芯片用)(4)U9.5裂解液2:50ml(9.5MUrea,2%CHAPS)30g的Urea加入30mlHPLCH20中—，充分溶解，再加入1.Og的CHAPS，定容至50ml，分裝后-80。C凍存。(IMAC3和H4芯片用)(5)WCX緩沖液200ral(50mMNaAc,pH4.0)NaAC(MW82.03)0.82g加入180mlHPLCH20中，充分溶解，調(diào)pH至4.0，HPLCH20定容至200ml，4。C保存。(6)SAX緩沖液200ml(0.05%TritonX-100，250mMTris-HCl，pH9.0)1Mtris-HCl10ml(pH9.0)，0.lmlTritonX-100與180mlHPLCH20混勻，HPLC&0定容至200ml，4'C保存。(7)I區(qū)C緩沖液200ml(0.05%TritonX-100，250mMNaCl，inlXPBS,)NaCl(MW58.44)2.922g加入1XPBS(pH約7.4)160ml中，攪拌均勻，再加入0.lmlTritonX-IOO，1XPBS定容至200ml。(8)H4緩沖液:200ml(10°/。ACN,250mMNaClinPBS)NaCl(MW58.44)2.922g加入1XPBS(pH約7.4)160ml中，攪拌均勻，再加入20ml100%ACN，1XPBS定容至200ml。(9)SPA飽和溶液:160ul(50%ACN+0.5%TFA)PiTFA溶液lOylTFA加入990iilHPLCH20中，混勻，4。C保存。SPA溶液配制:70ulP/。TFA溶液和70ulACN，同時加入SPA分裝管中，在渦旋混合器上充分混合(約3分鐘)靜置5min，以10000rpm離心5rain，取上清。采用弱陽離子交換芯片(WCX芯片)取WCX2的芯片，標(biāo)記芯片；芯片處理器(Bioprocessor)洗滌若干次，去離子水洗滌，取出晾干備用；每孔加上WCX緩沖液200ul，震蕩5min后，甩去孔中液體，重復(fù)二次；芯片處理器每孔加入100ul處理好的樣品，4"震蕩1小時；甩去樣品，每孔加入WCX緩沖液200iU，震蕩5min后，甩去孔中液體；每孔加入200ul去離子水，甩出；拆開芯片處理器，取出芯片，待微干后每加樣孔加SPA0.5Pl，重復(fù)二次；干后，上機測定。建立蛋白質(zhì)指紋圖譜AU-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的NP20芯片校正質(zhì)譜儀；最佳激光強度185;最佳檢測靈敏度8;設(shè)最高分子量為100000道爾頓(Da)，最佳狀態(tài)從2000Da到20000Da設(shè)Seldi數(shù)據(jù)收集參數(shù)檢測點20-80(acquisitionparameters為20，delta4，transientsperto5endingpositionto80);設(shè)預(yù)熱位置用2個spots,激光強度190，數(shù)據(jù)收集不包含預(yù)熱點。計算機從所獲得的原始數(shù)據(jù)快速精確的繪制出蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖。其中縱坐標(biāo)為蛋白質(zhì)相對含量，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比；蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比(m/z)與離子飛行時間的平方成正比。由E=UZ=l/2mv-2;h土推出M/Z=Kt2=^f2。其中Z為離子所帶電荷數(shù)，U為電壓，v為飛行速度，L為加速飛行電場電壓，K為常數(shù)。蛋白質(zhì)相對含量帶有正電荷的蛋白質(zhì)離子束在到達檢測器的一瞬間，電子倍增器將產(chǎn)生的瞬時電流(瞬時電流It=Q/t，其中Q為t時刻檢測器檢測到的電荷數(shù))轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)的相對含量。本發(fā)明選用WCX2、H4、IMAC3-Cu2+、SAX2四種蛋白質(zhì)芯片，分別對上述血清標(biāo)本建立蛋白質(zhì)指紋圖譜，實驗結(jié)果顯示W(wǎng)CX2芯片激光強度185，敏感性8;H4芯片激光強度210，敏感性9;I區(qū)C3-C,芯片激光強度230，敏感性9;SAX2芯片激光強度185，敏感性8;根據(jù)蛋白質(zhì)峰顯示程度，本發(fā)明最佳選擇芯片為WCX2芯片。建立DN的分析決策樹模型(1)比較不同組間蛋白質(zhì)差異蛋白質(zhì)指紋圖譜的分組選擇130例血清蛋白質(zhì)圖譜，根據(jù)有無DN將其分組，其中65例為DN組、65例為nonDN組，利用BiomarkerWizardSoftware3.1比較兩組間差異。蛋白質(zhì)指紋圖譜的標(biāo)化蛋白峰范圍2000-lOOOOODa，蛋白質(zhì)峰強度及mass均noHnalization。m/z為6634.8的蛋白為所有蛋白譜的共有蛋白，作為內(nèi)參照。采用BioMarkerWizard軟件生成蛋白質(zhì)峰并進行歸類比較，信噪比(S/N)為5，當(dāng)S/N>5及超過30%以上的樣本都具有的蛋白質(zhì)峰才被軟件認為是有意義的峰，根據(jù)方差分析的原理計算出總圖譜內(nèi)相同m/z的蛋白差異的尸值。2型糖尿病腎病患者與對照相比，檢測出的268個蛋白峰中46個蛋白峰有顯著差異(P〈0.0D、與nonDN組的Peakintensity比值〉2或〈0.5。其中22個蛋白峰在DN組中上調(diào)(表2)，平均m/z為2505.52,2654.90,3059.07，3253.57，3410.86，3632.77，3668.36，3750.06，4507.37，4558.50，4658.15，4890.31,5078.20，5205.38，5305.65，5318.32，5511.76，5710.27，5761.91，5955.42，5973.47和6779.03。24個蛋白峰在DN組中下調(diào)(表3)。表2:DN組中上調(diào)表達蛋白質(zhì)的m/z和Peakintensity<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>5205.380.210.481.18E-075305.651.673.492.21E-065318.321.162.396.21E-075511.760.531.078.8犯-075710.270.491.071.21E-075761.910.320.684.17E-065955.420.461.011E-105973.470.370.985E-1067^030.631.352.51E-07表3DN組中下調(diào)表達蛋白質(zhì)的m/z和Peakintensitym/znonDN組PeakintensityDN組PeakintensityP2049.753.780.492.46E-082052.811.590.525.5E-092233.971.280.455.92E-052235.561.180.411.24E-052759.272.210.752.75E-052872.630.840.413.8犯-052936.912.300.634.95E-05293H11.910.600.0001733197.313.090.757.24E-083266.073.300.671E-103268.773.570.643.67E-083272.091.600.593.9犯-063402.162.700.961.82E-073482.810.790.364.85E-053940.555.950.521.8E-063961.901.370.528.5E-094075.892.541.036.7E-094079.942.940.53<1E-1040恥.—028.681.332.67E-084111.082.700.751.68E-064301.822.680.834.21E-074969.902.190.657.0犯-06<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(2)利用部分差異蛋白的m/z和Peakintensity建立決策樹模型采用BiomarkerPatternsSoftware(BPS)5.0.2建立模型，所述的決策樹模型是由6個蛋白質(zhì)組成的7個節(jié)點的決策樹模型(圖l)。表4是各蛋白的重要性分值。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>所述的決策樹模型的根節(jié)點為m/z3197.31，當(dāng)m/z3197.31處強度《1.468時進入節(jié)點2，當(dāng)3197.31處強度>1.468時進入終節(jié)點8。進入節(jié)點2后，按m/z4075.89的強度進入下一層節(jié)點，強度《0.502時進入節(jié)點3，強度〉0.502時則進入節(jié)點4。進入節(jié)點3后，m/z3410.85強度《0.112者進入終節(jié)點1，而強度>0.112者進入終節(jié)點2。進入節(jié)點4后，根據(jù)ni/z4507.37處的強度，強度《0—.S24者進入節(jié)點5，而強度>0.824者進入節(jié)點6。進入節(jié)點5后，根據(jù)m/z5205.37處的強度，強度《0.165者進入終節(jié)點3，而強度〉0.165者進入終節(jié)點4。進入節(jié)點6后，再次根據(jù)m/z4507.37處的強度，強度《2.834者進入終節(jié)點5，而強度>2.834者進入節(jié)點7。進入節(jié)點7后，根據(jù)m/Z4658.14處的強度，強度《0.951者進入終節(jié)點6，而強度>0.951者進入終節(jié)點7。些血清蛋白指紋圖譜按照建模型的條件進行標(biāo)化后進入模型，BPS判斷這些標(biāo)本最后歸屬到哪一個終節(jié)點。進入終節(jié)點l、3、5、6、8的歸入nonDN組，而進入終節(jié)點2、4、7的判斷為DN。盲篩的結(jié)果證實了該模型的準(zhǔn)確性較高，22例DN中20例被準(zhǔn)確判斷，而28例nonDN有25例被準(zhǔn)確判斷，共5例被誤判，該模型盲法驗證準(zhǔn)確率達到90.00%(45/50)，敏感性90.91%(20/22)，特異性89.29%(25/28)，陽性預(yù)測值86.96%(20/23)，陰性預(yù)測值92.59%(25/27)。所述的的分析決策樹模型經(jīng)測試，可以明顯地區(qū)分出不同組間蛋白質(zhì)差異。本發(fā)明采用的主要儀器設(shè)備及主要試劑和耗材均為市購。根據(jù)上述所公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，上述的優(yōu)選具體實施方案應(yīng)被理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。從以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可很容易地理解本發(fā)明的本質(zhì)特征。而且在不偏離其主旨和范圍的情況下，可對本發(fā)明進行各種變更和改進。本發(fā)明方法以離體血清標(biāo)本為檢測對象，檢測標(biāo)本中的蛋白質(zhì)的差異表達的組合結(jié)果，了解其中的蛋白質(zhì)其間的相互聯(lián)系的升高或降低的組合。所獲得的組合結(jié)果通過結(jié)合其他診斷指標(biāo)綜合判斷，有可能為進一步的糖尿病腎病的診斷及病理機制提供參考信息，為探討糖尿病腎病形成的分子機制提供研究基礎(chǔ)和新的靶點。權(quán)利要求1、一種檢測糖尿病腎病血清標(biāo)本中差異表達的蛋白質(zhì)譜的方法，其特征在于采用表面加強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)，聯(lián)合應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)和分子標(biāo)志物模式軟件建立樹狀分析模式，檢測分析血清標(biāo)本中蛋白質(zhì)譜的差異表達，包括下述步驟，(1)血清標(biāo)本進行蛋白裂解預(yù)處理；(2)用弱陽離子芯片處理血清標(biāo)本；(3)芯片經(jīng)上樣、緩沖液平衡后加能量吸收分子SPA；(4)處理后的芯片經(jīng)PBS芯片閱讀儀分析獲得蛋白質(zhì)圖譜；(5)比較不同組間血清蛋白質(zhì)譜的差異；(6)建立糖尿病腎病的分析決策樹模型；(7)應(yīng)用樹狀分析模式獲得有差異的蛋白質(zhì)峰。2、按權(quán)利要求l所述的檢測糖尿病腎病血清標(biāo)本中差異表達的蛋白質(zhì)譜的方法，其特征在于所述的弱陽離子芯片是WCX2的芯片。3、按權(quán)利要求1所述的檢測糖尿病腎病血清標(biāo)本中差異表達的蛋白質(zhì)譜的方法，其特征在于所述的獲得蛋白質(zhì)圖譜的參數(shù)是檢測最高分子量為100000道爾頓，激光強度為185，檢測靈敏度為8，檢測點20-80。4、按權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的獲得蛋白質(zhì)圖譜的參數(shù)，其中檢測分子量是200020000道爾頓。5、按權(quán)利要求1所述的檢測糖尿病腎病血清標(biāo)本中差異表達的蛋白質(zhì)譜的方法，其特征在于，釆用軟件BiomarkerWizardSoftware3.1，比較不同組間血清蛋白質(zhì)譜的差異，其中內(nèi)參照共有蛋白的ra/z為6634.8，蛋白峰范圍2000-100000道爾頓；蛋白質(zhì)峰歸類信噪比S/N為5。6、按權(quán)利要求1所述的檢測糖尿病腎病血清標(biāo)本中差異表達的蛋白質(zhì)譜的方法，其特征在于，所述的決策樹模型是由6個蛋白質(zhì)組成的7個節(jié)點的決策樹模型。全文摘要本發(fā)明屬生物學(xué)和醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，具體涉及2型糖尿病腎病血清標(biāo)本中差異表達的蛋白質(zhì)譜的方法。本發(fā)明采用表面加強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)篩選糖尿病慢性并發(fā)癥血清樣本的全蛋白指紋圖譜，用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)篩選其中的生物標(biāo)記物，建立N血清蛋白質(zhì)組分析決策樹模型，經(jīng)盲法驗證及擴大樣本驗證模型，結(jié)果顯示2型糖尿病腎病病人存在血清蛋白質(zhì)指紋圖譜的差異。本發(fā)明有可能為進一步的糖尿病腎病的診斷及病理機制提供參考信息，為探討糖尿病腎病形成的分子機制提供研究基礎(chǔ)和新的靶點?？蛇M一步用于指導(dǎo)藥物開發(fā)和療效分析。文檔編號G01N33/68GK101393165SQ20071004622公開日2009年3月25日申請日期2007年9月20日優(yōu)先權(quán)日2007年9月20日發(fā)明者楊葉虹,胡仁明申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院